CN101235400B - 利用活性污泥生产聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于可降解生物材料领域，本发明公开了一种以活性污泥为原料利用基因工程菌生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括(1)活性污泥的水解酸化；(2)有机酸分离；(3)利用基因工程菌合成PHAs；(4)PHAs提取。本发明还公开了能以活性污泥为原料生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌以及构建方法。本发明方法利用污水处理过程中所产生的剩余活性污泥为原料，大大降低了PHAs的生产成本；其次所用基因工程菌生产效率高，能同时高效利用乙酸、丙酸、丁酸和乳酸合成羟基丁酸酯(PHB)和羟基戊醇(PHV)等；另外本发明所用活性污泥属于废物利用，减少了环境污染，具有明显的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于可降解材料生物工程领域，具体地说涉及一种以活性污泥水解酸化产物为原料利用基因工程菌生产聚羟基脂肪酸酯的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一类具有生物可降解性、生物相容性、压电性等许多优良性能的新型塑性聚酯，可作为化学合成塑料的理想替代品，在生物医学、制药、电子等众多领域具有广泛的应用前景。PHAs是微生物在营养不平衡条件下合成的胞内能量和碳源储藏性物质，广泛存在于细菌体内，其分子量多为50,000到1,000,000道尔顿(Da)，其单体皆为R构型。其结构通式如下所示：
其中x＝1，2，3等，n为100-30000。
目前生产PHA的主要方法是利用纯菌发酵，如美国Monsanto公司利用发酵方法生产PHBV，年产约1000t，此种方法存在的主要问题是价格昂贵，制约了大规模商业化应用；此外有利用驯化活性污泥为菌种，以外加纯碳源或污水为原料生产PHAs的方法，但存在驯化时间长(10多天)，碳源利用效率低，工艺条件难以控制、合成的PHAs质量不稳定、产量低等缺点，制约了这些方法的推广应用。因此降低生产成本、筛选或者构建合成PHA效率高的菌种成为解决问题的关键。
污水处理过程中所产生的活性污泥是污水处理系统中自然形成的微生物与有机物的聚集体，含有大量碳水化合物、脂类、蛋白质、维生素等有机物和不同种类的微生物，这些含碳物质经一定处理(如水解酸化)后，可以转化为丁酸、丙酸、乙酸等小分子物质，成为合成PHA的良好底物，并且使用乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等小分子脂肪酸的混合物可以得到3-羟基丁酸(HB)与3-羟基戊酸(HV)的共聚物，PHVB是目前市场上PHA生产中最主要的的产品之一。因此利用活性污泥作为生产PHA的廉价原料来源，不仅可以大大降低PHAs的生产成本，同时解决了剩余活性污泥造成的环境污染和占用耕地的问题。
目前已经发现有90多个种属的微生物具有合成PHA的功能，并且已经从40多株菌中克隆到了PHAs合成酶及其相关酶基因(应娇妍等.微生物学报，2007，47(4)：616～621)。PHA的种类以及合成途径的多样性是由不同菌种中调节PHA合成的相关酶基因的差异及底物的不同决定的。根据合成短、中链PHA的不同，以及来源菌株的不同，PHA合成相关酶系的家族组成和命名也有很大的不同。目前，已经发现短链PHA的合成途径有四条，中长链PHA的合成途径有两条(Laral等.Microbiology and Molecular biology reviews，Mar，1999，21～53)。其中有一条B一氧化途径是以脂肪酸为底物，通过酯酰辅酶A、酯酰辅酶A脱氢酶以及PHA合成酶的作用来合成PHA的。在大肠杆菌中，fadD基因编码了乙酰辅酶连接酶，参与催化B一氧化途径中脂肪酸转化为乙酰辅酶A的反应，fadE基因编码酯酰辅酶A脱氢酶，催化脂肪酸酯酰辅酶A脱氢生成烯酰辅酶A的反应。提高fadE基因的表达活性有助于提高PHA的合成效率(Si Jae Park等.Macromol，symp.2005，224，1-9)。
