CN101234100A - 萘醌类化合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供萘醌类化合物在制备治疗多药耐药肿瘤疾病药物中的应用。所用的萘醌类化合物是根据现有技术从植物紫草中提取或化学合成，其有效成分包含紫草素的对映体异紫草素以及它们的衍生物。该萘醌类化合物对多药耐药肿瘤细胞的作用不受P－gp，MRP1，BCRP等肿瘤耐药蛋白以及Bcl－2、Bcl－XL抗凋亡蛋白高表达的影响，而且对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于目前常用的有代表性的抗肿瘤药物，对多药耐药细胞的杀伤能力与其亲本药敏细胞基本一致，具有较低的毒性，因此具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属中药有效成分的用途，主要涉及萘醌类化合物在制备抗多药耐药肿瘤作用药物中的应用。
背景技术
紫草在我国大部分省区均有分布，它有消炎、收敛和解热作用，药用其根，已应用于临床，疗效确切。紫草最初记载于《神农本草经》，为防治麻疹的中药。而紫草素则是抗炎症的主要成分。紫草富含紫草素及其衍生物，其含量占3～6.5％，颜色深红，化学结构为萘醌类，在生物体内的氧化还原反应中能传递介子。具有止血、抗炎、抗菌、抗病毒及抗癌的药理活性。紫草的多种成分及其结构决定了其功能的广谱性和用途的多样化，可成为多种行业天然系列产品的中间体原料。
紫草虽然被报道具有抗肿瘤的作用，然而，并没有报道说明紫草具有治疗耐药肿瘤的功能。本发明说明紫草所含的萘醌类化合物具有独特的治疗多药耐药耐药肿瘤的功能。
多药耐药是指肿瘤细胞对不同结构和作用机理的药物产生交叉耐受性，肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药是成为化疗成功的障碍。据不完全统计，90％以上的患者死因与多药耐药(MDR)有关。
多药耐药的原因有很多，例如：
1.MDR1基因及其编码产物P-糖蛋白(P-gp)过度表达
1976年juliano[14]用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其对秋水仙碱耐药，首先揭示了MDR与细胞内药物浓度降低有关，并证实MDR细胞内存在一种能量依赖性膜转运蛋白，其相对分子质量为(1.5-1.8)×108，它由Mdr-1基因编码。人类Mdr-1基因位于第7对染色体，在人类正常组织中有不同程度表达。其中在肺，胃肠中有中等程度的表达。P-gp作为一种ATP酶活性的跨膜泵或“换位酶”，将摄入细胞内的药物泵出，促使其外流而维持细胞内化疗药物的低浓度水平。因此P-gp的过度表达与肿瘤细胞的固有耐药性有关。
此外，进一步的研究发现，P-gp在细胞凋亡中可能发挥重要的调控作用。报告抑制caspase活化，改变细胞内PH，抑制质膜去极化和K+外流，减少神经酰胺生成等等，造成细胞的调亡耐受，从而表现出耐药。
2.多药耐药相关蛋白(MRP)过度表达
MRP是于1992年由Cole等人在用对阿霉素选择耐药的肺癌细胞株H69AR中发现的第二个与多药耐药有关的ABC转运蛋白。它是一个分子量为190kDa，包含1531个氨基酸残基的膜蛋白，与Pgp仅有15％的同源性。后来又有八个MRP同源蛋白报道，分别命名为MRP 2～9，而最早发现的则称为MRP1。这些MRP蛋白均属于ABC家族中的C亚族，其中MRP1～6与多药耐药有过关，其它几个蛋白的功能至今还不明确。
在MRP家族中MRP1是研究的最多的一种，编码该蛋白的MRP1基因位于染色体的16p13.1。MRP1的功能和作用方式同PgP相似，也是作为一种ATP能量依赖泵，通过外排降低药物在胞内的积聚浓度来达到耐药效果。不同的是它的功能的发挥必须借助于胞内的谷胱甘肽(GSH)，是一种GSH结合物转运蛋白(即所谓的GS-X泵)。
与PgP的主要底物是疏水阳离子不同，MRP1的底物主要的是有机阴离子，并且主要以GSH、葡糖醛酰胺以及硫酸盐结合物的形式转运。但MRP1转运的底物也有许多是与PgP重叠的，但两者也有一些不同点，如MRP1表达的耐药细胞与PgP表达的相比，它对紫杉醇基本上不产生交叉耐药。
3.乳腺癌耐药蛋白(BCRP)过度表达
1990年Chen等用阿霉素(adriamycin，Adr)加维拉帕米(verapamil，Vp)从人乳腺癌细胞株MCF-7诱导得到一株MDR细胞MCF-7/AdrVp。该细胞株对抗肿瘤药物均能产生交叉耐药，后证实MCF-7/AdrVp细胞株无P-gp、MRP的过度表达。1998年Doyle等用RNA指纹分布技术研究发现在乳腺癌耐药细胞MCF-7/AdrVp中有一比亲本细胞MCF-7过度表达的大小为2.4kb mRNA分子，该mRNA编码一个由663个氨基酸残基组成的跨膜转运蛋白。因该蛋白首先在乳腺癌细胞中发现，故命名为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)。人的BCRP基因位于4q22，其cDNA长度为2.4kb，编码的蛋白质由663个氨基酸组成，其分子量约为72.6kD。
BCRP与P-gp和MRP一样同属于ABC转运蛋白超家族，也存在ATP结合盒，并具有ATP依耐性药物外排功能。但在结构上BCRP仅相当与P-gp分子的一半，它仅有6个跨膜区和1个ATP结合位点，故被称为不完全转运分子(halftransporter)。BCRP并非乳腺癌所特有，以mx诱导的人骨髓瘤细胞株RPM18226、人小细胞肺癌细胞株GLC4、人结肠癌细胞株S1-M1-3.2都发现了有BCRP的过表达。其耐药谱包括了米托蒽醌、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、托泊替康等，且对长春新碱、紫杉醇无交叉耐药。其耐药分子机制与P-gp及MRP基本相似，即通过主动外排药物及降低药物核质分布比例达到多药耐药。但BCRP也具有自身的特点：首先BCRP单体之间通过二硫键形成同二聚体，使结构近似于一完全转运蛋白，而后在发挥药物排出泵作用。此外BCRP也具有与前两种耐药蛋白不同的药物结合位点。
