CN101218028B

CN101218028B - 用于高通量筛选的细胞基平台

Info

Publication number: CN101218028B
Application number: CN2006800250231A
Authority: CN
Inventors: Y·古; J·周; L·许
Original assignee: Honeywell International Inc
Current assignee: Honeywell International Inc
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-05
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2026-05-05
Also published as: US7629115B2; JP2008539755A; WO2006124318A2; WO2006124318A3; US20060286661A1; CN101218028A; EP1879696A2

Abstract

本发明涉及一种测试多样品化合物的生物学效应的设备，所述设备包括具有基本上平面的顶面(3)和底面(5)的多孔部件(1)。顶面(3)包括多个细胞粘着区(7)和细胞解粘区(9)，而底面(5)提供装载样品化合物的多个位点(11)。这些位点位于多孔部件顶面上的细胞粘着区的对面。在某些实施方案中，本发明还包括至少一个可溶解层(13)，其提供装载样品化合物的多个位点。

Description

用于高通量筛选的细胞基平台

发明领域

高通量筛选技术的发展部分解决了在制药工业上筛选大量化合物生物活性的问题。通过使用微阵列技术和多种特异性测定法，大量的化合物在同样的条件下进行平行测试，以判断它们是否具有有效的生物活性。在活的细胞中测量生物活性的试验要求以数以千计的不同候选药物温育这些细胞。这种温育传统上在标准化的96、384和1536个孔构型的多孔滴定板上完成。多孔板与自动流体分配系统以及标准化试验联合使用，以快速筛选样品化合物。

发明概述

本发明在一个方面涉及一种测试多样品化合物的生物学效应的设备，该设备包括具有基本上平面的顶面和底面的多孔部件(porousblock)。顶面包括多个细胞粘着区和细胞解粘区，而底面提供装载样品化合物的多个位点。这些位点位于多孔部件顶面上的细胞粘着区的对面。

本发明在另一个方面涉及一种如上所述的设备，但还包括至少一个可溶解层，其提供装载样品化合物的多个位点。这些位点位于多孔部件顶面上的细胞粘着区的对面。

在某些实施方案中，上述设备还包括包围多孔部件的框体。在其它实施方案中，上述设备还包括高出并环绕顶面的壁。壁和顶面的组合体能够容纳液体。

附图简述

图1是具有装载样品化合物的多个亲水性位点(11)的设备的截面示意图，位点(11)位于亲水性细胞粘着区(7)的对面。

图2是具有可溶解层(13)的设备的截面示意图。

图3是具有框体(15)和从框体延伸的壁(17)的设备的截面示意图。

图4是具有框体(15)的设备的俯视图，显示了亲水性细胞粘着区(7)和疏水性细胞解粘区(9)。

图5图示样品化合物从位于设备的底面(5)上的单个位点(11)向位于设备的顶面(3)上单个亲水性细胞粘着区(7)的扩散。

发明详述

本发明涉及各种类型用于测试多样品化合物的生物学效应的设备。这些设备用于判断预定的测试化合物是否会影响细胞生物活性。生物学效应是在细胞中或细胞上任何可测量的变化。这种变化包括但不限于细胞外表或结构上的变化、细胞活性上的变化、基因表达水平上的变化、细胞蛋白表达水平上的变化、细胞蛋白活性上的变化以及细胞蛋白稳定性上的变化。

现有的96-孔板和384-孔板局限于它们迅速有效地筛选大量的与目的细胞系相关的化合物的能力。此外，当转移到1536-孔板时，四倍处理(four-fold processing)改进会被极大的流体处理问题所抵消。用于1536-孔形式的工作体积典型地小于10微升。在如此低的体积下，化学挥发性、溶剂蒸发以及气泡将促进大的样品间统计学差异。这些问题由于对应于引起高孔间剂量差异的单一孔细胞群体高方差细胞数目分布而变得加剧。这些实际的限制在随后的试验测量中促进高统计学差异，潜在地破坏精度和可靠性。

