CN101186925A - 通用型高效真核表达载体p3I-GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用型高效真核表达载体p3I－GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体，本发明构建的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2－hLY－hIFA，在乳腺细胞中能高水平表达绿色荧光蛋白，在泌乳期的乳腺细胞中，由于CSN2的启动子发挥了启动作用，使转pCMV/CSN2－hLY－hIFA的乳腺细胞分泌大量的人溶菌酶和人干扰素A，在通过乳汁分离获得目的蛋白的同时又能较好的防治家畜乳腺炎。

Description

通用型高效真核表达载体p3I-GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及真核表达载体的构建，特别涉及一种高效真核表达载体p3I-GFPN及由该载体构建的高效抗乳腺炎的转基因载体。

背景技术

构建高效真核表达载体是目前动物转基因技术中的研究重点和热点，迄今用于动物基因工程的表达载体大致分为质粒载体、病毒载体和人工染色体。良好的动物基因工程表达载体，必须具备高效整合到动物基因组中并在动物体内高效表达外源基因的能力，虽然病毒载体较好的解决了高效整合的问题，但高效表达外源基因的问题有待解决。间插序列(intervening sequence，IVS)是基因内部不编码蛋白的一段DNA序列，属于内含子，在基因转录过程中随外显子一同转录，它在加工转录本时具有切出随后的mRNA的作用，从而有利于翻译过程中核糖体结合和高效起始翻译。目前，以转基因体细胞为核移植的供体细胞来生产转基因动物是制作转基因动物中最常用也是最有效的手段，但转基因体细胞的筛选和鉴定是一项长期而繁琐的工作，目前常用真核表达载体中具有抗抗生素如Geneticin、hygromycin B作用的基因如neomycine phosphotransferase基因、hygromycin B phosphotransferase基因使转基因细胞在含有抗生素的培养液中存活，但由于载体具有随机整合到基因组中的特性，使部分具有抗性的转基因细胞不能正常表达外源基因，为区分可表达外源蛋白的转基因细胞和不能表达外源蛋白的转基因细胞带来了难度，如果在外源基因的同一转录本上引入一个方便检测的标记基因如绿色荧光蛋白基因并结合抗药筛选，就能简化并有效地筛选出表达外源蛋白的转基因细胞。同时，为了使位于同一个转录本上的外源基因与标记基因在翻译过程中不形成融合蛋白，可以利用具有核糖体结合并起始翻译作用的IRES序列将外源基因和标记基因连来，并在外源蛋白的编码区之后插入终止密码子。另外，为提高外源基因和标记基因的表达量，可在插入外源基因的多克隆位点前和与标记基因相连的IRES序列前各插入一个具有转录后切出作用的间插序列。

乳腺炎是由一种或多种致病微生物经乳头皲裂处或乳管口侵入乳管，引起乳腺组织急性化脓性感染的一类疾病，在产奶量较高的大家畜中尤为常见，另外，一些病毒感染乳腺细胞后也能引发乳腺炎。乳腺炎严重影响着奶业和畜牧业的发展，家畜乳腺炎特别是牛羊等产奶大家畜的乳腺炎严重危害着畜牧业的发展，仅美国每年由于家畜乳腺炎而直接导致的经济损失多达20亿美元；据有关资料统计，在美国每年由于乳腺炎而引起的损失占畜牧业的5-10％。目前治疗乳腺炎主要是运用抗生素和疫苗，而使用抗生素后的动物奶中因含有大量的抗生素而不能上市，更严重的是许多患乳腺炎的动物产奶量严重下降甚至终身不能产奶；疫苗虽然能较好的治疗乳腺炎，但由于细菌的高变异性，使疫苗易在短期内失效。

基因治疗是1980年代兴起于美国的一种高端医疗技术，它利用分子生物学的方法将正常的基因或具有治疗作用的基因通过一定方式导入体内，使之表达目的产物以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，是现代医学和分子生物学相接合而诞生的一门新技术。如果利用基因治疗的手段从根本上改良动物基因组，提高家畜抗乳腺炎的能力，就能较好的降低和防治乳腺炎。

溶菌酶是一种具有水解致病菌胞壁中黏多糖的小分子蛋白，Phillips等在论文《The3-dimensional structure of an enzyme molecule》中指出它通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁中不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂和内容物逸出而使细菌溶解；溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。Z.Yu等在发表的《Expression and Bioactivity of Recombinant HumanLysozyme in the Milk of Transgenic Mice》中和E.A.Maga等在论文《Production andProcessing of Milk from Transgenic Goats Expressing Human Lysozyme in the MammaryGland》中均指出，通过乳腺分泌人溶菌酶的转基因动物比普通动物更具溶菌和防止细菌感染的作用。干扰素是一类具有多功能的活性蛋白质，具有抗病毒、免疫调节、抗细胞增殖等作用，是一类重要的具有免疫调节作用的细胞因子。由于乳腺炎是由一种或多种致病菌引起的急性化脓性疾病，如果能较好的控制和杀死感染乳腺的细菌，同时提高机体的免疫能力，就能从根本上防治乳腺炎，而溶菌酶和干扰素正能起到溶解细菌、中和病毒、防止微生物感染和增强免疫力等作用。故将人溶菌酶基因和人干扰素基因插入通用性高效真核表达载体p3I-GFPN中，并根据动物在泌乳期易感染乳腺炎的特点，构建一个在干乳期稍低水平表达溶菌酶和干扰素，而在泌乳期高效表达溶菌酶和干扰素的抗乳腺炎真核表达载体。

发明内容

本发明的目的在于，构建一种高效表达外源基因和标记基因的通用型真核表达载体p3I-GFPN，便于将所需的目的基因导入真核生物内进行表达；为防治家畜乳腺炎和利用基因防治的手段建立一种动物疾病防治模式，在通用型高效真核表达载体p3I-GFPN的基础上构建一种高效抗乳腺炎的转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA，为制作乳腺生物反应器和抗乳腺炎等疾病的转基因动物奠定基础。

为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：

一种通用型高效真核表达载体p3I-GFPN，其特征在于与多克隆位点同一转录本下的标记基因即绿色荧光蛋白基因前添加了一段具有核糖体结合并起始其后顺反子翻译的IRES序列，使插入到多克隆位点的外源基因与绿色荧光蛋白基因在同一转录本中各自独立翻译，并能指示插入到多克隆位点的外源蛋白在转基因细胞或动物中的表达状况。同时，在多克隆位点的前后均添加了一段具有增强mRNA切出作用的间插序列，有利于插入到多克隆位点的外源基因和绿色荧光蛋白基因的高效表达；另外，在绿色荧光蛋白基因后面具有多个酶切位点，便于另一个外源基因的替代，使一个转录本能翻译出两个不同目的蛋白。其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

