CN101234909A - 水泥基材料微生物覆膜防护剂、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂，其特征在于防护剂由可合成矿物的微生物菌液和凝固剂组成，其中微生物菌液和凝固剂的体积比为1～2∶1。本发明充分利用自然界微生物资源，通过生物的矿化作用，在试件表面原位矿化沉积出一层致密的碳酸钙层，不仅资源丰富，而且环境清洁，成本低廉，工艺简单。碳酸钙属于无机材料，具有较好的耐候性，与基材有良好的相容性，能自动平衡基材内部各种应力(温度应力、结晶应力等)，并且防护材料失效后对基材造成的影响较小。

Description

水泥基材料微生物覆膜防护剂、其制备方法及其应用

一、技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种水泥基材料微生物覆膜防护剂、其制备方法及其应用。

二、背景技术

现有技术：水泥基材料往往由于其服役环境中各种侵蚀性介质的存在，在材料制备过程以及服役期间，由于荷载及外界因素的共同作用下，其表面容易产生疏松、剥落等问题，导致水泥基材料表面性能逐渐下降。这些问题若不能及时得以修复，外界水和侵蚀性介质不断从材料表面渗入，最终将引起混凝土耐久性能的加速劣化。混凝土表面与内部缺陷修复已成为一个重要的独立行业，许多混凝土表面防护涂料和裂缝修补材料不断问世，如环氧类树脂、水泥基渗透结晶型材料、聚合物砂浆、以及高分子灌浆材料等。这些材料在混凝土缺陷修复中发挥了重要作用，但是如何解决这些修复防护有机材料与水泥基材料的相容性，进一步提高其抗老化性能和耐久性能，增强其环境友好性，一直是众多研究者们致力突破的研究方向。

三、发明内容

技术问题：本发明针对上述技术空白，提供一种水泥基材料微生物覆膜防护剂、其制备方法及其应用。该技术方案选用了一种具有碳酸盐矿化特性的菌株巴氏芽孢杆菌Bacillus pasteurii，通过琼脂固载微生物的覆膜工艺，利用菌株的酶化作用在水泥石表面矿化沉积碳酸钙层，对水泥基材料表面进行覆膜防护。

技术方案：一种水泥基材料微生物覆膜防护剂，防护剂由可合成矿物的微生物菌液和凝固剂组成，其中微生物菌液和凝固剂的体积比为1～2∶1。微生物菌液为巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii，菌液浓度为4×10⁹～4×10¹¹cell/mL。凝固剂为尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂的混合溶液，其中尿素浓度为3～6mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为3～6mol/L，每升混合液中含1.5～2g琼脂粉。一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的制备方法，制备步骤为：将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，每升培养液含有蛋白胨4～6g、牛肉膏2～4g及尿素20～60g，在25～37℃下进行振荡培养，16～24小时后取出，5000～8000rpm离心5～8min，去除离心上清液后，用培养液收集菌株细胞，将收集得到的菌株细胞浓度控制在4×10⁹～4×10¹¹cell/mL范围内；配制尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂粉混合溶液，尿素浓度为3～6mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为3～6mol/L，再在每升混合液中添加1.5～2g琼脂粉，混合后加热至90～95℃，待琼脂粉完全溶解后置于室温冷却至45～50℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1～2的体积比搅拌混合。一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的应用，微生物菌液和凝固剂按照1∶1～2的体积比搅拌混合后，在2min内迅速涂刷于水泥石试件表面，6h后将微生物菌液再涂刷一遍于水泥石试件表面，置于室温养护。

采用琼脂固载涂抹于试件表面，通过菌株在其生长繁殖过程中产生的脲酶，不断分解微环境中的尿素，形成CO₃ ^2-，同时菌体细胞膜界面处带负电荷的SM(水可溶有机质)不断螯合环境中的Ca²⁺，诱导出局部的晶体阴离子(CO₃ ^2-)浓度进一步增大，从而吸引更多的Ca²⁺，直到晶体前驱物浓度增大到利于核化，不断缓慢矿化沉积出CaCO₃颗粒，附着于混凝土表面，从而达到表面防护的作用，整个反应如式(1)～式(3)所示。

