CN101245374B - 用于鉴定有毒中药材马钱子品种的多核苷酸序列及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了马钱子的5S rDNA序列和ITS序列，利用马钱子的5S rDNA序列和ITS序列鉴定马钱子品种的方法，以及利用该序列区分易于与马钱子混淆的中药材的方法。
Description
技术领域
本发明涉及马钱子品种的ITS序列和5S rDNA spacer序列，及基于所述序列鉴定某一植物是否属于马钱子品种的方法。
背景技术
在传统中医药领域，因不认识药材真假而误服有毒药材，而导致中毒的个案屡见不鲜，媒体的报导引起了人们的恐慌，甚至不敢再服用中药。要挽回中药的声誉示和人们对中药的信心，必须先能准确鉴定中药品种并区分有毒药材。
两种常用而毒性强烈的药材-鬼臼及马钱子均曾发生中毒事件。马钱子为马钱科植物马钱(Strychnos nux-vomica)的种子(中国药典2005年版)。全中国共有马钱属植物十一种，在个别地区，云南马钱(S.wallichiana)及伞花马钱(S.umbellate)亦会被用作马钱子使用。马钱子含有马钱子碱(strychnine)及番木鳖碱(brucine)，两者皆有毒但同时亦是马钱子的有效成份。不同品种马钱的化学成份有异，故此要准确鉴定马钱子的来源植物，才能在用药时控制马钱子的有效成份。而鬼臼指小檗科桃儿七属(Sinopodophyllum)及鬼臼属(Dysosma)植物的干燥根。在香港，中药桃儿七称为鬼臼。桃儿七属及鬼臼属植物都含鬼臼毒素(podophyllotoxin)。由于药材龙胆和威灵仙的外型和鬼臼十分相似，容易混淆。在香港，曾经有市民误以为鬼臼是龙胆和威灵仙，因而误服鬼臼(桃儿七)中毒。故此准确鉴定鬼臼(桃儿七)及外型相似的药材可保障公众健康。
DNA技术已成为一种快速而准确鉴定动植物品种的方法。真核生物的DNA含有大量的基因及功能不明的DNA片段，某些DNA片段可以用 作分子标签，用来区别不同的物种。中草药材多源自植物，故此也保存了DNA。利用分子生物学技术方法可以提取药材的DNA，并将DNA片段进行扩增及测序，经过DNA序列分析便可以鉴定出中草药材的来源植物。
植物的基因与内转录间隔(internal transcribed spacer，ITS)及核糖体5S rDNA基因间隔(5S rDNA spacer)是常用作分析种间关系的DNA片段。基因与内转录间隔(ITS)是在主体RNA(18S-5.8S-28S rDNA)的核糖体rDNA基因间隔，在核糖体18S rDNA基因和核糖体5.8S rDNA基因中间的间隔称为ITS1，在核糖体5.8S rDNA基因和核糖体28S rDNA基因中间的间隔称为ITS2。核糖体5S rDNA基因间隔(5S rDNA spacer)是重复的核糖体5S rDNA基因之间的间隔。ITS和5S rDNA spacer都是串联的多拷贝基因，而且它们都位于高度保守的rDNA转录区之间，而转录间隔区有较大变异，这种高度保守性与变异性的统一，使得5S rDNA基因序列成为研究真核生物中多拷贝基因的分子形成和演化的有用标记。但有毒药材已知的DNA序列数据不多，因而造成了因缺乏对照而不能鉴定的困境。
发明内容
本发明的目的在于提供可用作参比序列的马钱子和鬼臼的5S rDNA序列和ITS序列，以及利用所述序列鉴定中药材的方法。
本发明的第一方面提供了一种用于鉴别马钱子品种的分离的多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO：1-34的序列。
本发明的第二方面提供了一种用于鉴别鬼臼品种的分离的多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO：35-46和SEQ ID NO：55-72的序列。
本发明的第三方面提供了一种鉴别马钱子品种的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从植物样品中提取DNA；
(b)以步骤(a)提取的DNA为模板，使用通用引物，进行聚合酶链反应，扩增ITS和/或5S rDNA区段；
(c)对步骤(b)中获得的PCR产物进行克隆测序；和
(d)将步骤(c)测得的DNA序列与选自SEQ ID NO：1-17所示的马钱子ITS序列和/或选自SEQ ID NO：18-34所示的马钱子5S rDNA spacer序列进行比较以确定相应的植物品种。
本发明的第四方面提供了一种鉴别鬼臼品种的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从植物样品中提取DNA；
(b)以步骤(a)提取的DNA为模板，使用通用引物，进行聚合酶链反应，扩增ITS和/或5S rDNA区段；
(c)对步骤(b)中获得的PCR产物进行克隆测序；和
(d)将步骤(c)测得的DNA序列与选自SEQ ID NO：35-46所示的鬼臼ITS序列和/或选自SEQ ID NO：55-72所示的鬼臼5S rDNA spacer序列进行比较以确定相应的植物品种。
本发明的第五方面提供了上述马钱子或鬼臼的ITS序列或5S rDNAspacer序列在马钱子或鬼臼中药材的质量控制，鉴定真伪中的应用。
本发明的第六方面提供了上述马钱子或鬼臼的ITS序列或5S rDNAspacer序列在马钱子或鬼臼中药材资源调查中的应用。
本发明的第七方面提供了上述马钱子或鬼臼的ITS序列或5S rDNAspacer序列在马钱子或鬼臼中药材的研究与开发中的应用。
本发明的第八方面提供了上述马钱子或鬼臼的ITS序列或5S rDNAspacer序列在马钱子或鬼臼商品药材包括原药材、饮片及粉末的鉴定中的应用。
本发明的第九方面提供了上述马钱子或鬼臼的ITS序列或5S rDNAspacer序列在马钱子或鬼臼中药材种植业中的应用。
本发明的第十方面提供了上述马钱子或鬼臼的ITS序列或5S rDNAspacer序列在马钱子或鬼臼中药材加工与制造业中的应用。
本发明正是利用ITS和5S rDNA spacer序列的差异进行品种鉴定或辨别其真伪。为有效控制原料来源及生产过程中的不稳定因素，从基因组学着手，以鉴定药材的来源植物，有利于控制中成药的产品质量，从 而为制药行业提供科学合理的指导，提高药品的安全有效性。
具体实施方式
为达到本发明的目的，发明人收集了38份样品，包括4个马钱属(Strychnos)品种、3个鬼臼属(Dysosma)品种、1个桃儿七(Sinopodophyllum)、3个铁线莲属(Clematis)品种、5个龙胆属(Gentiana)品种；按照Draper和Scott(Draper and Scott，1988)所述大致相同的方法提取植物样品的DNA；然后以所提取的DNA为模板，以寡核苷酸作为聚合酶链反应(PCR)的引物，分别扩增ITS和/或5S rDNA区段，所用的引物分别采自植物ITS和/或5S rDNA两端的保守区段；应用克隆测序技术对所获得的ITS和/或5S rDNA spacer PCR产物进行测序；并将所测得的序列进行相似性比较。相似性是经序列比对分析而确定的两条序列间相同碱基的百分比。