4.抗调亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL的过度表达，导致肿瘤细胞调亡耐受
近年来，细胞凋亡与多药耐药及肿瘤细胞的抗药性的关系日益受到人们的关注，研究发现抑制调亡与耐药的形成存在一定的关系。细胞凋亡过程受到许多癌基因调控，如p53基因及Bcl-2家族(包括抑制凋亡基因Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Al及Bag，促进凋亡的基因如Bax，Bcl-xs，Bad和Bak等)。抑制凋亡基因中Bcl-2蛋白过度表达时，可引起细胞不死亡或病死率下降的抗凋亡作用，从而对抗药物的治疗作用，使化疗药物失去效果。即Bcl-2导致耐药主要是通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径而完成。Bcl-2家族中Bcl-x转录形成的mRNA经剪切、加工形成两种拼接形式，其中一种称为Bcl-xL，另一种为Bcl-xs。有研究表明Bcl-xL的过度表达可显著降低顺铂、足叶乙甙、长春新碱等药物的细胞毒作用并抑制细胞凋亡，从而形成多药耐药。促凋亡基因中Bax功能与Bcl-2相反，当Bax增加时自身可形成同源二聚体，致使细胞凋亡加速，肿瘤细胞对化疗药物敏感性增强。当Bcl-2表达增加，Bax同源二聚体解离，形成Bcl-2 Bax异源二聚体，抑制了Bax-Bax同源二聚体的细胞凋亡作用，从而肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性.因而可见，凋亡相关基因与细胞耐药间关系密切，在产生多药耐药的过程中存在着精密的调控系统，其中的调控机理尚不得而知，有待进一步深入探讨。
细胞死亡一般分两类，凋亡和坏死。细胞凋亡是最早被研究的程序性死亡现象，并且在过去很长一段时间内，程序性死亡等同于细胞凋亡。这种细胞的有序死亡在形态学上被描述为细胞质和和细胞核的皱缩、染色质向核外周集中、DNA的片断化、细胞分裂成小的凋亡小体，并通过吞噬作用被除去。凋亡主要通过两种信号通路引导，即由从线粒体释放的细胞色素c介导的内源途径和通过死亡受体与配体结合并被激活来介导的外源途径。但随着研究的深入，科学家们发现在凋亡以外，还存在着多种细胞的程序性死亡方式，由不同的信号通路调控。自噬是除凋亡外研究最多的程序性死亡，经历这种死亡方式的细胞的细胞质和细胞器被多个具有双层膜结构的囊泡隔离，并被运输到溶酶体或自噬泡降解。在一定的胁迫条件如饥饿、损伤条件下都可引发细胞的自噬行为，但过度的自噬行为将导致非凋亡性的细胞死亡。此外，细胞还存在着若干种其它程序性死亡方式，如Paraptosis，表现为线粒体和内质网的不断肿胀和细胞质的泡化。又如Mitotic catastrophe，这种死亡是由有丝分裂的失败引起，伴随着线粒体膜的通透化和caspases的激活，但它并不同于凋亡，因为对caspases的抑制和Bcl-2的过表达都不能抑制这种死亡方式的进行。
传统意义上认为，与细胞凋亡这一有序并受到调控的过程对立存在另一种死亡方式，即为坏死。这是一种由胞外损伤引起的混乱无序的死亡方式，主要表现为细胞的肿胀、质膜的破裂和继而引起的细胞成分的释放及组织炎症反应。但近来研究发现，有些坏死过程是有一系列步骤的。神经元细胞excitotoxicdeath就是通过过量的谷氨酸过度激活NMDA通道，随后细胞内钙离子水平和依赖于钙离子的通道活性提高实现的。在坏死模型的研究中，坏死是通过内质网上的离子通道实现的。
各种非凋亡类程序性死亡的研究已成为细胞生物学的一大热点。这些研究，一方面丰富了我们对细胞内部调控机制的理解，另一方面也为生物体发育控制，疾病治疗等提供了更多的分子靶点和作用机理，具有重要的意义。
2005年，哈佛大学医学院袁均瑛教授及其她的同事确认了一种新的程序性坏死方式-坏死样凋亡(Necroptosis)，具有以下几个主要特点：1，坏死样的形态学改变，早期细胞膜的破裂；2，线粒体膜电位下降；3，坏死过程中伴随有自噬现象；4，细胞内活性氧升高不是细胞死亡的关键因素；5，这种程序性坏死可以特异性地被一个小分子(necrostatin-1)所抑制，而目前常用的抑制剂都不能抑制这种死亡。而萘醌类化合物正是通过诱导坏死样凋亡来克服肿瘤的多药耐药性的。
发明内容
本发明的目的是提供萘醌类化合物的一种新用途，即：萘醌类化合物在制备治疗多药耐药肿瘤药物中的应用。本发明所采用的萘醌类化合物是根据现有技术从植物如紫草中提取或化学合成，所述萘醌类化合物的有效成分包含紫草素的对映体异紫草素以及它们的衍生物，用该萘醌类化合物制备的药物含有其他的抗肿瘤药物，及药物赋形剂或载体。
所述萘醌类化合物包含紫草萘醌类化合物、异紫草萘醌类化合物、紫草属素及紫草呋喃。
所述的药物可按本制剂领域已知方法制成肠道或非肠道组合药的剂型。制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂或注射剂。
制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。口服制剂包括缓释剂。
部分紫草素萘醌类化合物结构式如下：
去氧紫草素(Deoxyshikonin) R＝-H
