CN101248346A - 在表面上均匀混合并且分布反应物 - Google Patents

在表面上均匀混合并且分布反应物 Download PDF

Info

Publication number
CN101248346A
CN101248346A CNA2006800310730A CN200680031073A CN101248346A CN 101248346 A CN101248346 A CN 101248346A CN A2006800310730 A CNA2006800310730 A CN A2006800310730A CN 200680031073 A CN200680031073 A CN 200680031073A CN 101248346 A CN101248346 A CN 101248346A
Authority
CN
China
Prior art keywords
volume
container
reactant
reaction
cabin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800310730A
Other languages
English (en)
Inventor
樊尚·迪加
热罗姆·布鲁坦
埃利亚内·桑太让德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOTRAY
Original Assignee
BIOTRAY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOTRAY filed Critical BIOTRAY
Publication of CN101248346A publication Critical patent/CN101248346A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F31/00—Mixers with shaking, oscillating, or vibrating mechanisms
    • B01F31/65—Mixers with shaking, oscillating, or vibrating mechanisms the materials to be mixed being directly submitted to a pulsating movement, e.g. by means of an oscillating piston or air column
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00281—Individual reactor vessels
    • B01J2219/00286—Reactor vessels with top and bottom openings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0289—Apparatus for withdrawing or distributing predetermined quantities of fluid
    • B01L3/0293—Apparatus for withdrawing or distributing predetermined quantities of fluid for liquids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502723—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by venting arrangements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
    • B01L9/527—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for microfluidic devices, e.g. used for lab-on-a-chip
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)

Abstract

本发明涉及一种方法，所述方法用于在表面上混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的均匀混合物，并且涉及一种用于实施所述方法的小室(3)。所述小室包括：反应舱，所述反应舱包括：至少一个反应表面(13)，反应物可以直接或间接地固定到所述反应表面上，并且可选地，所述反应物可逆地固定到所述反应表面上；至少三个流体入口/出口(25，26)；至少一个容积固定的容器，所述容积固定的容器适于与所述反应舱连通，并且适于经由设有密封件的注入孔与所述反应舱的外部连通；流体环路，所述流体环路包括至少一个输入端口、至少一个排出端口以及至少一个容积可变的容器，所述容积可变的容器可单独地通过每个入口/出口与所述反应舱连通；用于使流体在所述反应舱和流体环路内循环的装置。本发明对于在表面上制备均匀膜，或者对于尤其在化学、生化或生物领域进行的“靶标－探针”识别反应是特别有用的。

Description

在表面上均匀混合并且分布反应物
技术领域
本发明涉及用于优化表面上的反应的自动化装置。具体地，本发明涉及一种用于在表面上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的方法，并且涉及一种用于实施所述方法的小室。
本发明还涉及一种自动化装置，用于在平坦的或多孔的表面上以均匀和可再现的方式进行生物、生化和化学反应。
背景技术
基因组学和后基因组学领域目前正在全面扩大。这与用于高通量分析的新型工具的开发具有紧密联系。生物芯片(DNA、蛋白质、核酸适体等)是这些强大的分析工具的一部分。生物芯片包括载体，在所述载体上生物或化学分子被局部化和固定(从每cm2数十到每cm2数千个)。这些分子通常被称为“探针(probe)”，具有特异识别溶液中的分子的能力。每个探针具有在不同程度上特异地并且在不同程度上强烈地与被称为“靶标(target)”的另一生物或化学分子相互作用的能力。
这就涉及各种相互作用。下面将进行不详尽的描述：两个互补的核酸序列(DNA芯片，荧光原位杂交(FISH)技术等)间的杂交反应，核酸与蛋白质、核苷酸、药物以及有机标记(称为适体)的亲和力，蛋白质可能建立的相互作用(免疫反应、酶催化反应、催化反应、金属结合肽等)。
这些技术使得同时筛选大量的不同分子成为可能。这对于为生物学家产生新信息源而言是必不可少的。事实上，使破译与病理学关联的分子基序、确定对应激(特别是毒理学)响应的基因表达的水平，或其他的寻求与遗传疾病相关的多态性成为可能的生物信息仅仅能够通过利用此类多个、平行、并且同时的筛选平台得到。
需要考虑的另一因素是测试的灵敏度。事实上，生物产品(例如，核酸、蛋白质、有机分子等)是以微小量提取的。为了优化分析的灵敏度以及持续时间，应要求分析仪器的小型化。例如，已知DNA芯片，其上在1cm2固定有数十万的探针。在微米和纳米技术领域正在发展的概念是片上实验室。
因此，在过去一些年间已经花费了很多努力来生产这些仪器。然而，没有几个试验常规地被生物实验室使用。例如“年轻的”生物芯片技术缺少稳定性和可重现性。目前，只有一个芯片的例子获得了CE-IVD(AmpliChipTM CYP450，Roche)认证。在临床实验室使用分子和基因诊断的芯片首先意味着其结果必须是标准化的并变得可靠，其次，必须允许高通量分析。
因此，从载体的生产到芯片的读取，再到数据处理，都必须可靠。已有大量文献涉及控制开发微阵列的工艺，在核酸杂交时各种获得靶链的方法，以及数据处理。然而，没有几个研究涉及杂交步骤对生物结果的影响。