利用上述通用型高效真核表达载体p3I-GFPN构建的一种抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA，其特征在于在多克隆位点插入了一个具有溶菌、抗菌、消炎、抗病毒等作用的人溶菌酶基因，并用具有抗病毒、调解免疫系统、抗细胞增殖等作用的人干扰素A基因替代绿色荧光蛋白基因，同时在间插序列和人溶菌酶基因之间插入了CSN2的启动子和到编码信号肽的DNA序列，便于增强外源基因在泌乳期乳腺细胞中的表达。其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明构建的高效表达外源基因和标记基因即绿色荧光蛋白基因(GFP gene)的通用型高效真核表达载体p3I-GFPN，外源基因通过多克隆位点(Nhe I，BspT I，  Sal I，Xho I，EcoR I；其序列为GCTAGCTTAAGTCGACTCGAGAATTC)插入该载体，多克隆位点序列与内部核糖体进入位点(internal ribozyme entry site，IRES)相邻，根据IRES在翻译中能够与核糖体结合并起始其后mRNA翻译的特性使插入到多克隆位点的目的基因和标记基因在一个转录本上各自独立翻译，且当目的基因的编码框后插入终止密码子时不与绿色荧光蛋白形成融合蛋白，有利于维持目的蛋白原有的特性和活性。在多克隆位点前后(即CMV启动子之后和IRES序列之前)各插入了一段0.3kb的间插序列(interveningsequence，IVS)，有利于转录后其后mRNA的切出，使插入到多克隆位点的目的基因和带有IRES的GFP基因的mRNA能够被剪切出来，有利于核糖体结合和提高翻译效率，增加外源蛋白和绿色荧光蛋白的表达量。另外，该载体中存在抗遗传霉素(Geneticin)的新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase gene，neo)，使被转染的真核细胞能够在含有Geneticin的培养液中存活，便于转基因细胞的筛选。

在此基础上，将具有溶菌、消炎、抗病毒等作用的人溶菌酶基因插入多克隆位点，并将山羊乳腺细胞特异性的β-酪蛋白(β-casein，CSN2)的启动子和到编码信号肽为止的DNA序列插入到CMV启动子和溶菌酶基因之间，以增强其在泌乳期乳腺细胞中的表达量，经乳腺细胞转染后证明构建的双启动子表达标记基因的量要明显高于单启动子载体。在此基础上将具有中和病毒、提高免疫力等作用的人干扰素A基因(humaninterferon-α，hIFA)替代GFP基因，有利于提高家畜乳腺炎易染期的抵抗力，最终构建了一种溶菌抗病毒的双启动子启动双顺反子的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA，为制作乳腺生物反应器和抗乳腺炎转基因动物提供了基础。

经细胞转染后荧光检测分析证实，载体p3I-GFPN和p3I-GFP的荧光强度大于pIGD和pIGPb，且均高于市售载体pIRES-AcGFP-Nuc，说明构建的通用型高效真核表达载体p3I-GFPN能够高效表达外源基因和标记基因；另外，它具有多个可用酶切位点，适用于大多数外源基因的插入，并且由于插入的外源基因和标记基因在一个转录本上，故能通过检测绿色荧光蛋白的表达量来确定外源蛋白在真核细胞内的表达状况，是一种简单易行的检测手段，并通过结合Geneticin的筛选，大大简化了阳性克隆细胞的筛选。

构建的双启动子启动双顺反子的真核表达载体之一的pCMV/CSN2-hLY-GFP，在乳腺细胞中能高水平表达绿色荧光蛋白，说明CMV启动子和CSN2启动子在乳腺细胞中能高水平启动外源基因和标记基因的表达，当标记基因被另一个外源基因取代后，两个外源基因均能在泌乳期的乳腺细胞中高效表达；在成纤维细胞中pCMV/CSN2-hLY-GFP表达GFP比pCMV-hLY-GFP要低一些，显示荧光的细胞数要少，说明CSN2启动子对CMV启动子有抑制作用，证实转pCMV/CSN2-hLY-hIFA的细胞和动物在干乳期的细胞和其他类型的细胞中不易过量表达和积累，在起到抗菌抗病毒的同时不影响转基因细胞和动物的正常生理代谢和生命活动。在泌乳期的乳腺细胞中，由于CSN2的启动子发挥了启动作用，使转pCMV/CSN2-hLY-hIFA的乳腺细胞分泌大量的人溶菌酶和人干扰素A，在通过乳汁分离获得目的蛋白的同时又能较好的防治家畜乳腺炎。

附图说明

图1是通用型高效表达载体p3I-GFPN的构建流程图；

图2是抗乳腺炎转基因真核表达载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA的构建流程图；

图3是制作载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA过程中购买和制作的各种载体的图谱；其中，(1)是pEGFP-C1，(2)是pIRESneo3，(3)是pIRES，(4)是pGFP，(5)是pGFPB，(6)是pT-2I，(7)是pIGD，(8)是pIGPb，(9)是p3I-GFP，(10)是p3I-GFPN，(11)是MD-hLY，(12)是pT-hLY，(13)是pT-7912，(14)是pT-CSN5’，(15)是pT-hIFA，(16)是pCMV-hLY-GFP，(17)是pCMV/CSN2-hLY-GFP，(18)是p CMV/CSN2-hLY-hIFA，(19)是pIRES2-AcGFP-Nuc；