(NH₂)₂CO+2H₂O＝CO₃ ^2-+2NH₄ ⁺        (1)

Cell+Ca²⁺＝Cell-Ca²⁺              (2)

Cell-Ca²⁺+CO₃ ^2-＝Cell-CaCO₃       (3)

琼脂是微生物固体培养基和半固体培养基中最常用的性能优良的凝固剂，其最大的特点就是凝胶化温度远低于凝胶融化温度，因此本发明利用琼脂作为菌株的载体，加热熔化为液态后，迅速涂刷于试件表面，将菌株和营养物质牢固固载于水泥石表面，给菌株的生长繁殖提供一个适宜的微环境，在水泥石表面原位矿化沉积出碳酸钙，使原地涂刷覆膜成为可能，有效增强了工程的可操作性。7天后水泥石试件表面呈现明显碳酸钙覆膜防护层，与基材表面结合紧密。通过测定水泥石试件毛细吸水系数发现，由于表层连续致密碳酸钙层的紧密附着，水泥石试件毛细吸水系数明显降低，覆膜后从原先的1688g/(m²·h^1/2)降至175g/(m²·h^1/2)范围内，降低幅度高达90％，防护效果显著。

有益效果：本发明充分利用自然界微生物资源，通过生物的矿化作用，在试件表面原位矿化沉积出一层致密的碳酸钙层，不仅资源丰富，而且环境清洁，成本低廉，工艺简单。碳酸钙属于无机材料，具有较好的耐候性，与基材有良好的相容性，能自动平衡基材内部各种应力(温度应力、结晶应力等)，并且防护材料失效后对基材造成的影响较小。同时，由于所得碳酸钙层是在有机质调控下生成，比一般化学法制得的碳酸钙具有更优良的性能，对基材起到有效的保护。本发明通过采用琼脂固载菌株和营养物质，涂刷于试件表面使其附着生长，不仅简化了工艺操作，而且同时优化微环境，保护胞内酶活性，使得碳酸钙能在较长时间内在试件表面与有机质和残余载体交联缓慢结晶生长，其与基材结合更为紧密，覆膜防护效果显著。

四、附图说明

图1是毛细吸水系数测定试验装置示意图，A处高度为10±1mm。

图2是琼脂固载菌株涂刷覆膜工艺示意图，B为浓缩菌液层，C为尿素、Ca(NO3)2、琼脂、菌株混合液层。

图3是水泥石表面覆膜白色沉淀物XRD图谱，证实矿化沉积产物主要为方解石。

图4是金相显微镜下观测到的试件覆膜厚度：(a)菌液浓度4×10¹⁰cell/mL(b)菌液浓度4×10⁹cell/mL。由图中可以看出，当采用4×10⁹cell/mL的菌液浓度涂抹，矿化形成的碳酸钙覆膜层相对较薄，厚度大约为30μm～45μm左右，而采用4×10¹⁰cell/mL的菌液浓度涂抹，矿化形成的碳酸钙覆膜层相对较厚，厚度大约为100μm～120μm左右，覆膜防护效果更好。

图5是电子扫描电镜下观察到的琼脂固载微生物沉积出的碳酸钙膜：(a)菌液浓度4×10¹⁰cell/mL(b)菌液浓度4×10⁹cell/mL。由图中可以看出，菌株涂抹浓度由4×10⁹cell/mL提高到4×10¹⁰cell/mL，所形成的碳酸钙层连续性更好，平整度更高，更有利于材料的表面防护。