紫草素(Shikonin) R＝-OH
乙酰紫草素(Acetylshikonin) R＝-OCOCH3
异丁酰紫草素(Isobutyrylshikonin) R＝-OCOCH(CH3)2
β-羟基异戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)R＝-OCOCH2C(CH3)2OH
异戊酰紫草素(Isovalerylshikonin) R＝-OCOCH2CH(CH3)2
α-甲基-正丁酰紫草素(α-methyl-n-butyrylshikonin) R＝-OCOCH(CH3)CH2CH3
β，β-二甲基丙烯酰紫草素(β，β-dimethylacrylshikonin) R＝-OCOCH＝C(CH3)2
2，3-二甲基戊烯酰紫草素(Teracrylshikonin) R＝-OCOCH2C(CH3)＝C(CH3)2
蒽醌(Anthraquinone) R＝-OCOC(CH3)＝CHC(CH3)2OH
丙酰紫草素(Propionylshikonin) R＝-OCOCH2CH3
1-甲氧基-紫草素1-methoxy-shikonin R＝-OH
1-甲氧基-β，β-二甲基丙烯酰紫草素(1-methoxy-β，β-dimethylacrylshikonin)
R＝-OCOCH＝C(CH3)2
1-甲氧基-乙酰紫草素(1-methoxy-acetylshikonin) R＝-OCOCH3
Shikonine
部分异紫草萘醌类化合物结构式如下：
去氧异紫草素(Deoxyalkannin) R＝-H
异紫草素(Alkannin) R＝-OH
去水异紫草素(Anhydroalkannin) R＝-CH＝CHCH＝C(CH3)2
β，β-二甲基丙稀酰异紫草素(β，β-dimethylacrylalkannin)
R＝-OCOCH＝C(CH3)2
乙酰异紫草素(Acetylalkannin) R＝-OCOCH3
β-羟基异戊酰异紫草素(β-hydroxyisovalerylalkannin)
R＝-OCOCH2C(CH3)2OH
α-乙酰基异戊酰异紫草素(α-acetoxyisovalerylalkannin)
R＝-OCOCH2CCH3OCOCH3
α-甲基-正丁酰异紫草素(α-methyl-n-butyrilalkannin)
R＝-OCOCH(CH3)CH2CH3
2，3-二甲基戊烯酰异紫草素(Teracrylalkannin)
R＝-OCOCH2C(CH3)＝C(CH3)2
紫草属素结构式如下：
紫草属素A (Lithospermidin A) R＝-COCH(CH3)CH2CH3
紫草属素B(Lithospermidin B) R＝-COCH(CH3)CH3
紫草呋喃结构式如下：
紫草呋喃A(Shikonofuran A) R＝-CH3
紫草呋喃B (Shikonofuran B) R＝-CH(CH3)CH2CH3
紫草呋喃C (Shikonofuran C) R＝-CH2CH(CH3)2
紫草呋喃D (Shikonofuran D) R＝-CH(CH3)2
紫草呋喃E (Shikonofuran E) R＝-CH＝C(CH3)2
所述的紫草素及其衍生物为下列之一：
(1)紫草素；(2)去氧紫草素；(3)乙酰紫草素；(4)异丁酰紫草素；(5)β-羟基异戊酰紫草素；(6)异戊酰紫草素；(7)α-甲基-正丁酰紫草素；(8)β，β-二甲基丙稀酰紫草素；
(9)2，3-二甲基戊烯酰紫草素；(10)蒽醌；(11)丙酰紫草素；(12)异紫草素；
(13)去氧异紫草素；(14)乙酰异紫草素；(15)去水异紫草素；
(16)β，β-二甲基丙稀酰异紫草素；(17)β-羟基异戊酰异紫草素；
(18)α-乙酰基异戊酰异紫草素；(19)α-甲基-正丁酰异紫草素；
(20)α-甲基-正丁酰异紫草素；(21)2，3-二甲基戊烯酰异紫草素；(22)1-甲氧基-紫草素；(23)1-甲氧基-β，β-二甲基丙稀酰紫草素；(24)1-甲氧基-乙酰紫草素；(25)紫草属素A；(26)紫草属素B；(27)紫草呋喃A；(28)紫草呋喃B；(29)紫草呋喃C；(30)紫草呋喃D；
(31)紫草呋喃E；(32)Shikonine。
肿瘤细胞产生多药耐药性时，细胞内高表达P-gp，MRP1，BCRP等药泵，可将进入细胞内的抗肿瘤药物如紫杉醇、阿霉素、长春新碱排出细胞外，使药效大大降低，而萘醌类化合物对多药耐药肿瘤细胞的作用不受P-gp，MRP1，BCRP的影响，而且对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、羟基喜树碱等。萘醌类化合物杀死P-gp，MRP1，BCRP高表达的多药耐药肿瘤细胞的机理是诱导程序性坏死-necroptosis，与其亲本药敏细胞一致。
肿瘤细胞高表达抗调亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL，可以产生凋亡耐受。而目前常用的抗肿瘤药物都是通过诱导细胞凋亡来发挥药效的，Bcl-2，Bcl-xL通过抑制细胞凋亡，使肿瘤细胞获得对多种抗肿瘤药物的耐受性。萘醌类化合物通过非调亡的途径(necroptosis)杀肿瘤细胞，可以避开凋亡通路，抗凋亡蛋白的高表达对萘醌类化合物的抗瘤活性影响很小，萘醌类化合物对Bcl-2，Bcl-xL高表达的耐药肿瘤细胞的杀伤能力与对其亲本细胞基本一致。
本发明所述的萘醌类化合物在制备肿瘤药物中的应用的有益效果如下：(1)具有临床应用前景，萘醌类化合物可杀伤多药耐药肿瘤细胞，其药效不受常规耐药机理影响。其对多药耐药肿瘤细胞的药效显著高于紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、羟基喜树碱等现有临床药物；(2)萘醌类化合物具有较低的毒性，因此，具有很好的临床肿瘤化疗、尤其是抗临床肿瘤多药耐药的应用前景。