图4是制作载体过程中的电泳图谱；其中，(1)是DNA MarkerIII(TIANGEN)(泳道1)，PCR产物GFP1(泳道2)，PCR产物GFP2(泳道3)。箭头A表示PCR产物。(2)是D2000(TIANGEN)(泳道1)，PCR产物GFP1用NheI/BamHI双酶切(泳道2)，PCR产物GFP2用SmaI/NotI双酶切(泳道3)。箭头A表示酶切产物。(3)是D15000(TIANGEN)(泳道1)，pGFP用NheI和BamHI双酶切(泳道2)，pGFPB用SmaI和NotI双酶切(泳道3)。箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(4)是D15000(TIANGEN)(泳道1)，pGFPB用NheI和SmaI双酶切(泳道2)。箭头A表示双酶切后的DNA片段。(5)是pT-2I用SmaI/NheI双酶切(泳道1～3)，D15000(TIANGEN)(泳道4)。箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(6)是GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(MBI)(泳道1)，质粒pIGD用NheI/SmaI双酶切(泳道2～4)。箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(7)是质粒pIGPa用MluI/NotI双酶切(泳道1～4)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(MBI)(泳道5)，箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(8)是GeneRuler^TM 1kbDNA Ladder(MBI)(泳道1)，pIGPa用NheI/NotI双酶切(泳道2～4)，箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(9)是pIGPb用NheI/NotI双酶切(泳道1)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(MBI)(泳道2)，pIGPb用EcoRI酶切(泳道3)。(10)是p3I-GFP用SalI酶切(泳道l～2)，pIGPb不能为SalI所酶切(泳道3～4)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(MBI)(泳道5)。(11)是GeneRuler^TM 1kb DNALadder(MBI)(泳道1)，p3I-GFP用MluI酶切(泳道2)。箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(12)是p3I-GFPN用SalI/NotI双酶切(泳道1)，p3I-GFPN不能为MluI所酶切(泳道2)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(MBI)(泳道3)。(13)是pT-7912(泳道1)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(泳道2)，pT-7912用Not I酶切(泳道3)。(14)是DNA MarkerIII(TIANGEN)(泳道1)，PCR产物CSN5’(泳道2～3)。箭头A表示PCR产物。(15)是GeneRuler^TM 1kb DNALadder(泳道1)，用Not I酶切自连的pGEM-T easy载体(泳道2)，pT-CSN5’用Not I酶切(泳道3)。箭头A表示用Not I酶切自连的pGEM-T easy载体的产物，箭头B表示用Not I酶切pT-CSN5’的产物。(16)是GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(泳道1)，PCR产物溶菌酶基因(泳道2)。箭头A表示PCR产物。(17)是GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(泳道1)，以人基因组为模板的PCR产物hIFA(泳道2～3)。箭头A表示PCR产物。(18)是GeneRuler^TM 1kbDNA Ladder(泳道1)，带有BamHI酶切位点的PCR产物hIFA用BamHI酶切(泳道2～3)。箭头A表示hIFA酶切产物。(19)是GeneRuler^TM 1kb DNA Lader(泳道1)，pCMV-hLY-GFP用NheI/SalI双酶切(泳道2～3)。箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(20)是pCMV/CSN2-hLY-GFP用NheI/MluI双酶切(泳道1～2)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(泳道3)。箭头A表示双酶切质粒后的小片段DNA，箭头B表示双酶切质粒后的大片段DNA。(21)是pCMV/CSN2-hLY-hIFA不能为SmaI所酶切(泳道1)，GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder(泳道2)，pCMV/CSN2-hLY-hIFA用BamHI酶切(泳道3)。箭头A表示用BamHI酶切的pCMV/CSN2-hLY-hIFA，箭头B表示pCMV/CSN2-hLY-hIFA不能为SmaI所酶切。

图5是制作载体过程中所用细胞的照片和载体转染细胞后的细胞荧光照片；其中，(1)是山羊胎儿成纤维细胞；(2)是用质粒pGFP转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(3)是用质粒pGFPB转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光(4A)是用质粒pIGD转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(4B)是用质粒pIRES2-AcGFP-Nuc转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(5)是用质粒pIGPb转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(6)是用质粒p3I-GFP转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(7)是用质粒p3I-GFPN转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(8)是用质粒pEGFP-C1转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(9)是乳腺细胞；(10)是用质粒pCMV/CSN2-hLY-hIFA转染的山羊胎儿成纤维细胞用400μg/ml的Geneticin筛选；；(11)是用质粒pCMV-hLY-GFP转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(12)是用质粒pCMV-hLY-GFP转染的乳腺细胞显示绿色荧光蛋白；(13)是用质粒pCMV/CSN2-hLY-GFP转染的山羊胎儿成纤维细胞显示绿色荧光；(14)是用质粒pCMV/CSN2-hLY-GFP转染的乳腺细胞显示绿色荧光蛋白；

图6是制作载体过程中一些重要的DNA片段的测序图谱。其中，图6-1是质粒pGFP中的GFP基因的DNA测序图谱；图6-2是质粒pGFPB中的GFP基因的DNA测序图谱；图6-3是用T7 promoter对pT-7912进行的DNA测序图谱；图6-4是用SP6 promoter对pT-7912的DNA测序图谱；图6-5是用T7 promoter对pT-hIFA中hIFA基因的DNA测序的图谱；图6-6是hLY基因的测序图谱；图6-7～图6-10是pCMV/CSN2-hLY-GFP中CSN2的启动子和到编码信号肽DNA序列的DNA测序图谱。

以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

1、试剂材料

pEGFP-C1(clontech)、pIRES-neo3(clontech)、pMD-hLY(何小宁，硕士毕业论文《人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建及其在小鼠乳腺癌细胞中的表达》)、山羊胎儿成纤维细胞和乳腺细胞(刘凤军，硕士毕业论文《山羊体细胞核移植的研究》)由本实验室保存，人胎盘取自陕西医药研究院附属医院，受孕萨能奶山羊血液采自中国克隆羊基地，TIANamp Genomic_血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，Restriction enzymes、DNA Taq polymerase和Pfu DNA polymerase购自MBI，dNTPs、T4 DNA Polymerase、T4 DNA ligase、Klenow flagment、Blood GenomeDNA Extraction Kit、TaKaRa LA PCRTM Kit Ver.2.1购自宝生物公司，Wizard^Plus SVMinipreps DNA Purification System、Wizard^SV Gel and PCR Clean-Up System和pGEM-T easy vector购自Promega，pIRES(由于此载体中IRES序列中的碱基突变和插入、CMV启动子不能启动等问题而不能用于真核表达)、pIRES2-AcGFP-Nuc购自Clontech，IPTG购自MercK，DMEM、DMEM/F-12、LIPOFECTAMINE 2000、epidermalgrowth factor(EGF)、Hydrocortisone、trypsin和Geneticin购自Invitrogen，Nacl、X-gal、glutamine、prolactin和Insulin-transferrin-seuim购自Sigma，Tryptone、Yeast extract购自Oxoid，Agar购自Beyotime，Agrose购自Biowest，fetal bovine serum购自山东银香伟业集团，青霉素和链霉素购自哈药总厂，PCR引物合成和测序由Invitrogen公司完成。