本发明的设备和方法通过前述的多孔形式，而不是用多孔基质作为用于候选药物置放的位点以及细胞和其它试验试剂的支持物，而解决了许多与高密度多孔筛选方法相关联的流体处理问题。在多孔基质部件两侧面的表面特性工程化，有助于定位试验试剂与样品间的相互作用，以及将目测检验区域限定在多孔部件表面细胞侧面的预定区域。

如图1所示，本发明的设备包括具有基本上平面的顶面(3)和底面(5)的多孔部件(1)。顶面包括多个细胞粘着区(7)和细胞解粘区(9)，而底面加入装载样品化合物的多个位点(11)。这些位点(11)位于细胞粘着区的对面。样品化合物置于设计成将化合物吸引和吸附进多孔基质内的位点(11)中的多孔基质底部表面上。吸附后，细胞在多孔部件的顶面上展开。在培养箱内温育后细胞粘附于顶面。样品化合物经过多孔基质扩散到多孔基质的顶面，并与固定于顶面的细胞相互作用。本发明的方法允许在样品置于底面(5)上后，再制备试验表面(顶面)(3)。

本发明的设备的各个元件描述如下。

多孔部件可以由任何材料制成，只要该材料对于待测试的化合物是可渗透的。多孔部件可包括如下所述的聚合物、凝胶或者膜。

在一个实施方案中，多孔部件由聚合物化合物制成。合适的聚合物是聚酰胺、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVAc)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚亚乙烯基、聚异丁烯酸甲酯以及聚对苯二甲酸乙二醇酯。在优选的实施方案中，聚合物层是透明或半透明的，以有助于视觉上的观察。聚合物层用常规的聚合物模塑技术如热压花、注塑、拉伸模塑(extension molding)以及本领域已知的方法制备。

在优选的实施方案中，聚合物是聚酰胺或EVAc。在特别优选的实施方案中，聚合物是尼龙。

在其它实施方案中，多孔部件是凝胶形式。这种凝胶的实例包括明胶、琼脂糖以及丙烯酰胺凝胶。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶是物理上或化学上交联的海绵状的结构。虽然它们可以包含高达99.5％的水，但是这些凝胶孔的尺寸与许多蛋白和核酸的尺寸相似。凝胶通过对基质浓度的适当选择而裁剪成宽范围尺寸的筛分子。凝胶的平均孔径由在凝胶中固体的百分比所决定，对于聚丙烯酰胺而言，其凝胶的平均孔径也由交联剂的量所决定。在优选的实施方案中，凝胶是琼脂糖、明胶、α-氢-ω-羟基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物和刺激敏感性水凝胶以及改性的淀粉/纤维素。在特别优选的实施方案中，凝胶是由纤维素衍生物制成。在另一优选的实施方案中，凝胶是刺激敏感性水凝胶。在另一特别优选的实施方案中，刺激敏感性水凝胶选自聚(n-异丙基芳基酰胺)和聚丙烯酸。

在又一个实施方案中，多孔部件是膜。在优选的实施方案中，膜是尼龙、纤维素、EVAc、PET或聚砜。在特别优选的实施方案中，膜是具有允许样品化合物经膜扩散或通过的特定孔径的尼龙。

多孔部件顶面的细胞粘着区是细胞可粘合或粘附其上的区域。多孔部件的顶面可以固有的包括细胞粘着区或者多孔部件的顶面可以改性形成细胞粘着区。细胞粘着区设计成允许细胞缔合或粘附于顶面上。多种方法可以被用来制备细胞粘着区。此类方法的实例包括细胞粘着区的亲水化。亲水化的方法包括合成聚合物的附接、蛋白的附接、化学修饰、光化学修饰、活性等离子体改性以及物理改性。这些细胞粘着区制备方法中的每一种在下文详细论述。

在某些实施方案中，顶面经过局部亲水化改性以形成细胞粘着区。亲水化指的是改性或使用亲水的表面，即包含带电荷或极性分子的区域。在优选的实施方案中，顶面通过局部加入至少一种肽进行改性以形成细胞粘着区。