两个参数显得很重要：整个载体上杂交的一致性，以及过程的自动化。为了达到极好的均匀性，至关重要的是给予溶液中的每个靶标相同的“看到”附着于载体的全部探针的几率。在遗传疾病的情形下所需的大量分析(例如用于筛选)意味着必须具有自动工具。由于可以提高和保证实验的较高重现性和再现性，由此使得能够减少引起变化的多个源头，因此这一方面很重要。
由于数百个反应可在同一载体上并行地进行，因此芯片是功能强大的分析工具。然而，为了使所有这些分析具有可比性，必须使它们在探针的规模上置于相同的反应。
在实验室中，载玻片上的杂交通常在载玻片和盖玻片之间进行(“被动杂交”方法)。因此，杂交溶液是固定的(静止)，而且这种类型的程序伴随着一定数量的缺陷。具体地，这种现有的杂交方法受限于载体表面的杂交缓冲液中靶标的扩散，在所述载体上探针被固定(仅有布朗运动)。
已经发现向流体中引入混合物能够对杂交结果产生积极影响。已经研究了与DNA芯片关联的微混合的原理。其思路是通过造成DNA分子的大量转移从而避开了分子扩散。
第一种途径是基于带电DNA分子在电场作用下的移动(Edman etal.(1997)“Electric field directed nucleic acid hybridization onmicrochips”Nucleic Acid Res.25(24)：4907-14)。这个方法已经给出了优于被动杂交方法30到40倍的结果。
用来加速杂交的其他途径利用通过对流产生的大量转移。第一种途径是基于经由超声波引起的对流槽的产生(Liu et al.(2003)“Hybridization enhancement using cavitation microstreaming”Anal.Chem.75(8)：1911-7)。微混合直接在载玻片表面的溶液中产生而没有引入死容积。与静态杂交相比，这种方法已经显示出将杂交信号强度和动力提高到5因子。作者指出获得了均匀性，而没有给出数量结果。
可供选择的方法包括进行机械搅拌。这些微流体系统(McQuain etal.(2004)“Chaotic mixer improves microarray hybridization”AnalBiochem.325(2)：215-26)被证明是尽管原理简单却难以实现的。根据探针密度、靶标浓度和杂交缓冲液体积，与静态方法相比，这种方法将杂交效率提高到2-8倍。McQuain等人(参见WO-A-03/16547)开发了一种基于混沌平流原理的载玻片搅拌系统。他们宣称在信号均匀性方面得到改进，接近于载体上固定探针的均匀度(变化参数是19％)，并且与静态模式相比为2因子。
这些技术当中的一些需要特殊载体(纳米级平台)或者其他昂贵的换能器。另外，这些系统未被集成到自动化系统中，这使得不能确保小反应容积的使用(可比作盖玻片和载玻片40-50μl之间的系统)。这些技术更多地根据动力学方面处理杂交的问题，并且基本上忽略了芯片等级上的杂交自动化和均匀性的方面。
与之相反，其他团队致力于获取用于大量分析的DNA芯片。目前此类实验中使用的技术是孔板。然而，每个孔消耗可观体积的生物材料，并且由于孔中受控搅拌的缺失而不能确保均匀性。
存在市场上可买到的一定数量的杂交台，能够进行自动杂交。所涉及的容积非常大(大于200μl)。这些杂交台中的大多数相对于表面进行液体排空和灌注活动，结果沿优选路径造成层流。伴随着的是反应区域的非均匀性。McQuain等人展示了进行均匀搅拌的重要性。因此，对混合进行的方式进行控制很重要。已经提议使用标准化的且相对较廉价的显微镜载玻片，并且通过混沌平流进行流体的混合。液体在微流体反应舱内的流动(舱的厚度小于100μm)遵循层流(非常低的雷诺数)。结果，微舱内产生很差的混合：第一原理包括引入暂时的流动变化。这是通过时间上周期地在不同区域内注入所述流体来进行。进而，在这种时间上周期性的二维流动中，流体的特定区域可能阻止混沌的出现。在相同注入水平的基础上，三维流动的引入能够消除这些死区并且在载玻片整个表面上促进混合。模拟结果显示依靠这种通过混沌平流进行混合的方法，减小了靶标扩散层，使得仪器的小型化并且在高通量检测的情形中应用于诊断用芯片(生物芯片)成为可能。
发明目的
本发明的一个目的是克服现有技术中的设备的缺陷。尤其是要解决杂交技术可靠的问题，并且更一般地，目的在于使得由载液携带的至少一种反应物在表面上的均匀混合和分布变得可靠。本发明的目的是为此用途开发一种高通量自动工具。
另一目的是提出一种用于在表面上均匀地混合和分布由载液携带的至少一种反应物的方法，所述方法利用了在层流中产生的混沌对流现象。
本发明的另一目的是提出一种用于在平坦的或多孔的表面上沉积化学或生化涂层、或者可选地为聚合物涂层的自动化工具，所述涂层的厚度和均匀性受到可再现地控制。
本发明的一个目的是开发一种用于改进整个反应表面上的化学、生化和生物反应的均匀性和可再现性的方法。
另一目的是开发一种用于在表面上均匀地混合和分布由载液携带的至少一种反应物的小室，其中反应表面的两点之间的反应的变异性降低。
本发明的附加目的是提供一种能够尤其用于“生物芯片”诊断、且其生产和使用都相对廉价的方法和装置。
本发明的另一目的是提供一种可逆的方法，即，可以使反应物和反应表面分离的方法。
自动化工具的规格表明：
-利用体积尽可能小的液体：对于单位面积，液体的体积由液体相对于表面的厚度决定；
-在溶液中搅拌反应物，以提高这些反应物相对于表面的均匀性，以便在表面上获得均匀的浓度；
-在表面上建立液体的均匀循环，以防止出现“死”区；
-控制反应温度；
-自动输送多种液体；
-自动清空该装置；
-能够在任意时间将任意类型的反应物直接注入反应装置中。
另一目的是提出一种分析装置，用于在反应表面上进行靶标-探针识别反应和在反应表面上形成涂层这两种情况下，检测反应的进行状态以优化反应的持续时间。
本发明另一目的是提出一种分析样品(例如生物样品)的装置。另一目的是提供一种控制反应表面上的涂层质量的装置。
发明简述
发明人首先开发了一种方法，其次开发了一种小室，用于在表面上均匀地混合和分布由载液携带的至少一种反应物。具体地，这种小室可集成到各种设备中，尤其是可集成到探针-靶标类型的化学和/或生化识别设备中，或者集成到用于在表面上形成均匀膜的设备中，该设备本身可以包括用于检测反应进行的装置。
为了提出这项技术，发明人已经生产了配备了自动杂交舱的流体系统，该系统能够实施基于舱内混沌平流原理的方法。
因此，如权利要求中所限定的那样，本发明首先涉及用于在表面上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的方法，包括下列基本步骤：
a)提供反应舱，所述反应舱具有：
·至少一个反应表面，所述反应物能够直接或间接地固定到所述反应表面上，可选地，所述反应物能够可逆地固定到所述反应表面上，
·至少三个流体入口/出口，以及
·至少一个容器，所述容器的容积是固定的，所述容积固定的容器能够与所述反应舱连通，并且能够经由注入孔与所述反应舱的外部连通；
b)可选地，所述容积固定的容器的所述注入孔被密封地关闭或者保持密封地关闭，接着经由所述反应舱的至少一个入口/出口，将与含有反应物的载液不同的至少一种流体引入所述反应舱中；
c)将所述含有反应物的载液注入至少一个容积固定的容器；
d)使所述含有反应物的载液在所述容积固定的容器、所述反应舱以及容积可变的容器之间循环，所述容积可变的容器能够经由所述反应舱的每个入口/出口与所述反应舱单独地连通；
e)通过相继选用不同的入口/出口而重复步骤d)；
f)可选地，重复步骤b)和/或步骤c)和/或步骤d)和/或步骤e)。
有利地，为了实施所述方法，发明人已开发了一种用于在表面上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的小室，包括
反应舱，其具有：
·至少一个反应表面，所述反应物能够直接或间接地固定到所述反应表面上，可选地，所述反应物能够可逆地固定到所述反应表面上，
·至少三个流体入口/出口，以及
