CN101240270A

CN101240270A - 一种固定化有细胞的海藻酸盐胶囊及其制备方法

Info

Publication number: CN101240270A
Application number: CNA2007100637753A
Authority: CN
Inventors: 戴鸿君; 徐坚; 张小莉; 梁松苗; 郭兴林
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2027-02-09
Also published as: CN101240270B

Abstract

本发明公开了固定化有细胞的海藻酸盐胶囊及其制备方法。本发明固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，包括胶囊膜和液体腔，细胞分散于液体腔内；胶囊膜材料为海藻酸盐。本发明胶囊生物相容性好，膜厚适宜，且囊内为液态环境，极大改善了传统固定化技术制备的载体的传质问题，使培养过程中囊内所有细胞均能保持活性，从而充分保证了细胞的有效利用率。另外，较大尺寸的胶囊在大规模制备和回收方面具有明显的优势，具有很好的应用前景。

Description

一种固定化有细胞的海藻酸盐胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及胶囊及其制备方法，具体地说涉及一种固定化有细胞的海藻酸盐胶囊及其制备方法。

背景技术

胶囊化是利用天然或合成的高分子材料对固体或液体进行包封的过程。该技术的主要特点是改变活性物质的理化性质(相态，溶解度等)；保护物质免受环境条件的影响；屏蔽味道、颜色和气味；降低物质毒性；控制释放活性物质等。用胶囊包封的生物大分子、微生物或细胞被阻隔在胶囊膜内部，而营养物质及其它小分子物质可自由通过囊膜进行物质传递，从而达到催化、培养和免疫隔离的目的。生物胶囊化技术已在细胞和酶的固定化、微生物及动植物细胞的大规模培养、药物控制释放等领域得到广泛的应用[文献1：马小军.微胶囊与人工器官.北京：化学工业出版社，2002]。在众多的胶囊化技术中，海藻酸盐胶囊制备简便、易于放大、细胞活性保持好，因而被广泛应用[文献2：Xianzhen Li.The use of chitosan to increase the stability of calciumalginate beads with entrapped yeast cells.Biotechnol.Appl.Biochem.1996，23：269]。但目前，海藻酸盐固定技术还存在一些问题，如大粒径的固态环境影响溶质在胶囊中的扩散[文献3：陈西广等.一种制备甲壳素微球载体的方法.中国发明专利96115714]，需要特殊的胶囊膜材料(如聚赖氨酸、高度脱乙酰化的壳聚糖)，工艺复杂，制备成本较高[文献4：马小军等.一种固定化酵母细胞的微胶囊制备方法.中国发明专利200310118155.7]等。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化有细胞的海藻酸盐胶囊及其制备方法。

本发明所提供的固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，包括胶囊膜和液体腔，细胞分散于液体腔内；所述胶囊膜材料为海藻酸盐。

其中，本发明胶囊的粒径在0.5-5.0mm，大小可控，分布均匀；胶囊膜厚10-200μm，可根据不同培养条件来调控。液体腔内含有保存液，常用保存液选自去离子水，Tris缓冲液，醋酸缓冲液，可溶性钙盐或钡盐溶液，或者含有可溶性钙盐或钡盐的缓冲液；其pH在5.0-9.0。

本发明海藻酸盐胶囊可以适用于多种细胞的固定化，例如大肠杆菌，红球菌，酵母细胞(包括啤酒酵母、热带假丝酵母、毕氏酵母及基因工程酵母)，肝、肾上腺、甲状腺细胞。

本发明海藻酸盐胶囊的制备方法，包括如下步骤：

1)将均匀混合有细胞的囊材溶液滴入低温凝固浴中，形成小球；

2)将所得小球在搅拌下加入海藻酸盐溶液中进行交联反应，在小球表面形成一层胶囊膜；

3)将所得胶囊置于保存液中保存，使胶囊核融化并扩散至膜外，从而在胶囊膜内形成液体腔，得到所述海藻酸盐胶囊。

其中，步骤1)所述囊材溶液包括囊材和二价盐溶液，囊材选自明胶；所述二价盐选自可溶性钙盐和可溶性钡盐；所述囊材溶液中，囊材的质量百分浓度为3％-30％，二价盐浓度为0.025-0.3mol/L。低温凝固浴为羟基硅油浴、液体石蜡浴、植物油浴等，温度在15℃以下。

步骤2)海藻酸盐溶液的质量百分浓度为0.1％-3％。小球与海藻酸盐溶液交联反应时间为30-180秒。而且，为了增强胶囊膜的强度，步骤2)小球进行交联反应之后，还在可溶性钙(或钡)盐溶液中进行反应。

步骤3)保存液为去离子水，Tris缓冲液，醋酸缓冲液，可溶性钙盐或钡盐溶液，或者含有可溶性钙盐或钡盐的缓冲液；保存液的pH在5.0-9.0；保存温度在20-50℃。