在某些实施方案中，表面通过用合成聚合物来制成亲水性。具体地说，该表面局部涂上一层便于细胞粘附的聚合物，如聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯。此类合成聚合物涂层在塑性的表面上产生均匀的净正电荷，对于某些类型的细胞而言，尤其在无血清和低血清条件下，塑性的表面能够增强细胞的附着、生长和分化。聚-D-赖氨酸表面通常改善初级神经元、神经胶质细胞、成神经细胞瘤及包括HEK-293的各种转染细胞系的附着和生长。在本发明优选的实施方案中，细胞粘着基元被嫁接到因可湿性不同而形成的区域内的多孔基质项面上。细胞粘着基元促进了均匀的细胞单层在表面形成，以及还允许样品化合物与粘附的细胞生物实际的相互作用。

在优选的实施方案中，顶面经过局部加入至少一种肽或蛋白进行改性，以形成细胞粘着区。

RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；SEQ ID NO：1)序列在几种重要的细胞外基质蛋白中发现，并给细胞表面受体的整联蛋白家族的成员作粘着配体。典型的RGD序列是Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro(GRGDSP；SEQ ID NO：2)。环状RGD也可以用作细胞粘着基元。典型的序列是Arg-Gly-Asp-(D-Phe)-Val(SEQ ID NO：3)。RGD改性表面引导细胞单层在膜上原位形成。

整联蛋白是异二聚体跨膜糖蛋白大家族，其将细胞附着于基底膜的细胞外基质蛋白或者附着于其它细胞的配体上。整联蛋白包括大小分别为120-170kDa和90-100kDa的大(α)和小(β)亚基。一些整联蛋白直接介导细胞与细胞识别和相互作用。整联蛋白包括用于二价阳离子Mg²⁺和Ca²⁺的结合位点，这是整联蛋白的粘附功能所必需的。哺乳动物整联蛋白形成分享与不同的α亚基缔合的共同β亚基的几个亚家族。β2整联蛋白仅在白细胞上表达，并经历包括活化后β亚基的磷酸化的构象变化。然而，此磷酸化对于构象活化既不是必要也不是充分的条件。活化状态受控于直接相邻于α链的跨膜域的Gly-Phe-Phe-Lys-Arg(GFFKR；SEQ ID NO：4)位点。

在某些实施方案中，表面经过糖蛋白如粘连蛋白、层粘连蛋白(lamnin)、玻连蛋白(vitronecin)、胶原蛋白改性或吸收它们，以便于细胞粘附。它们是细胞外基质的元件并与整联蛋白相互作用。在其它实施方案中，表面经过局部糖化改性。

在另一个优选的实施方案中，顶面经过化学基团改性以形成细胞粘着区。在特别优选的实施方案中，化学基团选自羟基、酮基、醛基、羧基和胺基。在尤其优选的实施方案中，化学基团是羟基。或者，本发明的优选实施方案通过选择性暴露均聚物而制成，该均聚物包含侧链，该侧链可用酸、碱或其它如活性等离子体、激光和紫外辐射的物理方法解离。选择性解离限定的区域内分子中疏水性侧链将导致亲水性表面特性。例如，将聚醋酸乙烯酯(PVAc)表面暴露于如氢氧化钾的强碱，则产生羟基并使得PVAc表面具有亲水性。

在替代方法中，在由均相的、疏水的、透紫外光聚合物组成的多孔基质中用紫外光裂解疏水性侧链。侧链的裂解使得紫外暴露的区域具有亲水性，而遮蔽的区域保持疏水性和完整侧链。

另外一种形成细胞粘着区的方法利用活性等离子体处理。等离子体是部分离子化的气体，包含离子、电子、原子和中性类物质。活性等离子体对于聚合物表面为高反应性。例如，氧等离子体处理涉及在氧存在下使用等离子体在膜表面形成过氧化物。过氧化物接着分解形成含氧自由基。聚合物等离子体处理通常使用的气体包括氧气、氩气、一氧化氮、四氟化碳和空气。如聚四氟乙烯(PTFE)的疏水性聚合物表面的氧等离子体处理使得被处理的表面具有亲水性。