·至少一个容器，所述容器的容积是固定的，所述容积固定的容器能够与所述反应舱连通，并且能够经由配备有密封装置的注入孔与所述反应舱的外部连通，
流体环路，其包括至少一个输入端口、至少一个排出端口、以及至少一个容器，所述容器的容积是可变的，所述容积可变的容器能够经由各个所述入口/出口单独地与所述反应舱连通；
用于使流体在所述反应舱体和所述流体环路中循环的装置。
根据本发明的方法和小室满足上述说明书的主要要求。事实上，所述方法和小室使得能够通过在与反应表面接触的膜内的混沌平流进行混合。因此，所述载液及其所携带的反应物被均匀地分布在整个反应表面上。换句话说，反应表面的所有点是等同的：在反应表面上不存在优选的载液流动。
例如，在探针-靶标识别反应的情况下(例如通过杂交)，每个靶标具有相同的几率看到固定在反应表面的探针。在形成涂层的情况下，用于形成所述涂层的反应物均匀地分布在整个待涂敷的反应表面上。
附图说明
图1表示自动杂交装置的等角视图。
图2表示图1的装置的所有内部元件的视图。
图3表示图1的装置的开启的杂交小室的等角视图。
图4表示从下方观察的杂交舱的盖体。
图5表示应用在显微镜载玻片上的舱沿图4中的线V的剖视图。
图6表示装置的杂交小室沿图2的线VI的剖视图。
图7表示装置的流体示意图。
图8表示装置的主体配置的立体图。
图9示出流体环路的注满(9A：空环路；9B和9C：流体环的灌注)。
图10示出生物样品的注入(10A：注入；10B：剩余流体的排出；10C：向反应舱内输送样品)。
图11示出混合阶段的多种可能的连续步骤。
在图9、10和11中，箭头指出流体循环的方向，并且符号Δ表示相应的阀门关闭。
图12是代表两类具有单核苷酸多态性的探针的信号/噪声比(SNR)的图，其中采用了两种杂交技术(在载玻片和盖玻片之间的技术，与本发明的混沌混合动态技术相比较)，如在实施例中描述的那样(信号/噪声比；以黑色示出：等位基因a；以阴影线示出：等位基因b)。
图13示出静态和动态杂交的总杂交动力学，如在实施例中描述的那样(平均荧光[任意单位，a.u.]作为时间[min]的函数；黑方块：静态杂交；圆圈：根据本发明的动态杂交)。
具体实施方式
下面将参考上述附图描述本发明，主要是在用于DNA芯片上的杂交的自动装置的情况下。当然，也可以预期其他类型的分子识别，例如从下列探针/靶标对中选择：DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA，PNA/DNA，PNA/RNA，PNA/蛋白质，蛋白质/DNA，蛋白质/RNA，蛋白质/蛋白质，化学分子(例如，荷尔蒙，脂质，糖脂，碳水化合物)/蛋白质，化学分子/DNA等(PNA：肽核酸)。
当然，此列表并没有限制，因为本发明旨在解决的问题是在反应表面上均匀地分布和混合由载液承载的至少一种反应物。在此情况下，将参考经由在反应表面上固定的探针将反应物-靶标间接固定至所述反应表面。
本发明也能够应用于反应物的沉积，以便在反应表面上形成均匀的化学或生化膜，或者具体为聚合物膜，其表面状态可以之前已经被改变以改进反应物的沉积。在此情况下，如果合适的话，反应物可直接或间接地固定在反应表面上。
术语“载液”表示包含反应物的液体，即，具体为经由注入孔注入反应舱中的液体。而且，例如在注入载液之前，反应舱通常含有起始液。一旦起始液和注入的载液混合，其混合物则一般称为载液。
图1以显微镜载玻片形式示出了用于在DNA芯片上杂交的自动杂交装置1的等角视图。所述装置包括盖体2和杂交小室3，盖体2例如由塑料制成，小室小室杂交小室3中可插入其上已固定有生物探针的任意类型的显微镜载玻片(尺寸为1英寸×3英寸×1mm，即26mm×76mm×1mm)。小室所述杂交小室将待杂交的表面(其上固定有探针的反应表面)限定在容积较小的反应舱内，在反应舱内将会产生与杂交有关的过程。该舱经由图2中示出的管道4连接到流体环路。所述流体环路包括优选位于盖体2下方的微电子流体元件。这些元件使得能够在反应舱内通过混沌平流进行混合。
有利地，为了控制反应条件，温度调节装置使得能够调节小室反应舱和/或流体环路中的杂交小室的温度。温度调节装置例如包括一个或多个加热元件，或者一个或多个帕尔帖效应小室。
图2还示出了分布系统8，其使得能够在流体环路6中分布各种溶液以进行例如预杂交、杂交和/或清洗。所述溶液经由管道5输送到分布系统8。
流体环路的电子流体元件和分布系统优选由受到盖体保护的电源板9来控制。温度调节装置和电源板9由盖体下方的电源7供电，电源7将主电源的交流电转变为24V直流电(在适当的情况下)。
有利地，电源板和温度调节装置由具有数字的和模拟的输入和输出的电路板控制。此电路板安装在计算机的PCI端口上。软件控制所述电路板，所述电路板经由连接到通信端口的电缆发送信息到装置1，也可以预期其他类型的通信端口。
如上所述，本发明涉及用于在表面13上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的小室3，小室3包括：
——反应舱16，反应舱16具有：
·至少一个反应表面13，反应物能够直接或间接地固定至反应表面13，可选地，反应物能够可逆地固定至反应表面13，
·至少三个流体入口/出口25、26，以及
·至少一个容器，其容积是固定的，容积固定的容器RF首先能够与反应舱16连通，其次能够经由设有气密封闭装置28的注入孔27舱与反应舱的外部连通；
——流体环路7，其包括至少一个输入端口63、至少一个排出端62、以及至少一个容器RV，容器RV的容积是可变的，容积可变的容器RV能够经由入口/出口25、26与反应舱独立连通；
——用于使流体在反应舱和流体环路中循环的装置。
有利地，如将在描述本发明的方法时具体说明的那样，容积固定的一个或多个容器RF的容积大于或等于容积可变的容器RV的最大容积。
优选地，反应舱16的入口/出口25、26规则地排列在反应舱的周边上。这使得能够改进载液沿反应表面的混合和分布的均匀度。
根据图3至图6所示的优选实施方案，反应舱16在顶部由设有所述入口/出口25、26的盖体C定界，在底部由所述反应表面13定界，在侧面由防漏密封件22定界。有利地，盖体C的下表面包括周边凹槽21，其中容纳有防泄漏的O形环密封件22。
优选地，反应表面是装配部分(例如显微镜载玻片)的上表面，所述小室还包括用于确定所述装配部分相对于盖体C的位置的装置。
图4示出盖体C的正视图，盖体C组成反应舱16的上部。盖体C包括矩形凹槽21，凹槽21中容纳有EPDM O形环密封件22。凹槽21限定代表反应舱16顶部的矩形内表面23(在此情况下深度为50μm)。如图6所示，当盖体C应用于如图6所示的显微镜载玻片13时，抵靠显微镜载玻片13推动凹槽21所限定的盖体外表面24。因此，无论载玻片13的厚度为多少，舱16的高度(h)都不改变。当抵靠载玻片13推动表面24时，O形环密封件被压入凹槽21中。这使得能够确保舱16的密封。在此实施例中，所述舱包括位于舱的4个角落处的4个入口/出口25、26。这些入口/出口使得载液和反应物能够在容积固定的容器RF和容积可变的容器RV之间沿着反应表面循环。另外，这些入口/出口连接到至少一个输入端口和至少一个排出端口，至少一个输入端口和至少一个排出端口允许在装置中注入和排出反应物溶液、清洗液以及净化溶液。注入口27使得能够在所述装置发挥作用时将生物材料从外界注入到反应舱内。注入口27与容积固定的容器RF连通。止动器28(图6)使得能够将容积固定的容器RF相对于外界紧密地关闭，尤其是在清空和填满反应舱16的阶段。
图3示出小室3打开时的详细等角视图。所述小室包括例如由佛达尔铝合金制成的显微镜载玻片支座12，支座12上放置设有生物探针微阵列的显微镜载玻片13。所述载玻片依靠两个在支座12上加工的邻接带14和15定位于水平平面中。所述小室包括经由共用轴18连接到支座12的两个杆17，共用轴18确保杆17和支座12之间的枢轴连接。盖体C经由轴18连接到杆17。该机构使得能够可重复地以均匀分布的力将盖体C应用在显微镜载玻片。因此，这将降低支座损坏的风险并保证优良的密封性。位于杆17末端的锁定系统19使得能够以足够的力重复地锁定系统。加热箔型的加热元件20被绑定在支座12上，使得能够控制杂交温度。