2、具体过程

2.1通用型高效真核表达载体p3I-GFPN的构建及细胞转染P3I-GFPN的制作流程见图1。

2.1.1载体pGFP的构建及细胞转染

取2μl纯化质粒pEGFP-C1(图3-1)为模板，以5’-CC

GCCACCATGGTGAGCAAG-3’(Nhe I/Kpn I/Sma I)为上游引物，5’-GA

ATCTGAGTCCGGAC-3’(BamH I/Not I/Xho I)为下游引物，20μl的PCR反应体系中各引物终浓度为0.4μM、dNTPs 0.4mM、2U DNATaq polymerase；60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，扩增GFP gene，产物命名为(GFP1)(图4-1，lane2)。纯化100μ1的GFP1并定容到50μl，取20μl的GFP1和20μl的pEGFP-C1分别用1.5μl的Nhe I和1.5μl的BamH I在37℃水浴中双酶切24h，电泳并胶回收pEGFP-C1骨架载体(3.9kb处)和GFP1(0.78kb处)(图4-2，lane2)后纯化定容到20μl，按1∶7的比例混合骨架载体和目的片段后添加1μl的T4 DNA Ligasebuffer和1μl的T4 DNA Ligase，总体积为10μl，4℃连接24h。将10μl连接载体加入到200μl的感受态DH5 α中，0℃冰浴30min、42℃热激90sec、再0℃冰浴2min，加入800μlLB溶液后在37℃中孵育45min，平板培养、挑取单克隆扩大培养、质粒提取后用NheI/BamH I双酶切(图4-3，lane2)和测序鉴定(图6-1)，载体命名为pGFP(图3-4)。

山羊胎儿成纤维细胞(图5-1)用含10％胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、各100U/ml的青霉素和链霉素、10ng/ml表皮生长因子的DMEM/F-12培养，当细胞皿底80％被铺满后用0.1％胰蛋白酶液消化传代。细胞转染前先将欲转染的细胞消化后铺于24孔板中，用上述培养液培养过夜，再用无血清无抗生素的DMEM培养液饥饿培养6h。

以pEGFP-C1为阳性对照、超纯水为阴性对照，取纯化的无蛋白无RNA污染的800ngpGFP质粒与50μl的DMEM混合，取3μl LIPOFECTAMINE 2000与50μl的DMEM混合，5min内将上述两种溶液混合，室温下放置20min后加到无血清无抗生素的DMEM液培养的细胞中混合，5h后替换成含血清和抗生素的细胞培养液，转染24h后用荧光显微镜检测细胞表达的荧光蛋白(图5-2)。

2.1.2载体pGFPB的构建及细胞转染

取2μl纯化质粒pGFP为模板，以5’-T

ATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’(Sma I)为上游引物，以5’-TT

TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(Not I)为下游引物，PCR反应体系同上；60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，扩增GFP gene，产物命名为(GFP2)(图4-1，lane3)。纯化100μl的GFP2并定容到50μl，取20μl的GFP2和20μl的pGFP分别用1.5μl的Sma I和1.5μl的Not I先30℃双酶切18h再37℃双酶切10h，电泳、胶回收pGFP骨架载体(3.9kb处)和GFP2(0.75kb处)(图4-2，lane3)、纯化并定容到20μl，按1∶7的比例混合骨架载体和目的片段后添加1μl的T4 DNA Ligasebuffer和1μl的T4 DNA Ligase，总体积10μl，4℃连接24h。10μl连接载体热激转化感受态DH5 α、平板培养、挑取单克隆扩大培养，质粒提取后用Sma I/Not I双酶切(图4-3，lane3)和测序鉴定(图6-2)，载体命名为pGFPB(图3-5)。

pGFPB转染山羊胎儿成纤维细胞(图5-3)，并以pGFP为阳性对照，方法与pGFP的细胞转染相同。

2.1.3载体pIGD的构建及细胞转染

取2μl纯化质粒pIRES-neo3为模板，以5’-AT

GAATTAATTCGCTGTCTG-3’(Nhe I/Kpn I/Mlu I)为上游引物，以5’-ATTTGTGGCAAGCTTATCATCGTGTTTTTC-3’(Sma I)为下游引物，PCR反应体系同上，62℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，扩增IVS和IRES，产物命名为2I。纯化100μl的2I并定容到20μl，取3μl纯化的PCR产物2I进行TA克隆、热激转化感受态DH5α并用蓝白斑筛选，挑取白斑进行单克隆扩大培养并提取质粒，用Nhe I/Sma I先30℃双酶切14h再37℃8h双酶切并进行电泳分析(如图4-5，lane1～3)，质粒命名为pT-2I(图3-6)。取20μl的pT-2I和20μl的pGFPB分别用1.5μl的Nhe I和1.5μl的Sma I先30℃双酶切18h再37℃双酶切10h，电泳并胶回收pGFPB骨架载体(4.7kb处)(图4-4，lane2)和pT-2I中的目的条带(0.9kb处)，纯化后各自定容到20μl，T4 DNA Ligase连接骨架载体和目的片段，连接载体热激转化感受态DH5α、平板培养、挑取单克隆扩大培养、质粒提取后用Nhe I/Sma I双酶切鉴定(图4-6，lane2～4)，载体命名为pIGD(图3-7)。

pIGD转染山羊胎儿成纤维细胞(图5-4A)，以pGFPB、pIRES2-AcGFP-Nuc(图5-4B)为阳性对照，方法同上。

2.1.4载体pIGPa和pIGPb的构建及细胞转染

取20μl的pIGD和20μl的pIRES(由于IRES处序列突变和插入、CMV启动子无法起到启动作用而不能用于真核表达)分别用2μl的Mlu I和1.5μl的Not I在37℃水浴中双酶切24h，电泳并胶回收pIRES骨架载体(5.5kb处)和2I与GFP gene连接的片段(1.7kb处)，纯化后定容到20μl，用T4 DNA Ligase连接骨架载体和目的片段，连接载体转化感受态DH5α、平板培养、挑取单克隆扩大培养、质粒提取后用Mlu I/Not I双酶切鉴定(图4-7，lane1～4)，载体命名为pIGPa。取1.5μl的Nhe I和1.5μl的NotI分别双酶切20μl的pIGPa和20μl的pIGD，37℃酶切24h，电泳后胶回收pIGD骨架载体(4.9kb处)和pIGPa中的目的片段(1.7kb处)(图4-8，lane2～4)，纯化并定容到20μl，用T4 DNA Ligase连接骨架载体和目的片段，连接载体转化感受态DH5a、平板培养、挑取单克隆扩大培养，质粒提取后用Nhe I/Not I双酶切(图4-9，lane1)和EcoRI单酶切鉴定(图4-9，lane3)，载体命名为pIGPb(图3-8)。