所测得的样品的ITS及5S rDNA spacer序列如下：
A：4个马钱品种17个样品的ITS序列：
(1)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA3)的ITS序列：SEQ ID NO：1。
(2)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA5)的ITS序列：SEQ ID NO：2。
(3)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA2)的ITS序列：SEQ ID NO：3。
(4)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA1)的ITS序列：SEQ ID NO：4。
(5)马钱(Strychnos nux-vomica样品(编号Maqianzi-SN1)的ITS序列：SEQ ID NO：5。
(6)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN2)的ITS序列：SEQ ID NO：6。
(7)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN3)的ITS序列：SEQ ID NO：7。
(8)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN4)的ITS序列：SEQ ID NO：8。
(9)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN6)的ITS序列：SEQ ID NO：9。
(10)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN7)的ITS序列：SEQ ID NO：10。
(11)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN9)的ITS序列：SEQ ID NO：11。
(12)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN16)的ITS序列：SEQ ID NO：12。
(13)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU2)的ITS序列：SEQ ID NO：13。
(14)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU3)的ITS序列：SEQ ID NO：14。
(15)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU1)的ITS序列：SEQ ID NO：15。
(16)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU4)的ITS序列：SEQ ID NO：16。
(17)华马钱(Strychnos cathayensis)样品(编号Maqianzi-SC1)的ITS序列：SEQ ID NO：17。
B：4个马钱品种17个样品的5S rDNA spacer序列：
(18)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA1)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：18。
(19)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA2)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：19。
(20)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA3)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：20。
(21)牛眼马钱(Strychnos angustiflora)样品(编号Maqianzi-SA5)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：21。
(22)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN1)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：22。
(23)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN2)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：23。
(24)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN3)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：24。
(25)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN5)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：25。
(26)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN6)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：26。
(27)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN7)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：27。
(28)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN9)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：28。
(29)马钱(Strychnos nux-vomica)样品(编号Maqianzi-SN16)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：29。