图6示出了根据本发明的小室的剖视图。支座12内的镗孔29接收探针，探针使得能够测量接近反应表面13的反应舱16的温度，以便能够尽量好地调节温度。
图6使得能够观察到锁定系统19。轴31经由聚合物套管34在部件30中滑动。轴31依靠把手33对弹簧32施加的预应力而保持在部件30上的适当位置。为了锁定小室，需要在把手33上施加力以使轴31滑动到部件30中，然后需要将把手33转动90°(举例而言)以将轴31转动相同的角度。凸边35向部件36用力推，部件36可从支座12上拆下。优选地，部件36由比支座的材料更硬的金属制成，以减小磨损。由此系统被锁定，并且使得系统19保持锁定的弹簧32的力经由杆17和轴18施加在盖体C上。此力足以压紧O形环密封件22，以使得盖体16的表面24压在显微镜载玻片上。杆17使得能够将施加在舱上的力松开以允许用户更舒适地施加此力。
图7示出了分布系统8和连接到反应舱16的流体环路7的简图。用于杂交操作的溶液容纳在瓶37内。溶液依靠置于阀下游的泵39、经由管道5输送到混合阀38。优选地，隔膜泵连接到两个非回流式阀。所述阀也可以是电磁阀。混合阀38使得能够选择用于灌注系统或注满流体环路的溶液。泵39的出口经由四向流体连接器40连接到流体环路。流体环路包括4个阀42、43、44和45，其分别连接到舱16的入口/出口57、56、54、55。阀42和43经由四向流体连接器40连接到泵39的出口和泵46的入口。阀44和45经由四向流体连接器40连接到环路的出口阀47和泵46的出口。废弃物容器48置于环路的出口阀47的下游，以收回经由管道5’使用的溶液。
有利地，泵46为容积可变的电磁阀形式，其组成容积可变的容器RV。
在注满包括舱16的流体环路的阶段，在混合阀38的作用下选择溶液，并且泵39将所述溶液输送到环路入口。阀42、43、44和45接着关闭，而泵46和阀47打开。泵39然后使溶液朝向废弃物容器48循环。流体环路的第一部分被注满。为了注满另一部分，泵46必须关闭并且阀42、43、44、45和47必须打开，接着泵39使溶液朝向废弃物容器48循环，使得溶液经由入口/出口57、56进入舱16并使得溶液经由入口/出口54、55排出。为了注满环路的第二部分，由于溶液由泵39推动，因此舱的注入孔必须关闭。类似地，能够通过选择空气而非溶液来清空流体环路。
在混合阶段，泵39关闭，并且阀47也关闭。另一方面，注入孔27打开或可选择地关闭。混合是通过一系列循环阶段而进行的。在阶段的第一半，阀43打开，并且阀44、45和42关闭。在高态下，泵46经由其入口吸入溶液，并经由与阀43相关联的入口/出口将溶液从舱16排出，其中阀43打开而阀44、45和42关闭。因为排出的液体的容积由容纳在与注入孔27连通的容积固定的容器RF中的溶液容积补偿，所以所述舱总是满的。
接着，在阶段的第二半，阀44打开，阀42、44和45关闭。泵从高态进入低态。在低态，泵将在高态时吸入的部分溶液推出并经由与阀44相关联的入口/出口将溶液注入舱16中，其中阀44打开而其他阀42、44和45关闭。舱容积的一部分等于由泵46置换的容积，这部分容积经由注入孔而注入容积固定的容器中。
由泵46置换的容积不超过注入孔的容积，以使得在高态下没有空气注入舱体中并因此也没有注入环路中。事实上，这将引起压头损失和较差的混合。另外，这将防止在低态时注满舱的溶液经由注入孔离开舱。
泵46将进行一系列以高态和低态为特征的脉动，其中连接到泵46的入口/出口在泵46从高态到低态转换，接着从低态到高态期间会从一个状态变化到下一个状态。因此，容积可变的容器能够经由每个入口/出口与反应舱独立地连通。
在混合过程中，在低态下没有外溢的情况下，能够将生物材料注入到注入孔27中。
而且，注入孔用作气泡陷阱。事实上，通常用于杂交的溶液包含表面活性剂，使得很难将其注入而没有泡沫。假设注入孔被放开，则进入其中的气泡不被重新注入舱内。
根据本发明的一个有利的特征，小室设有用于检测固定到反应表面的反应物的装置。例如，在核酸杂交的情况下，所述装置可以是荧光扫描器。
更一般地，可以预期能够检测反应物存在于反应表面给定位置的任意类型的传感器。传感器连接到图像分析装置，例如以确定反应表面上反应物已有效固定的位置。在微阵列的情况下，其中引入探针-靶标识别，探针的特性是已知的，这使得能够推导出靶标(即固定的反应物)的特征，并因此最终推导出被分析的样品的特征。
而且，根据实验条件和传感器的类型，分析可以是定性的(存在或不存在靶标)、定量的(存在的靶标的数量，例如与显色或荧光强度相关)、或半定量的(在某个检测水平之上为定量的，在该检测水平之下为定性的)。
因此能够具有动态分析工具。例如，杂交反应或更总体地，探针-靶标识别反应，通过重复将载液在反应表面上混合和分布的阶段来进行，并且同时利用合适的传感器检测出靶标在反应表面的固定。接着，当在预定数目的周期内确定两个检测/分析之间的情形没有变化时，即，没有检测到新的识别反应时，可以被认为分析已经完成。这使得能够减少分析的时间，因为混合周期数目不是随机固定的，而是取决于有效测量的情形。
分析也可与涂敷的均匀性有关。例如能够在沉积化学的、生化的和/或聚合物膜之后测量反应表面的显色。还可以预期测量通过膜和支座的光束强度的变化。如果该光束强度的变异性小于预定的阈值，则可以认为例如膜在厚度方面是均匀的。之前的校准将使得能够确定该膜的厚度。
因此，提供这样一种工具，其使得能够控制诸如显微镜载玻片的支座上涂敷的质量。
因此，本发明还涉及用于实现化学和/或生化的“靶标-探针”识别反应的设备，该设备包括根据本发明的至少一个小室，其中所述小室的反应表面是在支座的表面上制备的特定探针微阵列的形式，所述支座优选是显微镜载玻片。在此情况下，载液含有多个能够与探针微阵列特异反应的“靶标”反应物。
本发明还涉及用于在表面上形成均匀膜的装置，该装置包括根据本发明的至少一个小室。
优选地，这些设备包括用于在混合和分布小室的流体环路中分布至少一种流体的装置。所述分布装置，例如为多支管，使得能够自动地分布设备运行时使用的一种或多种流体、缓冲溶液、清洗溶液、漂洗溶液等，以及空气。根据本发明的另一特征，提供一种用于将含有所述反应物的至少一种载液经由容积固定的容器的注入孔，注入混合和分布小室的反应舱内的装置。这里再次存在自动化的可能性，这将提高可再现性。
完全能够预期并联和/或串联的多个混合和分布小室。这一点对于在同一反应表面上并行地或者甚至连续地进行多个识别反应或多个薄膜沉积是有益的。
另外，本发明涉及一种分析设备，其包括根据本发明的至少一个小室以及用于检测固定于反应表面上的反应物的装置。所述检测装置可以附接至分析小室，或附接至所述设备上。因此，可以预期各种混合和分布小室，其中每一个均包括反应表面和适于某种反应物的检测装置，并且都与相同的设备兼容。当相同的用户必须能够进行大量的反应和分析时可以证明这一点是有用的。
另一方面，当研究的反应总是总是相同的时，可以优选将检测装置附接至分析装置而非混合和分布小室，尤其是为了使分析更廉价和更可再现。
如上面关于本发明的装置的操作的描述那样，本发明还涉及用于在表面上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的方法。该方法主要包括以下步骤。
首先，提供如上所述的反应舱。可选地，与含有反应物的载液不同的至少一种流体经由至少一个入口/出口而引入反应舱中，例如为了启动所述方法，或者为了注满流体环路。
接着，含有反应物的载液被注入至少一个容积固定的容器中。因此，含有反应物的载液将能够经由注入孔而朝向反应舱循环。容积固定的容器的注入孔接着被关闭或保持打开，然后含有反应物的载液在容积固定的容器、反应舱以及容积可变的容器之间循环，其中所述容积可变的容器能够经由反应舱的每个入口/出口单独地与反应舱连通。此操作可通过事先将容积可变的容器置于清空状态，再将其从反应舱经由入口/出口注满来完成。将会清空容积固定的容器的吸力由此产生。然后，通过使流体经由另一入口/出口循环，以相反方向重复该步骤，这样使得能够朝向反应表面的另一区域分布流体。