附图说明
图1是α-甲基-正丁酰紫草素处理HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx后透射电镜图。
图2是α-甲基-正丁酰紫草素处理HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx，MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2和MCF-7/Bcl-xL后检测是否出现凋亡特征性DNA Ladder的图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一：萘醌类化合物杀肿瘤细胞的能力不受P-gp影响
实验材料：
K562，MCF-7/wt细胞株均来源于American Type Culture Collection(ATCC)公司。耐药细胞株K562/ADR，MCF-7/ADR为本研究组药物诱导筛选所得。萘醌类化合物购自日本东京化成工业株式会社。3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)购自Sigma公司。
实验方法：
萘醌类化合物对K562，MCF-7/wt以及它们相应的P-gp高表达的耐药株K562/ADR，MCF-7/ADR的IC50的计算。不同浓度萘醌类化合物作用细胞72小时后，MTT法计算IC50。
实验结果：
药物作用72小时，萘醌类化合物对耐药细胞株的IC50与亲本株细胞非常接近，有些甚至低于亲本细胞株，说明该类化合物可以克服P-gp介导的多药耐药，见表1。
表1萘醌类化合物对K562，MCF-7/wt及其耐药株的IC50。
| 萘醌类化合物 | IC50(μM) | |||
| K562 | K562/ADR | MCF-7/wt | MCF-7/ADR | |
| β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 0.73±0.040.96±0.090.82±0.241.03±0.272.48±0.040.42±0.21 | 0.64±0.110.92±0.070.83±0.111.42±0.042.20±0.040.42±0.12 | 2.71±0.283.67±0.712.41±0.0611.06±0.914.37±0.711.70±0.58 | 1.72±0.612.09±1.131.71±0.594.56±0.437.01±3.061.54±0.35 |
实施例二：萘醌类化合物杀肿瘤细胞的能力不受MRP1影响
实验材料：
HL60细胞株购自American Type Culture Collection (ATCC)公司。耐药细胞株HL60/ADR为本研究组药物诱导筛选所得。萘醌类化合物购自日本东京化成工业株式会社。3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)购自Sigma公司。
实验方法：
萘醌类化合物对HL60和它相应的MRP1高表达的耐药株HL60/ADR的IC50的计算。不同浓度萘醌类化合物作用细胞72小时后，MTT法计算IC50。
实验结果：
药物作用72小时，萘醌类化合物对亲本株细胞和耐药细胞株的IC50非常接近，有些甚至低于亲本细胞株，说明该类化合物可以克服MRP1介导的多药耐药，见表2。
表2萘醌类化合物对HL60及HL60/ADR的IC50。
| 萘醌类化合物 | IC50(μM) | |
| HL60 | HL60/ADR | |
| β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 0.30±0.040.63±0.200.35±0.080.86±0.112.85±0.420.14±0.13 | 0.34±0.110.65±0.070.36±0.190.54±0.023.00±0.400.26±0.19 |
实施例三：萘醌类化合物杀肿瘤细胞的能力不受BCRP影响
实验材料：
MCF-7/wt细胞株及其耐药细胞株MCF-7/mx均购自American Type CultureCollection(ATCC)公司。萘醌类化合物购自日本东京化成工业株式会社。3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)购自Sigma公司。
实验方法：
萘醌类化合物对MCF-7/wt和它相应的BCRP高表达的耐药株MCF-7/mx的IC50的计算。不同浓度萘醌类化合物作用细胞72小时后，MTT法计算IC50。
实验结果：
药物作用72小时，萘醌类化合物对耐药细胞株的IC50基本都低于亲本株细胞，说明该类化合物可以克服BCRP介导的多药耐药，见表3。
表3萘醌类化合物对MCF-7/wt及MCF-7/mx的IC50。
| 萘醌类化合物 | IC50(μM) | |
| MCF-7/wt | MCF-7/mx | |
| β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 2.71±0.283.67±0.712.41±0.0611.06±0.914.37±0.711.70±0.58 | 2.15±0.492.45±1.582.15±0.4113.21±0.406.54±2.741.66±0.57 |
