CN101229366B - 成纤维细胞生长因子在制备促进血管生成药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了成纤维细胞生长因子-1在制备促进血管生成药物中的应用。本发明还提供了一种含有成纤维细胞生长因子-1或其活性片段的药物。利用该药物可通过心脏插管重建疗法治疗冠心病，优选地选用与生理胶混合在局部缺血心肌内诱导血管生成。

Description

成纤维细胞生长因子在制备促进血管生成药物中的应用

技术领域

本发明涉及成纤维细胞生长因子蛋白在制备促进血管再生药物中的应用。 

背景技术

FGFS，在细胞的增殖、变异和正常的生长上都是有效的调节剂。它们还参与病理中肿瘤的处理和转移(Galzie，et al.Biochem.Cell Biol.(1997)75：669-685)。它们是中胚层，神经干细胞，内皮细胞在内的一种强有丝分裂和分化的因素。肝素蛋白、肝素和硫酸肝素可以结合几个FGF分子形成一种复合物与FGF受体结合，激活酪氨酸激酶，这些酪氨酸激酶的磷酸化作用可以启动复合信号系统，包括转录新的信使RNA的信号系统。两种成纤维细胞生长因子，酸性的和碱性的，作为血管再生的强诱导剂。(Friesel et al.(1995)FASEB J.9：919-925)都涉及到血管再生的调控，它们存在于正常和病态的血管中(Slavin，J.(1995)Cell Biology International19(5)：431-444)。这些因子已经被纯化，其cDNA序列与对应氨基酸序列已经被确定。aFGF已经有了各种不同的名字，包括胚胎肾脏衍生血管因子1，星形角质细胞生长因子1，血管内皮细胞生长因子(ECGF)，视网膜细胞生长因子，肝素结合生长因子1，血管内皮生长因子，眼源性生长因子2，prostatropin，胶质成熟因子(gospodarowicz 1987 Journal of CellularPhsiology supplement 5：15-26)。其克隆，分子序列和染色体位置已经被描述出来。(Jaye et al.1986 Science233：541-545)酸性成纤维细胞生长因子属于肝素结合型生长因子家族成员，现在成为FGFs，至今为止，至少已经知道了22个FGF家族的成员，FGF-1和FGF-2是FGF家族的典型的成员。除了VEGF，FGF-1被认为存在于大量的不同类型的细胞中，即可在 组织培养，又可在活性物质中作为一种具有有丝分裂的高度促进血管再生潜能的药剂。血管再生的生物过程通过将FGF-1结合在特殊的受体分子的表面被启动，FGFR的活性通过酪氨酸的自动磷酸化启动一连串复杂的基质的分裂，细胞的分化和增值，最后引起新血管的生成。aFGF基因位于第5号染色体，它具有一个单拷贝序列，通过两个内含子编码三个分开的分子(exons)，4.8kb的基因转化合成的aFGF含有155个氨基酸，然而，N段甲硫氨酸残基在体内被除去之含有154个氨基酸，含有154个氨基酸的aFGF有两种形式，其中有140个或134个氨基酸，aFGF是一种促有丝分裂的分子，分子量为15,000-17,000D。aFGF存在于大脑、视网膜、骨基质和骨肿瘤中，只有含有140和134个氨基酸的来自于组织。曾有人建议，通过特定的蛋白酶作用于aFGF来提取分离人造的aFGF片段(Gospodarowicz，et al.1987 Journal of Cellular Phsiology supplement 5：15-26；Jaye et al.1987The Journal of Biological Chemistry 262(34)：16612-16617)。也有人提出肝素可以增强aFGF生物活性(Thornton et al.(1983)Science222(4624)：623-625)。aFGF与肝素结合特性(Maciag et al(1984)Science225(4665)：932-935)已被作为一种有效的亲和层析法纯化aFGF蛋白质。与肝素结合型的aFGF活性可以从几倍提高到几百倍。 

