CN101195826A - 铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL。属于微生物生物技术领域。本发明与铜绿假单胞菌致病性的研究息息相关，此基因大小为1689bp，国际上对该基因的功能没有报道。实验发现该基因的缺失能够使IV型菌毛介导的蹭动能力丧失。IV型菌毛及它所介导的蹭动在铜绿假单胞菌生物被膜形成的早期起着必不可少的作用。生物被膜的形成提高了铜绿假单胞菌的耐药性，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。用铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL为新药靶点研制抗菌药物，为临床治疗和耐药防治服务。

Description

铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL及应用

【技术领域】：本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因，即鞭毛运动相关基因fimL。

【背景技术】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属假单胞菌属，革兰氏阴性菌，它是一种分布广泛的条件致病菌，在临床上，它能引起菌血病、耳、眼、皮肤及软组织、骨及关节、心内膜和呼吸系统等的感染，是人类的三大致病菌之一，是引起肺炎的首要致病菌。由于其具有形成生物被膜等多重耐药机制，耐药率高，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。

细菌生物被膜或称为菌膜，是细菌为适应不利的自然环境、维持自身生命而发生的形态学变化，形成一种有利于生存的特有的生命现象。当生物体内的细菌处于生长发育不利的环境时，菌体周边会分泌多糖复合物，使细菌相互粘连，附着于惰性物体如生物医学材料或粘膜表面并将其自身包绕在其中而形成的膜状物，使细菌可以停留在一个适宜的微环境中而不会被冲散。生物被膜的这种特殊结构可以作为一种屏障保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主免疫系统的清除，而成为潜在的感染源，导致难治性临床生物被膜的相关感染。鞭毛介导的泳动(swimming motility)和IV型菌毛介导的蹭动(twitching motility)都参与了生物被膜的早期形成。其中，蹭动是指细菌在固相表面上，依靠IV型菌毛的收缩和延伸，向周围运动的能力。

对生物被膜形成机制的研究，国内尚未见相关报道。由于生物被膜有非常重要的临床意义，最近几年，已引起国外一些科学家的重视，使他们涉足此领域进行研究。但其形成机制仍有许多未知领域等待探索。目前已知，生物被膜的形成大致分为三步：个体细胞的吸附；微菌落的形成；及成熟被膜的发育。我们对铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL的研究可以填补国内这一领域的空白，并完善铜绿假单胞菌生物被膜形成的机理。

【发明内容】：本发明目的是提供铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因、即鞭毛运动相关基因fimL，并用该基因为新药靶点研制抑制铜绿假单胞菌的新型药物。

本发明提供的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因长度为1689bp，位于铜绿假单胞菌基因组169节10946-10950。

上述的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL可以用于以该基因为新药靶点设计并制备抗菌药物；以及在食品卫生和耐药防治诸方面的应用。

本发明基因的获得方法：使用人工Mu转座技术(一种基于噬菌体Mu转座子的转座技术)，造成铜绿假单胞菌基因突变，建立突变子文库。筛选蹭动能力丧失的突变子，使用Bam HI酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物导入大肠杆菌DH5α，用卡那霉素和氨苄青霉素双抗LB平板筛选阳性转化子，测定转化子中插入片段的核苷酸序列，发现Mu插入的基因，确定此基因与铜绿假单胞菌鞭毛运动有相关性。

本发明的有益效果：

实验发现本发明基因的缺失能够使IV型菌毛介导的蹭动能力丧失。

Mu插入失活的基因泳动能力丧失，说明此基因与铜绿假单胞菌鞭毛的运动有关，这对鞭毛运动相关新基因的发现以及揭示新基因的功能都有指导意义。

通过本发明，可以针对fimL基因设计药物，限制其正常表达，使得细菌无法通过蹭行运动形成生物被膜，降低其耐药性，达到治疗铜绿假单胞菌引起的感染的目的。

【附图说明】：

图1是蹭动能力丧失的阳性转化子的蹭动运动检测图，

1、野生型PA68作为阳性对照  2、fimL::Mu PA6g突变株

图2是Mu克隆子酶切产物电泳图，1、DL15000 2、质粒3、质粒酶切

图3是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)，

4、DL2000  5、Mu克隆子PCR产物。

用Mu-kam P1和Mu-kam P2作为引物，克隆子质粒DNA为模板，可以扩增出700bp的特异性片段，说明所检测的克隆子质粒中携带着插入了Mu转座子的基因片段。

【具体实施方式】：

实施例1：使用Mu转座技术进行突变子文库的建立

(1)将临床分离株铜绿假单胞菌PA68接种于50ml L-broth培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/LNaCl)中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