底物的种类和组成的不同也会影响PHAs的种类和产量。活性污泥经过水解酸化后可以产生丁酸、丙酸、乙酸以及乳酸等小分子有机酸。酸化条件直接影响所获得的小分子有机酸的组成，另一方面，细菌对不同有机酸的利用效率有很大的不同，并受有机酸组成的影响(严群等.化工学报，2003，54(11)：1580-1585)。因此，将fadD、fadE与高表达启动子联接构建高表达质粒，并转入合适的宿主中，就可以通过对外源功能基因的强化表达提高基因工程菌对小分子有机酸的利用效率以及PHA的合成效率。而且还能通过改变工程菌中不同单体的比例来改善PHA产品的品质。利用构建的具有高产、高转化率、合成产品质量稳定等优点的基因工程菌，可成为商品化的PHA生产有效途径。
目前，构建聚羟基脂肪酸酯工程菌的专利主要有：《一株用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用》(申请号：03146663.X)公开了一株具有以脂肪酸为底物合成PHA能力的微生物，是重组嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)WQ CGMCC № 0911；《一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组菌株及其构建方法与应用》(专利号：ZL03120769.3)公开了一种构建具有以脂肪酸为底物合成PHA能力的基因工程菌的方法；《表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用》(申请号：200710100153.3)公开了利用抑制或敲除产聚羟基脂肪酸酯细菌中的与脂肪酸β氧化代谢途径相关的一个或多个基因后得到的产聚羟基脂肪酸酯菌基因工程菌的方法；《一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌》(申请号：200710098516.4)公开了一种在缺氧条件下可发酵得到聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌；《一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌及其应用》(申请号：200510133634.5)公开了一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008，可用于工业化生产聚羟基脂肪酸酯；
提取聚羟基脂肪酸酯的方法的专利主要有：《从细菌菌体中分离提纯细菌胞内聚羟基脂肪酸酯的方法》(专利号：ZL98100266.8)、《从细菌发酵液中直接分离提纯胞内聚羟基脂肪酸酯的方法》(专利号：ZL02112208.3)、《一种提取微生物胞内聚羟基脂肪酸酯的方法》(申请号：200610072867.3)。
经检索，没有发现以活性污泥为原料利用基因工程菌生产聚羟基脂肪酸酯的报道。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种以活性污泥为原料利用基因工程菌生产聚羟基脂肪酸酯的方法。
本发明的另一目的是提供一种能以活性污泥为原料生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌。
本发明的还一目的是提供一种能以活性污泥为原料生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌的构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案如下：
利用活性污泥生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：
(1)活性污泥的水解酸化；
(2)有机酸分离；
(3)利用基因工程菌合成PHAs；
(4)PHAs提取。
上述方法步骤(1)中所述的活性污泥的水解酸化是指将活性污泥在40～60℃、pH为5.5～6.0条件下进行水解酸化8～18h；同时以50～150rpm转速进行搅拌；澄清4～8h，得沉淀残留物和上清液。
上述方法中所述的活性污泥是指污水处理过程中所产生的剩余活性污泥。
上述方法中所述的活性污泥的水解酸化可通过水解酸化系统进行，所述的水解酸化系统包括：酸化池、酸化池上有进水口和出水口、此外有加热器、温控器、搅拌器等(见图2)。
上述方法中所述的温度可通过置于酸化池中的加热器和温控器控制。
上述方法中所述的pH值可通过加水或者加入活性污泥来控制。
上述方法步骤(2)中所述的有机酸分离是指将步骤(1)所得水解酸化后产物沉淀澄清，取上清液，并置于发酵罐中。