图6是琼脂固载微生物覆膜后水泥石试件的毛细吸水系数计算图，用以表征覆膜防护效果。I：菌株浓度4×10¹⁰cell/mL；II：菌株浓度4×10⁹cell/mL，由于试件表面单位吸水量和吸水时间的二分之一次方线性相关，因此试件的毛细吸水系数可由两者的线性相关斜率计算得出。通过实验与绘图计算得出，试件覆膜前毛细吸水系数为1688g/(m²·h^1/2)，当采用4×10¹⁰cell/mL的菌液浓度涂抹覆膜防护后吸水系数可降低至175g/(m²·h^1/2)，降低幅度近90％，覆膜防护效果显著；而采用4×10¹⁰cell/mL的菌液浓度涂抹覆膜防护后吸水系数可降低至399g/(m²·h^1/2)，覆膜防护效果略逊于前者。

五、具体实施方式

采用普通硅酸盐水泥PO32.5，水灰比0.45，成型水泥净浆，试件尺寸30mm×30mm×30mm，室温养护7天后待覆膜试验。将菌株巴氏芽胞杆菌Bacilluspasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，其成分如表1所示，在25～37℃下进行振荡培养，16～24小时后取出，5000～8000rpm离心5～8min，去除上清液，用培养液收集菌株细胞，利用紫外-可见光分光光度计测定浓缩菌液透光度OD值，根据OD值与菌液浓度的线性标定曲线将收集得到的菌株细胞浓度分别控制为4×10⁹cell/mL、4×10¹⁰cell/mL。然后配制尿素与Ca(NO₃)₂混合溶液，浓度为5mol/L，每升混合液中添加2g琼脂粉，混合后加热至90℃，待琼脂完全溶解后置于室温冷却至50℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1的体积比搅拌混合，在2min内迅速涂刷于尺寸30mm×30mm×30mm水泥石试件表面，6h后将离心获取的浓缩菌液再涂刷一遍于水泥石试件表面，置于室温养护，工艺操作如图2所示。7d后水泥石试件表面呈现明显碳酸钙覆膜防护层，与基材表面结合紧密。

                     表1培养基成分

营养物质	质量(g)	主要作用
			蛋白胨	5.0	提供氮源、碳源(能源)、生长因子
牛肉膏	3.0	提供氮源、碳源(能源)、无机盐、生长因子
			尿素	20.0	菌株酶化反应参与底物
蒸馏水	1000.0	提供水分

覆膜防护效果主要通过测定水泥石试件表面毛细吸水系数表征。在覆膜前后分别将水泥石试件置于烘箱中70℃烘干，直至其24h内质量损失率低于0.1％为止，取出，称重后将其4个侧面用石蜡密封，以确保水泥石在毛细吸水过程为一维吸水。在平底容器中放入支架，将水泥石试件覆膜面朝下置于支架上，往容器中缓慢注入水，直至液面高出试块底面(10±1)mm，如图1所示，待不同时间间隔取出，迅速擦干试件表面水分，称重，记录其质量变化情况，试件单位吸水量可如式(4)计算表征，因此试件的毛细吸水系数可因其线性相关而计算斜率得出。

$\frac{Q}{A}=k\sqrt{t}---\left(4\right)$

式中，Q——试件吸水量，g；

A——试件吸水表面积，m²；

t——试件吸水时间，h；

k——试件毛细吸水系数，g/(m²·h^1/2)

