CN101194595B - 假俭草侧芽诱导愈伤组织和植株再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种假俭草侧芽诱导愈伤组织和植株再生方法，属于植物组织培养技术领域。以假俭草的侧芽为外植体材料，接种在附加2，4-D-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、BAP-6-苄基氨基嘌呤0.1mg/L的愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织的诱导频率达90％以上。继代培养2次后转到附加KT-激动素2.0mg/L的绿苗分化培养基上，绿苗分化率在12％以上。以侧芽为外植体材料，获得的黄色、紧密、颗粒状愈伤组织适用于假俭草微繁、体细胞培养和农杆菌介导法基因转化。草坪草坪用质量高，通常种子产量越低，以侧芽为外植体对于草坪草再生体系建立、暖季型草坪草改良以及新品种产业化具有独特的重要的应用价值。

Description

假俭草侧芽诱导愈伤组织和植株再生方法

一、技术领域

本发明涉及一种假俭草侧芽诱导愈伤组织和植株再生技术，属于植物组织培养范畴，适用于假俭草微繁、体细胞培养和农杆菌介导基因转化受体材料的培养技术。

二、技术背景

假俭草(Eremochloa ophiuroides(Munro.)Hack.)是禾本科蜈蚣草属多年生草本植物，也是蜈蚣草属中唯一可用作草坪草的物种(Bouton et al，1983；Hanna，1995)。它具有强壮的匍匐茎，蔓延力强而迅速，秆斜升，其叶形优美，植株低矮，养护水平低，耐贫瘠，病虫害少，可广泛地用于庭院草坪、休憩草坪以及水土保持草坪建设中(Hansonet al.，1969；Beard，1973)。

采用常规杂交技术选育新品种，不仅周期长，工作量大，而且由于受育种材料自身变异的限制，改良幅度有限。随着生物技术的发展，细胞工程和基因工程技术日趋成熟，可以在细胞水平上进行人工定向突变体筛选或在分子水平上把目的基因直接导入材料，提高育种效率。

开展植物体细胞突变体筛选和转基因工作的基础条件之一，是建立高效的植株再生体系。迄今为止，国内外有关假俭草组织培养获得再生植株的报道仅有3篇，都是以假俭草的成熟种子和幼穗为外植体材料，通过愈伤组织的诱导和分化获得再生植株。Krans等(1985)以成熟种子和幼穗为材料，研究了假俭草愈伤组织诱导和植株再生；马生健等(2004)和Yoshikazu等(2004)分别以简报和摘要的形式，报道了以假俭草的种子为材料建立了再生体系。至今尚未见到以假俭草的侧芽为外植体材料建立植株再生体系的报道。由于草坪草用质量越高，通常种子产量越低，草坪草通常为常异花授粉植物，种子异质性高，难以作为外植体进行遗传转化工作，而丰富的侧芽是暖季型草坪草重要的形态特征之一，因此，以侧芽为外植体对于假俭草等暖季型草坪草再生体系建立、种质改良以及新品种产业化具有独特的重要的意义。

三、发明内容

技术问题

本发明提出的技术任务和要解决的技术问题是要克服现有假俭草离体培养技术诱导产生的半透明、湿润、粘性胚性愈伤组织，此类愈伤组织在继代培养过程中丧失绿苗分化的能力，以及种子异质性较高，不宜于用于微繁殖、体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化等缺陷。以假俭草丰富的侧芽为外植体材料，通过外源激素调控获得颗粒状愈伤组织，建立起适用于微繁殖、体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化的植株再生技术体系。

技术方案

假俭草侧芽愈伤组织诱导和植株再生的方法，其特征在于，

1)材料

选用假俭草带有侧芽的茎段为外植体材料；

2)培养基

基本培养基为由MS的大量元素、微量元素和维生素组成的MS培养基，附加蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L；

侧芽生长培养基：在基本培养基中添加激素BAP 2.0mg/L、NAA 0.8mg/L；

愈伤组织诱导和继代培养基：在基本培养基中添加激素2，4-D 1.0mg/L、BAP 0.1mg/L；

绿苗分化培养基：在基本培养基中添加激动素KT 2.0mg/L；

试管苗生根培养基：在基本培养基中添加生长素NAA 0.6mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至6.5；