因此，优选地，能够区分两个子步骤(其先后顺序是非强制性的)：
——使流体从容积固定的容器经由反应舱的第一入口/出口循环到容积可变的容器的子步骤，以及
——使流体从容积可变的容器经由反应舱的第二入口/出口循环到容积固定的容器的子步骤，其中所述第二入口/出口不同于所述第一入口/出口。
换句话说，在每个步骤中，选择一对入口/出口。在第一子步骤中，流体通过所述入口/出口对的两个入口/出口之一以一个方向循环，接着在第二子步骤中，流体通过所述入口/出口对的两个入口/出口中的另一个以相反的方向循环。然后选择另一对入口/出口，即，其中一个或两个入口/出口与之前的入口/出口不同的一对入口/出口，重复这两个子步骤。
通过连续选择不同的入口/出口，重复前面的步骤。可选地，含有反应物(或者与之前使用的一种或多种反应物不同的反应物)的载液的其他样品能够经由容积固定的容器注入孔而注入，并且能够重复在容积固定的容器和容积可变的容器之间循环流体的步骤。
在某些情况下，可能需要将装置中存在的气泡去除，优选地经由容积固定的容器的注入孔。这一点可以通过使容积固定的容器的注入孔保持打开并进行混合而实现，以便使得气泡被局限于容积固定的容器中，然后被排出。事实上，容积固定的容器形成反应舱内的高点。
最后，所述方法可以包括最终的步骤，其中反应舱和/或容积可变的容器和/或一个或多个容积固定的容器被排空。
可选地，当反应物和反应表面之间的反应是可逆转的时，所述最终的步骤可以包括释放反应物的步骤。也可以期望清洁反应舱和/或容积可变的容器和/或一个或多个容积固定的容器。这些操作通过以与灌注时所使用的方式类似的方式、使适当的流体在流体环路和反应舱中循环来进行。
下面将参考示意图8至11详细描述所述方法。图8A表示平坦的反应表面50，反应表面50包括固定有生物探针的微阵列51。
盖体53将表面51限制为小容积，所述容积组成反应舱。所述舱包括至少4个端口，其中包括三个入口/出口和一个注入孔。在图8所示的情况下，4个入口/出口54、55、56、57靠近反应舱的周边规则地分布，并且注入孔65靠近入口/出口的重心定位。每个入口/出口54、55、56或57连接到流体导管58、59、60或61，流体导管58、59、60或61包括开关阀，其优选是电磁阀。导管58、59、60和61连接到容积可变的容器64，容器64在其容积为最小值时用作闭塞的阀门。所述导管、舱和可变的容积组成流体环路，所述流体环路还包括直接连接到导管60和61的输入端口63、以及直接连接到导管58和59的排出端口62。输入端口63和排出端口62均包括开关阀。舱的注入孔65连接到容积固定的容器66，其容积大于或等于容积可变的容器64的最大容积。所述容积固定的容器设有防泄漏的密封系统。
杂交方法包括：
1/将流体环路注满缓冲溶液并调节温度；
2/注入生物靶标；
3/从流体环路排出部分缓冲溶液，其体积与注入的液体相同，从而不会将溶液过度稀释；
4/进行混合，以将生物靶标均匀地分布在探针微阵列51上。
图9示出了阶段1/。在第一步骤中，从被清空的系统开始(图9A)，导管58、59、60、61的阀关闭，输入端口63和排出端口62的阀打开并且容积可变的容器64位于其最大值(阀打开)(图9B)。容积固定的容器66关闭。缓冲溶液经由输入端口63注入，由此在入口和出口产生压力差(图9B)。当缓冲溶液到达排出端口62时，过程进入下一步骤。
在第二步骤中，导管58、59、60、61的阀打开，输入端口63和排出端口62的阀打开，并且容积可变的容器64位于其最小值(阀关闭)。容积固定的容器66保持关闭。继续经由输入端口注入缓冲溶液。并且所述溶液经由导管60和61通入舱内，从而将舱注满，然后再经由导管58和59离开而到达排出端口(图9C)。
流体环路被完全注满。在该阶段中，系统使温度达到与将靶标固定到探针所需的温度对应的温度。
上述两个步骤可以颠倒，也可以同时进行。
图10示出了阶段2/和3/。首先，输入端口63的阀和排出端口62的阀关闭。所有其他的阀均打开，容积可变的容器位于其最大值(阀打开)，并且容积固定的容器66打开。生物靶标(含有反应物的载液)被注入容积固定的容器66内。注入的体积注满容器而不外溢(图10A)。
为了进行混合，需要将容积固定的容器66清空。因此需要在不排出生物材料的情况下，从流体环路中排出体积与注入容积固定的容器中的体积对应的缓冲溶液。为此，采用一系列的步骤对来实现所述排出操作，其中包括至少一对(图10B和10C)其中注入的体积等于可变容积的最大值的阶段。
为此，在下一步骤中(图10B)，除排出端口62的阀之外，所有阀关闭。容积可变的容器减至最小值，并且体积与容积可变的容器的最大容积等同的溶液从环路中排出。
然后，排出端口62的阀变为关闭并且导管60和61的阀打开。容积可变的容器64增至最大值。从容积固定的容器66中排出相等的体积(图10C)。
图11示出了混合阶段4/。流体环路中注满缓冲液并含有生物靶标。混合阶段包括在探针微阵列51上以混沌方式分布生物靶标。无论在舱内引起何种流动，其都将是层流的并且存在生物靶标将采用相同路径和遭遇相同探针的风险。为了使靶标和探针之间的识别在表面上更加均匀，由多个层流产生混沌流，由此将靶标和探针之间“配对”的几率扩大。
混合是连续的4个步骤，其在整个反应过程中被依次重复。每个步骤包括2个子步骤：
-第一子步骤，其中容积可变的容器减至最小值。4个入口/出口中的一个打开，而其他关闭。与容积可变的容器的最大容积等同的体积被注入舱内，并且超出量被注入容积固定的容器66内。流体因此从容积可变的容器流入容积固定的容器；
-第二子步骤，其中容积可变的容器增至最大值，与前一步骤中打开的入口/出口不同的入口/出口被打开，而其他的入口/出口被关闭。例如，变为打开的入口/出口是与之前打开的入口/出口相对立的。与容积可变的容器的最大容积等同的体积从舱中排出，并且因此从容积固定的容器中排出相同的体积至舱中。流体从容积固定的容器进入容积可变的容器。
因此，例如；
阶段1：经由入口54注入溶液(图11A)，并且经由出口56排出溶液(图11B)。阶段2：经由入口55注入溶液(图11C)，并且经由出口57排出溶液(图11D)。阶段3：经由入口56注入溶液(图11E)，并且经由出口54排出溶液(图11F)。阶段4：经由入口57注入溶液(图11G)，并且经由出口55排出溶液(图11H)。
当然完全可以预期随机地注入和排出，或经由一对入口/出口同时排出流体，然后经由另一对入口/出口将其重新注入反应舱中。
实施例
A-材料和方法
生物材料
Sequentia公司(Evry，法国)提供了HPLC纯化寡核苷酸。每个探针与连接在其5′末端的氨基基团(-CH2)6-NH2合成。
本实验中采用标记为Cy3TM的25-低聚物控制探针来验证固定，并且采用包括单中心点突变(G代替A)的两个12-低聚物探针(等位基因a和等位基因b)。
本实验中采用标记为Cy3TM的84低聚物单链合成DNA靶标，其序列与两个12-低聚物探针互补。以6X SSC/0.1％SDS杂交溶液稀释探针。
生物芯片的加工
使用以10X PBS溶液稀释的25μM探针，在RosaSlide基底(RosaTech，法国)上加工微阵列。使用RosaTech 192点多微投射设备在每一个点处无接触地和无交叉污染地沉积约5nl探针溶液。使用RosaBlock(RosaTech，法国)溶液使所述基底的表面失活。此步骤使杂交过程中的吸收最小化。使用1％的SDS溶液在80℃下将微阵列清洗30分钟，然后用热水在80℃下漂洗30分钟。这一处理确保了微阵列之间的可重复性，并去除了未与基底共价结合的寡核苷酸探针。
在42×15mm2的基底表面上，以1mm的间距均匀地排列285个沉积。微阵列包括由两个等位基因沉积的网状形状形成的相同的簇。每个簇以荧光标记的核实控制探针隔开。
根据本发明的杂交台
TrayMix微混合器是一种自动动态混合和杂交台，其与标准的显微镜载玻片兼容。反应舱具有以下尺寸：18.8mm×49mm×50μm(宽×长×高)，并且通过圆形密封件密封。以混沌平流混合的自动射流系统在图7中示意性地示出。