(2)次日按1∶100接种至200ml L-broth培养基中，200rpm，37℃培养至OD₅₄₀≈0.5，终止培养。

(3)于2℃ 7000g离心10min，收集菌体。

(4)依次用等体积、1/2体积、1/5体积在冰浴中预冷的300mM蔗糖溶液重新悬浮、洗涤菌体，2℃8000g离心10min，倒净残液。

(5)根据菌体的多少用不同体积的300mM蔗糖溶液混匀，并通过活细胞计数制备成浓度约为10¹¹个cells/ml的感受态细胞。

(6)将感受态细胞分装成100μl/管，一部分直接用于电转化，一部分在液氮中冷冻后，放-80℃冰箱中保存。另一部分直接放-80℃冰箱保存备用。

(7)取感受态细胞100μl、质粒pSMC28和Mu转座复合物约50ng，加入到在冰浴中预冷的0.2cm电转化杯中(阴性对照只加感受态细胞不加质粒)，在Bio-Rad电穿孔仪上设置电容25μF，电阻200欧姆和合适的电压完成电击。

(8)电击后将转化体系转入预先37℃温浴的900μl L-broth培养基中。37℃，225rpm，培养1h。

(9)取100μL菌液涂布于50μg/ml Km抗性平板上，温箱37℃过夜培养，24小时后即可观察结果。

(10)从过夜培养的筛选平板上挑取数个菌落，分别接种到1ml的L-broth中，37℃，200rpm振荡培养16-18h。

(11)取2μl菌液做模板，以人工Mu转座子上的特异序列Mu1(5’-GCAACTGTCCATACTCTGA-3’)和Mu2(5’-CGCTGGGTTTATCGTCGA-3’)做引物，用PCR方法扩增Mu转座子片段。同时分别以铜绿假单胞菌菌株及质粒pHTH2做阴性及阳性对照。扩增条件为，先在94℃预变性15min，然后，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，再在72℃延伸10min。

(12)PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳检测，EB染色后紫外灯下观察结果并留照片，具有700bp卡那霉素抗性基因的转化子即为Mu转座复合物转化子。

实施例2：突变子的蹭动能力的检测

(1)在无菌塑料培养皿内铺上一层蹭动能力检测培养基[10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，1％(W/V)颗粒状琼脂粉]。

(2)从Mu转座子突变文库中活化突变菌株。

(3)用灭菌的牙签挑取菌落，扎透蹭动培养基，将细菌接种到培养基下面的塑料平皿上，37℃培养24小时。

(4)细菌就会依赖IV型菌毛的收缩和伸展在培养基下面的塑料表面以接种点为圆心，向周围蔓延生长，产生圆形的菌晕。

(5)将培养基轻轻揭去，用考马司亮兰染色液(10％乙酸，0.06％考马司亮兰)染色塑料平皿20分钟，倒掉染液，用自来水冲洗平皿1min，观察细菌因蹭动而产生的环，筛选蹭动能力丧失或减弱的突变子(图1)。

实施例3：铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因的克隆

1Mu转座复合物转化子基因组DNA的提取

(1)将铜绿假单胞菌Mu转座复合物转化子接于5mL LB液体培养基中，30℃ 200r/min过夜培养。

(2)4℃5000r/min离心10分钟，弃上清，菌体重悬于200μL裂解缓冲液。

(3)加入4μL 10mg/ml的RNase，37℃水浴30分钟。

(4)加入8μL 20mg/mL的蛋白酶K，20％ SDS 5μL，于56℃水浴30分钟。

(5)分别用等体积苯酚，苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿各抽提1次，12000r/min离心10分钟。

(6)加入2倍体积冷冻的无水乙醇，于-20℃放置30分钟。

(7)挑出DNA，70％乙醇洗涤2次，真空干燥。

(8)溶于50μLTE，-20℃保存。

2大量提取大肠杆菌质粒pUC18

(1)25mL液体LB培养基，接入携带质粒pUC18的大肠杆菌单菌落，30℃、200r/min培养过夜。

(2)菌液的OD₆₀₀值大于1.0后，4℃ 6000r/min离心10分钟，弃上清。

(3)加STE溶液(100mMNaCl，10mMTris.Cl pH8.0，1mM EDTA)12.5mL洗细胞，4℃ 6000r/min离心10分钟，弃上清。

(4)加溶液I(50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mM Tris.Cl，pH8.0)0.5mL再向各管中加入溶菌酶(反应浓度20μg/mL)，轻微混，37℃水浴15-30min。