实施例1

将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，其成分如表1所示，在25～37℃下进行振荡培养，16～24小时后取出，5000～8000rpm离心5～8min，去除上清液，用培养液收集菌株细胞，利用紫外-可见光分光光度计测定浓缩菌液透光度OD值，根据OD值与菌液浓度的线性标定曲线将收集得到的菌株细胞浓度控制为4×10¹⁰cell/mL。然后配制尿素与Ca(NO₃)₂混合溶液，浓度为5mol/L，每升混合液中添加2g琼脂粉，混合后加热至90℃，待琼脂完全溶解后置于室温冷却至50℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1的体积比搅拌混合，在2min内迅速涂刷于尺寸30mm×30mm×30mm水泥石试件表面，6h后将离心获取的浓缩菌液再涂刷一遍于水泥石试件表面，置于室温养护，工艺操作如图2所示。7d后水泥石试件表面出现明显连续的白色沉积附着层，与水泥石表面结合紧密，取样经XRD分析证实为方解石，如图3所示。金相显微镜下观测，其覆膜厚度相对大约为100μm～120μm左右，如图4(a)所示。同时，电子扫描电镜下观测发现，由于采用琼脂作为载体，Ca²⁺源和菌株均固载于多糖凝胶体系中，体系黏度较高，碳酸钙晶体的结晶生长受到多向抑制，结晶成长不完全，多呈无定形状态，与菌株细胞分泌出的水可溶性有机质和残余载体紧密胶粘，平整度与致密度较高，如图5(a)所示。试件覆膜后毛细吸水系数由覆膜前的1688g/(m²·h^1/2)降低至175g/(m²·h^1/2)，降低幅度近90％，如图6所示，覆膜防护效果显著。

实施例2

将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，其成分如表1所示，在25～37℃下进行振荡培养，16～24小时后取出，5000～8000rpm离心5～8min，去除上清液，用培养液收集菌株细胞，利用紫外-可见光分光光度计测定浓缩菌液透光度OD值，根据OD值与菌液浓度的线性标定曲线将收集得到的菌株细胞浓度控制为4×10⁹cell/mL。然后配制尿素与Ca(NO₃)₂混合溶液，浓度为5mol/L，每升混合液中添加2g琼脂粉，混合后加热至90℃，待琼脂完全溶解后置于室温冷却至50℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1的体积比搅拌混合，在2min内迅速涂刷于尺寸30mm×30mm×30mm水泥石试件表面，6h后将离心获取的浓缩菌液再涂刷一遍于水泥石试件表面，置于室温养护，工艺操作如图2所示。7d后水泥石试件表面亦出现明显连续的白色沉积附着层，与水泥石表面结合紧密，但是其覆膜厚度相对较薄，大约为30μm～45μm左右，如图4(b)所示。电子扫描电镜下观察覆膜层表面连续性和平整度稍差，如图5(b)所示。试件覆膜后毛细吸水系数由覆膜前的1688g/(m²·h^1/2)降低至399g/(m²·h^1/2)，如图6所示，覆膜防护效果略逊于采用菌株细胞浓度为4×10¹⁰cell/mL的覆膜实验。

实施例3

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂，防护剂由可合成矿物的微生物菌液和凝固剂组成，其中微生物菌液和凝固剂的体积比为1∶1。微生物菌液为巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii，菌液浓度为4×10⁹cell/mL。凝固剂为尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂的混合溶液，其中尿素浓度为3mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为3mol/L，每升混合液中含1.5g琼脂粉。

实施例4

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂，防护剂由可合成矿物的微生物菌液和凝固剂组成，其中微生物菌液和凝固剂的体积比为1.5∶1。微生物菌液为巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii，菌液浓度为4×10¹⁰cell/mL。凝固剂为尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂的混合溶液，其中尿素浓度为5mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为5mol/L，每升混合液中含1.8g琼脂粉。

实施例5

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂，防护剂由可合成矿物的微生物菌液和凝固剂组成，其中微生物菌液和凝固剂的体积比为2∶1。微生物菌液为巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii，菌液浓度为4×10¹¹cell/mL。凝固剂为尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂的混合溶液，其中尿素浓度为6mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为6mol/L，每升混合液中含2g琼脂粉。

