CN101231282B - 一种用于功能基因组研究的组织芯片、及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物芯片领域,具体地,本发明涉及一种用于功能基因组研究的组织芯片、及其制备方法和应用。本发明的组织芯片包括基片和位于所述基片表面的石蜡切片,其中,所述石蜡切片具有按照组织动态发育过程排列的处于不同发育时期的组织样品点。根据本发明的组织芯片可以与基因芯片技术相结合,高通量、经济、有效地验证研究芯片技术筛选出的差异表达基因在组织动态发育过程中的时空表达性。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片领域,具体地,本发明涉及一种用于功能基因组研究的组织芯片、及其制备方法和应用。
背景技术
随着许多生物基因组测序的完成,不同生物的功能基因组研究迅速发展。而不断革新的cDNA芯片和基因芯片技术是功能基因组研究的强有力手段,通过高通量的芯片技术可以筛选出成百上千的差异表达基因,然而传统分子生物学手段对芯片筛选出的差异表达基因的验证和研究都显得十分不足。传统的RT-PCR、荧光定量PCR等都只能对芯片检测的结果进行验证,而不能验证、研究差异表达基因的时空表达性;传统的原位杂交只能一条基因探针对应一个组织样品进行验证,不能与高通量的芯片技术相匹配。
因此,本领域迫切需要开发新的研究技术,以便能同高通量的芯片技术相匹配,验证、研究差异表达基因的时空表达性。
发明内容
本发明的目的是提供一种与基因芯片技术相匹配的高通量、经济、有效的用于功能基因组研究的组织芯片。
本发明的另一目的是提供制备上述组织芯片的方法。
本发明的再一目的是提供上述组织芯片在功能基因组研究方面的用途。
根据本发明的组织芯片包括基片和位于所述基片表面的石蜡切片,其中,所述石蜡切片具有多个按照组织动态发育过程排列的处于不同发育时期的组织样品点。
优选地,所述石蜡切片的厚度为6~8微米;所述石蜡切片具有25~250个组织样品点;以及每个发育时期的组织样品点重复20~30次。
根据本发明的制备组织芯片的方法包括以下步骤:
1)在空白石蜡块打出多个点样孔,优选所述点样孔的直径为1.5~2.0毫米,相邻点样孔之间的中心距离为2~5毫米;
2)在所述点样孔中植入不同发育时期的组织样品芯,优选每个发育时期的样品组织有20~30个
样品点重复,并且加热、优选在50℃烘箱中处理2小时,使组织样品芯同石蜡块融合;
3)将由步骤2)得到的石蜡进行切片,优选切片厚度为6~8微米;以及
4)将由步骤3)得到的石蜡切片置于基片上,获得组织芯片。
本发明还提供了上述组织芯片在功能基因组研究方面的应用。
进一步,本发明提供了一种使用上述芯片研究差异表达基因在组织发育过程中的时空表达性的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使用基因芯片技术筛选差异表达的基因,并标记所述基因;
b)制备上述差异表达基因的同源组织芯片,包括以下步骤:
I)在空白石蜡块打出多个点样孔;
II)在所述点样孔中植入与上述差异表达基因同源的处于不同发育时期的组织样品芯,并且加热使组织样品芯同石蜡块融合;
III)将步骤II)得到的石蜡进行切片;以及
IV)将通过步骤III)得到的石蜡切片置于基片上,获得组织芯片,
c)将上述差异表达基因和其同源组织芯片杂交,组织芯片原位杂交结果与基因芯片技术揭示的差异表达基因的表达模式相比较,验证基因芯片的结果,研究差异表达基因在组织发育过程中的时空表达性。
本发明的发明人经过技术实践和理论分析,开发了组织发育过程的组织芯片的新工艺、新用途,在此基础上完成了本发明。
用于本发明的组织材料没有特别限制。代表性的组织材料是小麦小穗发育不同时期的雄蕊材料,具体包括:雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期、双核花粉期的雄蕊组织样品。
用于本发明的基片没有特别限制,可以选择组织芯片领域常用的各种基片,基片要求透明、无色、不受有机溶剂腐蚀。优选基片是经过聚-L-赖氨酸处理的载玻片。
在本发明中,对组织芯片设计中的点样孔大小、间距和点样密度没有特别限制,组织芯片设计的参数取决于组织样品的大小。
在本发明中,对组织芯片中固定的组织种类没有特别限制。
用于本发明的石蜡切片厚度没有特别限制,为了进行原位杂交,通常切片的厚度为5~8微米。
本发明中所使用的组织固定技术、石蜡包埋技术、以及切片技术没有特别限制,可以选用本领域的常规技术。
本发明的组织芯片的应用范围为:与基因芯片技术相结合,运用原位杂交技术,研究组织发育过程中基因芯片技术筛选出的差异表达基因的时空表达性。根据本发明的组织芯片可以与基因芯片技术相结合,高通量、经济、有效地验证研究芯片技术筛选出的差异表达基因在组织动态发育过程中的时空表达性。
具体而言,通过高通量的基因芯片技术筛选出大量的差异表达基因,由于用于芯片分析的RNA来源于某一组织的不同细胞类型(在植物中,这种现象很普遍),传统的RT-PCR、荧光定量PCR都只能验证基因芯片的检测结果,而不能揭示差异表达基因的时空表达性;传统的原位杂交技术,只能一条基因一个组织样品进行原位杂交分析,不能同基因芯片技术的高通量相匹配。而本发明的组织发育过程的组织芯片可以于高通量的基因芯片技术相匹配,标记一条差异表达基因,可以对多个发育时期的多个组织样品进行原位杂交,由于不同时期的组织样品在均一化的条件下完成杂交,进而可以横向平行比较不同时期组织的原位杂交结果,并可以将这一结果同基因芯片检测结果纵向比较,从而研究基因的时空表达性。