实施例四：萘醌类化合物杀肿瘤细胞的能力不受抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL的影响
实验材料：
HL60，MCF-7细胞株购自American Type Culture Collection(ATCC)公司。质粒pSFFV-Neo，pSFFV-Bcl-2和pSFFV-Bcl-xL为弗吉尼亚大学Dr.StevenGrant馈赠。真核转染pSFFV质粒，G418筛选得到HL60和MCF-7的Bcl2，Bcl-xL高表达株。萘醌类化合物购自日本东京化成工业株式会社。3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)购自Sigma公司。
实验方法：
萘醌类化合物对HL60/Neo和MCF-7/Neo以及它们相应的抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL高表达耐药株HL60/Bcl-2，HL/60/Bcl-xL，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL的IC50的计算。不同浓度萘醌类化合物作用细胞72小时后，MTT法计算IC50。
实验结果：
药物作用72小时，萘醌类化合物对耐药细胞株的IC50和亲本细胞株非常接近，说明该类化合物杀灭肿瘤细胞的能力不受抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL的影响，见表4，表5。
表4萘醌类化合物对HL60/Neo及HL60/Bcl-2，HL60/Bcl-xL的IC50。
| 萘醌类化合物 | IC50(μM) | ||
| HL60/Neo | HL60/Bcl-2 | HL60/Bcl-xL | |
| β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 0.23±0.040.25±0.030.31±0.070.32±0.031.53±0.180.17±0.04 | 0.24±0.050.29±0.050.30±0.020.39±0.031.64±0.270.18±0.02 | 0.23±0.040.26±0.080.30±0.100.36±0.051.37±0.210.19±0.03 |
表5萘醌类化合物对MCF-7/Neo及MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL的IC50。
| 萘醌类化合物 | IC50(μM) | ||
| MCF-7/Neo | MCF-7/Bcl-2 | MCF-7/Bcl-xL | |
| β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 1.08±0.141.49±0.120.97±0.082.44±0.474.51±0.670.95±0.07 | 1.06±0.011.88±0.180.92±0.032.37±0.253.68±0.330.90±0.13 | 0.94±0.252.08±1.290.91±0.181.82±0.133.51±0.470.82±0.11 |
实施例五：萘醌类化合物在不同细胞株及耐药细胞株上均引起necroptosis
实验材料：
HL60，K562，MCF-7/wt，MCF-7/mx均来自于American Type CultureCollection(ATCC)公司。耐药株细胞HL60/ADR，，K562/ADR，MCF-7/ADR均为本研究组药物诱导筛选所得。质粒pSFFV-Neo，pSFFV-Bcl-2和pSFFV-Bcl-xL为弗吉尼亚大学Dr.Steven Grant馈赠。真核转染pSFFV质粒，G418筛选得到MCF-7的Bcl2，Bcl-xL高表达株。萘醌类化合物购自东京化成工业株式会社。Necrostatin-1(Nec-1)和Necrostatin-1无活性对照(Nec-1i)均购自美国Biomol公司。碘化丙啶(PI)染料购自Sigma公司，Caspase-3活性检测试剂盒购自BioVision Research Products公司，Calcein-AM ester购自MolecularProbe公司。CoCl2·6H2O购自杭州华东医药有限公司。凋亡细胞DNA Ladder检测试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。
实验方法：
1.取长势良好的HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx，MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL细胞，以每孔1×105细胞密度种24孔板(贴壁细胞先贴壁过夜)，60μMNec-1或Nec-1i(阴性对照)提前处理1小时，再用各萘醌类化合物处理细胞6小时，收集细胞，PI拒染计算细胞死亡率。
2.取长势良好的HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx，MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL细胞，以每孔1×106细胞密度种于6孔板，在培养基中加入α-甲基-正丁酰紫草素，使其终浓度为15μM(对于HL60和HL60/ADR)或20μM(对于其他各对细胞)，6小时后收集细胞。PBS洗涤后，2.5％的戊二醛4℃固定过夜，再用1％的锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon 812包埋，制超薄切片，硝酸铀及柠檬酸铅染色，TECNAI 10透射电镜观察。