本发明具有内部液态环境的海藻酸钙胶囊，用于细胞固定化。与传统的固定化技术相比，本发明首先制备出粒径在0.5-5.0mm范围内的带有细胞的凝胶小球，再在小球表面通过离子交联反应快速形成一层海藻酸盐胶囊膜，然后将所得的胶囊置于保存液中，恒温保存，使内部的凝胶融化并扩散至膜外，从而在囊内成液体环境，并使细胞分散于该液体环境中。

本发明的特点在于：(1)本发明所用的材料海藻酸盐、明胶、琼脂、卡拉胶等均为天然高分子，价格低，生物相容性好；(2)囊膜厚度适宜，且囊内为液体环境，有利于溶质的扩散与传递；(3)全生理条件下制备，无剪切和振荡，细胞活性100％保持。

本发明胶囊生物相容性好，膜厚适宜，且囊内为液态环境，极大改善了传统固定化技术制备的载体的传质问题，使培养过程中囊内所有细胞均能保持活性，从而充分保证了细胞的有效利用率。另外，较大尺寸的胶囊在大规模制备和回收方面具有明显的优势，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为制备固定化有细胞的海藻酸盐胶囊的过程图；

图2为固定化有酵母细胞的海藻酸钙胶囊的照片；

图3为固定化有酵母细胞的海藻酸钙胶囊培养照片。

图4为固定化有大肠杆菌的海藻酸钙胶囊培养照片

具体实施方式

制备本发明固定化有细胞的海藻酸盐胶囊的过程如图1所示：

第一步，先将细胞和囊材溶液混合均匀(混合温度要使囊材保持溶液状态，但又要在细胞的耐受温度之下，一般可控制在30-45℃)，然后，滴入低温凝固浴中，形成小球；其中，囊材溶液包括囊材和二价盐溶液，囊材选自明胶，其质量百分浓度为3％-30％；二价盐选自可溶性钙盐(如氯化钙、硝酸钙、醋酸钙等)和可溶性钡盐(如氯化钡、硝酸钡、醋酸钡等)，其浓度为0.025-0.3mol/L。低温凝固浴选用羟基硅油、液体石蜡、植物油等，温度在15℃以下。在制备小球的过程中，可控制小球的粒径0.5-5.0mm。

第二步，将所得小球在搅拌下加入海藻酸钠溶液中进行交联反应，在小球表面形成一层胶囊膜；其中，海藻酸钠质量百分浓度为0.1％-3％；小球与海藻酸钠溶液交联反应时间为30-180秒；成膜厚度为10-200μm，可根据不同培养条件来调控。

为了增强胶囊膜的强度，小球进行交联反应形成囊膜之后，还在可溶性钙(或钡)盐溶液中进行反应。

第三步，将所得胶囊置于保存液中保存，使胶囊核融化并扩散至膜外，从而在胶囊膜内形成液体腔，得到所述海藻酸盐胶囊。在制备完成后，海藻酸盐胶囊保存在保存液中，液体腔内的保存液与胶囊外的保存液成分保持一致。其中，常用保存液为去离子水或Tris缓冲液，醋酸缓冲液，可溶性钙(或钡)盐溶液，或含可溶性钙(或钡)盐的上述缓冲液，pH范围在5.0-9.0；保存温度在25-50℃。

通过如上过程，即得到本发明的固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，该胶囊包括胶囊膜1和液体腔3，细胞2分散于液体腔内。在本发明中，所选用的囊材材料在高温(50℃以上)溶解，并且在温度高于25℃时保持溶液状态，而在低温(15℃以下)凝固，因而可以先固定细胞，而后再溶解、液化，释放出细胞，从而使细胞分散于胶囊的液体腔内。本发明适用于多种细胞的固定化，如大肠杆菌、红球菌、酵母细胞(包括啤酒酵母、热带假丝酵母、毕氏酵母及基因工程酵母)和肝、肾上腺、甲状腺细胞等，应用广泛。

以下以具体的实施例来描述本发明。

实施例1、制备固定化有酵母细胞的海藻酸钙胶囊

将悬浮培养处于对数生长期的酵母菌离心收集菌体，在37℃下与明胶-氯化钙溶液(使混合后明胶浓度为15％(wt％)、氯化钙浓度为0.1mol/L)均匀混合，然后，滴入低温羟基硅油(5℃)中，并冷却十分钟，形成粒径为2.5-3.0mm明胶小球，然后在搅拌下将小球加入0.5％(wt％)海藻酸钠溶液中成膜反应90秒，然后用筛网滤出，搅拌下于0.1mol/L氯化钙溶液中继续反应10分钟，以增强胶囊膜的强度。最后筛网过滤，Tris缓冲液清洗3遍，于Tris缓冲液中37℃恒温处理，即制得海藻酸钙胶囊化的酵母菌(如图2)，膜厚100um。制备全过程均在生理条件下完成，酵母细胞存活率100％保持。

将配制的明胶-氯化钙溶液与酵母细胞充分接触30分钟后，稀释平板法测定其对酵母细胞活性的影响，结果表明，与对照组相比，活酵母细胞数未减少，证实明胶-氯化钙溶液对酵母细胞活性无影响。