pIGPb转染山羊胎儿成纤维细胞(图5-5)，以pIGD、pIRES2-AcGFP-Nuc为阳性对照，方法同pGFP的细胞转染。

2.1.5载体p3I-GFP的构建及细胞转染

取2μl纯化质粒pIRES-neo3为模板，以5’-TT

GAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGG-3’(Xba I)为上游引物，以5’-AT

CGACCTGCAGTTGGACCTGG-3’(Xho I/sal I/BspT I/Nhe I)为下游引物，PCR反应体系不变；64℃退火30sec，72℃延伸20sec，30个循环，扩增长度为0.3kb的IVS。纯化100μl的IVS并定容到50μl。各取1.5μl的Nhe I和Xho I双酶切20μl的pIGPb和各取1.5μl的Xba I/Xho I双酶切20μl的IVS，37℃酶切24h，电泳并胶回收pIGPb骨架载体(5.6kb处)和IVS(0.3kb处)和纯化成20μl，T4 DNA Ligase连接骨架载体和目的片段后热激转化感受态DH5 α、平板培养、挑取单克隆扩大培养、质粒提取后用Sal I酶切鉴定(图4-10，lane1～2)，载体命名为p3I-GFP(图3-9)。

p3I-GFP转染山羊胎儿成纤维细胞(图5-6)，以pIGPb、pIRES2-AcGFP-Nuc为阳性对照，方法同pGFP的细胞转染。

2.1.6载体p3I-GFPN的构建及细胞转染

取20μl的p3I-GFP用2μl的Mlu I在37℃酶切36h，电泳并胶回收一条为4.0kb的骨架载体和一条为1.9kb的目的条带(图4-11，lane2)，各自纯化并定容到20μl。各取7μl的骨架载体和目的条带并分别添加1μl的klenow flagment、1μl的klenow flagmentbuffer和1μl的dNTP，37℃反应8h，取其中的骨架载体溶液1μl、目的片段7μl混合，再添加1μl的T4 DNA Ligase buffer和1μl的T4 DNA Ligase，总体积为10μl。4℃连接24h后热激转化感受态DH5 α、平板培养、挑取单克隆扩大培养、质粒提取后分别用Mlu I、Sal I/Not I酶切鉴定(图3-12)，载体命名为p3I-GFPN(图3-10)。

p3I-GFPN转染山羊胎儿成纤维细胞(图5-7)，以p3I-GFP、pIRES2-AcGFP-Nuc为阳性对照，方法同pGFP的转染。

2.2抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA的构建及细胞转染pCMV/CSN2-hLY-hIFA的制作流程见图2。

2.2.1 β-酪蛋白启动子区及其部分外显子的克隆

根据血液基因组提取试剂盒说明书从新鲜的怀孕萨能奶山羊血液中提取基因组DNA，电泳检测后取2μl作为模板；根据GeneBank中山羊β-酪蛋白的序列号AF409096设计上游引物5’-AGAGGTCAAGGATGCTGCTAAACATTCTACAACAC-3’和下游引物5’-TTGCCAATAGTTACCAGTCAGTACATAGCCACATT-3’；20μl的PCR反应体系中引物终浓度为0.4μM、dNTPs 0.4mM、2U LA Taq polymerase；56℃退火1min，72℃延伸8min，30个循环，扩增从289bp处到7912处长为7.6kb的5’端的山羊β-酪蛋白DNA序列。100μl的PCR产物电泳并胶回收和纯化成20μl，取纯化的PCR产物3μl进行TA克隆、热激发转化感受态DH5 α并用蓝白斑筛选，挑取白斑进行单克隆扩大培养并提取质粒，用NotI酶切并进行电泳分析(图4-13，lane3)，对酶切后的DNA序列长度正确的载体进行两端测序鉴定(图6-3～4)并命名为pT-7912(图3-13)。取2μl pT-7912质粒为为模板，设计上游引物5′-TTGCTAGCTCAGCAGGGGTTGGTGGTGGACAGGAAAGC-3′(Nhe I)  和下游引物5′-TTACGCGTTGCAATGGCCAGAGCCACCAGACAGGC-3′(Mlu I)，反应体系同上；58℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，扩增CSN2的启动子区及到编码信号肽的DNA序列，即β-酪蛋白的3566bp处到6644bp处，扩增长度为3kb(图4-14)。纯化100μl的PCR产物并定容到20μl，取3μl PCR产物(CSN5’)再次TA克隆，经一系列操作后提取质粒，NotI酶切鉴定(图4-15，lane3)，载体命名为pT-CSN5’(图3-14)。

2.2.2人溶菌酶基因和人干扰素-α基因的克隆

取2μl纯化质粒pMD-hLY(图3-11)为模板，根据人溶菌酶基因的GeneBank中序列号NM000239设计上游引物5’-TT

GTCAACATGAAGGCTCTCATTGTTC-3’(Nhe I/Mlu I)和下游引物5’-TT

TTACACTCCACAACCTTGAACATACTGACGG-3’(Sal I)，20μl的PCR反应体系中各引物终浓度为0.4μM、dNTPs 0.4 mM、2U DNA Taq polymerase；60℃退火30sec，72℃延伸45sec，30个循环，扩增人溶菌酶基因的编码框序列(图4-16)。100μl的PCR产物纯化成20μl的溶液，取3μl进行TA克隆、转化感受态DH5 α、蓝白斑筛选和单克隆扩大培养，质粒提取后用NheI和SalI进行酶切鉴定，载体命名为pT-hLY(图3-12)。