上述方法中所述的水解酸化池残留物可以返回水解酸化池继续利用。
上述方法步骤(3)中所述的利用基因工程菌合成PHAs是指按照10～20％比例将具有PHA合成能力的基因工程菌加入到发酵罐中，并在25～40℃、pH为5.0～9.0条件下发酵培养80～120小时，得发酵液。在不添加任何外加营养物质的条件下，基因工程菌利用活性污泥水解酸化后的小分子有机酸合成PHAs。
上述方法步骤(4)中所述的PHA提取是指将所得发酵液在10000～15000rpm下离心1～5分钟，将沉淀物冷冻干燥，然后加入氯仿(每0.12g冻干细胞加入10～15ml氯仿)破壁，并在55～65℃下保温12～36h，过滤，所得滤液自然晾干，得本发明PHAs。
上述具有PHAs合成能力的基因工程菌是指能以活性污泥水解酸化产物为原料合成PHA的基因工程菌。
所述的基因工程菌是指含有T7启动子和fadD和fadE基因的基因工程菌。
上述能以活性污泥水解酸化产物为原料合成PHAs的基因工程菌可以按照本领域技术人员熟知的常规方法构建。
所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)、通过PCR从EcoliJM109(ATCC编号：53323)中扩增获得fadD和fadE基因片段；
(2)、用NdeI和BglII双酶切pRSET B质粒和fadD和fadE基因片段；
(3)、用T4连接酶将fadD和fadE和pRSET B质粒连接，得重组质粒；
(4)、将所得重组质粒转化宿主菌，即得本发明能以活性污泥为原料合成PHAs的基因工程菌。
上述构建方法步骤(1)中所述的PCR扩增所用的引物为：
上游引物：5’-TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA-3’
下游引物：5’-AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3’。
上述构建方法中所述的fadD和fadE基因为合成PHA的基因，这些基因来自大肠杆菌，可以EcoliJM109的DNA为模板进行PCR扩增获得。其中，fadD基因编码了乙酰辅酶连接酶，参与催化B一氧化途径中脂肪酸转化为乙酰辅酶A的反应，fadE基因编码酯酰辅酶A脱氢酶，催化脂肪酸酯酰辅酶A脱氢生成烯酰辅酶A的反应。
上述构建方法步骤(2)中所述的载体质粒pRSET B上带有IPTG诱导的高表达噬菌体T7启动子，在载体质粒上插入PHAs合成酶基因，如大肠杆菌JM109中的fadD和fadE，可使所获得的基因工程菌具有同时高效利用乙酸、丙酸、丁酸和乳酸合成羟基丁酸酯(PHB)和羟基戊酸酯(PHV)等共聚物的能力。
上述构建方法步骤(4)中质粒转化的方法是多种多样的，如化学转化法、电转化法、接合转化法以及冷冻转化法等。
上述构建方法步骤(4)中所述的宿主菌是指大肠杆菌Ecoli，如E.coliBL21(DE3)，或假单胞菌Pseudomonous sp.等。
上述基因工程菌的发酵培养方法可以采用分批培养的方式，
上述基因工程菌的发酵培养方法，包括如下步骤：
大肠杆菌：按照5～15％重量比将工程菌接种到LB培养基上，然后在30～40℃、转数为260～300rpm的摇床上培养8～16h，得培养液；再在4000～6000离心10～20min，接着用生理盐水洗涤3～5次，得基因工程菌液。
或假单胞菌：按照5～15％重量比将基因工程菌接种到LB培养基上，然后在25～35℃、转速180～240rpm的摇床上培养20～40h；再在4000～6000rpm下离心10～20min，接着用生理盐水洗涤3～5次，得基因工程菌液。
所述的LB培养基的组成成分及其重量比为：1L LB培养基中含有胰化蛋白胨8～10g，酵母提取物4～6g，NaCl 8～12g，琼脂粉12～18g和氨苄青霉素50ug。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明成本低，本发明以污水处理过程中所产生的剩余活性污泥为原料，属于废物利用，大大降低了PHAs的生产成本，使PHAs的大规模工业化生产成为可能。(2)本发明生产效率高。本发明利用高产、高转化基因工程菌，具有同时高效利用乙酸、丙酸、丁酸和乳酸合成羟基丁酸酯(PHB)和羟基戊醇(PHV)等的共聚物的优势。(3)本发明利用剩余活性污泥，实现污泥减量化和资源回收利用，减少了环境污染，具有明显的经济效益和社会效益。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