在另一个优选的实施方案中，顶面经过物理改性来改性以形成细胞粘着区和解粘区。物理改性包括制备具有第二聚合物的互穿网络(IPN)和提供细胞粘附必需的摩擦力的机械刮擦。在优选的实施方案中，物理改性是IPN的产生。在这个实施方案中，疏水性单体浸入到亲水性底物中，然后用光刻法聚合。未暴露于光刻中的区域中单体并不聚合，然后用溶剂洗涤，剩下带图案的聚合疏水性区域。

细胞解粘区设计成允许缔合或粘附于顶面的细胞分离。换句话说，在顶面提供细胞不能缔合或粘附的区域，该区域允许细胞簇的离散以使相互分离。多种方法可用来制备细胞解粘区，包括用于制备细胞粘着区的方法。这些方法的实例包括顶面疏水化以形成细胞解粘区。疏水化方法包括光化学修饰和激光烧蚀。在优选的实施方案中，光化学修饰包括局部聚合和局部形成IPN。细胞解粘区的每种制备方法在下文详细论述。

光刻方法用于在疏水性表面选择性形成亲水性区域，反之亦然。当如乙炔(C₂H₂)、三氟氯乙烯(C₂F₃Cl)或四氟乙烯(C₂F₄)的二聚体气体在真空中用远紫外光源(250-200纳米(nm)波长)照射下，光刻技术用模板或掩具选择性遮蔽表面的部分避免形成的聚合物沉积。紫外光引发气体中的聚合反应，并在形成足够的链长后，聚合物分子沉积在被处理的表面。这个技术用于在亲水性底物上选择性形成疏水性表面区域，反之亦然。例如，用四氟乙烯作为反应物二聚体气体的光刻法会导致疏水性聚四氟乙烯(PTFE)的沉积，聚四氟乙烯(PTFE)用于在如纤维素或聚丙烯腈的亲水性表面选择性地限定疏水性区域。

通过用同样的已述光刻技术，将大量的疏水性和亲水性区域加入到多孔基质中，但是，将紫外光施用于用可聚合化合物浸泡的透明多孔基质。将这样预处理的基质暴露到紫外光中能将包含于基质中的可聚合化合物聚合，根据所选择可聚合化合物存在的化学/物理性质，而使得暴露区域具有疏水性或亲水性。未聚合的化合物可以在使用之前从多孔基质中洗掉，或者，未聚合的化合物可被透析而使具有亲水性。在这种方法中，当紫外暴露后形成第二聚合物网络，其与预先存在的多孔基质网络互穿。这种构型称为互穿聚合物网络(IPN)。

多孔部件顶面的细胞解粘区(9)是细胞粘合或粘着能力低于细胞粘着区的区域。在优选的实施方案中，细胞不可测量地粘合至细胞解粘区。多孔部件顶面可固有地包括细胞解粘区，或者多孔部件顶面可改性形成细胞解粘区。

在某些实施方案中，顶面经过局部疏水化改性以形成细胞解粘区。

或者，本发明的优选的实施方案用激光烧蚀技术来制备。广义上说，激光烧蚀涉及使用高能量光去除或转化表面上的材料。聚合物的激光烧蚀导致聚合物的化学溶解，因此用于使暴露的多孔基质区域由疏水性转变成亲水性，反之亦然。激光烧蚀也可用于使具有所需润湿特性的材料沉积于多孔基质表面。这个方法涉及撞击包含待转变材料的靶体的激光辐射、能量吸收、局部的表面加热及所得材料的蒸发。这种材料形成沉积至靶体多孔基质底物上的羽绒状。

参见图1，化合物装载到多孔部件(1)的底面(5)上多个位点(11)、窗孔或孔上。化合物装载到位点(11)，并通过多孔材料的毛细管作用吸进部件(参见图5)。在优选的实施方案中，在多孔部件(1)的底面(5)上有数以千计的小位点(11)、窗孔或孔。这些位点位于多孔部件(1)的顶面(3)上细胞粘着区(7)的对面。