(30)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU1)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：30。
(31)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU2)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：31。
(32)伞花马钱(Strychnos umbellata)样品(编号Maqianzi-SU3)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：32。
(33)华马钱(Strychnos cathayensis)样品(编号Maqianzi-SC1)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：33。
(34)华马钱(Strychnos cathayensis)样品(编号Maqianzi-SC2)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：34。
C.4个鬼臼品种13个样品的ITS序列：
(35)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号DP2)的ITS序列：SEQ ID NO：35。
(36)六角莲(Dysosmapleianthus)样品(编号PD3)的ITS序列：SEQ ID NO：36。
(37)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号PD4)的ITS序列：SEQ ID NO：37。
(38)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号DV5)的ITS序列：SEQ ID NO：38。
(39)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号DV7)的ITS序列：SEQ ID NO：39。
(40)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号PD5)的ITS序列：SEQ ID NO：40。
(41)川八角莲(Dysosma veitchii)样品(编号PD1)的ITS序列：SEQ ID NO：41。
(42)川八角莲(Dysosma veitchii)样品(编号PD2)的ITS序列：SEQ ID NO：42。
(43)八角莲(Dysosma versipellis)样品(编号DV6)的ITS序列：SEQ ID NO：43。
(44)桃儿七(Sinopodop hyllumhexandrum)样品(编号SE2)的ITS序列：SEQ ID NO：44。
(45)桃儿七(Sinopodop hyllumhexandrum)样品(编号SE3)的ITS序列：SEQ ID NO：45。
(46)桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)样品(编号SE5)的ITS序列：SEQ ID NO：46。
D.8个容易和鬼臼混淆的品种的ITS序列：
(47)山木通(Clematis finetiana)样品(编号CF4)的ITS序列：SEQID NO：47。
(48)柱果铁线莲(Clematis uncinata)样品(编号CU1)的ITS序列：SEQ ID NO：48。
(49)威灵仙(Clematis chinensis)样品(编号CC5)的ITS序列：SEQID NO：49。
(50)条叶龙胆(Gentiana manshurica)样品(编号GM1)的ITS序列：SEQ ID NO：50。
(51)三花龙胆(Gentiana triflora样品(编号GT1)的ITS序列：SEQID NO：51。
(52)龙胆(Gentiana scabra)样品(编号GS6)的ITS序列：SEQ IDNO：52。
(53)坚龙胆(Gentiana regescens)样品(编号GR1)的ITS序列：SEQ ID NO：53。
(54)红花龙胆(Gentiana rhodantha)样品(编号GHH1)的ITS序列：SEQ ID NO：54。
E.4个鬼臼品种18个样品的5S rDNA spacer序列：
(55)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号DP2)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：55。
(56)六角莲Dysosma pleianthus)样品(编号DV5)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：56。
(57)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号DV7)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：57。
(58)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号PD3)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：58。
(59)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号PD4)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：59。
(60)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号PD5)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：60。
(61)六角莲(Dysosma pleianthus)样品(编号PD6)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：61。
(62)川八角莲(Dysosma veitchii)样品(编号PD1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：62。
(63)川八角莲(Dysosma veitchii)样品(编号PD2)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：63.