一方面，本发明涉及有关治疗冠心病血运重建治疗法，尤其是药品成分含重组纤维细胞生长因子，和运输含有成纤维细胞生长因子药物成分到缺血心肌的方法。在美国，根据美国心脏协会报道，心脏病的发作主要归因于冠状动脉的狭窄或堵塞。当血液供应的心肌的血流严重减少或停止时，心肌梗塞便发生，从而引起心肌缺血或坏死。动脉硬化常常会导致血管的阻塞或狭窄，这种情况与脂肪在血管壁的沉积是相关的。依据美国国家心脏肺脏和血液研究所研究报告(1987-1994年)和弗雷明汉心脏研究报告统计表明，在美国的死亡病例中每4.8人就有一人死于冠心病(1995年有481287死亡)。据每年报告显示，约有100万个新的和复发性心脏病 患者和近14万灾民患有心肌缺血，心绞痛或其他形式的冠心病(710万男性和680万妇女)。此外，仅在美国，有多达3至4万人，可能有不知情的脑缺血发作(沉默缺血)。目前可以用来治疗冠心病和心肌缺血的方法主要包括：1)冠状动脉搭桥，是指从患者的腿部取一段静脉，用架桥的方式在狭窄周围实现血液的运输；2)经皮腔内冠状动脉成形术(球囊扩张术)，是用一根导管通过狭窄区域的动脉，然后利用气囊的充气与收缩功能，来扩大血管内腔；3)激光血管成形术，它是用一根在其前端具有激光的导管来切除动脉粥样硬化斑块；4)artherectomy，是用一个在导管底部高速运转的“转头”来磨走粥样斑块；5)血运重建，是指由于心肌缺血减少时，通过激光使血液从左心室渗透到缺血心肌而改善缺血状况。由于上述每种方法都有弊端，所以在实际临床中多采用两种或两种以上方法的联合应用。 

1995年，仅在美国的胸外科手术中就有约573000人进行搭桥手术，通过冠状动脉搭桥手术向缺血心肌供血有其优势，但也有很大的缺点，它要求高度的入侵性的打开心脏。事实上，一般在心脏搭桥手术时要求心跳停止，以便移植的血管与冠状动脉吻合。由于机体通过心肺维持供氧和血液循环，因此，搭桥患者面临增加肾、大脑和其他器官损伤的风险。除了上述的医疗风险，搭桥手术也是非常昂贵，而且需要大量的恢复时间。此外，对于许多处于手术晚期或弥漫性冠心病高风险阶段的病人，冠状动脉搭桥不是一个可行的选择。因此，这些病人必须寻求替代疗法。最常使用的是用微创替代搭桥手术，如经皮腔内冠状动脉成形术(球囊扩张术)。1995年在美国大约有434,000例球囊手术实施。与冠状动脉搭桥手术相比这种方法入侵较性较少而且价格比较便宜，但改善血流量的效果较小而且是短暂的，因此在实际临床应用中多采用球囊扩张术与支架联合应用，以减少球囊扩张后的再狭窄，支架的作用是在血管中用以维持血管直径和血流量。然而，往往由于血管壁中的内皮及平滑肌细胞渗入支架，导致血流 量减小。另外，球囊扩张术是不推荐用于治疗重症弥漫性心脏病或有大于50％闭塞的左前降支冠状动脉冠心病患者。因此，球囊扩张术广泛适用于减轻心肌缺血患者。其他两个以导管为基础的激光成形术和arthrectomy技术，是通过去除动脉粥样硬化斑块来增加血流。虽然这些技术可单独使用，但它们常常与球囊扩张术一起使用来增加管腔直径，不幸的是采用这种手术方法驱除硬化斑块后产生的碎片和瓣状物，会引起手术后小血管闭塞的危险。最后一种血液运输重建术的方法，是指用激光使心肌血运重建，与搭桥手术相比其创伤微小而且费用较低，并为那些处于高风险搭桥手术患者术的病人提供了一种选择。它是通过激光直接向缺血心肌提供血液，来实现心肌血运重建，这种方法在治疗冠状动脉弥漫性病变可能有用。激光心肌血运重建术，理论上的安全性和有效性在一段时间内尚未被证明。事实上，通过激光气化产生血管群可有效地缓解心肌缺血，这种方法只是治疗急性心肌缺血一种权宜措施。因此，在选择治疗冠心病患者，特别是那些处于高风险手术的患者，的确需要一种比搭桥手术有效，比微创便宜，并比球囊扩张术及血运重建术更有效的方式。在正常的生理条件下毛细血管需几个月或几年才更新一次。然而，在某些条件下，其增长速率会加快，这种生理过程发生在生长的胎盘、生长发育的胎儿、伤口愈合的过程中，以及组织缺血应答反应中。血管多肽生长因子对于血管的生长是必要的。这些生长因子是通过内皮细胞表面的高亲和力受体来实现细胞的大量增值、分化，并对细胞迁移具有影响。因此，本发明是针对生长因子刺激血管的再生来实现缺血心肌的血液重建。 