用TIANamp Genomic_血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒从人胎盘组织中提取基因组DNA，并取2μl作模板；根据人干扰素α在GeneBank中的序列号NM_024013设计上游引物5′-GCAATATCTACGATGGCCTC-3′和下游引物5′-TTACGCGGACCAGATGT TATTCCTTCCTC-3′，PCR反应体系中同上；45℃退火30sec，72℃延伸45sec，30个循环，扩增人干扰素α基因的编码框序列(图4-17)。100μl的PCR产物纯化成20μl的溶液，取3μl进行TA克隆后转化感受态DH5 α，经一系列操作后用EcoR I进行酶切电泳和测序鉴定(图6-5)，结果与预想一致，载体命名为pT-hIFA(图3-15)。再设计上游引物5′-ATGATGGCCTCGCCCTTTGCTTT-3′和下游引物5′-TT

GATGTTATTCCTTCCTC CTT-3′(BamH I)进行PCR，50℃退火30sec，72℃延伸45sec，30个循环，以2μl的pT-hIFA为模板扩增带有BamH I酶切位点的人干扰素α基因。100μl的PCR产物纯化成50μl。

2.2.3 pCMV/CSN2-hLY-hIFA载体的构建及细胞转染

Nhe I/Sal I各1.5μl于37℃双酶切20μl的p3I-GFPN和20μl的pT-hLY 24h，电泳和胶纯化p3I-GFPN骨架载体(6.0kb)和溶菌酶基因(0.45kb)并各自定容到20μl。取1μl纯化的p3I-GFPN骨架载体和7μl纯化的溶菌酶基因，添加1μl的T4 DNA Ligase buffer和1μl的T4 DNA Ligase，4℃连接24h后热激转化感受态DH5 α、平板培养、单克隆扩大培养并提取质粒后用Nhe I/Sal I双酶切(图4-19)和测序鉴定(图6-6)，载体命名为pCMV-hLY-GFP(图3-16)。各取1.5μl的Nhe I/Mul I在37℃双酶切20μl的pCMV-hLY-GFP和各取1.5μl的Nhe I/Mul I/EcoR I在37℃三酶切20μl的pT-CSN5’，电泳胶回收和纯化pCMV-hLY-GFP的载体骨架(6.4kb处)和pT-CSN5’的目的片断(3.0kb处)，用T4 DNA Ligase连接骨架载体和目的片段。经一系列操作后，质粒提取并用NheI/Mul I双酶切(图4-20)和测序鉴定(图6-7～10)，载体命名为pCMV/CSN2-hLY-GFP(图3-17)。各取1.5μl Sma I/BamH I双酶切20μl的质粒pCMV/CSN2-hLY-GFP和取1.5μl的BamH I单酶切20μl的带有BamH I酶切位点的PCR扩增的hIFA基因，经电泳回收pCMV/CSN2-hLY-GFP的骨架载体(8.7kb处)和酶切后的hIFA(0.6kb处)(图4-18)，T4 DNA Ligase连接骨架载体和目的片段后经一系列操作和质粒提取，用Sma I、BamH I两种单酶切鉴定重组(图4-21)，载体命名为pCMV/CSN2-hLY-hIFA(图3-18)。

2.2.4细胞转染

乳腺细胞(图5-9)用含10％胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、各100U/ml的青霉素和链霉素、10ng/ml表皮生长因子、10ng/ml氢化可的松、5ng/ml胰岛素-转铁蛋白-硒钠的DMEM/F-12培养，当细胞成团铺在皿底后用0.1％胰蛋白酶液消化传代。乳腺细胞转染与山羊胎儿成纤维细胞一致。

质粒pCMV-hLY-GFP，pCMV/CSN-hLY-GFP转染山羊胎儿成纤维细胞和乳腺细胞(图5-11～图5-14)。吸取3ml添加了400ng/ml的促乳素的乳腺细胞培养液放入灭菌过的5ml离心管中，用未高压灭菌的干净枪头反复吹打5次，并在空气中暴露1小时；pCMV/CSN2-hLY-hIFA转染乳腺细胞，转染6小时后用上述处理的培养液培养转染的细胞，并以未转染的乳腺细胞和山羊胎儿成纤维细胞为对照；转染72小时后在高倍显微镜下观察发现未转染的乳腺细胞和山羊胎儿成纤维细胞培养孔中均有泳动的细菌，而转染pCMV/CSN2-hLY-hIFA的乳腺细胞培养孔中未见到细菌，证明该转基因载体的确具有抗菌溶菌的作用。pCMV/CSN2-hLY-hIFA转染的山羊胎儿成纤维细胞用含400μg/ml的Geneticin细胞培养液筛选，得到阳性抗性细胞(图5-10)。

综上所述，该载体的确可用于乳腺炎的基因防治。

核苷酸序列表

<110>

西北农林科技大学

<120>通用型高效真核表达载体p3I-GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体

<160>2

<210>1

<211>5934

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg      60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt     120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca     180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc     240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta     300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac     360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg     420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg     480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt     540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagagaat     600

taattcgctg tctgcgaggg ccagctgttg gggtgagtac tccctctcaa aagcgggcat     660

gacttctgcg ctaagattgt cagtttccaa aaacgaggag gatttgatat tcacctggcc     720

cgcggtgatg cctttgaggg tggccgcgtc catctggtca gaaaagacaa tctttttgtt     780

gtcaagcttg aggtgtggca ggcttgagat ctggccatac acttgagtga caatgacatc     840

cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccaggtcc aactgcaggt cggctagctt     900

aagtcgactc gagaattcac gcgcgcgtga attaattcgc tgtctgcgag ggccagctgt     960

tggggtgagt actccctctc aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt gtcagtttcc    1020

aaaaacgagg aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgcg    1080

tccatctggt cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tgaggtgtgg caggcttgag    1140

atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc    1200

actcccaggt ccaactgcag gtcgagcatg catctagggc ggccaattcc gcccctctcc    1260

cccccccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg    1320

ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag    1380

ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc    1440

caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg    1500

aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag    1560

gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca    1620

gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt    1680

caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc    1740

tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa    1800

ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca acccgggatg    1860

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac    1920

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    1980

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    2040

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    2100

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    2160

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    2220

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    2280

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    2340

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    2400

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    2460

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    2520

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga    2580

gcggccgcgg atccaccgga tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag    2640

aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga    2700

atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata    2760

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca    2820

aactcatcaa tgtatcttaa cgcgcgcgta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt    2880

cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat    2940

cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa    3000

gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg    3060

cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa    3120

agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc    3180

gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag    3240

tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg    3300

cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta    3360

aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata    3420

ttgaaaaagg aagagtcctg aggcggaaag aaccagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg    3480

tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag    3540

tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg    3600

catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact    3660

ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag    3720

gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc    3780

ctaggctttt gcaaagatcg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca    3840

agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg    3900

ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg    3960

cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc    4020

agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt    4080

cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc    4140

atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca    4200

tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc    4260

acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg    4320

gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct    4380

cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc    4440

tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc    4500

tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta    4560

cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt    4620

ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga    4680

gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac    4740

gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccctagg    4800

gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca    4860

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tcccagggct ggcactctgt cgatacccca ccgagacccc attggggcca atacgcccgc    4980

gtttcttcct tttccccacc ccacccccca agttcgggtg aaggcccagg gctcgcagcc    5040

aacgtcgggg cggcaggccc tgccatagcc tcaggttact catatatact ttagattgat    5100

ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg    5160

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ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag    5340