(64)川八角莲(Dysosma veitchii)样品(编号DVR1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：64。
(65)川八角莲(Dysosma veitchii)样品(编号DV10)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：65。
(66)八角莲(Dysosma versipellis)样品(编号DV6)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：66。
(67)八角莲(Dysosma versipellis)样品(编号SE1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：67。
(68)八角莲(Dysosma versipellis)样品(编号SE4)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：68。
(69)八角莲(Dysosma versipellis)样品(编号DP3)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：69。
(70)八角莲(Dysosma versipellis)样品(编号SHDVS3)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：70。
(71)桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)样品(编号SE2)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：71。
(72)桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)样品(编号SE3)的5SrDNA spacer序列：SEQ ID NO：72。
F.8个容易和鬼臼混淆的品种的5S rDNA spacer序列：
(73)山木通(Clematisfinetiana)样品(编号CF4)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：73。
(74)柱果铁线莲(Clematis uncinata)样品(编号CU1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：74。
(75)威灵仙(Clematis chinensis)样品(编号CC5)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：75。
(76)条叶龙胆(Gentiana manshurica)样品(编号GM1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：76。
(77)三花龙胆(Gentiana triflora)样品(编号GT1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：77。
(78)龙胆(Gentiana scabra)样品(编号GS6)的5S rDNA spacer序列：SEQ ID NO：78。
(79)坚龙胆(Gentiana rigescens)样品(编号GR1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：79。
(80)红花龙胆(Gentiana rhodantha)样品(编号GHH1)的5S rDNAspacer序列：SEQ ID NO：80。
本发明利用马钱及鬼臼植物内ITS和5S rDNA序列的差异进行种内和种间的比较，借此鉴定不同的马钱及鬼臼药材品种并辨别其真伪。
利用ITS序列鉴别马钱或鬼臼药材品种的方法包括下列步骤：
(1)收集植物样品；
(2)从步骤(1)选出的植物样品中提取DNA；
(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，以寡核苷酸作为聚合酶链反应(PCR)的引物，扩增ITS区段，所用的引物为通用引物，其分别采自植物ITS两端的保守区段；
(4)步骤(3)中所获得的PCR产物直接进行测序；和
(5)将步骤(4)中测得的序列与选自SEQ ID NO：1-17所示的马钱子ITS序列或选自SEQ ID NO：35-46所示的鬼臼ITS序列进行比较以确定相应的植物品种。
利用5S rDNA序列鉴别马钱或鬼臼药材品种的方法包括下列步骤：
(1)收集植物样品；
(2)从步骤(1)选出的植物样品中提取DNA；