实施例6

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的制备方法，其特征在于制备步骤为：将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，每升培养液含有蛋白胨4g、牛肉膏2g及尿素20g，在25℃下进行振荡培养，16小时后取出，5000rpm离心5min，去除离心上清液后，用培养液收集菌株细胞，将收集得到的菌株细胞浓度控制在4×10⁹cell/mL范围内；配制尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂粉混合溶液，尿素浓度为3mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为3mol/L，再在每升混合液中添加1.5g琼脂粉，混合后加热至90℃，待琼脂粉完全溶解后置于室温冷却至45℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1的体积比搅拌混合，得到水泥基材料微生物覆膜防护剂。

实施例7

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的制备方法，其特征在于制备步骤为：将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，每升培养液含有蛋白胨5g、牛肉膏3g及尿素40g，在30℃下进行振荡培养，18小时后取出，7000rpm离心6min，去除离心上清液后，用培养液收集菌株细胞，将收集得到的菌株细胞浓度控制在4×10¹⁰cell/mL范围内；配制尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂粉混合溶液，尿素浓度为5mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为5mol/L，再在每升混合液中添加1.8g琼脂粉，混合后加热至92℃，待琼脂粉完全溶解后置于室温冷却至48℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1.5的体积比搅拌混合，得到水泥基材料微生物覆膜防护剂。

实施例8

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的制备方法，其特征在于制备步骤为：将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，每升培养液含有蛋白胨6g、牛肉膏4g及尿素60g，在37℃下进行振荡培养，24小时后取出，8000rpm离心8min，去除离心上清液后，用培养液收集菌株细胞，将收集得到的菌株细胞浓度控制在4×10¹¹cell/mL范围内；配制尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂粉混合溶液，尿素浓度为6mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为6mol/L，再在每升混合液中添加2g琼脂粉，混合后加热至95℃，待琼脂粉完全溶解后置于室温冷却至50℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶2的体积比搅拌混合，得到水泥基材料微生物覆膜防护剂。

实施例9

一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的应用，其特征在于微生物菌液和凝固剂按照1∶1～2的体积比搅拌混合后，在2min内迅速涂刷于水泥石试件表面，6h后将微生物菌液再涂刷一遍于水泥石试件表面，置于室温养护。

Claims (5)

1.一种水泥基材料微生物覆膜防护剂，其特征在于防护剂由可合成矿物的微生物菌液和凝固剂组成，其中微生物菌液和凝固剂的体积比为1～2∶1。

2.根据权利要求1所述的水泥基材料微生物覆膜防护剂，其特征在于所述微生物菌液为巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii，菌液浓度为4×10⁹～4×10¹¹cell/mL。

3.根据权利要求1所述的水泥基材料微生物覆膜防护剂，其特征在于所述凝固剂为尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂的混合溶液，其中尿素浓度为3～6mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为3～6mol/L，每升混合液中含1.5～2g琼脂粉。

4.一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的制备方法，其特征在于制备步骤为：将菌株巴氏芽胞杆菌Bacillus pasteurii接种至装有含尿素底物的培养液中，每升培养液含有蛋白胨4～6g、牛肉膏2～4g及尿素20～60g，在25～37℃下进行振荡培养，16～24小时后取出，5000～8000rpm离心5～8min，去除离心上清液后，用培养液收集菌株细胞，将收集得到的菌株细胞浓度控制在4×10⁹～4×10¹¹cell/mL范围内；配制尿素、Ca(NO₃)₂和琼脂粉混合溶液，尿素浓度为3～6mol/L，Ca(NO₃)₂浓度为3～6mol/L，再在每升混合液中添加1.5～2g琼脂粉，混合后加热至90～95℃，待琼脂粉完全溶解后置于室温冷却至45～50℃，再与离心收集到的浓缩菌液按照1∶1～2的体积比搅拌混合，得到水泥基材料微生物覆膜防护剂。

5.一种水泥基材料微生物覆膜防护剂的应用，其特征在于微生物菌液和凝固剂按照1∶1～2的体积比搅拌混合后，在2min内迅速涂刷于水泥石试件表面，6h后将微生物菌液再涂刷一遍于水泥石试件表面，置于室温养护。

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