3.取长势良好的HL60和K562细胞，以每孔1×106细胞密度种于6孔板，60μM Nec-1提前处理1小时，再用α-甲基-正丁酰紫草素处理3(对于HL60细胞)或4(对于K562细胞)小时，收集细胞，用PBS洗涤两遍后，室温下在含有1μM Calcein-AM和5mMCoCl2的无血清无酚红RPMI-1640培养基中避光孵育15分钟，用PBS洗细胞三次，重悬于PBS后，流式检测细胞线粒体膜电位(MMP)变化。
4.取长势良好的HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR细胞，以每孔1×106细胞密度种于6孔板，在培养基中加入α-甲基-正丁酰紫草素，使其终浓度为15μM(对于HL60和HL60/ADR)或20μM(对于K562和K562/ADR)，6小时后收集细胞，用Caspase-3活性检测试剂盒检测是否有Caspase-3激活。凋亡阳性对照药物选用依托泊苷，处理条件分别为：HL60：20μg/ml处理6h，HL60/ADR：100μg/ml处理24h；K562和K562/ADR均为100μg/ml处理48h。
5.取长势良好的HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx，MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL细胞，以每孔1×106细胞密度种于6孔板，在培养基中加入α-甲基-正丁酰紫草素，使其终浓度为15μM(对于HL60和HL60/ADR)或20μM(对于其他各对细胞)，6小时后收集细胞。
a.70％乙醇4℃固定过夜，PBS清洗一遍，加入碘化丙啶(PI)染液，混匀，，4℃放置30min，流式细胞仪检测凋亡亚二倍体峰，并记录细胞凋亡率。各组细胞的凋亡阳性对照分别为：HL60：20μg/ml依托泊苷处理6h；HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/mx，MCF-7/Neo：100μg/ml依托泊苷处理48h；MCF-7/ADR，MCF-7/Bcl-2和MCF-7/Bcl-xL：100μg/ml依托泊苷处理72h。
b.按照凋亡细胞DNA Ladder检测试剂盒步骤说明提取各孔处理细胞的基因组DNA，最后溶于50μl洗脱缓冲液中。取10μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳约40min，紫外下观察电泳条带。以20μg/ml依托泊苷处理HL606h为凋亡阳性对照。
实验结果：
1.萘醌类化合物在HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx，MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL细胞株中引起的死亡都可以被Nec-1特异性抑制(Nec-li没有抑制效果)。具体死亡率数值见表6，表7，表8和表9。
表6Nec-1特异性抑制萘醌类化合物对HL60，HL60/ADR引起的细胞死亡
| 死亡率(％) | HL60 | HL60/ADR | ||||
| Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | |
| 对照β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素 | 1.47±0.7100.00±0.0079.74±5.08100.00±084.55±0.2552.23±0.32 | 11.41±1.9912.83±1.5023.54±0.6517.58±0.2026.13±1.277.45±1.11 | 4.68±0.9093.78±1.5183.08±5.2895.98±5.6989.98±0.9147.73±7.50 | 2.51±1.1683.43±4.1583.33±1.3977.92±1.8767.66±15.4366.87±4.81 | 3.76±2.434.76±0.789.16±2.483.43±0.148.25±1.387.00±1.33 | 3.29±2.0882.66±2.4281.04±1.1077.53±0.3669.58±2.3467.92±3.58 |
| α-甲基-正丁酰紫草素 | 80.33±1.30 | 14.95±8.85 | 76.82±5.11 | 86.80±1.53 | 8.12±1.38 | 82.96±6.84 |
表7Nec-1特异性抑制萘醌类化合物对K562，K562/ADR引起的细胞死亡
| 死亡率(％) | K562 | K562/ADR | ||||
| Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | |
| 对照β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 4.34±2.0271.37±10.9483.35±1.7982.47±0.7230.39±4.1679.26±2.8170.02±2.70 | 7.85±0.0214.26±0.4010.36±1.4611.70±2.636.62±1.518.16±0.879.80±1.38 | 3.25±1.3569.91±11.5681.23±1.0182.63±2.6332.34±2.5978.66±0.9373.40±2.27 | 1.77±0.8690.61±2.8080.26±4.9847.51±11.3714.49±0.6180.94±5.1952.82±8.00 | 2.99±0.1911.54±1.6820.20±2.8613.02±2.456.38±1.4518.36±3.0413.44±4.27 | 4.47±1.8188.97±2.3381.34±4.0747.26±6.2316.10±1.6779.36±0.9044.89±0.11 |