(5)加溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)1mL轻轻混匀至透明，冰浴10分钟。

(6)加入溶液III(3M KAc，5M乙酸，pH4.8)0.75mL剧烈振荡后，冰浴30分钟。

(7)4℃ 12000r/min离心5分钟，取上清。

(8)加入0.7体积的异丙醇，室温放置15分钟。

(9)4℃ 12000r/min离心10分钟，弃上清。

(10)加入100μL TE溶液溶解核酸。

(11)加入RNase(反应浓度为100μg/mL)37℃水浴30分钟。

(12)等体积苯酚∶氯仿(1∶1)，抽提，振荡均匀，4℃ 12000r/min离心15分钟，取上清。

(13)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH4.8)，-20℃放置20分钟沉淀DNA。

(14)4℃ 12000r/min离心10分钟，弃上清。

(15)加入1mL70％的冷乙醇洗DNA沉淀两次，干燥。

(16)加入50μL TE溶解质粒，-20℃保存。

3基因组DNA和质粒pUC18的酶切(50μL体系)：

10×buffer         5μL

Bam HI             2μL

DNA                10μL

ddH₂O              33μL

混匀，30℃水浴过夜。

4酶的灭活与纯化：

(1)酶切体系置于65℃水浴15分钟，之后降至室温。

(2)TE补足至400μL，等体积的苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次。

(3)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH4.8)，-20℃放置20分钟沉淀DNA。

(4)4℃ 12000r/min离心10分钟，弃上清。

(5)加入1mL70％的冷乙醇洗DNA沉淀两次，真空干燥。

(6)pUC18溶于88μL 1m mol/L Tris-Cl，基因组DNA溶于1μL TE。

5 pUC18去磷酸化：

pUC18    88μL

10×buffer           10μL

CIAP(碱性磷酸酶)     2μL

置于37℃水浴30分钟。

6去磷酸化酶的除去：

(1)TE补足至200μL，加入2μL 0.5mol/L EDTA。

(2)75℃水浴10分钟，使酶失活，并降至室温。

(3)等体积的苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次。

(4)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH4.8)，-20℃放置20分钟沉淀DNA。

(5)4℃ 12000r/min离心10分钟，弃上清。

(6)加入1mL70％的冷乙醇洗DNA沉淀两次，真空干燥。

(7)沉淀溶于5μL ddH₂O中。

7基因组DNA和质粒pUC18的连接(15μL体系)：

DNA            1μL

ddH₂O          10μL

pUC18          1μL

混匀，45℃水浴5分钟后，迅速冰浴，再加T4连接酶1.5μL，10×buffer 1.5μL，14-16℃水浴过夜。

8连接产物的处理：

(1)TE补足至200μL。

(2)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH4.8)，-20℃放置20分钟沉淀DNA。

(3)4℃ 12000r/min离心10分钟，弃上清。

(4)加入1mL70％的冷乙醇洗DNA沉淀两次，真空干燥。

(5)沉淀溶于5μL ddH₂O中。

9大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

(1)将大肠杆菌单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200转/分钟过夜培养。

(2)过夜培养的菌液按1∶100接种于100mL LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养。

(3)菌液OD₆₀₀在0.5-0.6之间时终止培养并置于冰上。

(4)转移至250mL离心中，4℃、6000r/min离心10min，收集菌体。

(5)100mL预冷的ddH₂O悬浮洗涤细胞，4℃ 6000r/min离心10分钟，收集菌体。

(6)50mL预冷的10％甘油悬浮洗涤细胞，4℃ 6000r/min离心10分钟，收集菌体。

(7)用2mL预冷的10％甘油悬浮洗涤细胞，4℃ 6000r/min离心10分钟，弃上清，尽量吸干管壁上的残留液体。

(8)用200μL预冷的10％甘油培养基重悬细胞。

(9)100倍稀释后测菌液OD₆₀₀，用预冷的10％甘油培养液将菌液稀释至浓度为2×10¹⁰-3×¹⁰10个细胞/mL(1 OD₆₀₀约相当于2.5×10¹⁰个细胞/ml)。

(10)将菌液分装，每管95μL。用于电转化或-70℃保存。

10大肠杆菌DH5α的电转化方法：

(1)5μLDNA连接产物与95μL大肠杆菌感受态细胞混匀，冰浴5-10分钟。

(2)混合物转移至预冷的0.2cm电转化杯中(阴性对照不加混合物，只加感受态细胞)，在Bio-Rad电转化仪上设置2.50kv，进行电击。

(3)从电转化杯中吸出电转化体系，并用1mL 37℃预热的SOC液体培养基(20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/LNaCl20mM葡萄糖，10mM氯化镁)稀释后，37℃，150转/分钟培养1小时。

(4)菌液全部涂布于含20mmol/L MgSO₄ 50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养。