在本发明的实施方案中，多孔基质层顶面的亲水性区域与排列在多孔基质层底面上的几何形状相同的亲水性区域垂直对齐。顶面的亲水性区域有助于能吸引试验元件的表面特性的形成。底面的亲水性区域有助于定位样品化合物及其载体溶剂，该溶剂采用微量吸管或自动的微流体处理技术置于多孔基质层上。顶面和底面区域的对齐使置于底面的样品化合物间的相互作用最佳，随后通过确保试验元件暴露到对应于扩散锥体中心轴的最大样品剂量，使样品化合物经过多孔层扩散到固定于顶面的试验元件(如细胞)中。

在本发明的另一个实施方案中，多孔基质层顶面上环形亲水性区域与排列在多孔基质层底面上的几何形状相同的疏水性区域垂直对齐。如前面实施方案，顶面亲水性区域有助于能吸引试验元件的表面特性形成，或者在这些预定区域内起固定试验元件如细胞的作用。多孔部件底面的疏水性区域有助于定位溶剂携载的样品化合物，该溶剂采用微量吸管或自动的微流体处理技术置于表面上。该顶面和底面区域对齐优化了样品和试验元件的相互作用。

任何类型的细胞可用于本申请。细胞可以是无限增殖化细胞或初级细胞。在某些实施方案中，细胞已经用目的基因转染。

在优选的实施方案中，细胞是粘着细胞。在另一个优选的实施方案中，细胞是真核细胞。在特别优选的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在尤其优选的实施方案中，细胞是人细胞。

本发明所利用的细胞的实例包括但不限于BHK、C2C12、CHO、COS-1、COS-7、F9、HEK293、HeLa、Jurkat、L8、L929、NIH3T3、PC-12、Sf9细胞。

应认识到，本领域技术人员也能改变本发明来判断非细胞材料与样品化合物的相互作用。例如，作为将细胞接种到顶面的细胞粘着区的替代，也可将肽和其它化合物粘附于细胞粘着区，并测试与样品化合物的相互作用。

参见图2，设备可包括提供装载样品化合物的多个位点的可溶解层(13)。这些位点位于多孔部件(1)的顶面(3)上的细胞粘着区的对面。

可溶解层的目的是为了控制药物通过该层的扩散。在优选的实施方案中，在细胞置于板上后，可溶解层溶解大约1到约2小时以确保细胞固定在板上。

可溶解层可以是温度敏感、湿度敏感、pH敏感或对特定的化学品(例如离子、葡萄糖或尿素)敏感。在某些实施方案中，可溶解层是琼脂糖、明胶、壳多糖、聚丙烯酸和聚(N-异丙基丙烯酰胺)或Pluronic^TM(α-氢-ω-羟基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物)。

参见图3和4(图3是图4的截面示意图)，在优选的实施方案中，设备还包括包围多孔部件的框体(15)。框体提供结构支撑，以使得多孔部件在各种操作期间维持在基本平面的位置。

在另一个实施方案中，设备还包括围绕多孔基质部件整个顶面的固持壁(17)。该壁允许试验试剂悬浮液分配到表面上，并当细胞、蛋白或其它生物元件与顶面上限定的细胞粘着区相互作用时保持和顶面接触。当悬浮液慢慢倒出，并且任选冲洗表面时，细胞、蛋白或其它生物元件维持并固定在限定的细胞粘着区内。现在扩散通过多孔基质层的样品化合物能和在多孔部件顶部上的这些细胞、蛋白或其它生物元件相互作用。在某些实施方案中，多孔部件包括壁。在另一个实施方案中，框体包括壁。

在另一个实施方案中，设备的顶面和/或底面覆盖有盖子(19)或薄膜。盖子(19)或薄膜防止温育的细胞或装载的化合物受到污染并保持设备无菌。

按照本发明的化合物，如同与本发明设备相关描述中的“样品化合物”、“测试化合物”或“候选药物化合物”的本文上下文所用的化合物。因此，这些化合物包括合成得来的或来自天然来源的有机或无机化合物。