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta    5400

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta    5460

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag    5520

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg    5580

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg    5640

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag    5700

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc    5760

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<210>2

<211>9314

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg    60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt   120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca   180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc   240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta   300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac   360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg   420

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cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccaggtcc aactgcaggt cggctagctc   900

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tggagtggat tgcatttcct actccatttg attaatttag tgacttttaa atttcttttt  1380

ccatattcgg gagcctattc ttccttttta gtctatactc tcttcactct tcaggtctaa  1440

ggtatcatcg tgtgcttgtt agcttgttac ttcctccatt atagcttaag cactaacaac  1500

tgttcaggtt ggcatgaaat tgtgttcttt gtgtggcctg tatatttctg ttgtgtatta  1560

gaatttaccc caagatctca aagacccact gaatactaaa gagacctcat tgtggttaca  1620

ataatttggg gactgggcca aaacttccgt gcatcccagc caagatctgt agctactgga  1680

cgatttcatt tcctttatca gattgtgagt tattcctgtt aaaatgctcc ccagaatttc  1740

tggggacaga aaaataggaa gaattcattt cctaatcatg cagatttcta ggaattcaaa  1800

tccactattg gttttatttc aaaccacaaa attagcatgc cattaaatac tatatataaa  1860

cagccactaa atcagatcat tatccattca gcttctcctt cacttcttct cctctacttt  1920

ggaaaaaagg taagaatctc agatataatt tcagtgtatc tgctactcat ctttattttg  1980

gactaggtta aaatgtagaa agaacataat tgcttaaaat agatcttaaa aataagggtg  2040

tttaagataa ggtttacact attttcagca gatatgttaa aaaatagaag tgactataaa  2100

gacttgataa aaattatagt gactgcaaat gttttaggaa tataataaga tataataaca  2160

gtggttgcta ttttctttag cacaagacta gttaacaggc tgtattaaaa gatcttttct  2220

tgaattaaat attttcaatt tgattaaacc tacctcagcc ataaaggcaa gcacatttca  2280

tttatactat ggggatttga ataattatta ctgaagaagc tctaccaaca aaaagtttat  2340

agagctatca tatttagtca agagataaag agggttgtta ggatatatat gctatttgaa    2400

aggtatttat aaaagaagag tatatttatc aaaatttctc agaacatcca aatttcaagt    2460

ttatcattta tcttacaata tttcaaaaat attaaaatag atacatgaaa tacagaagta    2520

aattaaagag aaagtatttt acttggtaaa aaaattctag gttggacaga gagtgccagg    2580

aaacaaaaac aatgaaaaat gtgacctgac aggaattata gctcaaagta tactagtaag    2640

taatgaaatg gcttaaaaat tggtatataa aatgctagtt ataaaataaa caaaatgcaa    2700

taaaatcctc cctacatgta atgaattcta ggtattatgc tcttttttga agtcttgaca    2760

ataaaaattt ttttagaagt ttataggcat cttgaataaa gtgaaacaaa ttaagaatta    2820

gtatccatga gaaaaatata gaaaaatttt cctaatttag tttgaaaatc tgggattgaa    2880

gatgtgtgtc aagagatgtt ggtggcaaga acattttttt ttcaagaact tataaaaatg    2940

caacaaaaca aaccatttaa tacattttgg tcaaaatcaa taatgtattt tattttatgc    3000

tccaaggagc ataaaattgg ggactgggca agagaaactg acaccctggt aaattaccaa    3060

gagataagta cacagttcta tgtagagaaa ataagcatag tgtatgatct ctaaaattat    3120

gtgagacaaa ggagagatga cattatgcat gtggggatga agactgagta gagaagaaac    3180

aatctaatca gtccaagaaa acatctcgat cagtggaaca aatagaagaa atgctaaaat    3240

gaaacagaag tcttactgga aataaaagat atgcataaga caaaaattca tgaaaatcac    3300

ttagtttagc agagaaaaga taaaaataaa gtatgacctt cttcatatac attgtttgat    3360

cacatgcacc tcaataaaac tgagtctcca acagaaatga aacattaata ttttgtttac    3420

tgctctaatc ccaggatcta agcgatatct ggcaataaaa ataataaata tatatttttt    3480

aataaatgaa tcaaccactt aatttttctg taaatatctg taacttctct tctgtctttc    3540

caaaaacact cataagtact gtgaatgaga tgaaaaagag tggagtagga tataggctgt    3600

tagcagaaaa catctgaatg gctggcagtg aaacattaac ttgaaatgta agattaatga    3660

gtaatagtaa attttaacct tggccatatg ataaaatgtt tattaatatt tttctaaaat    3720

acagggcttt ttgtttttgc catgaggttt gcaggatctt ggttccctga ccagggatca    3780

aacctgcgct cccctggaag catggagtct tggacatttg tattatacac tatctttggt    3840

tccttttaaa gggaagtaat tttacttaaa taagaaaata gattgacaag tcatacgctg    3900

tttcctcatc ttcccattca caggaatcga gagccatgaa ggtcctcatc cttgcctgtc    3960

tggtggctct ggccattgca acgcgtgtca acatgaaggc tctcattgtt ctggggtttg    4020

ccctcctttc tgttacggtc cagggcaagg tctttgaaag gtgtgagttg gccagaactc    4080

tgaaaagatt gggaatggat ggctacaggg gaatcagcct agcaaactgg atgtgtttgg    4140

ccaaatggga gagtggttac aacacacgag ctacaaacta caatgctgga gacggaagca    4200

ctgattatgg gatatttcag atcaatagcc gctactggtg taatgatggc aaaaccccag    4260

gagcagttaa tgcctgtcat ttatcctgca gtgctttgct gcaagataac atcgctgatg    4320

ctgtagcttg tgcaaagagg gttgtccgtg atccacaagg cattagagca tgggtggcat    4380

ggagaaatcg ttgtcaaaac agagatgtcc gtcagtatgt tcaaggttgt ggagtgtaag    4440

tcgactcgag aattcacgcg cgcgtgaatt aattcgctgt ctgcgagggc cagctgttgg    4500

ggtgagtact ccctctcaaa agcgggcatg acttctgcgc taagattgtc agtttccaaa    4560

aacgaggagg atttgatatt cacctggccc gcggtgatgc ctttgagggt ggccgcgtcc    4620

atctggtcag aaaagacaat ctttttgttg tcaagcttga ggtgtggcag gcttgagatc    4680

tggccataca cttgagtgac aatgacatcc actttgcctt tctctccaca ggtgtccact    4740

cccaggtcca actgcaggtc gagcatgcat ctagggcggc caattccgcc cctctccccc    4800

ccccccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg    4860

gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc    4920

ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa    4980

aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag    5040

acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg    5100

cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg    5160

ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa    5220

caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg    5280

gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca    5340

cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc catgatggcc    5400

tcgccctttg ctttactgat ggtcctggtg gtgctcagct gcaagtcaag ctgctctctg    5460

ggctgtgatc tccctgagac ccacagcctg gataacagga ggaccttgat gctcctggca    5520

caaatgagca gaatctctcc ttcctcctgt ctgatggaca gacatgactt tggatttccc    5580

caggaggagt ttgatggcaa ccagttccag aaggctccag ccatctctgt cctccatgag    5640

ctgatccagc agatcttcaa cctctttacc acaaaagatt catctgctgc ttgggatgag    5700

gacctcctag acaaattctg caccgaactc taccagcagc tgaatgactt ggaagcctgt    5760

gtgatgcagg aggagagggt gggagaaact cccctgatga atgcggactc catcttggct    5820

gtgaagaaat acttccgaag aatcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt    5880

gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatccctct ctttatcaac aaacttgcaa    5940

gaaagattaa ggaggaagga ataacatcgg atccaccgga tctagataac tgatcataat    6000

cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct    6060

gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa    6120

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca    6180

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa cgcgcgcgta aattgtaagc    6240

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa    6300

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt    6360

gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg    6420

cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt    6480

ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga    6540

gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg    6600

ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg    6660

cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc    6720

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc    6780

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtcctg aggcggaaag aaccagctgt    6840

ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc    6900

aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag    6960

gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc    7020

cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa    7080

ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt    7140

gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaagatcg atcaagagac aggatgagga    7200

tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag    7260

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc    7320

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg    7380

aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc    7440

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg    7500

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct    7560

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg    7620

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat    7680

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc    7740

atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg    7800

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc    7860

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct    7920

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat    7980

cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga    8040

cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct    8100

tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg    8160

agttcttcgc ccaccctagg gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca ataccggaag    8220

gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagac agaataaaac gcacggtgtt gggtcgtttg    8280

ttcataaacg cggggttcgg tcccagggct ggcactctgt cgatacccca ccgagacccc    8340

attggggcca atacgcccgc gtttcttcct tttccccacc ccacccccca agttcgggtg    8400

aaggcccagg gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaggccc tgccatagcc tcaggttact    8460