(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，以寡核苷酸作为聚合酶链反应(PCR)的引物，分别扩增5S rDNA区段，所用的引物为通用引物，其分别采自植物5S rDNA两端的保守区段；
(4)应用克隆测序技术对步骤(3)中所获得的5S rDNA spacer PCR产物进行测序；和
(5)将步骤(4)中测得的序列与选自SEQ ID NO：18-34所示的马钱子5SrDNA序列或选自SEQ ID NO：55-72所示的鬼臼5S rDNA序列进行比较以确定相应的植物品种。
上述所测得的四个马钱品种，包括马钱(Strychnos nux-vomica)、牛眼马钱(Strychnos angustiflora)、华马钱(Strychnos cathayensis)及伞花马钱(Strychnos umbellata)的ITS序列作比较。马钱及牛眼马钱在同一品种的样品之间的相似性介于99.0％至100.0％，但两者的相似性介于98.4％至99.3％，因此这两个品种不能以ITS序列区分。比较马钱，牛眼马钱及伞花马钱，在同一品种的样品之间的相似性高于97.9％，品种之间的相似性为85.8％到94.0％，因此，当样本的ITS序列跟马钱，华马钱或伞花马钱比较后，凡相似性高于97.9％的都鉴定为同一品种。
上述所测得的四个马钱品种，包括马钱(Strychnos nux-vomica)、牛眼马钱(Strychnos angustiflora)、华马钱(Strychnos cathayensis)及伞花马钱(Strychnos umbellata)的5S rDNA序列在同一品种的样品之间的相似性介于91.4％至99.2％，而种间5S rDNA spacer序列的相似性为42.4-85.5％。因此，当不知名样本的5S rDNA序列跟马钱、牛眼马钱、华马钱或伞花马钱比较后，凡相似性高于91.4％的都鉴定为同一品种。
四种鬼臼类药材桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)、六角莲(Dysosma pleiantha)、八角莲(Dysosma versipellis)及川八角莲(Dysosmaveitchii)的ITS序列作比较。在同一品种的样品之间的相似性为98.7％-99.8％，品种之间的相似性为91.5％到95.6％，因此，当样本的ITS序列跟 桃儿七、六角莲、八角莲及川八角莲比较后，凡相似性高于98.7％的都鉴定为同一品种。
两个桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)样品之间的5S rDNA序列相似性是95％，而桃儿七跟六角莲(Dysosmapleiantha)、八角莲(Dysosmaversipellis)及川八角莲(Dysosma veitchii)相似性介于88.1％-92.0％，因此当不知名样本的5S rDNA序列跟桃儿七比较后，凡相似性等于或大于95.0％的都鉴定为桃儿七，而非六角莲、八角莲或川八角莲。六角莲，八角莲及川八角莲在同一品种的样品之间的相似性介于93.7％-99.3％，而品种间的相似性为87.5％-96.1％，因此5S rDNA序列不能区分六角莲、八角莲及川八角莲。
此外，比较过鬼臼及容易混淆的威灵仙类药材与龙胆类药材的ITS及5S rDNA spacer序列。四种鬼臼类药材与威灵仙类药材山木通(Clematisfinetiana)、柱果铁线莲(Clematis uncinata)及威灵仙(Clematis chinensis)的ITS序列相似性介于51.9％-54.1％。四种鬼臼类药材与龙胆类药材条叶龙胆(Gentiana manshurica)、三花龙胆(Gentiana triflora)、龙胆(Gentiana scabra)、坚龙胆(Gentiana reigescens)及红花龙胆(Gentianarhodantha)的ITS序列相似性为49.9％-55.8％，而桃儿七、六角莲、八角莲及川八角莲在同一品种的样品之间的相似性为98.7％-99.8％，因此当不知名样品对比鬼臼的ITS序列，凡相似性低于98.7％均是非鬼臼。
四种鬼臼类药材与威灵仙类药材(山木通Clematis finetiana)、柱果铁线莲(Clematis uncinata)及威灵仙(Clematis chinensis)的5S rDNA spacer序列相似性介于27.6％-31.7％。四种鬼臼类药材与龙胆类药材条叶龙胆(Gentiana manshurica)、三花龙胆(Gentiana triflora)、龙胆(Gentianascabra)、坚龙胆(Gentiana reigescens)及红花龙胆(Gentiana rhodantha)的5S rDNA序列相似性为24.1％-42.0％。而桃儿七、六角莲、八角莲及川八角莲在同一品种的样品之间的相似性为93.7％-99.3％，因此，当不知名样品对比鬼臼的5S rDNA序列，凡相似性低于93.7％均是非鬼臼。