组合化学的出现已促使在设计用于识别潜在有前景的候选药物的高通量筛选方法的进展。组合化学依靠自动化的方法有系统地和有效地产生大量的潜在药物先导化合物。

例如，期望能够筛选大量的天然存在的化合物，如在非传统医药上使用的那些。另外，期望能够筛选大量的已知预先存在的药物和化合物的超出它们当前已知活性的生物活性。也期望能够筛选大量核酸和核酸类似物，包括正义(sense)和反义寡核苷酸、RNAi、siRNAs、质粒和硫代磷酸寡核苷酸。

这种筛选试验包括适于高通量筛选化学库，使得它们特别适用于识别小分子候选药物的试验。考虑的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽，优选可溶解的肽、(多)肽-免疫球蛋白融合体、抗体(包括但不限于多-和单克隆抗体)、抗体片段(例如FAb片段和F(ab)2片段)单链抗体、抗独特型抗体和这些抗体或片段的嵌合或人源化形式，以及人抗体和抗体片段。这些试验可以各种形式进行，包括蛋白-蛋白结合试验、生化筛选试验、免疫试验和细胞基试验，这些在本领域中都有充分的表征。

混合物元件可以按任何提供必需活性的顺序加入。温育可以在任何便于最佳结合的温度下进行，典型地在约4℃和40℃之间，更常用的是在约30℃和40℃之间。温育期同样选择适于最佳结合并也最小化至便于迅速、高通量筛选的时间，典型在约0.1到48小时，优选在12到36小时之间，更优选在20到24小时之间。在温育后，候选化合物的作用用便利的试验来测定。这种试验包括但不限于以下实验：测量细胞外表或结构上的变化、细胞活性的变化、基因表达水平的变化、细胞蛋白表达水平的变化、细胞蛋白活性的变化以及细胞蛋白稳定性的变化。

结合至细胞上的适宜化合物包括多肽或多核苷酸片段或小分子，例如肽模拟物。分子量通常少于100kD，更优选少于10kD的小分子化合物优选作为治疗剂，因为它们更可能渗透到细胞，且不易受各种细胞机理降解，也不会像蛋白或多肽那样引起免疫反应。小分子包括但不限于合成有机或无机化合物。也可用大分子化合物(化合物分子量大于100kD)。许多药物公司有广泛的这种分子库，其可方便地用本发明的试验来筛选。非限定性的实例包括蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理试剂和它们的代谢物、转录及翻译控制序列。

识别与细胞相互作用的化合物的技术可利用嵌合底物(例如已附加表位融合的或融合的免疫粘附素)。测量任选标记(例如放射性标记)的候选分子与细胞的结合。

在本发明的实施方案中，在细胞粘附后，样品通过多孔部件释放并扩散。样品与细胞相互作用，产生的生物学效应表示样品化合物潜在的药物效力。本发明的设备证明了对已知化合物或其它控制条件高度可预期和再现性的反应，证明了在阳性和阴性反应之间清晰的阈值。本发明也证明了对于用至少几百种化合物多样化的集合如美国食品与药物管理局(FDA)批准药物或其它生物活性分子集合的高通量筛选(HTS)试验的适宜性和再现性。本发明的某些实施方案需要有进行HTS所必要的试剂如酶指示剂的可得性、试剂读出必需的化学品以及产生足够的反应底物(DNA、RNA、蛋白或酶底物)的能力。本领域技术人员可利用各种已知方法来评价样品的显著意义，其证明初级高通量筛选中的药理活性。这些方法可用于评价多种成功的(hit)化合物，这些化合物在初级HTS试验中可被鉴别。次级筛选也可用于排除人工现象，并且为了优先考虑化合物进一步的测试，可包括合适的反筛选。

生物学效应包括通过显微镜观测监控细胞数目、构型、尺寸、粘附性、形态或死亡而测得的效果。

除了显微镜观测之外，生物学效应可用试验来测量。试验测量候选化合物诱导细胞代谢活性、细胞粘附、细胞增殖、细胞生长或细胞死亡(坏死或凋亡)的能力。这些试验包括MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四钠)试验、胱冬酶试验、Cr51-释放试验、ATP试验、片段化DNA试验及其它已知的测量细胞死亡的方法。