混沌混合通过由反应舱内的微阀形成的周期交叉流而产生。输入和排出端口以及入口/出口允许将各种溶液(杂交、清洗、除污溶液)注入舱内，以及将液体排出，尤其是排到废弃物容器中。计算机经由用户软件接口控制装置的运行。用户仅不过将靶标经由注入孔直接注入反应舱中。系统通过混沌平流来产生混合，而珍贵的生物样品没有任何损失。混合系统的总体积是500μl。杂交温度由加热元件控制，温变范围在20℃-80℃±0.5℃之间。
杂交
1-被动杂交(静态)
1.1载玻片和盖玻片之间的方法(手动)
使用在载玻片和盖玻片之间进行杂交的现有方法获得的结果作为用于比较的基础阈值。理想地，少量的靶标(约50μl)被放置在承载有微阵列的载玻片表面和盖玻片之间。杂交在受限的环境中进行，其中温度和相对湿度受到控制。
1.2没有混沌混合的微混合器
承载有微阵列的载玻片被放置在微混合器中。为了进行杂交，关闭所述装置的混合器功能，并且将靶标的均匀溶液引入反应舱中。
2.被动杂交(动态)
独立使用了两种不同的杂交方式，以展示反应舱内的混沌混合的优点：
2.1-利用均匀的靶标溶液进行自动杂交
1.将微阵列手动插入反应舱中。
2.自动地调整温度以及利用均匀的靶标溶液自动使系统初始化。
3.在反应舱内自动混合。
4.从反应舱内自动排出反应物。
5.手动移除微阵列。
6.在准备连续杂交时，利用超纯水自动清洗舱。
2.2-通过将靶标溶液注入经初始化的混合环路中而进行自动杂交
1.将微阵列手动插入反应舱中。
2.自动调整温度并利用缓冲溶液自动使系统初始化。
3.将靶标溶液经由注入孔手动注入反应舱中。
4.在反应舱内自动混合
5.从反应舱内自动排出反应物。
6.手动移除微阵列。
7.在准备连续杂交时，利用超纯水自动清洗。
对根据上述两中方式获得的结果进行比较，可以显示出根据本发明的混沌混合的优点。除了动力学实验之外，所有的杂交实验均进行2小时。
微阵列的清洗
以5X SSC和0.1％的SDS溶液将所有的杂交阵列清洗2分钟，接着以2X SSC溶液清洗。然后，在扫描之前，通过离心机在1500g条件下将阵列干燥1分钟。
扫描和结果分析
使用两个PMT增益扫描微阵列，使用GeneTACTM LS IV(Genomic Solutions Ltd，Cambridgeshire，UK)以10μm分辨率扫描固定的控制探针和次饱和的杂交探针(等位基因a和等位基因b)。
利用LEOM(http://leom.ec-lyon.fr/)开发的TARGET软件通过分段来分析每个点的荧光强度。在微阵列上测量每个点的平均信号强度。基于进行的测量结果计算变化系数(CV)。根据对于同一总体而言，信号强度的标准差与信号强度的平均值之比来确定CV。此系数使得能够比较整个基底的表面上杂交的均匀度。用于三个微阵列的Cy3TM标记的控制探针，其信号强度被用来确定微阵列的本征非均匀性。基底的总CV在0.01和0.15之间。
B-结果
假定微混合器中使用的体积是载玻片和盖玻片之间的方法中使用的体积的10倍(500μl与50μl相比)，进行两个系列的实验。
在第一系列实验中，在两个实验状态下使用类似的靶标浓度：
1.静态：在载玻片和盖玻片之间(1.1)以及在微混合器中进行，同时混合功能关闭(1.2)。
2.动态：在微混合器中进行，同时混合功能发挥作用。
在第二系列实验中，使用相同量的靶标，对于载玻片和盖玻片之间的方法以50μl稀释，以及对于微混合器中的方法以500μl稀释。
混沌混合对于杂交的影响(相同的浓度)
为了确定动态混合的影响，比较了利用微混合器时具有或没有混沌混合而获得的杂交结果。结果显示了动态杂交与静态杂交相比在信号强度和均匀度方面的优点。
在载玻片和盖玻片之间杂交的荧光结果和CV用作参考。本技术的高CV显示出在载玻片和盖玻片之间的方法中固有的杂交响应的非一致性。甚至如果初始靶标溶液是均匀的，那么在没有混沌混合的混合环路中杂交的CV更大(0.56)。
混沌混合几乎能够将杂交的CV减小到微阵列固有的CV值，而无论注入的溶液均匀与否。
以相同量靶标进行的测试
利用5pmol靶标进行静态和动态两个杂交实验。
甚至如果与微混合器一起使用的靶标溶液浓度比与在载玻片和盖玻片之间的方法一起使用的靶标溶液浓度低10倍，则微混合器使得能够在强度和CV方面获得优越的结果。每类探针的信号/噪声比(SNRs)在图12中表示。
动态杂交使得能够通过增大等位基因a的SNR(以黑色表示)以及减小等位基因b的SNR(以阴影线表示)而增大杂交特异性，以检测单核苷酸多态性(SNP)。
反应的总动力学是研究的重要参数，因为两种技术间的靶标浓度截然不同。图13示出了静态(黑方块)和动态(圆圈)杂交的总杂交动力学。两个曲线是类似的，这表明杂交率处于相同的数量级。即，在任一时刻，与静态杂交相比，动态杂交的信号强度和标准差得到改进。
利用每一种方法都没有达到杂交的渐进值。在混沌混合中杂交程度的减小比较不明显，因为在通过动态混合(靶标/探针比＝50)获得的反应表面上，靶标分子的供给是恒定的。
混沌混合导致反应动力学改进以及靶标在整个反应表面上的快速分布。30分钟之后，动态混合情况下的杂交信号大于在载玻片和盖玻片之间的技术的情况下获得的杂交信号。
应当注意到，在小于200分钟的动态杂交中，获得与在载玻片和盖玻片之间的过夜杂交类似的结果。除了利用动态杂交获得均匀性的改进和信号强度的增加之外，动态杂交的速度提高约4倍是本发明的另一个优点。
本发明的主要优点可以总结如下：
-在待处理的支座的反应表面上一致且均匀的混合，而无死区(通过在以缓冲溶液初始化的舱内的荧光标签的均匀化和混合来显现)
-与在载玻片和盖玻片之间的静态技术相比，反应速度得以改进，并且时长和反应周期数得以优化。
-在整个处理区域上高度一致的生物响应：支座的固有一致性的数量级的变化系数，即支座的固有“噪声”。
-整个方法的自动化，其导致可重复性的改进。
-两个简单变异之间的特异性的改进。
-在任意时刻经由注入孔向反应舱中加入反应物的可能性。
这对于例如双重标签系统(ELISA类型)是有利的。
-为了实现双链靶标的变性，或者可选地打破反应舱之外的靶标的辅助结构，在流体环路中引入加热元件的可能性(＞90℃)。
具体地，本发明具有以下应用：
-在高通量扫描技术中，
-在生物芯片中：DNA(微阵列，荧光原位杂交(FISH)，完全基因杂交)、肽、蛋白质、糖蛋白、酶、催化剂、细胞、组织等)，
-在催化反应(例如选择金属结合蛋白质)、酶催化反应中等，
-在化学和电化学反应中。

Claims (24)

1.用于在表面上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的方法，包括下列基本步骤：
a)提供反应舱，所述反应舱具有：
·至少一个反应表面，所述反应物能够直接或间接地固定到所述反应表面上，可选地，所述反应物能够可逆地固定到所述反应表面上，
·至少三个流体入口/出口，以及
·至少一个容器，所述容器的容积是固定的，所述容积固定的容器能够与所述反应舱连通，并且能够经由注入孔与所述反应舱的外部连通；
b)可选地，所述容积固定的容器的所述注入孔被密封地关闭或者保持密封地关闭，接着经由所述反应舱的至少一个入口/出口，将与含有反应物的载液不同的至少一种流体引入所述反应舱中；
c)将所述含有反应物的载液注入至少一个容积固定的容器；
d)使所述含有反应物的载液在所述容积固定的容器、所述反应舱以及容积可变的容器之间循环，所述容积可变的容器能够经由所述反应舱的每个入口/出口单独地与所述反应舱连通；
e)通过相继选用不同的入口/出口而重复步骤d)；
f)可选地，重复步骤b)和/或步骤c)和/或步骤d)和/或步骤e)。
2.如前述权利要求所述的方法，其中所述步骤d)和步骤e)分别包括：
子步骤d1)和e1)，其中所述流体经由所述反应舱的第一入口/出口从所述容积固定的容器循环到所述容积可变的容器，以及
子步骤d2)和e2)，其中所述流体经由所述反应舱的不同于所述第一入口/出口的第二入口/出口从所述容积可变的容器循环到所述容积固定的容器。