11克隆子的筛选、鉴定：

(1)从过夜培养的双抗平板上挑取转化子，小量提取质粒，用限制性内切酶BamH I酶切，并以pUC18BamH I酶切产物为对照。

(2)以DL15000为DNA标准，在0.8％琼脂糖凝胶中电泳检测鉴定，挑选同时具有pUC18载体带和外源目的基因带的克隆子(图2)。

(3)同时以从转化子中提取的质粒为模板，用Mu转座子DNA片段的Mu转座子检测引物Mu-kam P1和Mu-kam P2进行PCR(具体方法同实施例1中所述)。电泳检测PCR产物，以DL2000为DNA标准，以质粒pHTH2为正对照，若能扩增出700bp的特异性带，则说明转化子质粒中含有人工Mu转座子DNA片段，克隆成功(图3)。

(4)对成功克隆的转化子质粒进行测序。

12克隆子质粒的DNA测序：

将用15％甘油管保存的转化子菌液，用以Mu转座子两端的反向序列为依据设计的AM42P2作为引物进行测序。委托上海英俊公司进行DNA测序，测定转座子插入位点侧翼的核苷酸序列。

13.基因推断：

测序结果在铜绿假单胞菌的基因组数据库(http//www.pseudomonas.com)或GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST中进行序列比对最终发现所需基因。

序列表

<110>南开大学

<120>铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL及应用

<160>1

<210>1

<211>1689

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400>1

atggtcacag gagccacgtc cctcagtctg gtgcgcgacg agttgttcgc caccatggaa 60

caggccgaac agggtcttga gcagttcatt gccgagcggc agaatggcag cctactgcag 120

cacgccgtcg aatgcctgca acagatccgc ggcaccctca acctgatcga gctggccggc 180

gccgagctgc tggcccagga agccctgcag ctggcgaccg acattcccac cggcgtcagc 240

gaggagcgcg acggccagct ggcagccctg ggcaacgccc tgtacgtgct gcgccgctac 300

ctggagaacg tcgaggccaa tcgccaggag atccccgaac tgctcttgcc ggcgatcaac 360

gaagtgcgct gtgccgcagg gcagccggcg ctgccggaaa gtttcttctt cagcgcccga 420

ctggatatcc cgcggccgcc gagcaccgcc atcgaccacc tgccttccga agccgaactg 480

ggcgaggaaa gccggcggat gcgccacatg taccagatcg gcctgctcgg gctgatccgc 540

gaacagaacc tctatcccag cctcaagttg atgggccgcg cgctggcgcg cctcgacagc 600

ctgcacggcg gggtggcccg ttcgcggctg tgctggatcg gcgccgcggc gatcgagtcg 660

atcgtcgatg gccaactgtt gccacgcaag tcgcgtaagc aactgttctc gcgcatcgac 720

cgcgagctca agcaattgct gatcggccct gcctacgagg cgccgcgcca tctgctcaag 780

gaactgcttt acctggtggc gctgtccgat ggccagggcc cgcgttcgcg cgaggtccgc 840

gaactgcttg ggctggcgcc gctgccgttc accgaccact tgctggaaga ggaatcgcag 900

cgcttgtccg gtcccggcca gtcggtgatg cgttcgctgt ccacggcgat ccgcgaggaa 960

ctcgccgggg tcaaggacat gctcgacctg atcgagcgcg gcgtggccca gccggacagc 1020

ctgaccaacc tgcatgcgca actgggcaag ctgagcaaga ccctcggcat ggtcggcctg 1080

aactcggccg gcaccgccct gcagacccag ctacccaccg tggccgcctg ggctgccagc 1140

ggcgtcgccg attcgccgcc ggcgttgctg cgcctggccg atgcggtgct ctacgtggaa 1200

agcatggtcg gcaacctcga gcgcggcgag cgccgcatca tccggccgac tccggcggag 1260

cccgggcagg aagccgatgc attcgccgtg caccagttgg ccgaggcgcg catcgtggtg 1320

atcgaggagg ccaaggccgg cctggccctg gccaagcgtg cgatcaccgc gtacctggaa 1380

tccaatggcg acaagctcaa cctggccaac gtcccggcca gcctgcaggc ggtccggggt 1440

ggtctctggt tcctcggtca ggagcgcgcc gcgctgctgg tcggcggctg cgccgactac 1500

atccagcagc gcatgatcga gaccgcgcag atgccgtcgg aacagatgct ggaaaccctc 1560

gccgacgccc tgaccagtct cgaatactat ctcgagggcg gtgccgtgct gcgtccgcag 1620

ggccagccgg acgtcctcga cctcgccagc gccagcgtca aggcgctcgg actgccggtg 1680

gccgcctga                                                         1689

Claims (2)

1.一种铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL，其核苷酸序列如序列表所示，其基因长度为1689bp，位于铜绿假单胞菌基因组169节10946-10950。

2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL的应用，用于以该基因为新药靶点设计并制备抗菌药物。

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