发明内容
本发明的目的在于以为海洋药物为开发契机,水产品特别是海洋鱼类加工下脚料为原料开发提供一种具有更高活性的化妆品原料-海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法。
本发明提供的海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法,包括下列步骤:
①水产品加工下脚料预处理
将水产品加工下脚料用水洗净、搅碎后,经碱浸泡脱杂蛋白、脱色、异丙醇脱脂,然后沉淀经反复冲洗至无异味,再脱水。
②酶水解
将步骤①经预处理的水产品加工下脚料,在海洋碱性蛋白酶894存在下于水中进行水解,水解温度30-60℃,优选37-45℃;更优选为40℃;pH值为7.5-12.5,优选为8.0-9.0,更优选为8.0;海洋碱性蛋白酶894与预处理的水产品加工下脚料重量(质量)比(简称酶料比)为1∶1000至1∶25,优选为1∶150至1∶50,更优选为1∶150,预处理的水产品加工下脚料与水质量比(简称料水比)为1∶150至1∶1,优选为1∶10至1∶4,更优选为1∶10;时间为10-60分钟,优选为10-30分钟更优选为30分钟;水解后产物迅速于沸水中灭酶冷却后于0-10℃,优选4℃离心得上清液抗氧化胶原肽,亦可进一步处理得冻干抗氧化胶原肽。
按照本发明提供的海洋碱性蛋白酶水解894水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法中,所述水产品加工下脚料包括淡水产品加工下脚料及海洋水产品加工下脚料,例如海洋鱼类水产品加工下脚料,或其混合水产品加工下脚料。所述海洋碱性蛋白酶894为黄海水产研究所发明专利产品,专利号为:ZL00123404.8,由黄海水产研究所提供。
在步骤①中搅碎通常采用高速组织搅碎机例如DS-1高速组织搅碎机15000转/分剪切搅碎5-10分钟,搅碎时间随着高速组织搅碎机的转速而变。所述碱浸泡脱杂蛋白采用碱例如KOH或NaoH等浸泡水产品加工下脚料,碱的浓度一般0.1mol/L-.0.5mol/L,碱的用量为水产品加工下脚料质量10-50倍,优选20-30倍。脱色通常采用例如活性炭于0-10℃,优选4-5℃脱色4-8h。脱脂采用5-20重量%,优选10重量%的异丙醇于0-10℃,优选4-5℃脱脂20-48h。
在酶水解中,酶水解的工艺条件:温度、pH值、酶料比、料水比及时间直接影响到抗氧化胶原肽的产率,反应温度对胶原肽产率影响如图1所示,即用羟自由基的清除率η来表征。由图1可知,在温度40℃、45℃时羟自由基清除率的η值分别是达到峰值55.35%、56.83%,两者数值接近,而温度在45℃以下时随温度增加η值增大,这是因为随温度上升酶活接近最佳活性温度而不断增强,提高了作用速率,从而加速了目的胶原肽的得率;当温度在45℃以上时,温度开始对酶活起抑制作用,使底物降解为目的产物的速率下降,从而又引起η值的回落。
pH值对酶水解的影响如图2所示,由图2可知,在碱性pH范围7.5~12.5间,当pH值为8.5时,其羟自由基清除率最大为59.27%,之后随pH减小或增大羟自由基率均下降。说明在pH8.5左右时,是酶作用底物产生目的胶原肽的最佳pH范围。
酶料比对酶水解的影响如图3所示,由图3可知,不加酶时其羟自由基清除率的η值仅为11.72%,而酶料比为1∶1000时η值就达到47.24%,而此后,随着酶料比的增大其η值的增幅明显减缓,在酶料比增大到1∶25时,η值反而越过酶料比为1∶50时的最大抗氧化值57.74%下降为54.23%。其原因为随着酶浓度的增加其底物逐渐达到饱和,当出现酶浓度过饱和时,过饱和的酶就会作用于目的胶原肽,使其降解而降低目的胶原肽的含量。
料水比对酶水解的影响如图4所示,由图4可知,料水比在1∶10时所得产物的羟自由基清除能力最大,而料水比增大和减少时其羟自由基清除能力均有所下降,但总体上料水比对η值无明显影响。
水解时间对酶水解的影响如图5所示,由图5可知,反映时间在30、50min时羟自由基清除率的η值分别达到56.76%、57.48%处于峰值,两水平再反应时间相差20min时,η值却相差不到一个百分点。反应时间在50min以后随时间的延长η值逐渐下降。根据酶动力学反应原理,随时间的增加水解程度不断增大,目的胶原肽逐渐被进一步降解,从而使η值回落。
由上述综合可见酶水解温度45℃、酶料比1∶50、pH8.0、料水1∶4、反应时间30分所得抗氧化胶原肽的羟自由基清除率为60.42%。与同浓度VC相比,为其抗氧化活性的2倍多。
本发明制备的抗氧化胶原肽抗氧化活性与同浓度的VC(东北制药总厂供)做羟自由基清除率对比,结果如表1。
表1抗氧化胶原肽与VC的羟自由基清除率(η)的对比
浓度(mg/ml) |
胶原肽(η1) |
VC(η2) |
活性比(η1/η2) |
1051 |
92.5472.0824.67 |
38.8128.110 |
2.382.56+∝ |
由此可见冻干抗氧化胶原肽和VC浓度均为10mg/ml和5mglml时,所提取得未经纯化的抗氧化胶原肽的抗氧化活性都在VC的2倍以上,当浓度降至1mg/ml时VC的抗氧化值消失,而本发明制备的抗氧化胶原肽的抗氧化活性仍在24.67%。可见所提取的抗氧化胶原肽有着较高的抗氧化活性。
本发明提供的由海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法特点为原料来源丰富,变废为宝、工艺简单可靠,产物抗氧化胶原肽活性、产率高,与目前市场上VC抗氧化活性相比在2倍以上,是一种天然的抗氧化剂,用于食品,这也为开发其天然生理活性,应用于化妆品、医学等方面。
海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料的产物抗氧化胶原肽可清除羟自由基,仰制番红花红0褪色。亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基(Fenton反应),该反应产生的羟自由基可使番红花红0褪色,利用两者线型关系进行对照空白试验,通过测定羟自由基清除率η未表征水解产物抗氧化胶原肽的得率。抗氧化活性测定为取0.25mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液1ml,40μg/ml的番红花红1ml,供试样品0.5ml,1%过氧化氢1ml(新鲜配制),0.945mmol/L EDTA-Fe(II)1ml(新鲜配制),混合后在37℃水浴中反应30min后在520nm处测定吸收度。空白组以0.5ml蒸馏水代替供试样品抗氧化胶原肽上清液样品。对照组以1.5ml蒸馏水代替EDTA-Fe(II)和供样品抗氧化试胶原肽上清液样品。并按下式计算清除率:
式中A样品、A空白、A对照分别为样品、空白和对照的吸光值。