发明内容

本发明的目的在于提供成纤维细胞生长因子(FGF-1)在制备促进血管生成药物的应用。 

本发明的另一个目的在于提供含有FGF-1的药物组合物。 

本发明的目的还在于提供一种应用上述药物治疗冠心病的方法。 

本发明通过实验证实FGF-1能够诱使缺血组织生成血管，从而改善血流量。 

本发明进一步提供了一种含有FGF-1或者其活性片段的药物组合物，该组合物包括选自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金属阳离子(如Zn²⁺、Mn⁺和Mg²⁺)及低分子量肽的活性蛋白质保护剂，选自聚乙二醇、羧甲基纤维素碱金属盐、肝素、硫酸肝素或其类似物、硫酸多糖、谷胱甘肽的稳定剂混合，并加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂，制备成各种剂型。 

其中所述FGF-1具有SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列，或SEQID NO：2第20～155所示的氨基酸序列。重组纤维细胞生长因子-1蛋白或其片段生产的方法可参照专利00114010.8。 

本发明优选地是制备成注射剂，其含有金属阳离子，如锌离子、镁离子作为蛋白保护剂，还含有肝素作为稳定剂。使用时，可用生理盐水适当稀释，使得FGF-1的使用浓度为10～100mu.g/kg，肝素的使用浓度为1～1000U/ml。 

通过注射的方法，在缺血组织区域注入适量药剂，可诱使注射部位生成血管。注射剂量通常为0.1mu.g/kg到10mu.g/kg。可在注射前可先注射适量生理胶水，进一步，本发明还提供了一种治疗冠心病的方法，其包括如下步骤： 

1、全身麻醉后，进行开胸手术，并找出冠状动脉狭窄的部位； 

2、控制β受体，降低心跳速率达到的范围大约是每分钟心跳20-60次； 

3、在缺血心肌内注入药剂，注射时尽量靠近心脏冠状动脉狭窄部位。 

上面涉及的开胸手术，在左侧第5个肋骨前切开，打开左侧胸膜的区域和心包。如上所提到的，标明的步骤至少有一点动脉狭窄，进一步用缝 合线牵引由中心处向前收缩。如上所提到的，这种方法更进一步包括冠状动脉搭桥的实现。 

一般在缺血性区域注射六周后血管才再生，更多情况是在缺血性区域注射3个月后血管才再生。 

FGF-1最后注入的百分比范围大约是0.1mu..g/kg到10mg/kg。优选地，FGF-1最后注入的浓度范围大约是10到100mu.g/kg每人体重。 

本发明通过实验证实FGF-1能够促进血管的生成，显著改善血液流量。本发明用其来治疗冠心病，取得了显著的效果。 

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，这些实施例不能作为本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，下述实施方案中的手段为本领域所熟知的常规手段。 

最近的实验已经证明血管生长因子，在组织缺血的动物体内可以有效改善血流量。Yanagisawa-Miwa et al.(1992)Science 257：1401-1402证明在兔子的冠状动脉内注入生长因子后，冠状动脉的侧枝梗塞的数量减少。Baffour et al.(1992)J.Vascul.Surg.16：181-191还在动物体内观察到，在缺血的肢体内注射生长因子可以引起血管的再生。同样，兔子的缺血气管注射生长因子浓缩蛋白引起血流的明显改善(1994，Ann.Thorac.Surg.57：444-449)。因此，初步的动物实验表明血管生长因子，可有助于缺血组织中的血管生成。 

根据本发明的首选体现，心肌缺血是由一个或多个冠状动脉狭窄所导致的，通过应用含有血管生长因子有效量药剂成分与可选生理″胶水″达到或接近冠状动脉狭窄部位来定点治疗(见Schmacher et al.(1998)Circulation 97：645-650)。本发明发现酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1) 和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，能有效地促进血管生成。通过向冠状血管狭窄部位定点注射含有任何血管生成物质的药剂成分包括生理胶水在内，来治疗哺乳动物冠心病。许多生长因子已确定具有重大再生血管特性，其中包括：FGF-1和FGF-2(FGF称为肝素结合生长因子(HBGF)和血管内皮细胞生长因子(ECGF)。见Schlaudraff et al.(1993)Eur.J.Cardio-thorac.Surg.7：637-644；Fasol et al.(1994)J.Thorac.Cardiovasc.Surg.107：1432-1439)，血管内皮细胞以及平滑肌细胞是一种很强的有丝分裂细胞；血管内皮生长因子(VEGF)，能促血管内皮细胞分化，但不能用作用平滑肌细胞(例Isner et al.(1996)Lancet 348：370-374；Dvorak et al.(1991)J.Exp.Med.174：1275-1278)血管生成素-1，可以间接调节补充新血管细胞平滑肌的生成(Suri et al.(1996)Cell 87：1171-1180)；血管生成素-2，有可能阻止平滑肌细胞附着于微血管壁上(Maisonpierreet al.(1997)Science 277：55-60)；血小板生长因子(血小板源生长因子)，胰岛素样生长因子1和2(IGF-I and IGF-II)，转化生长因子α和β(TGF-.alpha.and TGF-.beta)及表皮生长因子(EGF)都被证明为内皮细胞及平滑肌细胞的生长的有效的调节剂。 