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga    8520

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt    8580

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct    8640

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc    8700

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc    8760

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc    8820

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg    8880

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt    8940

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg    9000

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg    9060

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt    9120

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag    9180

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt    9240

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta    9300

ttaccgccat gcat                                                      9314

Claims (2)

1.一种通用型高效真核表达载体p3I-GFPN，其特征在于，其DNA序列如下：

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACG

GTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAA

CGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGT

GTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATG

ACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC

AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG

TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGT

AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGAATTAATTCGC

TGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGT

TTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCA

GAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA

CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGTCGGCTAGCTTAAGTCGACTCGA

GAATTCACGCGCGCGTGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGG

GCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCC

TTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAG

ATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACT

GCAGGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACG

TTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTT

TGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAA

GGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAG

CGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATAC

ACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCA

AGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCA

CATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTG

AAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCGGGATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGC

CCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCAC

CTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACC

CTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGC

CCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTT

CGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCAC

AAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACT

TCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGA

CGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGC

GATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGCGG

CCGCGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAA

AACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTT

ATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG

TTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGCGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAA

ATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGAC

CGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGG

CGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCC

GTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAG

AAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACC

ACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTA

TTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATA

TTGAAAAAGGAAGAGTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAG

GCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTC

CCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATC

CCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCG

AGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCG

ATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGT

GGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCG

CAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGC

TATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCT

GCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCT

GATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGC

GAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGC

CGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTG

CCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATC

AGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA

CGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGG

GGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAG

GTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTC

GCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAA

AAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGT

CGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCG

GGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCTCAGGTTACTCATATATACTTT

AGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAAT

CCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTT

TTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGC

TACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTA

GTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCT

GCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCT

GAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCT

ATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAG

CGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGC

GTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT

GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCC

ATGCAT。

2.一种由权利要求1所述的通用型高效真核表达载体p3I-GFPN构建的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA，其特征在于，其DNA序列如下：

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGG

CGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGAATTAAT

TCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGT

CAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTG

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TCCGCCCCTCTCCCCCCCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCG

GTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCT

GTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGG

AAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACC

TGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCAC

GTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCC

AGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAA

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TGATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGGGCTGTGA

TCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCC

TCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAG

CCATCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGA

TGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAG

GAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTC

TCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTT

ATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAATAACATCGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAAT

CAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAA

ATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATT

TCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGCGCG

TAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGG

CCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAA

GAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGT

GAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCC

GATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAG

GGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCG

TCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATC

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TTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCG

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GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTG

AACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGAC

AATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTG

TCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG

CTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTC

ATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCT

ACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATC

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CGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGA

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AGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTT

CTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGC

CATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTG

GATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAG

GAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTG

TTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGC

CCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCG

GCAGGCCCTGCCATAGCCTCAGGTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGA

TCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGA

CCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAA

CCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCA

GAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC

TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGAC

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GAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGC

GGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTAT

CTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCC

TATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC

TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCAT。

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