3.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述步骤b)包括初始化步骤，在所述初始化步骤中，将初始化流体经由所述反应舱的至少一个入口/出口引入所述反应舱中。
4.如前述权利要求中任意一项所述的方法，包括最终步骤，在所述最终步骤中所述反应舱和/或所述容积可变的容器和/或一个或多个容积固定的容器被排空。
5.如前项权利要求所述的方法，其中所述最终步骤还包括释放所述反应物的步骤，和/或对所述反应舱和/或所述容积可变的容器和/或一个或多个容积固定的容器进行净化的步骤。
6.如前述权利要求中任意一项所述的方法，包括至少一个冲洗存在的气泡的步骤，并且优选经由容积固定的容器的注入孔来冲洗存在的气泡。
7.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述反应表面承载多个探针，尤其是移植到所述表面上的化学或生化探针，并且其中所述反应物能够与所述探针特异反应。
8.如权利要求1到6中任意一项所述的方法，其中所述反应物能够在所述反应表面上形成均匀的、尤其是有机的和/或无机化学的聚合的或电化学膜。
9.一种分析方法，包括如前述权利要求中任意一项所述的用于在表面上均匀混合和分布的方法的实施，并且还包括检测固定在所述反应表面上的反应物的步骤。
10.一种用于在表面上均匀地混合和分布由载液以层流方式携带的至少一种反应物的小室，包括
反应舱，其具有：
·至少一个反应表面，所述反应物能够直接或间接地固定到所述反应表面上，可选地，所述反应物能够可逆地固定到所述反应表面上，
·至少三个流体入口/出口，以及
·至少一个容器，所述容器的容积是固定的，所述容积固定的容器能够与所述反应舱连通，并且能够经由配备有密封装置的注入孔与所述反应舱的外部连通，
流体环路，其包括至少一个输入端口、至少一个排出端口、以及至少一个容器，所述容器的容积是可变的，所述容积可变的容器能够经由各个所述入口/出口单独地与所述反应舱连通；
用于使流体在所述反应舱和所述流体环路中循环的装置。
11.如前项权利要求所述的小室，其中所述容积固定的一个或多个容器的容积大于或等于所述容积可变的容器的最大容积。
12.如权利要求10或11所述的小室，其中所述反应舱的所述入口/出口规则地排列在所述反应舱的周边。
13.如权利要求10至12中任意一项所述的小室，其中所述反应舱在顶部由设置有所述入口/出口的盖体定界，在底部由所述反应表面定界，以及在侧面由防泄漏的密封件定界。
14.如前项权利要求所述的小室，其中所述盖体的下表面包括周边凹槽，所述周边凹槽中容纳有O形环密封件。
15.如权利要求13或14所述的小室，其中所述反应表面是装配部分的上表面，所述装配部分优选为显微镜载玻片，所述小室还包括用于确定所述装配部分相对于所述盖体的位置的装置。
16.如权利要求10至15中任意一项所述的小室，还包括用于调节舱内温度的装置和/或用于调整流体环路内温度的装置。
17.如前项权利要求所述的小室，其中所述用于调节温度的装置具有至少一个珀尔帖效应小室的形式。
18.如权利要求13至17中任意一项所述的小室，包括用于将所述盖体相对于所述反应表面锁定的装置。
19.如权利要求10至18中任意一项所述的小室，还包括用于检测固定于所述反应表面的反应物的装置。
20.一种化学或生化的“靶标-探针”识别设备，包括至少一个如权利要求10至18中任意一项所述的小室，其中所述小室的所述反应表面为在支座上制备的特定探针的微阵列形式，所述支座优选为显微镜载玻片，并且其中所述载液含有多个能够与所述微阵列的探针特异反应的“靶标”反应物。
21.一种用于在表面上形成均匀膜的设备，包括至少一个如权利要求10至18中任意一项所述的小室。
22.如权利要求20或21所述的设备，包括：
用于在混合和分布小室的流体环路中分布至少一种流体的装置；
用于将至少一种含有所述反应物的载液注入所述混合和分布小室中的装置。
23.如权利要求20至22中任意一项所述的设备，其中多个混合和分布小室并联和/或串联布置小室。
24.一种分析设备，包括如权利要求20至23中任意一项所述的设备以及用于检测固定至反应表面的反应物的装置，所述检测装置能够附接至一个或多个混合和分布小室。
CNA2006800310730A 2005-07-12 2006-07-12 在表面上均匀混合并且分布反应物 Pending CN101248346A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0552169A FR2888518B1 (fr) 2005-07-12 2005-07-12 Melange et distribution homogenes d'un reactant sur une surface
FR0552169 2005-07-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101248346A true CN101248346A (zh) 2008-08-20

Family

ID=36101723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800310730A Pending CN101248346A (zh) 2005-07-12 2006-07-12 在表面上均匀混合并且分布反应物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7772010B2 (zh)
EP (1) EP1902295B1 (zh)
CN (1) CN101248346A (zh)
AT (1) ATE466269T1 (zh)
DE (1) DE602006013982D1 (zh)
DK (1) DK1902295T3 (zh)
FR (1) FR2888518B1 (zh)
WO (1) WO2007006800A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842086A (zh) * 2011-10-07 2014-06-04 索尼公司 样本液注入导引装置
CN105102109A (zh) * 2013-03-05 2015-11-25 塔驰莱特遗传学有限公司 合成设备和方法
CN111950686A (zh) * 2020-07-22 2020-11-17 北京大学 一种数据处理装置及数据处理方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0611041D0 (en) * 2006-06-05 2006-07-12 Univ Bristol Mixing apparatus and method of designing a mixing apparatus
DE102007021499A1 (de) 2007-05-04 2008-11-06 Deere & Company, Moline Bedienvorrichtung
EP2198000A4 (en) * 2007-09-17 2013-02-20 SUPRAMOLECULAR NANO-STAMP PRINTING DEVICE
US8877485B2 (en) * 2009-12-09 2014-11-04 Dako Denmark A/S Apparatus and method for processing biological samples
CN103674674B (zh) * 2014-01-13 2016-08-17 俞冬熠 颠倒混匀器
KR20160018201A (ko) * 2014-08-08 2016-02-17 삼성전자주식회사 유체분석 카트리지 및 이를 포함하는 유체분석장치
CN106583141B (zh) * 2016-12-07 2019-07-26 孙平 一种高效率试剂涂片机