在血管狭窄部位应用血管生长因子最好的剂量是0.1mug-10mg/kg，最优地，血管生成因子最后剂量范围约1mu.g-1mg/kg。最优地，生长因子剂量范围大约10-100mu.g/kg。 

FGF-1脂质体，用以提高生长因子在缺血组织中的亲和力，并防止生长因子迅速进入全身循环。血管生成因子进入全身循环不可取的的原因有两个。首先，它会迅速稀释到一个无效的浓度，二是生长因子在特定位点以外的靶位点可刺激不良生长现象。 

实施例1应用药物组成 

方案1： 

方案2： 

方案3： 

实施例2手术方法 

常规全身麻醉病人被置于一个仰卧的手术台上，左侧略有升高，然后 在前方左侧做开胸切口。常规监测心脏程序，包括中央静脉和动脉系。在左侧第5个肋骨前做六至八公分的横弧形皮肤切口。轻微剥离少量肌肉，肋软骨在交界处与肋骨分离，进入左胸腔。打开心包，并用缝线向回心方向牵引。 

通过对冠状动脉系统及其分支引起的机能障碍进行探讨和鉴定，此技术使用于心脏的前部(LAD)、侧部和心尖部，另外右冠状动脉所属的隔面心肌缺血也可使用。经过麻醉师静脉注射β-受体阻滞剂，使心率减至约每分钟20-60次，最好是每分钟约40-60次。 

血管生成药物各成分按以上方法制备(在应用前制备)。用标准的20剂量针头注射器吸取适量血管生长因子的药物向缺血心肌内注射。一般最多注射3针，注射的部位分别为LAD、Cx(侧部)，和RCA(尖部)。每次注射应尽量靠近冠状动脉的狭窄区域。注射结束后，确定没有出血和心包没有开放，用胸管插入左胸腔，手术切口用通常方式缝合。皮肤切口可以用可被吸收的材料线缝合。胸管需要使用约12至24小时，病人在手术室内被拔管及术后监测一般为24小时，平均住院天数为3天。 

也可用导管技术把血管生成药物运送到血管狭窄部位。事实上，导管操控技术手段并不仅限于上述的运输血管生成物质，它还可以把其它的有效药物运输到血管狭窄部位。因此，经皮腔内导管运输术也包含上述所描述的方法。 

实施例3体外研究实验 

在体外实验中，我们证明促细胞生长因子对人隐静脉内皮细胞有增殖和有丝分裂的效应。内皮细胞培养5至9天后补充生长因子诱导单细胞融合，与阳性组(数据未显示)相比，对照组单细胞在7至11天仍前不融合。此外，我们采用3H-thymidine与上皮细胞核结合方法分析DNA合成率也证实了这一结果。加入肝素后hFGF-1的细胞增殖能力可进一步增强。 

不同浓度的重组的FGF-1(0.01，0.5，1.0毫克/公斤体重)，可采用皮下注射，肌肉注射，静脉注射当中的任何一种方式注射给27只新西兰白兔，其中的13只做溶剂的空白对照。此后，直肠的温度在注射后前3小时每半小时测量一次，然后是每小时测量一次，从第二天算起每8小时测量一次(持续12天)。与此同时白细胞计数也持续测量12天。除此之外，红细胞沉降率和c反应蛋白值也需在注射后的第三，第六，第九和第12天测定。 

在动物模型中，人生长因子产生的致热效应能够被彻底排除。因为在27个动物试验观察期间与对照组(n＝13)比较，在短期的间隔时间内，没有任何一例体温升高和炎症反应的迹象。这个结果不依赖于生长因子的浓度及给药途径(静脉，皮下或肌肉注射)。 

hFGF-1引起肿瘤的排除 

我们采用人肿瘤细胞株做刺激实验，来排除生长因子的致瘤作用。我们采用sup3H-thymidine测定法研究pleomorphocellular肉瘤，格拉维刺瘤，黑色素瘤和小细胞肺癌肿瘤细胞。在96孔板中，初始细胞数为每孔500个细胞。不同浓度生长因子(10和100ng hFGF-1)刺激培养的肿瘤细胞，持续刺激24小时。此外，把人肿瘤细胞株植入实验动物体内进一步排除其致瘤性。把初始剂量为3×10⁶细胞植入80只裸鼠皮下。为此，吸取0.1毫升肿瘤细胞培养基皮下注射到裸鼠右腹部。实验动物按肿瘤细胞株被随机分为4组：第1组(n＝20)只接受肿瘤细胞，第2组(n＝20)接受肿瘤细胞与hFGF-1，第3组(n＝20)接受悬浮的肿瘤细胞和生长因子，而第4组(n＝20)只接受生长因子。每隔4天取血一次，并称其体重。经过12周后，取出肿瘤，测定大小和重量。随后进行了组织学的测定实验。 