表8Nec-1特异性抑制萘醌类化合物对MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx引起的细胞死亡
| 死亡率(％) | MCF-7/wt | MCF-7/ADR | MCF-7/mx | ||||||
| Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | |
| 对照β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素 | 3.01±2.1243.06±12.2937.31±3.8131.98±1.5377.61±3.1148.61±7.09 | 4.18±0.163.40±0.598.56±0.247.62±0.6726.08±3.854.01±1.11 | 2.20±0.4547.73±10.0536.66±1.3432.62±3.4776.12±0.5650.11±1.92 | 1.40±0.6796.22±0.6856.03±2.94100.00±18.65±2.3621.57±11.3 | 1.65±0.8114.87±1.308.38±0.63010.12±0.8410.09±2.109.80±2.35 | 3.87±1.2793.81±1.1555.22±4.55100.00±0.0017.46±1.1324.23±2.95 | 8.70±2.1195.25±0.1475.37±5.57100.00±0.0095.86±1.0465.38±1.81 | 5.58±1.287.70±2.3114.29±6.228.68±3.4429.41±4.5919.67±1.96 | 5.34±2.1691.92±3.0173.86±1.6196.80±1.1294.72±2.9567.37±2.38 |
| α-甲基-正丁酰紫草素 | 58.10±12.53 | 12.18±1.84 | 59.67±14.49 | 74.99±8.31 | 10.75±2.06 | 66.70±1.47 | 100.00±0.00 | 19.87±1.58 | 100.00±0.00 |
表9Nec-1特异性抑制萘醌类化合物对MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL引起的细胞死亡
| 死亡率(％) | MCF-7/Neo | MCF-7/Bcl-2M | CF-7/Bcl-xL | ||||||
| Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | Nec-1- | Nec-1+ | Nec-1i | |
| 对照β，β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素异戊酰紫草素异丁酰紫草素去氧紫草素α-甲基-正丁酰紫草素 | 2.29±1.1147.78±0.9545.71±3.7160.28±5.3132.88±3.8334.68±5.3547.11±7.74 | 3.21±0.7819.95±0.9013.93±2.5613.13±1.9315.03±2.0416.93±2.7210.19±1.66 | 2.47±0.5838.45±4.1943.10±5.0443.18±4.2929.78±0.4536.81±1.2149.93±8.18 | 3.02±2.3638.72±6.9726.41±1.3755.71±7.4548.86±13.2240.47±9.0568.58±5.89 | 4.10±1.017.03±0.7312.92±1.168.33±3.218.09±0.637.65±1.2614.20±3.88 | 6.78±1.3650.63±1.5237.36±7.3450.12±6.0645.00±3.7637.52±6.2461.32±13.34 | 3.64±0.5129.95±5.2029.97±0.4838.97±3.2559.38±1.8616.62±4.1856.65±0.41 | 5.02±1.2110.97±1.0114.29±1.929.69±2.2010.58±2.8911.01±2.0116.15±2.69 | 4.65±0.8624.77±5.1937.87±1.0332.17±2.2051.24±9.6133.31±1.2755.08±2.74 |
2.透射电镜观察α-甲基-正丁酰紫草素处理后的细胞，出现大量的线粒体扩张，内部结构严重破坏；细胞膜断裂，破损；自噬小体常见；内质网拉伸等细胞坏死特征，具体见图1，图中A：a-d，HL60细胞；e-h，HL60/ADR细胞；B：a-d，K562细胞；e-h，K562/ADR细胞；C：a-d，MCF-7/wt细胞；e-h，MCF-7/ADR细胞；i-1，MCF-7/mx细胞。
3.α-甲基-正丁酰紫草素处理细胞后线粒体膜电位(MMP)迅速下降，表现为CalceinAM绿色荧光强度减弱，用necroptosis特异性抑制剂Nec-1可部分恢复荧光强度，表明对膜电位的下降的抑制，见表10。
表10Nec-1对α-甲基-正丁酰紫草素引起细胞线粒体膜电位下降的抑制
| 荧光强度(％对照) | 对照 | MBS处理 | Nec-1+MBS处理 |