以下实施例仅用于举例说明本发明，而不应理解为以任何形式限制 本发明的范围。
实施例
实施例1：通过ITS或5S rDNA spacer序列鉴别不同来源的马钱品种
(1)DNA的提取
植物的DNA提取方法与Draper和Scott(Draper and Scott，1988)所述大致相同，简述如下：将牛眼马钱(Strychnos angustiflora)(Maqianzi-SA1，Maqianzi-SA2，Maqianzi-SA3，Maqianzi-SA5)，马钱(Strychnos nux-vomica)(Maqianzi-SN1，Maqianzi-SN2，Maqianzi-SN3，Maqianzi-SN4，Maqianzi-SN5，Maqianzi-SN6，Maqianzi-SN7，Maqianzi-SN9，Maqianzi-SN16)，伞花马钱(Strychnosumbellata)(Maqianzi-SU1，Maqianzi-SU2，Maqianzi-SU3，Maqianzi-SU4)及华马钱(Strychnos cathayensis)(Maqianzi-SC1，Maqianzi-SC2)用70％乙醇的蒸馏水溶液冲洗，然后，与液氮混合并研磨成粉末。将所得的粉末样品与6倍体积的CTAB提取缓冲液混匀，在56℃水浴中保温30分钟后，加入等量的氯仿-异戊醇(24：1)混合液抽提，离心，取上清液。向残余物中加入0.1体积的10％CTAB溶液，室温放置10分钟后再用氯仿-异戊醇萃取一次，离心，取上清液并与前次的上清液混合。向所得上清液中加入等量的CTAB沉淀缓冲液产生沉淀，室温放置1小时后以13000g离心15分钟。将DNA沉淀物用乙醇纯化后溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)中备用。
(2)PCR扩增反应
ITS区段的DNA由PCR扩增反应获得。反应所用的通用引物为ITS4和ITS5：
ITS4序列为：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
ITS5序列为：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’
5S rDNA区段的DNA由PCR扩增反应获得。反应所用的通用引物为5S2F和5S2R：
5S2F序列为：5’-GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’
5S2R序列为：5’-TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA-3’
反应溶液包括：10ng植物DNA，1XTag缓冲溶液(10mM Tris-HCl，pH8.3，0.001％明胶)，0.2mM dNTPs，1μM引物，以及1单位Taq DNA多聚酶(Promega，USA)。反应条件为：于94℃预处理5分钟，然后进行35个循环，循环条件是：94℃、1分钟；60℃、1分钟；72℃、2分钟；72℃、10分钟。
(3)克隆测序技术
将步骤(2)得到的PCR产物用DNA纯化试剂盒GENCLEAN III Kit(Bio101，USA)进行纯化。取出1μl(约50ng)纯化的PCR片段，用克隆试剂盒TA cloning Kit(pGEM-T Easy Vector Systems，Promega，USA)将该PCR片段克隆到TA cloning Kit所提供的T/A载体上，然后转化至E.coli细菌中，于摄氏37度培养16小时后，用质粒纯化试剂盒Rapid Plasmid MiniprepSystem(Marligen Bioscience，Germany)纯化质粒。测序通过反应试剂盒ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PEBiosystems，USA)和遗传分析仪Genetic analyzer(ABI Prism3100，Applied Biosystems，USA)进行。
(4)序列比对结果和结论
使用Bio-Edit序列分析软件(Tom Hall Isis Pharmaceuticals，Inc)，将上述所测得的四个马钱品种，包括马钱(Strychnos nux-vomica)、牛眼马钱(Strychnos angustiflora)、华马钱(Strychnos cathayensis)及伞花马钱(Strychnos umbellata)的ITS序列作比较(表一)。马钱及牛眼马钱在同一品种的样品之间的相似性介于99.0％至100.0％，但两者的相似性介于 98.4％至99.3％，因此这两个品种不能以ITS序列区分。比较马钱，牛眼马钱及伞花马钱，在同一品种的样品之间的相似性高于97.9％，品种之间的相似性为85.8％到94.0％，因此，当样本的ITS序列跟马钱，华马钱或伞花马钱比较后，凡相似性高于97.9％的都鉴定为同一品种。