CN114247493B (zh) * 2020-10-20 2023-06-27 深圳铭毅智造科技有限公司 一种用于化学反应的芯片的固定装置

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4438785C2 (de) * 1994-10-24 1996-11-07 Wita Gmbh Wittmann Inst Of Tec Mikrochemische Reaktions- und Analyseeinheit
GB0028647D0 (en) * 2000-11-24 2001-01-10 Nextgen Sciences Ltd Apparatus for chemical assays
ATE288316T1 (de) * 2001-05-25 2005-02-15 Tecan Trading Ag System mit verfahrenseinheit zum hybridisieren von nukleinsäureproben, proteinen und gewebeschnitten
WO2003016547A2 (en) * 2001-08-13 2003-02-27 Vanderbilt University Distribution of solutions across a surface
EP1346770A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-24 Corning Incorporated Microvolume biochemical reaction chamber
WO2005007223A2 (en) * 2003-07-16 2005-01-27 Sasha John Programmable medical drug delivery systems and methods for delivery of multiple fluids and concentrations

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842086A (zh) * 2011-10-07 2014-06-04 索尼公司 样本液注入导引装置
CN105102109A (zh) * 2013-03-05 2015-11-25 塔驰莱特遗传学有限公司 合成设备和方法
CN105102109B (zh) * 2013-03-05 2017-12-08 塔奇莱特知识产权有限公司 合成设备和方法
CN111950686A (zh) * 2020-07-22 2020-11-17 北京大学 一种数据处理装置及数据处理方法
CN111950686B (zh) * 2020-07-22 2023-09-05 北京大学 一种数据处理装置及数据处理方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1902295B1 (fr) 2010-04-28
ATE466269T1 (de) 2010-05-15
US7772010B2 (en) 2010-08-10
EP1902295A1 (fr) 2008-03-26
FR2888518A1 (fr) 2007-01-19
US20080223115A1 (en) 2008-09-18
FR2888518B1 (fr) 2007-10-05
WO2007006800A1 (fr) 2007-01-18
DK1902295T3 (da) 2010-08-23
DE602006013982D1 (de) 2010-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101248346A (zh) 在表面上均匀混合并且分布反应物
CN101512018B (zh) 用于进行微流体化验的化验片和化验盒的结构设计
US7326561B2 (en) Flow-thru chip cartridge, chip holder, system and method thereof
EP2481815B1 (en) Microfluidic devices
EP2227690B1 (en) The micro-chamber plate, manufacturing method thereof
US8053185B2 (en) Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions
US6258593B1 (en) Apparatus for conducting chemical or biochemical reactions on a solid surface within an enclosed chamber
US9677133B2 (en) Biological chip hybridization system
Jiang et al. Recent advances in droplet microfluidics for single-cell analysis
US7008788B2 (en) Containers for supports comprising biopolymers
CA2401518A1 (en) Device and method for performing syntheses, analyses or transport processes
Rodriguez-Mateos et al. FISH and chips: a review of microfluidic platforms for FISH analysis
JP2003315337A (ja) 還流型生化学反応装置
US20050180894A1 (en) System, method, and product for efficient fluid transfer using and addressable adaptor
CN1815233B (zh) 在封闭系统中利用泵和阀控制的杂交系统
CA2468260A1 (en) Flow-thru chip cartridge, chip holder, system & method thereof
US20040101870A1 (en) Microvolume biochemical reaction chamber
US20200102587A1 (en) Nucleic acid amplification method and nucleic acid analyzer
EP1346770A1 (en) Microvolume biochemical reaction chamber
US20240058813A1 (en) Fluid delivery device with passive pressure equilibration
US20100184623A1 (en) Gene-array operation chip device
KR100601975B1 (ko) 펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치
WO2023168018A2 (en) Method and apparatus for processing tissue and other samples encoding cellular spatial position information with combinatorial encoding
Liu et al. Integrated Microfluidic DNA Array Biochips

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080820