将制备好的含有酵母细胞的海藻酸钙胶囊置于YPD液体培养基中，摇瓶培养(28℃，180rpm)，至48小时于显微镜下观察酵母菌的生长情况(取1ml的生理盐水将一个胶囊溶解后观察，放大倍数为400倍)，结果如图3A-图3C所示，图3A为培养前照片，图3B为YPD培养基培养48h照片，图3C为在Tris缓冲液保存48h照片。结果表明，酵母细胞在海藻酸胶囊中生长状况良好；而未培养的固定化酵母细胞没有增殖，但形态保持完好。

实施例2、制备固定化有大肠杆菌的海藻酸钙胶囊

将悬浮培养处于对数生长期的大肠杆菌(E.coli JM109(pKST11))离心收集菌体，在40℃下与明胶-氯化钙溶液(使混合后明胶浓度为25％(wt％)、氯化钙浓度为0.1mol/L)均匀混合，滴入低温羟基硅油(10℃)中，并冷却十分钟，形成粒径为3.5-4.0mm明胶小球，然后在搅拌下将小球加入1.5％(wt％)海藻酸钠溶液中成膜反应120秒，然后用筛网滤出，搅拌下于0.1mol/L氯化钙溶液中继续反应10分钟，以增强胶囊膜的强度。最后筛网过滤，Tris缓冲液清洗3遍，于Tris缓冲液中37℃恒温处理，即制得海藻酸钙胶囊化的大肠杆菌(如图4)，膜厚150um。

将制备好的含有酵母细胞的海藻酸钙胶囊置于LB液体培养基中，摇瓶培养(30℃，180rpm)，至24小时于显微镜下观察大肠杆菌的生长情况(取1ml的生理盐水将一个胶囊溶解后观察，放大倍数为1000倍)，结果如图4A-图4C所示，图4A为培养前照片，图4B为LB培养基培养24h照片，图4C为在Tris缓冲液保存24h照片。结果表明，大肠杆菌在海藻酸胶囊中生长状况良好；而未培养的固定化大肠杆菌没有增殖。

实施例3、制备固定化有酵母细胞的海藻酸盐胶囊

将悬浮培养处于对数生长期的酵母菌离心收集菌体，在37℃与明胶-氯化钡溶液(使混合后明胶浓度为5％(wt％)、氯化钡浓度为0.05mol/L)均匀混合，滴入低温液体石蜡(2℃)中，并冷却十分钟，形成粒径为1.0-1.5mm明胶小球，然后在搅拌下将小球加入0.5％(wt％)海藻酸钠溶液中成膜反应40秒，然后用筛网滤出，搅拌下于0.05mol/L氯化钡溶液中继续反应10分钟，以增强胶囊膜的强度。最后筛网过滤，醋酸缓冲液清洗3遍，于醋酸缓冲液中25℃恒温处理，即制得海藻酸钡胶囊化的酵母菌。

细胞培养实验证实，酵母细胞在海藻酸胶囊中保持有良好的活性，生长状况良好。

Claims

1. 一种固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，其特征在于：所述海藻酸盐胶囊包括胶囊膜和液体腔，细胞分散于液体腔内；所述胶囊膜材料为海藻酸盐。

2. 根据权利要求1所述的固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，其特征在于：所述胶囊的粒径在0.5-5.0mm；胶囊膜厚10-200μm。

3. 根据权利要求1所述的固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，其特征在于：所述液体腔内含有保存液，所述保存液选自去离子水，Tris缓冲液，醋酸缓冲液，可溶性钙盐或钡盐溶液，或者含有可溶性钙盐或钡盐的缓冲液；所述保存液的pH在5.0-9.0。

4. 根据权利要求1-3任一所述的固定化有细胞的海藻酸盐胶囊，其特征在于：所述细胞选自大肠杆菌，红球菌，酵母细胞，肝、肾上腺、甲状腺细胞。

5. 权利要求1所述固定化有细胞的海藻酸盐胶囊的制备方法，包括如下步骤：

2)将所得小球在搅拌下加入海藻酸钠溶液中进行交联反应，在小球表面形成一层胶囊膜；

6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述囊材溶液包括囊材和二价盐溶液，囊材选自明胶；所述二价盐选自可溶性钙盐和可溶性钡盐；所述囊材溶液中，囊材的质量百分浓度为3％-30％，二价盐浓度为0.025-0.3mol/L。

7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述的低温凝固浴为羟基硅油浴、液体石蜡浴或植物油浴，温度在15℃以下。

8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)海藻酸钠溶液的质量百分浓度为0.1％-3％。

9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的小球与海藻酸钠溶液交联反应时间为30-180秒。

10. 根据权利要求5-9任一所述的制备方法，其特征在于：步骤2)小球进行交联反应之后，还在可溶性钙盐或钡盐溶液中进行反应，以增强胶囊膜的强度。

11. 根据权利要求5-9任一所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述保存液选自去离子水，Tris缓冲液，醋酸缓冲液，可溶性钙盐或钡盐溶液，或者含有可溶性钙盐或钡盐的缓冲液；所述保存液的pH在5.0-9.0。

12. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤3)保存温度在25-50℃。