上述所测得的四个马钱品种，包括马钱(Strychnos nux-vomica)、牛眼马钱(Strychnos angustiflora)、华马钱(Strychnos cathayensis)及伞花马钱(Strychnos umbellata)的5S rDNA序列在同一品种的样品之间的相似性介于91.4％至99.2％，而种间5S rDNA spacer序列的相似性为42.4％-85.5％。因此，当不知名样本的5S rDNA序列跟马钱、牛眼马钱、华马钱或伞花马钱比较后，凡相似性高于91.4％的都鉴定为同一品种(表二)。
实施例2：通过ITS或5S rDNA spacer序列鉴别不同的鬼臼品种
(1)DNA的提取
植物的DNA提取与实施例1中的方法相同，样本为六角莲(Dysosmapleianthus)(DP2，PD3，PD4，DV5，DV7，PD5，PD6)、川八角莲(Dysosmaveitchii)(PD1，PD2，DVR1，DV10)、八角莲(Dysosma versipellis)(DV6，SE1，SE4，DP3，SHDVS3)及桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)(SE2，SE3，SE5)。
(2)PCR扩增反应
反应的通用引物及方法与实施例1中的方法相同。
(3)克隆测序技术
方法与实施例1中的方法相同。
(4)序列比对结果和结论
使用Bio-Edit序列分析软件(Tom Hall Isis Pharmaceuticals，Inc)，将四种鬼臼类药材桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)、六角莲(Dysosma pleiantha)、八角莲(Dysosma versipellis)及川八角莲(Dysosma veitchii)的ITS序列作比较(表三)。在同一品种的样品之间的相似性为98.7％-99.8％，品种之间的相似性为91.5％到95.6％，因此，当样本的ITS序列跟桃儿七、六角莲、八角莲及川八角莲比较后，凡相似性高于98.7％的都鉴定为同一品种。
两个桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)样品之间的5S rDNA序列相似性是95％(表四)，而桃儿七跟六角莲(Dysosma pleiantha)、八角莲(Dysosma versipellis)及川八角莲(Dysosma veitchii)相似性介于88.1％-92.0％，因此当不知名样本的5S rDNA序列跟桃儿七比较后，凡相似性等于或大于95.0％的都鉴定为桃儿七，而非六角莲、八角莲或川八角莲。六角莲，八角莲及川八角莲在同一品种的样品之间的相似性介于93.7％-99.3％，而品种间的相似性为87.5％-96.1％，因此5S rDNA序列不能区分六角莲、八角莲及川八角莲。
实施例3：通过ITS序列鉴别鬼臼及其易混淆品种
(1)DNA的提取
植物的DNA提取与实施例1中的方法相同，样本为山木通(Clematisfinetiana)(CF4)、柱果铁线莲(Clematis uncinata)(CU1)、威灵仙(Clematischinensis)(CC5)、条叶龙胆(Gentiana manshurica)样品(GM1)、三花龙胆(Gentiana triflora)(GT1)、龙胆(Gentiana scabra)(GS6)、坚龙胆(Gentiana regescens)(GR1)及红花龙胆(Gentiana rhodantha)(GHH1)。
(2)PCR扩增反应
反应的通用引物及方法与实施例1中的方法相同。
(3)克隆测序技术
方法与实施例1中的方法相同。
(4)序列比对结果和结论
使用Bio-Edit序列分析软件(Tom Hall Isis Pharmaceuticals，Inc)，比较鬼臼及容易混淆的威灵仙类药材与龙胆类药材的ITS及5S rDNA spacer序列(表五)。四种鬼臼类药材与威灵仙类药材山木通(Clematis finetiana)、柱果铁线莲(Clematis uncinata)及威灵仙(Clematis chinensis)的ITS序列相似性介于51.9％-54.1％。四种鬼臼类药材与龙胆类药材条叶龙胆(Gentiana manshurica)、三花龙胆(Gentiana triflora)、龙胆(Gentianascabra)、坚龙胆(Gentiana reigescens)及红花龙胆(Gentiana rhodantha)的ITS序列相似性为49.9％-55.8％，而桃儿七、六角莲、八角莲及川八角莲在同一品种的样品之间的相似性为98.7％-99.8％，因此当不知名样品对比鬼臼的ITS序列，凡相似性低于98.7％均是非鬼臼。