因而,本发明制作的组织芯片、以及与基因芯片技术相结合的分析方法,可以用于研究差异表达基因在组织发育过程中动态的时空表达性。本发明的组织芯片以及新型的研究方法是功能基因组研究的有效手段。
附图说明
图1显示本发明的实施例1的组织芯片的设计原理。
图2显示局部的本发明的组织芯片的显微结构。
图3显示雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的雄蕊组织的基因表达谱分析。
图4显示TCCP1基因在雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的表达模式。
图5显示TCCP1基因与组织芯片原位杂交结果。
具体实施方式
实施例1组织发育过程的组织芯片的制备
1.材料和方法
组织材料来源于小麦小穗发育的雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的雄蕊组织,每个一发育时期的雄蕊组织重复25次,组织芯片密度为100芯/片,切片厚度为7微米,如图1所示。
2.结果
组织芯片脱点率小于5%,番红染色表明雄蕊组织的显微结构分明,未出现组织结构变形,结果如图2所示。
实施例2目的基因与组织芯片的原位杂交
1.材料和方法
组织芯片来源于实施例1制备的组织芯片。分析雄蕊组织雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的基因表达谱,如图3所示,挑选目的基因TCCP1,TCCP1基因的表达模式如图4所示。将TCCP1基因进行探针标记,与实施例1中的组织芯片进行原位杂交。
2.结果组织芯片原位杂交的结果表明:在单核花粉期检测到原位杂交信号,杂交信号分布在花粉粒、花粉囊壁以及药隔维管束的细胞中;在三核花粉期也检测到杂交信号,其杂交信号弱于单核花粉期的杂交信号,这一时期的杂交信号分布在药隔维管束的细胞中。单核花粉期和三核花粉期的原位杂交结果如图5所示。TCCP1基因原位杂交信号强弱的结果同芯片技术检测的结果相一致,即:在单核花粉期TCCP1基因的表达量最多,在三核花粉期TCCP1基因受到抑制,基因的表达量减少。组织芯片原位杂交结果在验证基因芯片结果的基础上,进一步揭示出TCCP1基因表达的空间分布。在单核花粉期TCCP1基因分布在花粉粒、花粉囊壁以及药隔维管束的细胞中,在三核花粉期TCCP1基因集中分布在药隔维管束的细胞中。
Claims (6)
1.一种组织芯片,所述组织芯片包括基片和位于所述基片表面的石蜡切片,其特征在于,所述石蜡切片具有按照组织动态发育过程排列的处于不同发育时期的组织样品点,其中,所述组织样品点的材料来源于小麦小穗发育的雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的雄蕊组织,每一发育时期的雄蕊组织重复25次,切片厚度为7微米。
2.一种制备权利要求1所述组织芯片的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
1)在空白石蜡块打出点样孔;
2)在所述点样孔中植入不同发育时期的组织样品芯,并且加热使组织样品芯同石蜡块融合,其中所述组织样品点的材料来源于小麦小穗发育的雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的雄蕊组织,每一发育时期的雄蕊组织重复25次;
3)将由步骤2)得到的石蜡块进行切片,切片厚度为7微米;以及
4)将由步骤3)得到的石蜡切片置于基片上,获得组织芯片。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述点样孔的直径为1.5~2.0毫米。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,相邻点样孔之间的中心距离为2~5毫米。
5.如权利要求1所述的组织芯片在功能基因组研究方面的应用。
6.一种使用权利要求1所述芯片研究差异表达基因在组织发育过程中的时空表达性的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
a)使用基因芯片技术筛选差异表达的基因,并标记所述基因;
b)制备上述差异表达基因的同源组织芯片,包括以下步骤:
I)在空白石蜡块打出多个点样孔;
II)在所述点样孔中植入与上述差异表达基因同源的处于不同发育时期的组织样品芯,其中所述组织样品点的材料来源于小麦小穗发育的雌雄蕊分化期、药隔形成期、四分体时期、单核花粉期和双核花粉期的雄蕊组织,并且加热使组织样品芯同石蜡块融合,每一发育时期的雄蕊组织重复25次;
III)将由步骤II)得到的石蜡块进行切片,切片厚度为7微米;以及
IV)将由步骤III)得到的石蜡切片置于基片上,获得组织芯片,
c)将上述差异表达基因和其同源组织芯片杂交,从而获得所述差异表达基因在组织发育过程中的时空表达性结果。
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