3)培养方法

田间选取无病虫害、健壮的嫩茎，去除叶鞘和叶片，经冲洗干净后剪成带有侧芽约2cm长的段块，用0.2％洗衣粉浸泡20min，流水冲洗1h，在超净工作台上用75％的乙醇浸泡50s，0.2％升汞消毒15min，再用无菌水冲洗4-5次。

经表面消毒的茎段先接种到侧芽生长培养基上，侧芽在愈伤组织诱导培养基上产生愈伤组织，第28天时从中选择黄色、紧密、颗粒状愈伤组织进行继代增殖，愈伤组织继代培养2次，然后绿苗分化培养基上，4-5周后再生植株转到试管苗生根培养基中，再生植株在试管苗生根培养基中生根，2周后试管植株移栽到盆钵和田间；

在离体培养过程中培养室温度为25±1℃，愈伤组织诱导和增殖培养在散射光下进行，绿苗分化、生长和生根培养在光照条件下进行。

有益效果  本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

以侧芽为外植体材料，通过外源激素调控获得颗粒状愈伤组织，建立起植株再生技术体系。

颗粒状愈伤组织在继代培养过程中能保持植株再生的能力，适用于微繁殖、体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化。在此基础上开展了耐寒体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化研究工作，已获得体细胞突变体和转基因试管植株。

本发明适用于假俭草微繁、体细胞培养和农杆菌介导法基因转化。考虑到(1)草坪草坪用质量高，通常种子产量越低，甚至种子产量为0，(2)草坪草通常为常异花授粉植物，种子异质性高，难以作为外植体进行遗传转化工作，(3)丰富的侧芽是暖季型草坪草重要的形态特征之一，所以，以侧芽为外植体对于草坪草再生体系建立、暖季型草坪草改良以及新品种产业化具有独特的重要的应用价值。

四、附图说明

图1从侧芽诱导愈伤组织

图2颗粒状愈伤组织

图3分化绿苗

图4试管苗

图5试管苗生根

图6移栽植株

五、具体实施方式

1.材料和方法

1.1实验材料

取带有侧芽的假俭草茎段为外植体材料。

1.2培养基

基本培养基由MS的大量元素、微量元素和维生素组成，添加葡萄糖30g/L，固化剂-琼脂7.5g/L。MS培养基是植物组织培养中最为常用的培养基(Murashige T，Skoog F.A revised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissueculture[J].Physiol.plant，1962，15：473～497)；

侧芽生长培养基：基本培养基添加激素BAP(中国医药上海化学试剂公司)2.0mg/L、NAA(南京生兴生物技术有限公司)0.8mg/L；

愈伤组织诱导和继代培养基：基本培养基中添加激素2，4-D(中国医药上海化学试剂公司)1.0mg/L、BAP 0.1mg/L；

绿苗分化培养基：基本培养基中添加激动素KT(南京生兴生物技术有限公司)2.0mg/L；

试管苗生根培养基：基本培养基中添加生长素NAA(南京生兴生物技术有限公司)0.6mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钾和盐酸调整pH值至6.5；

1.3培养方法

田间选取无病虫害、健壮的嫩茎，去除叶鞘和叶片，经冲洗干净后剪成带有侧芽约2cm长的段块，用0.2％洗衣粉浸泡20min，流水冲洗1h，在超净工作台上用75％的乙醇浸泡50s，0.2％升汞消毒15min，再用无菌水冲洗4-5次。

经表面消毒的茎段先接种到侧芽生长培养基上，10-14d侧芽在愈伤组织诱导培养基上产生愈伤组织，第28d时从中选择黄色、紧密、颗粒状愈伤组织进行继代增殖，然后转到绿苗分化培养基上再生植株，试管植株生根后移栽到盆钵和田间。在离体培养过程中培养室温度为25±1℃，愈伤组织诱导和增殖培养在散射光下进行，绿苗分化、生长和生根培养在光照条件下进行。

2.结果

2.1 BAP和NAA对侧芽生长的影响

侧芽接种到侧芽生长培养基上，5-6d后开始长出新叶，15-18d时侧芽长势进入旺盛生长期。促进侧芽生长的最佳培养基为基本培养基附加BAP2.0mg/L、NAA 0.8mg/L。