图2是活性污泥水解酸化池的结构示意图。
具体实施方式
实施例1、本发明宿主为大肠杆菌的基因工程菌的构建
宿主为大肠杆菌E coli，载体为质粒pRSET B-GFP，该质粒上有IPTG诱导的高表达噬菌体T7启动子。
(1)、含有fadD和fadE基因的DNA片段的PCR扩增
上游引物：5’-TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA-3’
下游引物：5’-AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3’
以上述引物自大肠杆菌JM109基因组中扩增fadD和fadE基因，具体技术方案为：在PCR体系中加入Ex Taq DNA聚合酶，93.8℃解链40秒，62℃退火1分钟，73℃延伸2分钟，如此进行30个循环。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大约为3012bp的DNA片段。
(2)、将fadD和fadE基因和载体质粒pRSET B同时进行NdeI/BglII双酶切，酶切后利用T4连接酶将fadD和fadE连接到质粒pRSET B中，得重组质粒。
(3)、将克隆有fadDfadE基因的质粒转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(ATCC编号：64771)，质粒转化为电转化法。将转化子涂布与LB固体培养平板上，在37℃、230rpm下培养12h；挑取平板上长出的单克隆，将其接种到LB液体培养基(LB培养基的组成成分及其比例为：1L培养基中含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g。培养基中需要加入氨苄青霉素50微克每升)中，在37℃、200rpm下摇床培养16h，提取质粒，并用NdeI/BglII双酶切鉴定，经测序表明正确，菌株命名为WSH-DE1010基因工程菌。
(4)发酵培养：将工程菌接种到LB培养基(LB培养基的组成成分及其比例为：1L培养基中含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g。培养基中需要加入氨苄青霉素50微克每升)上，100ml三角瓶中装20ml培养基或2000ml三角瓶中装1000ml培养基，37℃下摇床培养，摇床转数为280r/min，培养时间12h，4000rpm离心15min，用生理盐水洗涤3次后备用。
实施例2、本发明宿主为假单胞菌的基因工程菌的构建
(1)、含有fadD和fadE基因的DNA片段的PCR扩增
上游引物：5’-TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA-3’
下游引物：5’-AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3’
用上述引物自大肠杆菌JM109基因组中扩增fadD和fadE基因，具体技术方案为：在PCR体系中加入Ex Taq DNA聚合酶，93.8℃解链40秒，62℃退火1分钟，73℃延伸2分钟，如此进行30个循环。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大约为3012bp的DNA片段。
(2)、将fadD和fadE基因和载体质粒pRSET B同时进行NdeI/BglII双酶切，酶切后利用T4连接酶将fadDfadE连接到质粒pRSET B中，得重组质粒。
(3)、利用电转化法将重组质粒转入到假单胞菌Pseudomonous sp.，将转化子涂布与LB固体培养基平板上，在37℃、200rpm下培养16h；挑取平板上长出的单克隆，将其接种到LB液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养16h，提取质粒，并用NdeI/BglII双酶切鉴定，经测序表明正确，菌株命名为WSH-DE1110基因工程菌。
(4)该基因工程菌的发酵培养：将10％该基因工程菌接种到100ml LB培养基(LB培养基的组成成分为：1L培养基中含有：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，并且需加入氨苄青霉素50微克)中，在转速200r/min、温度30℃条件下培养30h；然后在4000rpm离心15min，用生理盐水洗涤3次，备用。