四种鬼臼类药材与威灵仙类药材(山木通Clematis finetiana)、柱果铁线莲(Clematis uncinata)及威灵仙(Clematis chinensis)的5S rDNA spacer序列相似性介于27.6％-31.7％(表六)。四种鬼臼类药材与龙胆类药材条叶龙胆(Gentiana manshurica)、三花龙胆(Gentiana triflora)、龙胆(Gentianascabra)、坚龙胆(Gentiana reigescens)及红花龙胆(Gentianarhodantha)的5S rDNA序列相似性为24.1％-42.0％。而桃儿七、六角莲、八角莲及川八角莲在同一品种的样品之间的相似性为93.7％-99.3％，因此，当不知名样品对比鬼臼的5S rDNA序列，凡相似性低于93.7％均是非鬼臼。
因此，采用本发明提供的马钱及鬼臼的ITS及5S rDNA spacer的DNA序列及鉴定方法，通过其DNA序列的比较，使得对中药马钱及鬼臼的鉴定更加方便和可靠。
表一)马钱ITS序列相似性(百分比)
牛眼马钱 马钱 伞花马钱 华马钱
牛眼马钱 99.0-99.6 98.4-99.3 86.2-87.7 87.4-88.0
马钱 99.0-100.0 85.8-87.2 87.1-87.2
伞花马钱 97.9-99.5 93.6-94.0
华马钱
表二)马钱5S rDNA序列相似性(百分比)
牛眼马钱 马钱 伞花马钱 华马钱
牛眼马钱 93.5-98.5 80.7-85.5 45.3-47.7 43.6-45.0
马钱 91.4-99.2 44.4-51.5 42.4-47.2
伞花马钱 91.5-92.2 73.1-75.6
华马钱 96.2
表三)鬼臼ITS序列相似性(百分比)
六角莲 川八角莲 八角莲 桃儿七
六角莲 98.7-99.8 92.2-93.2 94.7-95.6 91.5-92.7
川八角莲 99.8 92.5-92.7 91.5-92.1
八角莲 91.6-91.9
桃儿七 99.2-99.5
表四)鬼臼5S rDNA序列相似性(百分比)
六角莲 川八角莲 八角莲 桃儿七
六角莲 93.7-98.9 89.5-96.1 87.5-93.7 88.1-91.9
川八角莲 93.7-98.5 87.5-92.0 88.8-92.0
八角莲 95.6-99.3 87.8-90.6
桃儿七 95.0
序列表
<110>香港赛马会中药研究院有限公司
<120>用于鉴定有毒中药材马钱子和鬼臼品种的多核苷酸及其使用方法
<130>HKWIL0598
<160>80
<170>PatentIn version3.3
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Claims (8)
1.一种鉴别马钱子品种的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从植物样品中提取DNA；
(b)以步骤(a)提取的DNA为模板，使用通用引物，进行聚合酶链反应，扩增ITS和/或5S rDNA区段；
(c)对步骤(b)中获得的PCR产物进行克隆测序；和
(d)将步骤(c)测得的DNA序列与选自SEQ ID NO：1-16所示的马钱子ITS序列和/或选自SEQ ID NO：18-34所示的马钱子5S rDNAspacer序列进行比较以确定相应的植物品种。
2.一种用于权利要求1所述方法鉴别马钱子品种的分离的多核苷酸序列，其具有选自SEQ ID NO：1-16和ID NO：18-34的序列。
3.权利要求2的分离的多核苷酸序列在马钱子中药材的质量控制，鉴定真伪中的应用。
4.权利要求2的分离的多核苷酸序列在马钱子中药材资源调查中鉴别马钱子品种的应用。
5.权利要求2的分离的多核苷酸序列在马钱子中药材的研究与开发中鉴别马钱子品种的应用。
6.权利要求2的分离的多核苷酸序列在马钱子原药材、饮片及粉末的鉴定中的应用。
7.权利要求2的分离的多核苷酸序列在马钱子中药材种植业中鉴别马钱子品种的应用。
8.权利要求2的分离的多核苷酸序列在马钱子中药材加工与制造业中鉴别马钱子品种的应用。
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| Publication number | Publication date |
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| HK1124887A1 (en) | 2009-07-24 |
| CN101245374A (zh) | 2008-08-20 |
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