这些试验也包括监控或跟踪特定分子标记，例如基因表达报道分子、酶活性报道分子或细胞信号分子。

如上所述，多孔部件包括具有多个细胞粘着区和细胞解粘区的顶面。这些区域可从顶面延伸到底面或从顶面延伸到顶面和底面之间的一些点。在优选的实施方案中，亲水性区域在顶面和底面上对齐，并通过整个多孔基质层邻接。如同前述实施方案，亲水性顶面和底面区域有助于固定试验试剂及定位样品的放置。这些亲水性区域经过多孔基质的延伸通过将样品化合物保持在亲水性区域内来促进扩散，由此使样品化合物在顶面的产率最大化，及使由于样品化合物通过多孔基质的明显径向扩散所引起的样品对样品污染的程度最小化。这个实施方案在多孔基质中及其表面都是不连续的。

实施例

实施例1-多孔部件的形成

多孔部件由直径为10毫米、大约100微米厚、具有典型的0.45微米孔径的亲水性多孔尼龙膜制成。然后将膜浸泡在单体异丁烯酸甲酯(MMA)中。尼龙膜然后在无菌条件下夹在两玻璃板之间。

实施例2-细胞粘着区形成

为了产生细胞粘着区，将MMA浸泡过的尼龙膜暴露于300微米直径的激光束中，将该膜在特定的区域选择性加热到70℃，保持5秒。在这些选择性加热的区域，MMA聚合并形成疏水性区域，而MMA浸泡过的尼龙膜未暴露于激光束的区域保持完整并且仍是亲水性的。在这种方法中产生的多孔部件包括96个亲水性细胞粘着区。然后从玻璃板上取下膜，并用乙醇洗涤去除过量的MMA。然后形成具有带图案的疏水性区域的亲水性尼龙膜。

然后从模具取下带图案的膜，并插入包括壁的框体。框体为多孔部件提供另外的支撑，而壁允许容纳液体。

实施例3-细胞的接种

在补充10％胎牛血清的DMEM培养基中，以1-10×10⁴细胞/毫升的密度将NIH3T3成纤维细胞接种到多孔部件上，并在37℃、5％CO₂培养箱中温育过夜。

第二天培养基发生变化。

实施例4-样品化合物的装载

各种化合物库可由合成或化学分离和纯化获得。将这些化合物溶解在无菌的PBS中，并用液体转移装置或阵列器(arrayer)涂覆到多孔部件底面的96个不同的位点，这些位点直接位于细胞粘着区的对面。多孔部件可倒置(即底面在顶上)，以方便装载。然后将多孔部件放回到培养箱中，保持至少6小时。

实施例5-MTT试验

细胞用PBS洗涤3次，然后向包含细胞的板中加入5毫克/毫升MTT溶液(DMEM培养基∶MTT溶液比为5∶1)，随后板和细胞在CO₂培养箱中在37℃下温育5小时。然后用针和注射器去除培养基。在这时，向每个孔中加入DMSO(DMEM培养基∶MTT溶液比为2∶1)。可能需要用滴管上下吸取以溶解任何结晶。然后将板在37℃下温育5分钟，并转移到板阅读器，测得在550nm的吸光度。

Claims

1.一种测试多样品化合物的生物学效应的设备，所述设备包括具有基本上平面的顶面和底面的多孔部件，所述顶面包括许多细胞粘着区和细胞解粘区，所述底面提供装载所述样品化合物的多个位点，所述位点位于所述多孔部件所述顶面上的所述细胞粘着区的对面；

其中当样品化合物被装载到所述位点时，它们穿过所述多孔部件朝向位于对面的所述细胞粘着区扩散。

2.权利要求1的设备，所述设备还包括包围所述多孔部件的框体。

3.权利要求1的设备，所述设备还包括高出并环绕所述顶面的壁，其中所述壁和所述顶面的组合体能够容纳液体。

4.权利要求1的设备，其中所述顶面改性形成所述细胞粘着区。

5.权利要求1的设备，其中所述多孔部件可让分子量小于100kDa的化合物渗透。

6.权利要求1的设备，其中所述多孔部件包括聚合物。

7.权利要求6的设备，其中所述聚合物选自聚酰胺(尼龙)、聚碳酸酯、EVAc、PET和聚砜。

8.权利要求1的设备，其中所述多孔部件包括凝胶。

9.权利要求8的设备，其中所述凝胶选自琼脂糖、明胶、α-氢-ω-羟基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、刺激敏感性水凝胶和改性淀粉/纤维素。