2.2 2，4-D和BAP对愈伤组织诱导和继代增殖的影响

2，4-D和BAP不同浓度的组合对侧芽诱导愈伤组织有明显的影响。试验结果显示：在基本培养基上附加2，4-D 0.5～1.0mg/L和BAP 0～0.5mg/L，侧芽能诱导产生愈伤组织；2，4-D的浓度达到或超过2.0mg/L时，未能诱导产生愈伤组织(表1)。在基本培养基附加2，4-D 1.0mg/L和BAP 0.1mg/L的诱导培养基上，12d左右从侧芽的基部诱导产生愈伤组织，其中黄色、致密状愈伤组织占40％以上，后愈伤组织覆盖侧芽的基部(图1)。在基本培养基附加2，4-D 1.0mg/L和BAP 0.1mg/L的愈伤组织继代培养基上，黄色、致密愈伤组织大量快速增殖。

试验中观察到茎段的截面、节、节间和叶片都未能诱导愈伤组织发生。

表1.2，4-D和BAP浓度对愈伤组织诱导的影响

2.3 KT和BAP对愈伤组织分化的影响

BAP浓度在0.5～3.0mg/L之间，愈伤组织未能分化出绿苗。KT 2.0mg/L显著促进颗粒状愈伤组织的增殖，绿苗分化率达到12.6％，平均每块愈伤组织产生3.6个绿芽。KT 2.0mg/L的效果显著好于KT 3.0mg/L(表2)。

BAP 2.0mg/L和NAA 0.8mg/L组合有利于颗粒状愈伤组织分化绿苗和丛生芽的增殖。胚性愈伤组织接种在含有BAP 2.0mg/L和NAA 0.8mg/L的基本培养基上，2周后小芽伸长1～1.5cm，4-5周后小芽长大，通过继代分化培养可大量增殖绿芽(图4)。

在本试验中愈伤组织继代培养2次仍可保持植株再生的能力。

表2KT和BAP对愈伤组织分化的影响

2.4试管苗生根和移栽

在不附加NAA的对照生根培养基上试管苗的生根率也达到96％以上，但是根的质量与附加NAA的有显著的差别。NAA浓度为0.6mg/L时，试管苗的根数和根粗均明显高于对照，也高于NAA浓度为0.3mg/L和0.9mg/L的相对应值。附加NAA0.6mg/L的培养基为试管苗最佳生根培养基，第6d试管苗开始生根，2周后平均每株生根7.8，根长0.6cm，根的直径2.0mm(表3，图5)

试管生根苗先移栽到营养钵，2周后再移栽到土盆(图6)，移栽存活率达到94％。

表3NAA浓度对试管苗生根和根系发育的影响

Claims (1)

1.假俭草侧芽诱导愈伤组织和植株再生方法，其特征在于，

1)材料

选用假俭草带有侧芽的茎段为外植体材料；

2)培养基

基本培养基：由MS的大量元素、微量元素和维生素组成，附加葡萄糖30g/L，琼脂7.5g/L；

侧芽生长培养基：基本培养基中添加激素BAP 2.0mg/L、NAA 0.8mg/L；

愈伤组织诱导和继代培养基：基本培养基中添加激素2，4-D 1.0mg/L、BAP 0.1mg/L；

绿苗分化培养基：基本培养基中添加激动素KT 2.0mg/L；

试管苗生根培养基：基本培养基中添加生长素NAA 0.6mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至6.5；

3)培养方法

田间选取假俭草的嫩茎，去除叶鞘和叶片，经冲洗干净后剪成带有侧芽2cm长的段块，用质量比0.2％的洗衣粉浸泡20min，流水冲洗1h，在超净工作台上用75％的乙醇浸泡50s，0.2％升汞消毒15min，再用无菌水冲洗4-5次；

经表面消毒的茎段先接种到侧芽生长培养基上，侧芽在愈伤组织诱导培养基上产生愈伤组织，第28天时从中选择黄色、紧密、颗粒状愈伤组织进行继代增殖，愈伤组织继代培养2次，然后移到绿苗分化培养基上，4-5周后再生植株转到试管苗生根培养基中，再生植株在试管苗生根培养基中生根，2周后试管植株移栽到盆钵和田间；

在离体培养过程中培养室温度为25±1℃，愈伤组织诱导和增殖培养在散射光下进行，绿苗分化、生长和生根培养在光照条件下进行。

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