实施例3、活性污泥的水解酸化
按照图2所示制造水解酸化池，水解酸化池壁有进水孔、出水孔，池顶部有排气孔和温度计孔，加热器，并装有搅拌装置。
将30L活性污泥(取自北京清河污水处理厂，污泥浓度(SS)约为20g/L(98％含水率)，其中VSS占70％，约14g/L)置于水解酸化池，水解酸化池内温度控制在50℃，水力停留时间为8-18h，pH值控制在5.5～6.0之间(pH值通过调节污泥投配量和水力停留时间来调节)。经水解酸化后，约40％的VSS转化为有机酸，也就是5.5/L有机酸。出水的有机酸浓度大约在1500mg/L，实现污泥减量约为55％。沉淀澄清，得上清液和沉淀残留物，上清液即为活性污泥水解酸化所得的有机酸溶液。
实施例4、基因工程菌(以大肠杆菌为宿主菌)利用剩余活性污泥水解酸化产物生产PHAs
在发酵培养罐中加入实施例1制备的WSH-DE1010基因工程菌液0.8升，然后瞬间加入8升实施例3制备所得上清液，并在温度为37℃、pH为6.0条件下进行发酵培养60小时，按照文献(Ouyang等.Biosci.2007，7，227-233)中记载的方法检测PHA含量和菌体细胞干重，结果PHAs的积累率占细胞干重的65％。
实施例5、基因工程菌(以假单胞菌为宿主菌)利用剩余活性污泥水解酸化产物生产PHAs
在发酵培养罐中加入0.8升实施例2所制备的WSH-DE1110基因工程菌液，然后瞬间加入8升实施例3所制备的上清液，然后在温度为30℃、pH为6.2的条件下进行发酵培养72小时，得发酵液。检测(检测方法同实施例4所引用方法)结果表明PHAs的积累率占细胞干重的60％。
实施例6、PHAs的提取试验
取实施例4中所得发酵液100毫升，然后在10000rpm下离心1分钟，将其沉淀物冷冻干燥，再将冻干的菌体加入氯仿(每0.12g干细胞加入10毫升氯仿)，然后在60℃下保温24小时，过滤后，蒸去氯仿，称重，获得0.65gPHAs。
Claims (5)
1.利用活性污泥生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：
(1)活性污泥的水解酸化；所述的活性污泥的水解酸化是指将活性污泥在40～60℃、pH为5.5～6.0条件下进行水解酸化8～18h；同时以50～150rpm转速进行搅拌；澄清4～8h，得沉淀残留物和上清液；
(2)有机酸分离；取步骤(1)所得水解酸化后产物沉淀澄清，取上清液，并置于发酵罐中；
(3)按照10～20％比例将具有聚羟基脂肪酸酯合成能力的基因工程菌加入到发酵罐中，并在25～40℃、pH为5.0～9.0条件下发酵培养80～120小时，得发酵液；所述的基因工程菌含有T7启动子和fadD和fadE基因；
(4)聚羟基脂肪酸酯提取。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤(4)中所述的聚羟基脂肪酸酯提取是指将所得发酵液在10000～15000rpm下离心1～5分钟，将沉淀物冷冻干燥，然后加入氯仿，并在55～65℃下保温12～36h，过滤，所得滤液自然晾干，得聚羟基脂肪酸酯。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)、通过PCR从EcoliJM109中扩增获得fadD和fadE基因片段；
(2)、用NdeI和BglII双酶切pRSET B质粒和fadD和fadE基因片段；
(3)、用T4连接酶将fadD和fadE和pRSET B质粒连接，得重组质粒；
(4)、将所得重组质粒转化宿主菌，即得能以活性污泥为原料合成聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR扩增所用的引物为：
上游引物：5’-TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA-3’
下游引物：5’-AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3’。
5.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于其步骤(4)中所述的宿主菌是指大肠杆菌(E coli)或假单胞菌(Pseudomonous sp.)。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |