CN101189262A - Humanin受体或Humanin样多肽受体 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是根据HN信号途径的信息研究受体，通过发现Humanin受体或Humanin样多肽受体(HNR)，可以了解促进或抑制发挥HN的神经保护作用等活性的胞内信号传递机理，确定与此相关的化合物，从而建立HNR激动剂和HNR拮抗剂的筛选方法，使筛选的化合物在神经退行性疾病、特别是阿尔茨海默病的治疗药开发中发挥作用，提供阿尔茨海默病神经细胞死亡测定系统，以及提供HNR基因强制表达方法或细胞内基因敲除法等。因此，本发明涉及含有选自gp130或其部分多肽、CNTF－R和WSX－1的至少两种蛋白质的Humanin受体或Humanin样多肽受体(HNR)。

Description

Humanin受体或Humanin样多肽受体

技术领域

本发明涉及Humanin受体或Humanin样多肽受体(以下可总称标记为“HNR”)、强制表达该受体的转化细胞、与该受体结合的化合物的筛选方法、含有该化合物的药物组合物等。本申请是基于2005年4月22日提出的日本专利申请2005-124394和2005年9月5日提出的日本专利申请2005-255972，主张其优先权，其内容均引用到本说明书中，视为该公开内容的一部分。

背景技术

神经脱落被认为与阿尔茨海默病(AD)的主要神经学征兆或症状表达直接相关，其病理学机理尚未了解，但是是AD治疗的最重要的靶。各种AD相关的伤害、即家族性AD(FAD)基因突变体的过量表达或者来自淀粉样蛋白β前体(APP)的毒性β淀粉样蛋白(Aβs)的增加和添加等通过各种途径体外诱导神经细胞死亡。

人们发现：家族性AD(FAD)中，三个基因-APP、早老素1(PS1)、早老素2(PS2)中的错义突变是病因(Shastry和Ginlin，1999)。这些突变基因在FAD脑中是如何体内导致神经脱落的，这点尚不明确，但是多个研究小组证明在培养细胞中(Yamatsuji等人.，1996a，b；Wolozin等人.，1996；Zhao等人.，1997；Nishimura等人.，1998；Luo等人.，1999；Hashimoto等人.，2000)或在初代培养皮质神经(PCN)中(Niikura等人.，2004)，FAD相关的APP和PS基因突变体的表达引起了神经细胞死亡。

并且，被认为与AD病理密切相关(Hardy和Selkoe，2002)的β淀粉样蛋白的增加是生理上的浓度过高，在体外显示诱发神经细胞死亡(Loo等人.，1994；Hashimoto等人.，2001；Hashimoto等人.，2004)。

本发明人使用由AD患者死亡后解剖脑的枕叶制作的cDNA文库，通过对防止细胞死亡的化合物不施加偏倚的功能性筛选方法“デストラツプスクリ一ニング法”，鉴定出编码被命名为Humanin(HN)的24个氨基酸肽MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA的cDNA(专利文献1)。HN显示对各种FAD基因或抗APP抗体、以及β淀粉样肽(Aβ)等全部的由AD相关伤害引起的神经细胞死亡显示拮抗作用(Hashimoto等人.，2001a和b.，Nishimoto等人.，2004)。以10μM的HN即显示完全的拮抗作用。并且，后续的研究中，HN显示对某种神经细胞或非神经细胞死亡、例如无血清培养基中PC12(Kariya等人.，2002)或淋巴细胞(Kariya等人.，2003)的细胞死亡、或者AD导致的人脑血管性平滑肌细胞毒性(Jung等人.，2003)、以及来自朊病毒的肽导致的神经毒性(Sponne等人.，2004)也具有拮抗作用。

我们报导了HN由细胞内分泌，经细胞表面的受体介导，由细胞外对AD相关伤害引起的神经细胞死亡发挥拮抗作用。

最近，Ying等人(2004年)报导：在PC12细胞株中，HN是以PTX感受性G蛋白结合受体-人甲酰肽受体样-1(FPRL-1)作为受体结合，拮抗Aβ(1-42)导致的神经细胞死亡。Ying等人的报导中显示，HN对Aβ诱导的神经毒性显示拮抗作用，这是由于其竞争性地阻止Aβ与FPRL-1结合。但是，在调查FPRL-1是否参与了HN对AD相关伤害的神经保护作用时，发现在F11神经杂交细胞株或初代培养皮质神经(PCN)中，FPRL-1并未参与HN的神经保护作用，并指出：在该体系中存在FPRL-1以外的受体，HN经该受体介导发挥神经保护作用。

我们的研究显示，STAT3和某种酪氨酸激酶参与了HN的神经保护作用，这显示在该信号途径中存在细胞因子受体样的受体。

gp130在白细胞介素6(IL-6)受体家族中是共有的细胞因子受体亚单元。含有gp130的受体受到包括IL-6、IL-11、LIF、CNTF、制癌蛋白(OSM)、心肌营养素-1或IL-27的Th1型细胞因子刺激。这些细胞因子与受体的结合诱导了gp130的均聚二聚体化或gp130与相关受体、例如LIF受体、OSM受体、WSX-1(IL27受体)的杂合二聚体化，将细胞因子的信号传递至经JAK/STAT或RAS/MAPK信号途径介导的胞内信号途径(Raga等人.，1997；Boulay等人.，2003；Boulanger等人.，2004)。最近的研究显示：属于IL-6/IL-12细胞因子家族的IL-27(IL-27p28/EBV诱导基因3)与WSX-1/gp130(Pflanz等人.，2004)结合，显示控制Th1和Th2免疫反应(Yoshida等人.，2004)。还得知：CNTF-R是不具有细胞内信号结构域的gp130相关受体。

专利文献1：日本特再WO01/021787抑制神经细胞死亡的多肽、Humanin

专利文献2：WO03/097687 Neuroprotective Polypeptides and Methodsof Use

发明内容

因此，本发明的目的是：根据HN信号途径的信息探索其受体，发现Humanin受体和Humanin样多肽受体(HNR)，由此了解促进或抑制HN发挥神经保护作用等活性的细胞内信号传递的机理，确定与其相关的化合物，建立HNR激动剂和HNR拮抗剂的筛选方法；使筛选的化合物在神经退行性疾病、特别是阿尔茨海默病的治疗药开发中发挥作用；提供阿尔茨海默病神经细胞死亡的测定系统；以及提供HNR基因强制表达方法或细胞内基因敲除法等。

即，本发明涉及以下各种方式。

[1]Humanin受体或Humanin样多肽受体(HNR)，该受体含有选自gp130或其部分多肽、CNTF受体α链(CNTF-R)和WSX-1的至少两种蛋白质。

[2]Humanin受体或Humanin样多肽受体，该受体由gp130或其部分多肽，CNTF-R和WSX-1构成。

[3]Humanin受体或Humanin样多肽受体，该受体由gp130或其部分多肽和WSX-1构成。

[4]上述[1]-[3]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体，其中，gp130的部分多肽至少具有胞内结构域的第1-133位氨基酸序列。

[5]Humanin受体或Humanin样多肽受体，该受体由CNTF-R和WSX-1构成。

[6]上述[1]-[5]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体，其中，gp130、CNTF-R和WSX-1是来自人的蛋白质。

[7]化合物的筛选方法，该化合物与上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合。

[8]上述[7]的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物是与该受体的胞外结构域结合。

[9]上述[7]的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物是与该受体的胞内结构域结合。

[10]上述[7]的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物是该受体的激动剂。

[11]上述[7]的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽该受体结合的化合物是该受体的拮抗剂。

[12]上述[7]-[11]中任一项的筛选方法，该方法包含以下步骤：

(a)使试验试样与Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质接触的步骤；

(b)测定该受体和该试验试样中所含的化合物的结合特性的步骤；以及

(c)选择与该受体结合的化合物的步骤。

[13]上述[12]的筛选方法，其特征在于：在Humanin或Humanin样多肽的存在下，使试验试样与Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质接触。

[14]上述[12]或[13]的筛选方法，其中，Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质在细胞中强制表达。

[15]上述[12]或[13]的筛选方法，其中，Humanin受体或Humanin样多肽受体在转化细胞中强制表达，所述转化细胞是通过含有编码构成该受体的至少一种蛋白质的基因的表达载体进行转化得到的。

[16]上述[12]-[15]中任一项的筛选方法，该方法是通过检测对神经细胞死亡的拮抗作用或抑制作用的变化来测定该受体与化合物的结合特性。

[17]上述[12]-[15]中任一项的筛选方法，该方法是通过检测SATAT3的第706位的酪氨酸的磷酸化亢进或抑制来测定该受体与化合物的结合特性。

[18]上述[7]-[12]中任一项的筛选方法，该方法是在无细胞系中实施。

[19]转化细胞，该转化细胞是通过表达载体转化的，所述表达载体含有编码构成选自gp130、CNTF-R和WSX-1的Humanin受体或Humanin样多肽受体的至少一种蛋白质的基因。

[20]上述[19]的转化细胞，其中，Humanin受体或Humanin样多肽受体强制表达。

[21]细胞，该细胞是其中的编码构成选自gp130、CNTF-R和WSX-1的Humanin受体或Humanin样多肽受体的至少一种蛋白质的基因被敲除的细胞。

[22]上述[21]的细胞，该细胞是ES细胞。

[23]非人敲除动物，其来源于上述[22]的ES细胞。

[24]上述[23]的敲除动物，该敲除动物是纯合体。

[25]上述[23]或[24]的敲除动物，该敲除动物是啮齿类。

[26]药物组合物，该药物组合物含有与上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，是神经细胞死亡抑制剂。

[27]药物组合物，该药物组合物以与选自上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于伴随有神经退行性的疾病的预防或治疗。

[28]药物组合物，该药物组合物以与上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于阿尔茨海默病的预防或治疗。

[29]药物组合物，该药物组合物以与上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗。

[30]药物组合物，该药物组合物以与选自上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于疯牛病的预防或治疗。

[31]药物组合物，该药物组合物以与上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于血管性痴呆症的预防或治疗。

[32]抗体，该抗体与上述[1]-[6]中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体特异性结合。

根据本发明，Humanin受体或Humanin样多肽受体(NHNR)的结构得以明确，可提供与该受体结合的化合物的筛选方法、以及含有该化合物的药物组合物等。

附图简述

图1A)是将pcDNA3载体或pcDNA3-V642I-APP载体(0.5μg)、和pCAG载体、以及pCAG-野生型小鼠gp130(mgp130wt)或pCAG-小鼠gp130胞外结构域(mgp130tr)(0.5μg)转染神经杂交细胞株F11细胞。示出的是导入72小时时由WST8测定求出的表示细胞存活率的图表。其下面的照片表示通过免疫印迹法确认V642I-APP的表达和mgp130wt或mgp130tr的表达的结果(照片)。B)是在重组体可溶性人gp130(图中，下段“+”)或BSA(图中、下段“-”)(10μg)的存在下，将原代培养皮质神经(PCN)与Aβ(25μM)(图中上段)共同培养。示出的是通过WST-8测定(上)和钙黄绿素荧光法(下)求出的Aβ处理开始72小时后细胞存活率的图表。C)是在1μg抗小鼠gp130中和抗体(RX435)或对照IgG的存在下，将PCN与25μM的Aβ1-43共同培养。示出的是Aβ处理开始72小时后由钙黄绿素荧光法求出的细胞存活率(左)和由LDH测定求出的细胞死亡率(右)的图表。D)是将pcDNA3载体或pcDNA3-V642I-APP(0.5μg)、pEFBos载体或pEFBos-野生型人gp130(0.5μg)转染F11细胞。在导入24小时时添加1μg抗小鼠gp130中和抗体。是通过锥虫蓝排除测定和WST-8测定求出的转染72小时后各细胞死亡率(左)和细胞存活率(右)的图表。也表示了通过免疫印迹法确认V642I-APP的表达和人gp130wt的表达的结果(照片)。

图2A)是将pcDNA3载体或pcDNA3-APP(0.5μg)、和pEFBos载体或编码嵌合体(以G-CSFR/gp130表示)的pEFBos载体(0.5μg)转染F11细胞，其中，所述嵌合体是将人GCSF受体的胞外结构域与使胞膜结构域和胞内结构域的C末端截短的gp130融合而成的。示出的是通过免疫印迹法确认48小时后各嵌合蛋白质的表达的结果(照片)。B)是将pcDNA3载体或pcDNA3-APP(0.5μg)、以及pEFBos载体或编码嵌合体(以G-CSFR/gp130表示)的pEFBos载体(0.5μg)转染F11细胞，其中，所述嵌合体是将人GCSF受体的胞外结构域与使胞膜结构域和胞内结构域的C末端截短的gp130融合而成的。G-CSFR/gp130(277)含有相当于细胞内氨基酸编号1-277的gp130胞内结构域全部，G-CSFR/gp130(133)、(68)、(25)分别含有细胞内的1-133、1-68、1-25个氨基酸。转染24小时后添加各种量的人G-CSF。示出的是通过锥虫蓝排除测定求出的转染72小时后的细胞死亡率的图表。下面的图也表示通过免疫印迹法确认V642I-APP表达的结果(照片)。C)示出的是使用pcDNA3-K595N/M596L-APP(NL-APP)、M146L-PS1、以及N141-I-PS2载体代替pcDNA3-V642I-APP载体，进行与图2A同样的试验得到的结果的图表。下部分是通过免疫印迹法确认NL-APP、M146L-PS1、N141-I-PS2的表达的结果(照片)。D)是将pEFBos载体或pEF-G85R-SOD1载体(0.5μg)、以及pEFBos载体或编码G-CSFR/gp130(277)或G-CSFR/gp130(25)的pEFBos载体(0.5μg)转染F11细胞。转染24小时后添加各种量的人G-CSF。示出的是通过锥虫蓝排除测定求出的转染72小时后细胞死亡率的图表。下面部分也表示通过免疫印迹法确认G85R-SOD1的表达的结果(照片)。E)是通过HN处理，gp130的酪氨酸的磷酸化得到增强。以MOI25，用人gp130-编码腺病毒感染PCNs(6孔板中1.0×10⁶细胞/孔)(DIV3)，60小时后加入1μM HNG、1μM HNA或100ng/ml大鼠IL-6和1μg/ml sIL-6R，在37℃下处理15分钟。用2μg gp130抗体进行免疫沉淀，图表示出的是将沉淀物用磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹的结果(照片)。

图3A)是将PCN以2.5或5×10⁴/孔接种于96孔板，在Aβ(25μM)存在或非存在下，以及各细胞因子存在或非存在下进行培养。示出的是通过WST-8测定和该黄绿素荧光法求出的72小时后细胞存活率的图表。B)与上述A同样，添加可溶性IL-6受体α(sIL-6R)或可溶性CNTF-R(100ng/ml)，用各配体IL-6和CNTF(100ng/ml)刺激，图表示出的是研究上述的添加对Aβ导致的神经细胞死亡的影响的结果图表。左图示出的是由钙黄绿素荧光法求出的细胞存活率，右图示出的是通过WST-8测定求出的细胞存活率的图表。C)与上述A同样，添加1μg小鼠gp130、小鼠LIFR、小鼠IL-11R和大鼠CNTF-R的中和抗体，通过钙黄绿素荧光法求出72小时后细胞存活率。D)是向F11细胞中导入图示量的pRNA-U6.1/穿梭载体(空)、pRNA-U6.1/穿梭-IL-6R siRNA、或者pRNA-U6.1/穿梭-LIFRsiRNA。72小时后从细胞中提取总RNA。通过实时PCR法对IL-6R和LIFRmRNA的量进行定量。内部对照是对G3PDH的mRNA量进行定量、校正。通过免疫印迹法对各蛋白质的变化进行定量。E)是向F11细胞中导入图示量的pRNA-U6.1/穿梭载体(空)、pRNA-U6.1/穿梭-IL-6R siRNA、或者pRNA-U6.1/穿梭-LIFR siRNA。图表示出的是48小时后用100ng/ml IL-6、100ng/ml CNTF或1μM HNG、在37℃下将细胞处理15分钟，收获。图表示出的是用碱性STAT3(Tyr⁷⁰⁵)抗体和STAT3抗体进行免疫印迹的结果(照片)。

图4A)是将pEF-Bos、pEF-mycHis CREME9、pEF-mycHis人WSX-1或pEF-V5-人CNTF-R(0.5μg)、和pCAG-人gp130(0.5μg)转染F11细胞，或者将pEF-mycHis人WSX-1、pEFV5人CNTF-R和pCAG人gp 130(0.5μg)转染F11细胞。为了使添加载体的总量保持1.5μg，适量添加了pEF-Bos载体。图表示出的是通过检测免疫荧光反应来求出生物素标记HN与各转染的细胞的结合量的测定结果的图表。下面部分是通过免疫印迹表示出各蛋白质的表达(照片)。B)是将pEF-mycHis人CREME9或pEF-mycHis人WSX-1(0.5μg)、和pCAG-人gp130(0.5μg)转染F11细胞。在几种试验中，为了竞争，添加了10μM的未标记的HNG或HNA。右侧是通过激光扫描共焦显微镜LSM(Carl Seiss，德国)检测的荧光信号的照片。C)示出的是通过共价结合NH或者HNA的琼脂糖4B磁珠进行的体外Pull-down测定的结果照片。F11细胞中，使CNTF-R、WSX-1、IL-6-R过量表达，通过各4B磁珠进行体外Pull-down测定，免疫印迹是使用Humanin的PO4抗体进行(下图)。上图中使用的琼脂糖4B磁珠中含有的HN或HNA是以HN合成肽(50pmol)作为阳性对照进行比较。

图5示出的是为了确认在HN介导的神经保护作用信号中CNTF-R和WSX-1是否参与，使用质粒siRNA法，将这些蛋白质的表达在F11细胞株中敲除的结果图表。A)是将pRNAU6.1/穿梭载体(NO)、pRNAU6.1/穿梭-siWSX-1载体(W)、或pRNAU6.1/穿梭-siCNTF-R载体(C)转染F11细胞，72小时后溶解细胞，提取RNA，通过实时PCR测定mRNA量，通过免疫印迹法测定蛋白质的量。B)是将pcDNA3载体或pcDNA3-V642I-APP(0.5μg)、pRNAU6.1/穿梭载体(NO)、pRNAU6.1/穿梭-siWSX-1(W)、pRNAU6.1/穿梭-siCNTF-R(C)或pRNAU6.1/穿梭-siFPR-2(F)转染F11细胞，24小时后添加10nM的HNG。转染72小时后进行WSP-8测定。C)是将pcDNA3载体或pcDNA3-V642I-APP(0.5μg)、和pRNAU6.1/穿梭载体(Vec)或pRNAU6.1/穿梭-siWSX-1(W)或pRNAU6.1/穿梭-siCNTF-R(C)(0.5μg)、和含有pFEBos载体或pEF-V5-人CNTF-R或pEF1/mycHis-人WSX-1(1μg)的三种载体转染F11细胞，24小时后添加10nM的HNG。转染72小时后实施WST-8测定。

图6A)示出的是将pFEBos载体或pEF-mycHis-人WSX-1、或/和pEF-V5-人CNTF-R(各0.5μg、总量1.0μg)转染COS7细胞，72小时后用抗myc抗体(抗myc-WSX-1)或抗小鼠和人CNTF-R抗体进行共免疫沉淀试验。将该免疫沉淀物进行免疫印迹处理的结果的照片。细胞溶解B)是用10μMHNA和10nM HNG对F11细胞进行1、3、6小时处理。收获前的30分钟用作为交联剂的1mM BS3处理。用Gp130或CNTFR的抗体进行免疫沉淀，用WSX-1、gp130、CNTF-R的抗体进行免疫印迹。图表示出的是作为对照的免疫沉淀，在一部分中用SOD1的抗体进行免疫沉淀的结果照片。作为input，是将二十分之一量的各溶胞产物进行免疫印迹。

图7是将0.5μgpcDNA3载体或pcDNA3-V642I-APP导入F11细胞中，5小时后给予10nM HNG或10μM HN或者图示浓度的人IL-27。在部分试验中，图示的浓度的IL-27或IL-6与HNG同时给予。给予后72小时时进行WST-8测定。数字标记的F11细胞同时测定了其V642I-APP的表达。下面部分表示通过免疫印迹测定的V642I-APP的表达(照片)。

图8A)是将F11细胞接种于铺有聚-L-赖氨酸的96孔板(7×10³细胞/孔)，在10μM未标记的HNG或HNA非存在下或存在下加入图示浓度的生物素-HN或生物素-HNG，进行以免疫荧光为基础的结合测定(2)(左侧的图)。右侧图中，用0.5μg pcDNA3.1/GS-人CNTF-R、pEF1/MycHis-人WSX-1、1.0μg pCAG-人gp130对F11细胞进行基因导入，24小时后接种于铺有聚-L-赖氨酸的96孔板(7×10³细胞/孔)，36小时后，在10μM未标记的HNG或HNA非存在下或存在下加入图示浓度的生物素-HN或生物素-HNG，进行以免疫荧光为基础的结合测定(2)。B)是向F11细胞中导入0.5mg pRNA-U6.1/穿梭载体、pRNA-U6.1/穿梭-WSX-1 siRNA、pRNA-U6.1/穿梭-CNTF-RsiRNA、pRNA-U6.1/穿梭-WSX和pRNA-U6.1/穿梭-CNTFR siRNA-1 siRNA两者(各0.5μg)、pRNA-U6.1/穿梭-FPR2 siRNA或pRNA-U6.1/穿梭-LIFR。转染的全体载体量为加上骨架载体为1.0μg。24小时后，在100nM未标记HNG存在下、非存在下，对图示浓度的生物素-HNG进行处理，转染72小时后进行以免疫荧光为基础的结合测定(2)。

图9A)是在铺有聚-L-赖氨酸的96孔板(5.0×10⁴细胞/孔)中对PCN细胞进行处理，第三天给予图示浓度的生物素-HG或生物素-HN或人IL-27，进行以免疫荧光为基础的结合测定(2)。在部分试验中，除10nM的生物素-HNG之外，还同时加入图示浓度的未标记的IL-27、CNTF、IL-6或HNG。B)是在铺有聚-L-赖氨酸的96孔板(7×10⁴细胞/孔)中对PCN细胞进行处理，第三天给予图示浓度的人IL-27、10nM HNG和图示浓度的IL-27、IL-6、CNTF或2μl的mWSX-1-N抗体或免疫前血清(preimmunesera)。给予后16小时时开始10μM的Ab(1-43)处理。开始Ab(1-43)处理开始72小时后进行WST-8测定。

图10A)示出的是使用F11细胞的提取液进行mWSX-1-C抗体的免疫印迹的结果(泳道1)、同时使用10倍量的提取液进行mWSX-1-C抗体的免疫沉淀-免疫印迹的结果(泳道3)、以及作为阴性对照进行免疫前血清的模拟免疫沉淀的结果(泳道2)的照片。B)示出的是使用PCNs(DIV3)和F11细胞的提取液进行mWSX-1-C抗体的免疫印迹的结果照片。

图11A)示出的是向F11细胞中加入图示浓度的HN、HNG、HNA，15分钟后收获，通过识别STAT3的第706位磷酸化酪氨酸的抗体和识别STAT3的抗体进行免疫印迹的结果照片。B)是向F11细胞中导入0.5μgpRNA-U6.1/穿梭载体、pRNA-U6.1/穿梭-WSX-1 siRNA、pRNA-U6.1/穿梭-CNTF-RsiRNA、pRNA-U6.1/穿梭-WSX-1和pRNA-U6.1/穿梭-CNTFRsiRNA-1 siRNA两者(各0.5μg)、或者pRNA-U6.1/穿梭-FPR2 siRNA。要转染的全部载体量是加入骨架载体后为1.0μg。48小时后加入HNG、CNTF、IL-27，15分钟后收获，用识别STAT3第706位磷酸化酪氨酸的抗体和识别STAT3的抗体进行免疫印迹。

图12A)是向6孔板每个孔中加入7×10⁴个F11细胞，将1μgpRNA-U6.1/穿梭载体或pRNA/U6.1/穿梭-Bax对其进行转染，72小时后通过实时PCR对小鼠Bax的mRNA表达进行定量。作为内部对照，测定G3PDH的mRNA进行校正。B)是向6孔板每个孔中加入7×10⁴个F11细胞，将pRNA-U6.1/穿梭载体或pRNA-U6.1/穿梭-Bax以0.5或1μg对其进行转染，72小时后通过免疫印迹验证Bax蛋白质的表达。C)是向6孔板每个孔中加入7×10⁴个F11细胞，用1μg pRNA-6.1/穿梭载体或pRNA-U6.1/穿梭-Bax以对其进行转染，72小时后加入100nM星形孢菌素或DMSO，培养3、6、9小时，通过WSP-8测定对存活细胞量进行定量。以载体/DMSO处理的细胞的值为100％，以此进行校正的数字如图所示。D)是向6孔板每个孔中加入7×10⁴个F11细胞，用pcDNA3载体或pcDNA3-V642I-APP或pcDNA3-M146L-PS1(0.5μg)和1.0μgpRNA-U6.1/穿梭载体或pRNA-U6.1/穿梭-Bax siRNA或pRNA-U6.1/穿梭-WSX-1对其进行转染。24小时后添加10μM HN，72小时后进行WSP-8测定。部分细胞溶胞产物通过免疫印迹法确认了APP和PS1的表达。E)是向6孔板每个孔中加入7×10⁴个F11细胞，用1.0μg pRNA-U6.1/穿梭载体或pRNA-U6.1/穿梭-BaxsiRNA、或pRNA-U6.1/穿梭-WSX-1和pRNA-U6.1/穿梭-CNTFR(各0.5μg)对其进行转染。72小时后，添加图示浓度的生物素-HN，在部分试验中同时添加未标记的HN或HNA(100μM)，进行免疫荧光HN结合测定。

实施发明的最佳方式

本发明中，Humanin样多肽受体含有选自gp130或其部分多肽、CNTF受体α链(CNTF-R)和WSX-1的至少两种蛋白质。因此，其具体例子例如有：由gp130或其部分多肽、CNTF-R和WSX-1三种蛋白质构成的受体，由gp130或其部分多肽和WSX-1两种蛋白质构成的受体，以及由CNTF-R和WSX-1两种蛋白质构成的受体。并且，只要本发明的受体的功能不受损害，除了这些蛋白质之外还可以含有其它蛋白质作为构成要素。

构成Humanin样多肽受体的gp130或其部分多肽、CNTF-R和WSX-1等各亚单元只要其构成HNR的亚单元的功能实质上不受影响，还可以含有1或多个氨基酸置换、缺失、插入和/或附加所得的氨基酸序列。它们可以按照本领域技术人员所公知的任意方法制备。

本说明书中，“Humanin样多肽”包含具有与国际公开WO01/021787号公报中公开的含有上述24个氨基酸的多肽(Humanin)同等或更高的、对由AD相关伤害引起的神经细胞死亡的拮抗作用或抑制作用的多肽及其衍生物。本说明书中，只是标记为“Humanin样多肽(受体)”时，也包含“Humanin(受体)”本身。

因此，Humanin样多肽的具体例子例如是：具有国际公开WO01/021787号公报中记载的式(I)所示的氨基酸序列的多肽。

Pro-Xn₁-(Cys/bXaa)-(Leu/Arg)-Xn₂-Leu-Thr-(Gly/Ser)-X

n₃-Pro(I)

(式中，“Cys/bXaa”是Cys或碱性氨基酸，“(Leu/Arg)”是Leu或Arg，“(Gly/Ser)”是Gly或Ser，Xn₁、Xn₂和Xn₃各自独立表示10个残基或以下的任意氨基酸)

更具体的例子有：在选自国际公开WO01/021787号公报中记载的SEQ ID NO.5-8、10、12、13、21-24、26-29、32、33、37-40、46、48、54和60的氨基酸序列中含有1或多个氨基酸、缺失、插入和/或附加得到的氨基酸序列、具有对由AD相关伤害引起的神经细胞死亡具有拮抗作用或抑制作用的多肽。

上述本发明的多肽也包括各种衍生物。这里，“衍生物”是指将本发明的多肽的官能团按照已知的方法，通过修饰、附加、突变、置换、或除去等而具有变异的形态的化合物。所述官能团的变异可采用本领域技术人员公知的任意方法，以例如保护存在于多肽中的官能团、进行多肽的稳定性或组织转移性的控制、或者进行多肽的活性控制等为目的而进行。

即，多肽可通过翻译后的修饰进行自然修饰，也可以进行人工修饰。修饰包含肽的骨架、氨基酸支链、氨基末端或羧基末端等的修饰。多肽可以是分支状，也可以是环状。修饰包含乙酰化、酰基化、ADP核糖基化、酰胺化、[黄素、核苷酸、核苷酸衍生物、脂质、脂质衍生物或磷脂酰肌醇]等的共价键、形成交联、环状化、形成二硫键、去甲基化、焦谷氨酸化、羧基化、糖基化、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、磷酸化、遍在蛋白化等，但并不限于此。上述多肽可以制成本领域所公知的任意的盐和酯化合物。本发明的多肽可通过公知的肽合成技术制备，还可通过使编码这些多肽的DNA表达来制备。

本发明中，“对由AD相关伤害引起的神经细胞死亡具有拮抗作用或抑制作用”是指拮抗或抑制上述AD相关的神经细胞死亡的至少一种。即，上述Humanin样多肽包含具有抑制这些AD相关的神经细胞死亡的至少其中之一的活性。细胞死亡的抑制可以不是完全抑制，而是显著抑制。神经细胞死亡的抑制活性可按照以下实施例记载的方法或其它方法(例如参照国际公开号WO00/14204)进行鉴定。

通过本发明的筛选方法，可以鉴定与Humanin样多肽受体结合的化合物。该化合物可以是人等生物体内原来含有的物质，也可以是人工合成的物质。该化合物还可以与Humanin样多肽受体的任意部分例如胞外结构域或胞内结构域结合。并且，该化合物可以是该受体的激动剂或该受体的拮抗剂。

本发明的筛选方法可以按照本领域公知的任意方法、体系实施。例如，可以通过有细胞系或无细胞系实施。有细胞系是使用表达Humanin样多肽受体的细胞本身实施的系统。特别是本发明中，首次阐明了构成Humanin样多肽受体的蛋白质，因此根据该认识，可以通过本领域公知的任意方法制备Humanin样多肽受体强制表达的细胞。例如，可以通过用表达载体转化适当的宿主细胞容易地制备，所述表达载体含有编码构成Humanin样多肽受体的至少一种蛋白质的基因。使用上述细胞时，试验试样中所含的化合物和Humanin样多肽受体的结合特性有增强的可能性，因此，试验试样中只少量含有目标化合物时或者对于结合力(亲和性)较弱的化合物均可显著地测定。

本发明的筛选方法例如可按照以下步骤实施。

(a)使试验试样与Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质接触的步骤；

(b)测定该受体和该试验试样中所含的化合物的结合特性的步骤；以及

(c)选择与该受体结合的化合物的步骤。

这里，通过在适量的Humanin或Humanin样多肽的存在下进行上述步骤(a)，可以利用该化合物与Humanin或Humanin样多肽之间的竞争反应测定该化合物的结合特性。

在有细胞体系中实施的筛选方法中，上述步骤(a)中的受体与试验试样的接触可通过向表达该受体的细胞培养系统中添加试验试样等本领域所公知的任意方法，使该细胞与试验试样接触来实施。另外，为上述有细胞体系时，可以通过检测对神经细胞死亡的拮抗作用或抑制作用的变化(抑制作用的增强、减少和阻碍等)来测定该受体与化合物的结合特性。并且，已经了解到，如以下实施例所示，Humanin或Humanin样多肽使SATAT3的第706位酪氨酸的磷酸化亢进，因此，通过检测HATAT3第706位酪氨酸的磷酸化的亢进或抑制即可以测定该受体与化合物的结合特性。

表达载体可通过本领域公知的任意方法容易地制备。编码构成Humanin样多肽受体的至少一种蛋白质的基因可根据国际公开WO01/021787号公报及其它公知文献的记载容易地制备。该表达载体除上述蛋白质的编码区之外，也可以包含5’和3’非编码序列(包含非转录序列、非翻译序列、启动子、增强子、抑制基因、转录因子结合序列、剪切序列、polyA附加序列、IRES、mRNA稳定化·去稳定序列等)。

本发明的筛选方法中使用的宿主细胞没有特别限定，特别可以使用包括人和猴等的哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等的细胞或个体。宿主-载体体系例如有：杆状病毒-Sf细胞系(Okamoto等人.，J.Biol.Chem.270：4205-4208，1995)、pcDNA-CHO细胞系(Takahashi等人.，J.Biol.Chem.270：19041-19045，1995)、CMV启动子质粒-COS细胞系(Yamatsuji等人.，EMBO J.15：498-509，1996)等。这些细胞可以在本领域公知的任意条件进行培养。

上述宿主细胞本身无需表达原有的HNR。但是，可以由原本可能表达该受体的组织或细胞例如脑皮质组织、神经细胞株或成神经细胞瘤或畸形瘤细胞等制备。神经细胞株例如有F11细胞、PC12细胞(L.A.Greene和A.S.Tischler，1976，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73：24224-2428)、NTERA2细胞(J.Skowronski和M.F.Singer，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6050-6054)、SH-SY5Y细胞(L.Odelstad等人.，1981，Brain Res.，224：69-82)等。这种情况下，通过来自导入的表达载体的受体强制表达，表达比原来的表达量更多的Humanin样多肽受体，结果测定灵敏度进一步提高。

可通过无细胞体系实施本发明的筛选方法。所述无细胞体系筛选方法可以使用本领域公知的任意方法。例如，根据筛选的方法，可以使本发明的受体或构成该受体的至少一种蛋白质与溶解状态或者与载体结合的形式用于筛选。本发明的受体可被标记。标记可例举：放射线同位素标记、荧光物标记、生物素或地高辛标记、标志序列的附加等。

例如，将试验试样过固定有构成本发明的HNR或构成HNR的至少一种蛋白质的亲和柱，通过纯化与柱特异性结合的化合物来实施与它们结合的化合物的筛选。还可以是使合成化合物、天然物库或者随机噬菌体肽展示文库等与固定的本发明的受体或构成该受体的至少一种蛋白质作用，筛选所结合的分子。另外，还可以利用表面等离子体共振现象结合，通过检测该结合进行筛选(例如ビアコア(BIAcore制备))。这些筛选也可以通过采用组合化学的技术的高通量筛选进行。

本发明的筛选中使用的试验试样例如可以是纯化蛋白质(包括抗体)、基因文库的表达产物、合成肽的文库、细胞提取液、细胞培养上清、合成低分子化合物的文库、土壤等天然材料、放线菌培养液等含有细菌释放物质的溶液等。试验试样可以根据需要进行适当的标记，例如放射标记、荧光标记。

编码本发明的构成HNR的至少一种蛋白质、即选自gp130、CNTF-R和WSX-1的至少一种蛋白质的基因被敲除的细胞可通过利用本领域公知的同源重组的基因打靶制备。上述敲除细胞优选小鼠、人等哺乳类细胞，还可以使用这样得到的敲除细胞、采用本领域公知的方法制备各种敲除动物。所述各种敲除动物是杂合体或纯合体。特别是小鼠和大鼠等啮齿类的敲除动物可用作阿尔茨海默病等伴随有神经退行性的疾病的研究的有用的试验动物。

与本发明的HNR结合的化合物具有Humanin的激动剂或拮抗的活性，因此可用于阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、疯牛病和血管性痴呆病等伴随有神经退行性的疾病的常规预防或治疗。

如上所述，目前的研究已经证实了在阿尔茨海默病中发生神经细胞的死亡。因此，本发明的药物组合物有望作为保护阿尔茨海默病中的神经退行性的药物使用。使用本发明的药物组合物，除了阿尔茨海默病以外，例如还可以预防由于脑缺血导致的神经细胞的细胞死亡的疾病(T.Kirino，1982，Brain Res.，239：57-69)。除此之外，伴随有痴呆的帕金森病(M.H.Polymeropoulos等人.，1997，Science，276：2045-2047)、弥漫性路易体病(M.G.Spillantini等人.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：6469-6473)、伴随唐氏综合征的痴呆等也是治疗或预防对象。另外，APP的近似分子-APLP1被称为先天性肾病综合征的病因基因(Lenkkeri，U.等人.，1998，Him.Genet.102：192-196)，因此也是该肾病综合征等肾病的治疗或预防对象。

因此，本发明的药物组合物含有与HNR结合的化合物作为有效成分，除了将该有效成分本身直接给予患者之外，还可以通过公知的制剂学方法制成制剂。例如，可以与药理学上可接受的载体或介质、具体来说有无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、缓释剂等适当组合制成制剂给予。本发明的药物组合物可以是水溶液、片剂、胶囊、锭剂、口腔贴片、酏剂、混悬液、糖浆剂、滴鼻液或吸入液等形式。本发明化合物的含有率可根据治疗目的、给药途径、治疗对象等由本领域的技术人员适当确定。

给予患者时，可根据有效成分的性质例如经皮、鼻腔内、经支气管、肌内、腹腔内、静脉内、脊髓腔内、脑室内或口服进行。例如用于脑神经退行性疾病的治疗时，本发明的药物组合物优选通过包括静脉内、脊髓腔内、脑室内或硬膜内注射的任意适当途径导入到中枢神经系统中。本领域技术人员可根据患者的年龄、体重、症状、给药方法等选择适当的给药量。给药量、给药方法可根据本发明的药物组合物的有效成分的组织转移性、治疗目的、患者体重或年龄、症状等由本领域技术人员适当选择。例如，在阿尔茨海默病治疗等中，为了保护脑神经细胞退行性而给药时，优选上述化合物以在作为靶的细胞周围可有效地抑制神经退行性的浓度进行给予。即，只要具有Humanin多肽或与其同等的神经细胞保护作用的物质，应至少给予1nM或以上，优选10nM或以上，更优选100nM或以上，进一步优选1μM或以上。

本发明的抗体可包含本领域所公知的任意形式和种类。例如包含多克隆抗体和单克隆抗体，以及可通过本领域公知的基因工程方法制备的各种人源化抗体等嵌合抗体。

实施例

以下按照实施例进一步详细说明本发明。本发明的技术范围并不受这些实施例的任何限制。

试验材料和试验方法

细胞株和基因

神经杂交细胞株F11细胞以及编码V6421-APP、K595N/M596L-APP(NL-APP)、M146L-PS1、N141-I-PS2 cDNA的pcDNA3载体按照记载制备(Hashimoto等人.，2000，2001a，2003)。对于PCAG-人gp130和pCAG-人gp130 ED(胞外人gp130)按照报导制备(Kumanogoh等人.，1997)。对于G-CSF受体的胞外结构域与gp130的胞膜结构域和各种胞内结构域的部分融合而成的pcDNA载体按照报导进行制备(Fukuda等人.，1996)。gp130的胞内结构域由C端截短。被称为G277的嵌合蛋白质含有gp130胞内结构域全长277个氨基酸，G-195、G-133、G-68、G-25包含胞内结构域的1-195、1-133、1-68、1-25个氨基酸。C末端带有mycHis标志的人WSX-1、带有mycHis标志的小鼠CREME9是使用有义、反义引物组、人WSX-1使用(5’--ACTAGTACCATGCGGGGAGGCAGGGG-3’和5’-GAATTCGGCCAGAACCTG TGGCCTGG-3’)、小鼠CREM9使用(5’-GGATCCACCATGAAGGGCGCGATGG AGCC-3’和5’-GAATTCAAATACCAGCACTTTCCATCCAGG-3’)，由人和小鼠胚胎cDNA通过PCR进行扩增。编码C末端带有V5标志的人CNTF-R(V5-CNTF-R)和大鼠IL-6R(pUCM18-大鼠IL-6R)的质粒可分别由Invitrogen和美国典型培养物保藏中心购入。将家族性ALS(FALS)基因G85R-SOD1编码在pEFBos载体上的质粒由迁省次博士赠予(Hashimoto等人.，2001a，Kanekura等人，2004)。人野生型gp130的粘粒是将全长gp130插入到pAxCAwt(TaKaRa)的SwaI位点构建。

重组细胞因子与可溶性受体

小鼠心肌营养素1(CT1)、大鼠IL-6、小鼠LIF、小鼠IL11、可溶性大鼠IL-6R、可溶性人CNTF-R、重组小鼠gp130/Fc嵌合与重组人可溶性CNTF-R由R&D系统(明尼阿波利斯、明尼苏达、美国)获得。人IL-6、人制癌蛋白M、大鼠CNTF、人GCSF由PeproTechEC公司(伦敦、英国)获得。人CNTF由R&D系统或PeproTechEC公司获得。人IR-27由R&D公司获得。

抗体

抗小鼠APP抗体(22C11)和抗小鼠PS1抗体购自Chemi-con(Ternecula，加利福尼亚，美国)，抗PS2抗体和phoshoSTAT3(Tyr⁷⁰⁵)抗体购自CellSignaling Technology(Beverly，马萨诸塞，美国)。HRP结合或非结合抗myc单克隆抗体购自Biomol(Plymouth Meeting，PA)。HRP结合或非结合抗V5抗体购自Invitrogen。兔多克隆抗体抗HN抗体PO4根据报导(Tajima等人.，2002)制备。抗G-CSFR、gp130、CNTF-R、LIFR、SOD1、STAT3、IL-6R抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，美国)。抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体、4G10购自アツプステ一トUSA(チヤ一ロテスブイレ、弗吉尼亚、美国)。两种兔多克隆抗体、抗小鼠WSX-1抗体是将相当于WSX-1的N末端16个氨基酸的合成肽MNRLRVARLTPLELLL(mWSX-1-N)和相当于C末端16个氨基酸的合成肽YSGYEKHFLPTPEELGLLV(mWSX-1-C)与匙孔血蓝蛋白(Sigma)共价结合的物质进行免疫得到。同样，两种兔多克隆抗人WSX-1抗体是将相当于WSX-1的N末端17个氨基酸的合成肽MRGGRGAPFWLWPLPKC(hWSX-1-N)和相当于C末端20个氨基酸的合成肽LPTPEELGLLGPPRPQVLAC(hWSX-1-C)与匙孔血蓝蛋白(Sigma)共价结合的物质免疫所得。抗小鼠gp130中和抗体、抗小鼠LIFR中和抗体、抗小鼠IL-11R中和抗体、抗人CNTF-R中和抗体、抗大鼠CNTF-R中和抗体购自R&D系统。其它单克隆抗体、抗小鼠gp130、RX435由庆应义塾大学医学部福田博士赠予。Bax的抗体由Santa Cruz Biotechnology购入(P-19)。

肽

合成HN、合成S14G-HN(HNG)、C8A-HN(HNA)、人淀粉样蛋白-β(1-42)肽购自肽研(箕面、大阪)。生物素-HN、生物素-HNG购自神户天然物化学株式会社。

转染、细胞死亡测定、细胞存活率测定

转染的方法可按照以前报道的方法进行(Hashimoto等人.，200，2001a，2003)。将F11细胞以7×10⁴/孔接种于6孔皿，导入指示的载体。按照说明书操作，导入效率大致一定，约为70％。导入后72小时时，通过锥虫蓝排除测定和LDH测定汇总细胞死亡率，通过WSX-8测定求出细胞存活率(Hashimoto等人.，200，2001a，2003)。通常转染开始后5小时后添加HN，HN效果大致相同，因此在一部分试验中将添加HN的时间改为24小时后。

初代培养皮质神经和细胞存活率测定

初代培养小鼠皮质神经(PCN)可按照以前报导的方法准备(Sudo等人.，2000)。简单地说，初代培养皮质神经由ICR小鼠14天的胚胎(E14)获得，在经聚L赖氨酸表面处理的96孔板(SUMITOMO BAKELITE Co.，Ltd.)上，用神经培养基，以2.5或5×10⁴/孔接种，或者在6孔板上以1.0×10⁶/孔接种，使用神经培养基(SUMITOMO BAKELITE Co.，Ltd.)(Hashimoto等人.，2003，Niikura等人，2004)。三天后，将细胞培养基更换为含有N2补充物的DMEM。第四天体外加入显示25μM Aβ1-43浓度的HN或细胞因子，在可溶性细胞因子受体或中和抗体存在下、非存在下观察其影响。处理72小时后，通过WST-8或钙黄绿素荧光法求出细胞存活率，通过锥虫蓝排除测定或LDH测定求出细胞死亡率(Hashimoto等人.，2000，2001a，b，2003)。

以免疫荧光为基础的结合测定(1)

将所示量的编码V5-CNTF-R或者mycHis-WSX-1的表达质粒根据需要与PCAG-人gp130一起导入到F11细胞中(6孔板上7×10⁴/孔)，24小时后重新接种于96孔板(7×10³/孔)。导入第36小时时，在10μM的HNG(S14G-HN)或HNA(C8A-HN)存在或非存在下，添加标记了100nM生物素的HNG-FLAG(Hashimoto等人.，2001a)。反应6小时后将细胞用4％低聚甲醛/PBS固定30分钟。用PBS洗涤，然后将细胞用结合了FITC的抗生物素蛋白(モレキユラ一プロ一ブ、ユ一ジン、俄勒冈、美国)染色。通过荧光吸收测定器(Wallac 1420 ARVOSX Multi Label Counter)测定免疫荧光强度(激励＝485nm、释放＝535nm)。免疫组织化学分析是通过激光扫描共焦显微镜LSM(Carl Seiss，德国)进行。

以免疫荧光为基础的结合测定(2)

将所示量的编码V5-CNTF-R或者mycHis-WSX-1的表达质粒根据需要与PCAG-人gp130一起导入到F11细胞中(6孔板上7×10⁴/孔)，24小时后重新接种于铺有聚-L-赖氨酸的96孔板(7×10³/孔)。导入第36小时时，在标记浓度的HNG(S14G-HN)或HNA(C8A-HN)存在或非存在下，添加标记了标记浓度的生物素的HN或HNG(Hashimoto等人.，2001a)。反应6小时后将细胞用PBS洗涤，然后将细胞用结合了FITC的抗生物素蛋白(モレキユラ一プロ一ブ、ユ一ジン、俄勒冈、美国)染色。通过荧光吸收测定器(Wallac1420 ARVOsx Multi Label Counter)测定免疫荧光强度(激励＝485nm、释放＝535nm)。免疫组织化学分析是通过激光扫描共焦显微镜LSM(Carl Seiss，德国)进行。

pull-down测定

向F11细胞(6孔板上，7×10⁴/孔)导入编码mycHis-WSX-1、V5-CNTF-R或大鼠IL-6R(V6标记)的质粒。导入后48小时时，为了通过琼脂糖4B-HN或HNA进行pull-down测定而采集细胞溶解液(细胞溶胞产物)。琼脂糖4B与HN或HNA的结合反应按照制造公司(Amersham PharamaciaBiotech，Uppsala，瑞典)的指示，使3ml CNBr-活化琼脂糖4B和5mg HN或HNA在偶联缓冲液中(0.1M NaHCO₃、0.5M NaCl，pH 8.3)、在4℃下反应过夜。为了防止非特异性结合，磁珠在室温下与封闭缓冲液(0.2M甘氨酸、pH 8.0)反应2小时，然后用偶联缓冲液洗涤，在进行pull-down测定前在4℃下保存。各pull-down测定中，对100μl细胞溶解液使用20μl1∶1琼脂糖淤浆。

免疫印迹分析

将(10-20μg/泳道)细胞溶胞产物或pull-down沉淀物按照已报导的方法，用SDS-PAGE处理，将在凝胶上分离的蛋白质转移到PVDF膜上(Hashimoto等人.，2000)。通过ECL法(Amersham Pharamacia Biotech，Uppsala，瑞典)使发生引发免疫反应的蛋白质条带变得可观察。

以质粒为基础的小RNAi

编码小鼠FPR2、小鼠CNTF-R、小鼠WSX-1、小鼠IL-6R和小鼠LIFR的小干涉RNA(sRNAi)的质粒载体如下构建。

小鼠FPR2

有义DNA片段：

5’-AGGATCCCGTAACTACCACTAAGCAATGTCTTGATATCCGGACATTGCT

TAGTGGTAGTTATTTTTTCCAAAAGCTTGCA-3’、

反义DNA片段：5’-TGCAAGCTTTTGGAAAAAATAACTTACCACTAAGC

AATGTCCGGATATCAAGACATTGCTTAGTGGTAGTTACGGGATCCT-3。

小鼠CNTF-R

有义DNA片段：5’-TTGGATCCCGTGTGTGCTGTGCCATCCGAGATTGATATC

CGTCTCGGATGGCACAGCACACATTTTTTCCAAGGTACCTT-3’、

反义DNA片段：

5’-AAGGTACCTTGGAAAAAATGTGTGCTGTGCCATCCGAGACGGATATCAA

TCTCGGATGGCACAGCACACGGGATCCAA-3’。

小鼠WSX-1

有义DNA片段：5’-TTGGATCCCATATCCACTTGAGAGAAGATCTTGATATCC

GGATCTTCTCTCAAGGGATATTTTTTTCCAAGGTACCTT-3’、

反义DNA片段：5’-AAGGTACCTTGGAAAAAAATATCCACTTGAGGAAG

ATCCGGATATCAAGATCTTCTCTCAAGTGGATATGGGATCCAA-3’。

小鼠IL-6R

有义DNA片段：5’-GCGGATCCCGTTTAAGCTGTGAAACGCTTCGTTGATATC

CGCGAAGCGTTTCACAGCTTAAATTTTTTCCAAAAGCTTGC-3’、

反义DNA片段：5’-GCAAGCTTTTGGAAAAAATTTAAGCTGTGAAACGC

TTCGCGGATATCAACGAAGCGTTTCACAGCTTAAACGGGATCCGC-3’。

小鼠LIFR

有义DNA片段：5’-TTGGATCCCATATCCACTTGAGAGAAGATCTTGATATCC

GGATCTTCTCTCAAGGGATATTTTTTTCCAAGGTACCTT-3’、

反义DNA片段：5’-AAGGTACCTTGGAAAAAAATATCCACTTGAGGAAG

ATCCGGATATCAAGATCTTCTCTCAAGTGGATATGGGATCCAA-3’

小鼠Bax

有义DNA片段：5’-CGGGATCCCATGATCTGTTCAGAGCTGGTGTTGATATC

CGCACCAGCTCTGAACAGATCATTTTTTTCCAAGGTACCCC-3’

反义DNA片段：5’-GGGGTACCTTGGAAAAAAATGATCTGTTCAGAGCT

GGTGCGGATATCAACACCAGCTCTGAACAGATCATGGGATCCCG-3’。

这些DNA片段可按照制造商的指示进行加热、降温，进行退火。这样退火的引物和pRNAU6.1/穿梭空载体(GenScript，NJ，美国)用BamH1和Kpn1在37℃下消化过夜反应。切断的DNA片段和空载体用GENECLEAN II试剂盒(Q BIOgene，USA)纯化。连接是使用LigationConvenience试剂盒(NIPPON GENE，Tokyo，Japan)，按照试剂盒的指示进行。这些siRNA载体序列可直接测定序列确认，siRNA质粒的效果可通过下述实时PCR确认。

实时PCR

为了验证内源性的mRNA，实施实时PCR。用ISOGEN试剂(NIPPONGENE，Toyama，Japan)提取RNA，接着进行实时PCR。通过Sensiscript反转录酶(QIAGEN，德国)，由0.5mg总RNA合成第一链cDNA(First strandcDNA)。实时PCR是使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN)实施。接着用ABI PRISM7700(Applied Biosystems，Foster City CA)进行分析。有义引物和反义引物的组如下制备。

小鼠CNTF-R为5’-TTCCACCGTGACTCCTGCACCTG-3’、5’-GAGGGCTGGGTCCTTCTCACAGAC-3’，小鼠WSX-1为5’-CCGCAGAAAGCTCTCACCTGTCAG-3’，5’-CCATGGATATCCGTTCTCCACCTG-3’、小鼠LIFR为5’-GTGGAAGATACGTCGGCAGACTCG-3’，5’-ACCCTGAAGGTCAGCAATCCTCAG-3’、小鼠IL-6R为(5’-CCCTGCCAGTATTCTCAGCAGCTG-3’，5’-CGGCCTTCCAGGTATGGCTGATAC-3’)、小鼠IL-6R为5’-CCCTGCCAGTATTCTCAGCAGCTG-3’，5’-CGGCCTTCCAGGTATGGCTGATAC-3’、小鼠Bax为5’-GGAATTCACCATGGACGGGTCCGGGGAGCAG-3’，5’-GGGGTACCGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGAG-3’，人和小鼠G3PDH为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’和5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’。数据分析通过SequenceDetection System ver.1.9.1(Applied Biosystem)进行。为了调节各mRNA的表达水平，使用G3PDH mRNA作为对照。

统计分析

所有的细胞死亡试验、细胞存活试验、实时PCR均以n＝3进行。体外试验图中的所有数值均为平均值±SD。进行方差分析的统计处理，在post hoc检测中为p＜0.05，有显著差异。

结果1：

考虑到某种酪氨酸激酶或STAT3含在经HN介导的神经保护作用信号途径中(Hashimoto等人.，2005)，可以认为HN受体属于细胞因子受体家族。gp130是属于IL6R受体家族的细胞因子受体中共有的亚单元，使其胞外结构域和胞膜结构域强制表达(gp130tr)，或者添加含有人gp130的胞外结构域(gp130ED)的重组可溶性人gp130，则如图1A和图1B所示，完全地抑制经HN介导的对V642I-APP过量表达导致的毒性(A)和25μM的Aβ导致的毒性(B)的神经保护作用。gp130ED和gp130tr显示发挥显性失活型的作用(Kumanogoh等人.，1997；Jostock等人.，1998)，因此，该结果意味着经HN介导的神经保护作用的信号是经gp130介导的。我们进一步对该结果进行确认，研究使其与抗gp130中和抗体反应，对该信号有怎样的影响。已经显示该抗小鼠gp130抗体(RX435)抑制小鼠gp130的功能但不阻碍人gp130功能，但是该抗体在F11细胞中抑制经HN介导的神经保护作用(图1C)，而该抑制是由于对该抗体没有感受性的人gp130的同时表达而抑制(图1D)。该结果明确地显示gp130与该HN信号有关。

结果2：

为了进一步确认HN的神经保护作用信号中有gp130的介入，构建各种嵌合蛋白质，即胞外结构域为G-CSF、胞膜结构域为gp130、胞内结构域为C端截短成各种长度的人gp130(Fukuda等人.，1996)。被称为G277的嵌合蛋白质是包含gp130的全部胞内结构域，G-195、G-133、G-68、G-25分别包含胞内第1-195、1-133、1-68、1-25位氨基酸(胞内结构域的N末端氨基酸为第1位)。首先，确认这些嵌合蛋白质的表达(图2A)。使G-277表达，用100nM G-CSF刺激，抑制由V642I-APP表达所诱导的神经细胞死亡。但是，使G-25或G-68表达，并同样刺激，则无法抑制该细胞死亡(图2B)。G-133表达时，同样的刺激抑制该细胞死亡的程度为中间性(图2B)。在以前的研究中显示：gp130的胞内结构域的第3位酪氨酸(也包含在G-133中)对于祖B细胞(proB cell)中的抗编程性细胞死亡效果中是必须的(Fukuda等人.，1996)，因此推测相当于134-277的结构域所介导的另外的信号是100％保护AD相关伤害导致的神经细胞死亡所必须的。同样，G-277表达，则通过100nM的G-CSF刺激来防御NL-APP、M146L-PS1、N141I-PS2导致的神经细胞死亡，而G-25表达时则不预防(图2C)。与这些AD相关神经细胞死亡对照的100nM的G-CSF并不防御目前公开的作为家族性肌萎缩性侧索硬化症的病因基因的Cu/Zn-SOD1突变体基因所引起的神经细胞死亡(图2D)。另外，通过HN处理，可见gp130磷酸化水平的增加(图2E)。

结果3：

为了研究HN受体的分子基础，对于目前已知的IL-6家族的细胞因子是否可效仿经HN介导的神经保护作用进行了研究。如图3A所示，可与小鼠心肌营养素-1(CT-1)、大鼠IL-6、小鼠IL-11、人OSM、小鼠LIF、小鼠CNTF-R结合的人CNTF在生理水平(最高为100ng/ml)均不抑制Aβ诱导的F11的细胞死亡。这对于V642I-APP过量表达导致的神经细胞死亡也同样(未给出数据)。

IL-6受体、IL-11受体、LIF受体或CNTF受体与gp130均在F11细胞和初代培养脑皮质神经中表达(YH和M.M的未发表的研究成果)，应该生成gp130与这些受体的亚单元组合而成的功能性IL-6受体、IL-11受体、OSM受体、LIF受体或CNTF受体生成。因此，可以得出IL-6、IL-11、CT-1、OSM、LIF以及CNTF诱导的经gp130介导的途径并不足以诱导AD相关伤害导致的细胞死亡的结论。由以上认识可知：无法推想HN与这些细胞因子受体结合可发挥神经保护作用。

结果4：

为了使IL-6介导的信号增大，我们对于添加可溶性IL-6受体α(sIL-6R)或可溶性CNTF-R(100ng/ml)，分别用各自的配体IL-6和CNTF(100ng/ml)刺激，研究对Aβ导致的神经细胞死亡的影响(图3B)。如所预想，IL-6如果表达为sIL-6R，则诱导gp130的均聚二聚体化，显示与HN同样的活性。与此相反，对于CNTF，即使使可溶性CNTF-R(sCNTF-R)过量表达，也不显示HN样的活性。考虑到CNTF与CNTF-R的结合是通过gp130与LIF-R的杂合二聚体化来传递胞内信号，由此推测：LIF-R并未参与经HN介导的神经保护作用。

结果5：

使用gp130结合受体的中和抗体，进一步研究与已知的gp130偶联的受体是否参与了经HN介导的神经保护作用。结果，抗大鼠CNTF-R中和抗体也识别小鼠CNTF-R，这可以推想到，但还发现该CNTF-R的抗体使HN活性消失(图3C)。结合图3B中的CNTF/可溶性CNTF-R的结果考虑，可以认为CNTF-R与配体CNTF结合，以与诱导gp130和LIFR的杂合二聚体化的原本形式完全不同的形式参与HN信号。并且，制备了编码IL-6R和LIF-R的特异性siRNA的载体(图3D)。通过使这些载体在F11细胞内表达、使内源性IL-6R或LIF-R的表达降低，这并不能使与HN作用时STAT3的磷酸化减弱(图3E)。这也证明了HN并不经IL-6R或LIF-R介导传递细胞存活信号。

结果6：

为了进一步研究HN受体(HNR)的分子基础，通过使与gp130形成受体复合物(Pflanz等人.，2004)的IL-27受体-WSX-1、CNTF-R、以及推测可能与gp130形成复合物但尚未调查的受体CREME9(CRL4)(Boulay等人.，2003)在F11细胞株中过量表达，在不反映内源水平的HNR和HN结合的条件下进行与免疫荧光HN的结合测定(以免疫荧光为基础的结合测定(1))。

使人WSX-1和人CNTF-R在F11细胞中表达，则HN结合增加，但是同样使CREME9表达，HN的结合量却不增加(图4A)。在相同的测定中，CNTF-R和WSX-1同时过量表达使HN结合量协同性增加(图4A)。各蛋白质的表达通过免疫印迹确认。该结果显示：CNTF-R和WSX-1是HNR的成分。为了确认HN是否与WSX-1特异性结合，在HN的1000倍活性的衍生物HNG或大量的作为阴性对照、没有活性的HNA存在下，进行HN结合试验(图4B)。在表达WSX-1与gp130的细胞中，HNG抑制了HN的结合，但不抑制HNA。这显示HN与WSX-1特异性结合。在通过使HN或HNA共价结合的琼脂糖4B磁珠进行的体外Pull-Down测定中发现：HN与在F11细胞中过量表达的CNTF-R和WSX-1结合，但不与IL-6受体结合(图4C)。还确认了与HN不同，HNA不与这些受体结合(图4C)。

结果7：

为了确认CNTF-R和WSX-1参与了HN介导的神经保护作用信号，使用质粒siRNA法，在F11细胞株中将这些蛋白质的表达敲除。该方法的效率通过实时PCR的mRNA和蛋白质法的蛋白质定量进行研究(Sui等人.，2001，Kanekura等人.，2004)(图5A)。阴性对照是使用最近发表的HN受体-小鼠FPR-2(Ying等人.，2004)的siRNA。如图5B所示，如果阻止内源性WSX-1表达，则HN对于V642I-APP过量表达导致的神经细胞死亡的活性完全消失。如果抑制CNTF-R表达，则HN活性与对照相比减少30％。但是，即使抑制FPR-2表达，HN活性也不减少。并且，使人CNTF-R或人WSX-1分别表达，被小鼠的CNTF-R和WSX-1的siRNA抑制的HN活性完全恢复(图5C)。以上的结果强烈地支持了CNTF-R和WSX-1是HN受体的成分这一结论。考虑到CNTF-R的中和抗体完全抑制HN活性(图3C)、而siRNA对CNTF-R的表达抑制与WSX-1的情形相比是不完全的(图5A)，由于CNTF-R表达是不完全抑制，因此在图5B中，可以认为完全未抑制HN活性。

结果8：

研究CNTF-R是否可与WSX-1形成复合物。将myc标记掺入人WSX-1中，V5标记掺入人CNTF-R中，在COS7细胞中过量表达，通过共免疫沉淀试验进行分析。如图6A所示，WSX-1的免疫沉淀是与CNTF-R共沉淀，CNTF-R的免疫沉淀是与WSX-1共沉淀。这显示WSX-1与CNPF-R结合。

结果9：

通过HN处理，CNTF-R与WSX-1、或者WSX-1与gp130的结合受到诱导。如图6B所示，对F11细胞进行10nM的HNG或HNA处理，在0、1、3、6小时后回收细胞，通过gp130抗体和CDTF-R抗体进行免疫沉淀，将该沉淀物用mWSX-1抗体进行免疫印迹分析。结果可知，通过HNG处理，在特异性内源水平的表达中，CNTF-R与WSX-1、或者WSX-1与gp130的结合受到诱导。

结果10：

已经报导IL-27是将WSX-1/9gp130作为其受体。因此，IL-27有可能显示与HN同样的效果。如所预想的，对F11细胞进行IL-27处理，在高浓度区(1-10μM)显示HN样效果。并且同时，100nM或以下的IL-27处理则显示相反的抑制HN的效果(图7)。

结果11：

进一步开发灵敏度更高的以免疫荧光为基础的结合测定(2)，成功地检测了与内源水平的HN受体的结合。使用该测定方法，使用具有内源水平的HNR的F11细胞(图8的左侧2个图)和通过转染高表达CNTF-R/WSX-1/gp130的F11细胞(右侧2个图)，对HN或者HNG与HNR的结合强度进行结合测定。上侧2个图是研究HN的结合，下侧2个图是研究HNG的结合，结果，HN和HNG分别以10μM和10nM为饱和浓度，显示浓度相关性的结合，了解到：各KD在1-10μM和1-10nM的范围。结合特异性如下确认：通过过量添加未进行生物素标记的HN和HNG，结合几乎完全受到抑制。以上得到的HN或HNG与HNR的结合的参数与以前研究中所报导的(Hashimoto等人.，2001a，b)HN或HNG的神经细胞死亡抑制活性参数几乎完全一致(图8A)。

结果12：

使用siRNA的方法，验证在使内源性CNTF-R和WSX-1表达降低的F11细胞中各种活性是否受到影响，由此确认HN或HNG与内源水平HNR的结合同CNTF-R和WSX-1的表达相关(图8B)。如图8B所示，在使内源性CNTF-R和WSX-1表达降低的F11细胞中，两者的结合显著降低，使CNTF-R和WSX-1两者的表达同时降低，则HN或HNG与F11细胞的结合完全受到抑制。由于FPR2和LIFR的表达降低，因此结合不受影响。这些事实意味着HN或HNG与F1 1细胞的结合与CNTF-R和WSX-1的表达具有相关性。

结果13：

进一步使用生理性神经细胞TCN，与在F11细胞中观察的(图7)相同，研究高浓度IL-27、CNTF处理是否抑制HN与PCN细胞的结合。与在F11细胞中的结果相同，100nM-1μM的IL-27处理抑制了HN与PCN的结合(图9A)。相同浓度的CNT-F也与IL-27同样，抑制HN与PCN的结合，但是IL-6则没有上述效果。

结果14：

与结合抑制试验的结果一致，与F11细胞相同，高浓度IL-27在PCN细胞中也显示具有HN样效果，并且抑制HN的功能(图9B)。还证明：CNT-F也与IL-27同样，抑制HN的功能，并且HN的功能由于WSX-1抗体(mWSX-1-N)处理而受到抑制。这些结果支持了PCN与F11细胞相同，HN是以CNTF-R/WSX-1/gp130为受体发挥功能的结论。

结果15：

实际上PCN与F11细胞相同，可见WSX-1的表达(图10A和B)。

结果16：

在F11细胞中，CNT-F或IL-27处理使STAT3的第706位酪氨酸磷酸化亢进，还发现HN或HNG也使STAT3磷酸化(图11A)。并且，使用siRNA使内源性CNTF-R和WSX-1表达降低，则HNG导致的STAT3第706位酪氨酸磷酸化完全受到抑制(图11B)。该结果意味着HN或HNG与CNTF-R或WSX-1相关性地引发STAT3的第706位酪氨酸磷酸化。

结果17：

制备小鼠Bax的特异性siRNA(siRNA-Bax)。使该siRNA在F11细胞中表达，则内源性Bax mRNA量与蛋白量显著减少(图12A、B)。并且，siRNA-Bax显示显著地抑制星形孢菌素诱导性F11细胞的编程性细胞死亡，因此可判断该siRNA-Bax有效地发挥了功能(图12C)。因此，用siRNA-Bax抑制F11细胞的内源性Bax的表达，调查HN对于V642I-APP或M146L-PS1高表达诱导性F11神经细胞死亡的抑制效果如何变化。同时研究siRNA对于作为阳性对照的WSX-1的效果。首先，已经了解到siRNA-Bax对于V642I-APP导致的神经细胞死亡本身具有抑制效果，因此，在检测V642I-APP导致的神经细胞死亡的体系中无法验证siRNA-Bax对于HN作用的效果。另一方面，siRNA-Bax对于M146L-PS1诱导性神经细胞死亡不具有抑制效果，因此，可以验证siRNA-Bax对于HN作用的效果。如图12D所示，即使抑制内源性Bax表达，HN对于M146L-PS1诱导性神经细胞死亡的抑制效果也完全不受影响。因此，可以得出HN的抑制细胞死亡的效果是通过抑制Bax的功能来发挥这个结论。另外，如图12E所示，与同时抑制内源性WSX-1和CNTFR表达的情形不同，即使抑制内源性Bax表达，也完全不能抑制对HN与F11细胞的结合活性。以上两个结果至少支持了在F11细胞中，HN的靶不是细胞内的Bax这个结论。

以下给出的技术文献的内容被引用在本说明书中，视为其公开内容的一部分。

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产业实用性

本发明所阐明的Humanin样多肽受体(HNR)可用作了解促进或抑制发挥HN的神经保护作用等活性的胞内信号途径的机理，同时可在神经退行性疾病、特别是阿尔茨海默病等的治疗药开发等临床应用中发挥作用。

Claims (32)

1.Humanin受体或Humanin样多肽受体(HNR)，该受体含有选自gp130或其部分多肽、CNTF受体α链(CNTF-R)和WSX-1的至少两种蛋白质。

2.Humanin受体或Humanin样多肽受体，该受体由gp130或其部分多肽，CNTF-R和WSX-1构成。

3.Humanin受体或Humanin样多肽受体，该受体由gp130或其部分多肽和WSX-1构成。

4.权利要求1-3中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体，其中，gp130的部分多肽至少具有胞内结构域的第1-133位氨基酸序列。

5.Humanin受体或Humanin样多肽受体，该受体由CNTF-R和WSX-1构成。

6.权利要求1-5中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体，其中，gp130、CNTF-R和WSX-1是来自人的蛋白质。

7.化合物的筛选方法，该化合物与权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合。

8.权利要求7的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物是与该受体的胞外结构域结合。

9.权利要求7的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物是与该受体的胞内结构域结合。

10.权利要求7的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物是该受体的激动剂。

11.权利要求7的筛选方法，其中，与Humanin受体或Humanin样多肽该受体结合的化合物是该受体的拮抗剂。

12.权利要求7-11中任一项的筛选方法，该方法包含以下步骤：

(a)使试验试样与Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质接触的步骤；

(b)测定该受体和该试验试样中所含的化合物的结合特性的步骤；以及

(c)选择与该受体结合的化合物的步骤。

13.权利要求12的筛选方法，其特征在于：在Humanin或Humanin样多肽的存在下，使试验试样与Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质接触。

14.权利要求12或13的筛选方法，其中，Humanin受体或Humanin样多肽受体或构成该受体的至少一种蛋白质在细胞中强制表达的。

15.权利要求12或13的筛选方法，其中，Humanin受体或Humanin样多肽受体是通过含有编码构成该受体的至少一种蛋白质的基因的表达载体转化的细胞强制表达所得的。

16.权利要求12-15中任一项的筛选方法，该方法是通过检测对神经细胞死亡的拮抗作用或抑制作用的变化来测定该受体与化合物的结合特性。

17.权利要求12-15中任一项的筛选方法，该方法是通过检测SATAT3的第706位的酪氨酸的磷酸化亢进或抑制来测定该受体与化合物的结合特性。

18.权利要求7-12中任一项的筛选方法，该方法是在无细胞系中实施。

19.转化细胞，该转化细胞是通过含有编码构成选自gp130、CNTF-R和WSX-1的Humanin受体或Humanin样多肽受体的至少一种蛋白质的基因的表达载体转化的。

20.权利要求19的转化细胞，其中，Humanin受体或Humanin样多肽受体强制表达。

21.细胞，该细胞是基因敲除细胞，编码构成选自gp130、CNTF-R和WSX-1的Humanin受体或Humanin样多肽受体的至少一种蛋白质的基因被敲除。

22.权利要求21的细胞，该细胞是ES细胞。

23.非人敲除动物，该敲除动物来自权利要求22的ES细胞。

24.权利要求23的敲除动物，该敲除动物是纯合体。

25.权利要求23或24的敲除动物，该敲除动物是啮齿类。

26.药物组合物，该药物组合物含有与权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，是神经细胞死亡抑制剂。

27.药物组合物，该药物组合物以与选自权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于伴随有神经退行性的疾病的预防或治疗。

28.药物组合物，该药物组合物以与权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于阿尔茨海默病的预防或治疗。

29.药物组合物，该药物组合物以与权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗。

30.药物组合物，该药物组合物以与选自权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于疯牛病的预防或治疗。

31.药物组合物，该药物组合物以与权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体结合的化合物作为有效成分，用于血管性痴呆症的预防或治疗。

32.抗体，该抗体与权利要求1-6中任一项的Humanin受体或Humanin样多肽受体特异性结合。

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