CN101200501A - 双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺 - Google Patents
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Abstract
一种双(3，5－二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于它包括以下步骤：(1)取一定体积具有适当浓度的纯化血红蛋白，加入一定浓度的有机磷酸盐，加入一定浓度具有缓冲能力的物质，调节其pH；(2)在低温下，对血红蛋白溶液进行较彻底脱氧；(3)按一定物质的量比加入DBBF；(4)用氨基酸中止反应。其优越性在于：(1)DBBF替代PLP对人脐带血血红蛋白进行修饰，提高四聚体的稳定性；(2)DBBF能够特异地分子内交联α199位Lys和α299位Lys，亲氧性明显降低。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及修饰人脐带血血红蛋白的方法，尤其是一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺。
(二)背景技术：
在外科手术中，输入全血仍然是非常重要的医疗手段。全血输入存在着很大的局限性：来源有限，储存困难，应用时须交叉配型，同时可能引起血液类疾病的传播。因此，研制安全有效的血液替代品引起了科研工作者的广泛兴趣。基于血红蛋白(Hb)类的载氧体，被认为是潜在的理想血液替代品。目前，基于Hb类的血液替代品，得到了广泛的研究，已有多种产品进入临床阶段，例如Oxyglobin(Biopure)和PolyHeme(Northfield)。但是，原料Hb来源主要为人血和动物血。随着全血输入需求量的增加，人血是远远不够的。采用动物血研制血液替代品也同样存在一定的局限性。杨成民等首先采用人脐带血为原料提取Hb，为血液替代品研究奠定了基础。据文献报导：在中国每年的新生儿超过2000万，以每个胎盘可以采血量150ml计算，来源十分可观，同时又避免了采用动物血所造成的潜在问题。
无基质血红蛋白(SFHb)虽然具有很好的携氧能力，却并不能直接应用于临床，这主要是因为：SFHb四聚体在红细胞外不稳定，易解聚为二聚体，经肾脏排出体外，形成血尿；SFHb具有高的亲氧性(低P50)，很难向组织有效地释氧。因此以血红蛋白为基础的血液代用品的研究工作都主要集中于降低氧亲和力、稳定四聚体结构和延长其循环半衰期。
目前，血液来源主要来源为成人血和动物血(主要为牛和猪)。这类血红蛋白在结构上由四个亚基(α1α2β1β2)组成。而人脐带血血红蛋白在结构上与其存在很大差异，它是由80％四亚基(α1α2γ1γ2)和20％四亚基(α1α2β1β2)组成。结构上的差异主要在γ链上区别于β链的结构部分。而这些结构上的差异就决定了物质性质上的差别。1988年，Biopure公司的戊二醛聚合牛血红蛋白产品HemopureTM(HBOC-201)经FDA的批准开始进行III期临床试验。牛血血红蛋白不存在2，3-DPG，其亲氧性主要受溶液中Cl-离子浓度的调控，无需进行化学修饰。而其他血红蛋白受2，3-DPG调控，由于2，3-DPG极易流失，亲氧性明显增加，不能向组织有效供氧。因此，需要进行化学修饰提高P50，增强向组织释氧的能力。目前，广泛应用的修饰剂为吡哆醛-5-磷酸(PLP)、两个吡哆醛的双醛基衍生物NFPLP(2-nor-2-formylpyridoxal 5′-phosphate)NFPLP。PLP、NFPLP均可修饰Hb的β链提高P50。Northfield公司(USPatent No.6,552,173)一直从事戊二醛聚合磷酸吡哆醛化人血红蛋白方面的研究。目前，他们的主要产品Polyheme，该产品正在进行III期临床试验。磷酸吡哆醛PLP由于是单醛基结构，并不能使血红蛋白形成稳定的四聚体结构，Greebburg等发现，在循环过程中PLP-Hb并不稳定，容易离解为二聚体被代谢掉，从而影响到输氧功能。人脐带血血红蛋白γ链与HbA的β链在结构上存在一定差别，修饰PHb的γ链是否达到修饰HbA的β链的效果，需要进行试验研究。
DBBF具有双醛基功能基团结构，在血红蛋白不同氧合状态下可以发生两个不同反应。在脱氧条件下，DBBF能够特异地分子内交联α199位Lys和α299位Lys，产物P50得到提高，亲氧性明显降低；在氧合条件下，可以特异地分子内交联β182位Lys和β282位Lys，产物的亲氧性反而降低。Baxter公司对这类交联剂进行了广泛的研究，并将其产品称为HemAssitTM，又称为双阿司匹林交联血红蛋白(DCLHb)(United States Patent 4,600,531)。1985年美国军方与公司合作开始DCLHb的研究，由于Hb经过分子内交联，稳定性大大增加，使交联后产品可以直接用加热方式灭毒。虽然DCLHb成为第一例被FDA批准进行期临床试验的红细胞代用品，但是在动物试验和对失血性休克病人复苏的试验中，均表现出明显的临床副作用，主要是四聚体Hb对NO的吞噬作用造成了血管的强烈收缩和血压的升高以及明显的胃肠反应。1998年Baxter宣布终止有关的研究。
(三)发明内容：
本发明的发明目的是提供一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，它是一种能够降低人脐带血血红蛋白亲氧性，使血红蛋白溶液具有合适P50的修饰方法。
本发明的技术方案为：一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于它包括以下步骤：
(1)取一定体积具有适当浓度的纯化血红蛋白，加入一定浓度的有机磷酸盐，加入一定浓度具有缓冲能力的物质，调节其PH为4.5-8.0；
(2)在低温下0℃-20℃，对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法，进行较彻底脱氧；
(3)按一定物质的量比加入DBBF，DBBF∶Hb为1～4∶1，在通氮条件下，反应温度为10℃～45℃，PH值为4.5～8.0，反应时间1～4小时，血红蛋白溶液浓度为1～100mg/ml；
(4)用氨基酸中止反应，氨基酸与DBBF的摩尔比为2～10∶1，同样条件下，反应时间1～3小时。
上述所说的步骤(1)中加入的有机磷酸盐为2、3-DPG类似物，可以预先用NaOH调节好，pH值为4.5～8.0的植酸，在血红蛋白溶液中的浓度范围为1～10mM/L。
上述所说的步骤(1)中选用的血红蛋白为人脐带血血红蛋白。
上述所说的步骤(1)中加入一定浓度具有缓冲能力的物质为Bis～Tris或Tris～HCl。
上述所说的步骤(2)中脱氧方法为每间隔10～20min，通N2，抽真空，通小流量N2维持体系脱氧态。
上述所说的步骤(4)中氨基酸可以是甘氨酸或赖氨酸。
本发明的优越性在于：(1)DBBF替代PLP对人脐带血血红蛋白进行修饰，提高四聚体的稳定性；(2)DBBF能够特异地分子内交联α199位Lys和α299位Lys，亲氧性明显降低，根据这一点首次从修饰剂的角度考察DBBF与人脐带血血红蛋白的反应，结合人脐带血血红蛋白的自身特点优化反应条件，为最终血液替代品具有合适的亲氧性奠定基础。
(四)附图说明：
图1为本发明所涉一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺中纯化PHb HPLC图谱；
图2为本发明所涉一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺中图2DBBF-αPHb HPLC图谱；
图3为本发明所涉一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺中DBBF-αPHb氧合曲线。
(五)具体实施方式：
一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于它包括以下步骤：
(1)取一定体积具有适当浓度的纯化血红蛋白，加入一定浓度的有机磷酸盐，加入一定浓度具有缓冲能力的物质，调节其PH为6.0-8.0；
(2)在低温下0℃-10℃，对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法，进行较彻底脱氧；
(3)按一定物质的量比加入DBBF，DBBF∶Hb为2.5∶1，在通氮条件下，反应温度为35℃～40℃，PH值为6.0～8.0，反应时间2.5小时，血红蛋白溶液浓度为50mg/ml；
(4)用氨基酸中止反应，氨基酸与DBBF的摩尔比为2∶1，同样条件下，反应时间2小时。
上述所说的步骤(1)中加入的有机磷酸盐为2、3-DPG类似物，可以预先用NaOH调节好，pH值为6.0～8.0的植酸，在血红蛋白溶液中的浓度为8mM/L。
上述所说的步骤(1)中选用的血红蛋白为人脐带血血红蛋白。
上述所说的步骤(1)中加入一一定浓度具有缓冲能力的物质为Tris～HCl。
上述所说的步骤(2)中脱氧方法为每间隔15min，通N2，抽真空，通小流量N2维持体系脱氧态。
上述所说的步骤(4)中氨基酸是赖氨酸。
DBBF交联人脐带血血红蛋白的α链99位赖氨酸上的氨基发生反应：
2Hb-NH2+HOC-CH2-CH2-COH-→Hb-N＝CH-CH2CH2CH-N＝Hb
本发明试验效果如图1～3。
Claims (6)
1.一种双(3，5一二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于它包括以下步骤：
(1)取一定体积具有适当浓度的纯化血红蛋白，加入一定浓度的有机磷酸盐，加入一定浓度具有缓冲能力的物质，调节其PH为4.5-8.0；
(2)在低温下0℃-20℃，对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法，进行较彻底脱氧；
(3)按一定物质的量比加入DBBF，DBBF∶Hb为1～4∶1，在通氮条件下，反应温度为10℃～45℃，PH值为4.5～8.0，反应时间1～4小时，血红蛋白溶液浓度为1～100mg/ml；
(4)用氨基酸中止反应，氨基酸与DBBF的摩尔比为2～10∶1，同样条件下，反应时间1～3小时。
2.根据权利要求1所说的一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于所说的步骤(1)中加入的有机磷酸盐为2、3-DPG类似物，可以预先用NaOH调节好，pH值为4.5～8.0的植酸，在血红蛋白溶液中的浓度范围为1～10mM/L。
3.根据权利要求1所说的一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于所说的步骤(1)中选用的血红蛋白为人脐带血血红蛋白。
4.根据权利要求1所说的一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于所说的步骤(1)中加入一定浓度具有缓冲能力的物质为Bis～Tris或Tris～HCl。
5.根据权利要求1所说的一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于所说的步骤(2)中脱氧方法为每间隔10～20min，通N2，抽真空，通小流量N2维持体系脱氧态。
6.根据权利要求1所说的一种双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸脂修饰人脐带血血红蛋白α链的工艺，其特征在于所说的步骤(4)中氨基酸可以是甘氨酸或赖氨酸。
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