| HL60K562 | 1.00±0.001.00±0.00 | 35.33±3.2211.09±9.35 | 62.51±10.8746.37±5.35 |
4.α-甲基-正丁酰紫草素在HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR细胞株中引起的死亡没有Caspase-3的激活。以对照组细胞的Caspase-3活性水平为基准，药物处理后细胞内Caspase-3的活性水平与对照组的比值即为激活倍数，表11列出了对照组，药物处理组和凋亡阳性对照组caspase-3激活的具体倍数。
表11α-甲基-正丁酰紫草素处理HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR后Caspase-3激活的倍数
| Caspase-3激活倍数 | HL60 | HL60/ADR | K562 | K562/ADR |
| 对照α-甲基-正丁酰紫草素阳性对照 | 1.00±0.001.57±0.1410.41±1.96 | 1.00±0.001.11±0.003.71±0.23 | 1.00±0.001.29±0.4113.99±0.13 | 1.00±0.001.22±0.5812.06±0.22 |
5.α-甲基-正丁酰紫草素处理HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR，MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx，MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL后对细胞进行PI染色周期分析，发现凋亡的细胞比例与对照非常接近，也没有出现凋亡亚二倍体峰，而用依托泊苷作为凋亡阳性对照均出现明显的凋亡亚二倍体峰，凋亡率也明显上升，见表12，表13和表14。
表12MBS处理HL60，HL60/ADR，K562，K562/ADR后凋亡细胞比例
| 凋亡细胞比例(％) | HL60 | HL60/ADR | K562 | K562/ADR |
| 对照α-甲基-正丁酰紫草素依托泊苷 | 1.84±0.082.53±0.8620.08±0.64 | 1.00±0.082.75±0.8731.11±3.94 | 1.85±0.462.38±0.8612.25±0.51 | 2.48±0.662.97±0.818.15±1.44 |
表13MBS处理MCF-7/wt，MCF-7/ADR，MCF-7/mx后凋亡细胞比例
| 凋亡细胞比例(％) | MCF-7/wt | MCF-7/ADR | MCF-7/mx |
| 对照α-甲基-正丁酰紫草素依托泊苷 | 1.33±0.761.53±0.6612.76±2.56 | 0.56±0.091.33±0.6410.27±2.00 | 1.33±0.572.55±1.0236.19±1.66 |
表14MBS处理MCF-7/Neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL后凋亡细胞比例
| 凋亡细胞比例(％) | MCF-7/Neo | MCF-7/Bcl-2 | MCF-7/Bcl-xL |
| 对照α-甲基-正丁酰紫草素依托泊苷 | 0.67±0.071.36±0.1643.46±2.47 | 2.11±0.822.25±0.7616.27±2.15 | 1.17±0.301.97±0.7116.01±0.21 |
6.用20μg/ml依托泊苷处理HL60 6h的凋亡阳性对照出现明显的DNAladder现象，而用α-甲基-正丁酰紫草素处理的各种细胞都和对照一样没有出现DNA ladder，说明α-甲基-正丁酰紫草素没有引起凋亡时细胞核DNA断裂现象，结果参见图2(图中M：分子量标准对照；PC：阳性对照；1：未用药物处理的对照细胞；2：α-甲基-正丁酰紫草素处理的细胞)。
以上实例说明：萘醌类化合物引起细胞死亡的主要方式是一种程序性坏死-necroptosis。由于其杀肿瘤细胞主要为一种非调亡的方式，所以，可以避开普通调亡耐受，并可以克服P-gp，MRP1，BCRP等耐药蛋白以及Bc1-2，Bc1-xL介导的多药耐药。
萘醌类化合物目前广泛用于食品添加剂以及化妆品的色素。同时在1991年已有中国学者用紫草素复合方剂较为成功的用于临床实验，治疗晚期癌症患者。说明其对正常个体的毒性较小。又由于其特殊的杀肿瘤细胞机理，可以克服多种原因介导的调亡耐受，使其在抗肿瘤多药耐药性的药物制备和临床应用上具有广阔的前景。
Claims (4)
1.萘醌类化合物在制备治疗多药耐药肿瘤药物中的应用，所用的萘醌类化合物是根据现有技术从植物紫草中提取或化学合成，其特征是：所述萘醌类化合物包含紫草素的对映体异紫草素以及它们的衍生物，用该萘醌类化合物制备的药物含有其他的抗肿瘤药物，及药物赋形剂或载体。
2.根据权利要求1所述的萘醌类化合物在制备治疗多药耐药肿瘤药物中的应用，其特征是：所述萘醌类化合物包含紫草萘醌类化合物、异紫草萘醌类化合物、紫草属素及紫草呋喃。
3.所述药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂或注射剂。
4.根据权利要求3所述的萘醌类化合物在制备治疗多药耐药肿瘤药物中的应用，其特征是：所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。
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