10.权利要求9的设备，其中所述刺激敏感性水凝胶选自聚(n-异丙基芳基酰胺)和聚丙烯酸。

11.权利要求1的设备，其中所述多孔部件包括膜。

12.权利要求11的设备，其中所述膜选自尼龙、纤维素、EVAc、PET和聚砜。

13.权利要求5的设备，其中所述细胞粘着区从所述顶面延伸到所述底面。

14.权利要求5的设备，其中所述顶面经过局部亲水化改性形成所述细胞粘着区。

15.权利要求1的设备，其中所述顶面改性形成所述细胞解粘区。

16.权利要求15的设备，其中所述顶面经过局部疏水化改性形成所述细胞解粘区。

17.权利要求5的设备，其中所述顶面通过局部加入至少一种肽改性形成所述细胞粘着区。

18.权利要求17的设备，其中所述至少一种肽选自RGD和聚赖氨酸。

19.权利要求5的设备，其中所述顶面经过局部糖化改性形成所述细胞粘着区。

20.权利要求5的设备，其中所述顶面经过局部蛋白修饰或吸附改性形成所述细胞粘着区。

21.权利要求20的设备，其中所述局部蛋白修饰包括修饰至少一种选自粘连蛋白和胶原蛋白的蛋白。

22.权利要求5的设备，其中所述顶面经过化学基团改性形成所述细胞粘着区。

23.权利要求22的设备，其中所述化学基团选自羟基、酮基、醛基、羧基和胺基。

24.权利要求5的设备，其中所述顶面经过物理改性来改性形成所述细胞粘着区。

25.权利要求24的设备，其中所述物理改性是选自机械刮擦、化学腐蚀或者激光烧蚀的方法。

26.权利要求1的设备，其中所述细胞粘着区和所述细胞解粘区通过选自光刻法、区域性聚合和区域性形成互穿网络的方法制备。

27.权利要求1的设备，其中所述多样品装载到所述多个位点上。

28.权利要求1的设备，其中所述多个位点是亲水性的点或孔。

29.权利要求1的设备，其中所述多个位点是疏水性的点或孔。

30.权利要求5的设备，其中所述顶面经过局部疏水化改性，形成所述细胞粘着区。

31.权利要求15的设备，其中所述顶面经过局部亲水化改性，形成所述细胞解粘区。

32.一种测试多样品化合物的生物学效应的设备，所述设备包括：

(a)具有基本上平面的顶面和底面的多孔部件，所述顶面包括许多细胞粘着区和细胞解粘区；以及

(b)至少一个可溶解层，所述可溶解层提供装载所述样品化合物的多个位点，所述位点位于所述多孔部件所述顶面上的所述细胞粘着区的对面，其中所述可溶解层相邻于所述底面并且所述可溶解层控制所述样品化合物扩散穿过所述多孔部件。

33.权利要求32的设备，其中所述可溶解层包括温度、湿度或pH敏感性聚合物。

34.权利要求32的设备，其中所述可溶解层包括可降解聚合物。

35.权利要求32的设备，其中所述可溶解层对所述样品化合物不渗透。

36.权利要求32的设备，其中在所述可溶解层溶解后，所述可溶解层允许所述样品化合物扩散。

37.权利要求32的设备，其中所述可溶解层具有在其溶解状态和非溶解状态之间不同的扩散系数。

38.权利要求33的设备，其中所述聚合物选自琼脂糖、明胶、壳多糖、聚丙烯酸和聚(N-异丙基丙烯酰胺)。

39.权利要求34的设备，其中所述可降解聚合物包括α-氢-ω-羟基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。