以上各种人体肿瘤细胞株进行的刺激试验结果：与对照组相比样品组DNA合成的速率增加，但未见任何肿瘤细胞系。此外，在裸鼠体内hFGF-1 也未能增加肿瘤细胞的生长。同样地，用生长因子处理后动物体内肿瘤组织学的变化和肿瘤特异多肽的变化水平均未观察到。排除了hFGF-1的致瘤效应，我们认为是FGF受体与hFGF-1结合下调导致生长因子降低肿瘤细胞的生长能力。因此，hFGF-1的治疗没有伴随任何肿瘤活性。 

实施例4动物实验中hFGF-1的血管生成潜能 

作为先前实验的补充，我们把FGF-1注射到近亲交配的路易鼠的局部缺血部位，共275只动物，包括125只对照组(用预处理的热变性FGF-1，70℃，3分钟)。经腹壁和膈肌打开心包，用两个钛夹夹在左心室心尖部位来诱发心肌缺血。生长因子被注入到局部位点。12周后通过血管造影术对冠状动脉血管系统成像，最后对同一心肌梗塞部位的样品进行组织学上的估价。 

在局部缺血的鼠心脏中，已经证明FGF-1可以诱发血管生成。在动物试验中，钛夹被用来引起心肌缺血后，生长因子被注入心肌内，12周后，通过主动脉造影术显示：与对照组相比，hFGF-1注射位点有明显的造影剂累积，而这种显影剂的积累在对照组动物中没有明显出现。组织学检查发现，经FGF-1注射的心肌毛细血管密度每平方毫米增加了三倍。 

实施例5临床应用中重组FGF-1与冠状动脉搭桥术联合治疗冠心病 

此研究选取20例(14男6女；最低年龄50岁)无任何既往性梗死或心脏手术的冠心病患者，生长因子与搭桥手术联合用于手术中。作为对照组，20名患者接受同一程度热变性的FGF-1(70℃3分钟)。完全随机选择治疗。 

每一位病人在接受手术前，手术人员都要预先解释这个过程的详情。两组病人要在临床症状、伴随症状、心血管疾病风险、心功能、性别和年龄方面进行比较。并进行冠状动脉的形态比较。 

所有患者在LAD的源端或远端三分之一处都有较严重的狭窄，而且 左心室的平均射血分数达50％。该冠状动脉旁路自体移植手术(每名患者有2-3根来自LAD的搭桥另一根来自左边的IMA(乳内动脉搭桥)在维持体外循环情况下按常规完成。在IMA或LAD附近和它们远端的心肌分别注入重组hFGF-1(平均浓度0.01毫克/公斤体重)。在对照组，我们用热变性重组hFGF-1。12周后，通过对所有IMA分流的患者，进行选择性地数字减影血管造影成像。 

通过电算化辅助数字灰度值分析的方式进行血管成像和评价，这是一种证明毛细血管新生普遍认证的较好的技术。然后对所有患者移植的血管的管腔及其远端吻合端周围心肌内注入显影剂。在每个目标位点选择100图素进行数字分析。完全黑的x光片被定为灰度值为150，胶片中没有黑度的区域灰度值为零。在术后前5天期间，除了术后例行程序，还需进行每日两次的实验室检查和每天三次的体温检测。 

重组HFGF-1首次在临床上被应用于人体心脏，新生血管与正常的血管都可以被血管造影技术所显示。通过对20例IMA旁路的患者，选择地进行数字减影血管造影成像，得出的结果如下：在注射FGF-1的IMA/LAD的近端与远端区，都有相当大量的显影剂积累，并从动脉向外周延伸3至4厘米。在对照的造影病人，只给予热变性重组hFGF-1，IMA/LAD吻合也是可辨认的，但上述描述的显影剂的积累不存在。造影治疗组与对照组记录速率为每秒四像，它显示了从造影剂注射的部位到血管末端的距离。 

基于以上体外和体内实验，重组hFGF-1的疗效对先天性缺血性心脏病人血管生成显著，并首次确立用于治疗冠心病患者。 

                序列表 

Claims (1)

1.一种促进血管生成的药物，其由下列组分组成：

其中，所述FGF-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示。