CN101183075A - 癌症检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括4－MUS及4－MU。所述试剂盒可用于检测癌症等以进行癌症的初期筛查和疗效监测。

Description

癌症检测试剂盒

技术领域

本发明涉及用于检测癌症和其他疾病的试剂盒。

背景技术

癌症具有极高的致死率。提高癌症存活率最重要的因素之一是早期检测。然而，目前对癌症进行的早期诊断和有效治疗均存在一定的局限性。

癌症发生和发展与酶基因异常表达密切相关，在细胞癌变过程中，与细胞增殖有关的酶及其同工酶活性增加。芳香基硫酸酯酶(Arylsulphatase，ARS)及其同工酶能水解芳香族的硫酸酯类，与机体解毒功能有关。一般认为，血清ARS活性升高是炎症过程；对区别肿瘤和非肿瘤有一定参考价值。血清中该酶浓度的测定，可以在临床上对疾病的诊断、治疗及预后判断，提供极为有用的资料。

有研究表明芳香基硫酸酯酶及其同工酶(ARS)为水解酶，能催化芳香基硫酸酯水解，它们已被证明在肺癌病人血清中比正常人血清中的活性高，治疗以后活性显著下降，包含ARS在内的溶酶体酶活性的提高可以被用来有效诊断和疗效检测(Wozniak，A.，et al.，2002)。而且ARSA和ARSB的活性在人初生和次生肿瘤组织的不同组织学类型中，在几乎所有的初级肺癌中显著升高(Gasa，S.，et al.，1980)。在乳腺癌患者中检测出ARS活性是健康女性的2-5倍，经过手术或化疗后，活性降至正常。酶活性跟肿瘤大小和转移情况相关(Rozwodowska，M.，et al.，2004)。而且还发现乳腺癌组织约是正常组织中硫酸酯酶活性的两倍(Chetrite，G.S.，et al.，2005)。另外，利用非特异性底物进行实验，发现ARS活性在胃癌、直肠癌、乳腺癌和皮肤癌中升高(Dzialoszynski，L.M.，et al.，1966)。

4-甲基伞形酮硫酸盐(4-methyl umbelliferone sulfate，4-MUS)能作为一个合适的底物来检测ARS的活性(George，G.G.，et al.，1969)。而且4-MUS在Km和Vmax、敏感性和稳定性方面比其他底物要好，其水解的产物4-甲基伞形酮(4-methyl umbelliferone，4-MU)在碱性溶液中有较高的荧光，便于检测。现有技术均在检测ARS中的A或者B，而本发明是检测ARSA和B这类酶，因为4-MUS不能分辨出A/B(William，R.S.，et al.，1967，Bostick，W.D.，et al.，1978.)。

发明内容

我们通过ARS这类酶催化4-MUS底物这样的生化反应，根据反应液中生成物4-MU反映酶活力的原理。利用特制的检测仪器，经特定的激发和检测波长检测产物4-MU的荧光强度，并根据已知浓度的4-MU标准品绘制标准曲线，从而定量检测样品中的ARS的活性。以此来进行癌症的初期筛查和疗效监测。

本发明涉及一种检测癌症的试剂盒，其包括4-MUS和4-MU。试剂盒中4-MUS的浓度为0.1-100mM，优选1-10mM，4-MU的浓度为1-10000nM，优选10-10000nM，更优选100-5000nM。

本发明的试剂盒可用于检测下列癌症：肺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、肠癌、鼻咽癌、肾癌、膀胱癌、淋巴癌、胆囊癌、壶腹癌、阴茎癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、大肠癌、肝外胆管癌、软组织肉瘤、精原细胞瘤、尤文氏肉瘤、白血病、骨肉瘤、脑瘤、恶性淋巴瘤。优选地，所述癌症是肺癌。

本发明的试剂盒使用的生物学样本为人的全血、血清、尿液、唾液、痰液、淋巴液以及其他组织液。优选地，所述生物学样本为血清。

优选地，本发明的试剂盒还包括缓冲剂及终止液。所述缓冲剂优选醋酸钠，其浓度范围是1-10000mM，优选10-5000mM，更优选100-1000mM，其pH的范围是1-14，优选4-6。所述终止液优选碳酸钠/碳酸氢钠，其浓度范围是1-50000mM，优选10-5000mM，更优选100-1000mM，最优选400-600mM，其pH的范围是1-14，优选9-11。

本发明还涉及一种特制的、专门用于检测芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的检测仪器，其基本构造见图2。它可以在特定的波长激发和检测荧光信号。所述激发波长的范围是100-600nm，优选300-400nm。检测波长的范围是100-1000nm，优选400-500nm。这种检测仪器能够实现自动化，批量化的操作。

本发明可用于筛查与疗效监测：

正常人群筛选；有症状病人的诊断以及良性和恶性肿瘤的鉴别；病情严重程度，评估治疗方案；监测肿瘤的治疗效果；预测肿瘤的复发及预后。

本发明的优势(与ELISA的比较)：

由于酶与底物的反应是高效和专一的，因此酶活性测定优于抗原-抗体反应技术，即基本上不存在假阳性情况。同时，酶活性测定更能直接的反映肿瘤发生过程中酶生物学功能，即实验结果更加真实可信。而且检测产物具有特异的激发和检测波长，使得整个实验可操作性强。

附图说明

图1显示实验原理。

图2显示检测芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的检测仪器的基本构造。

图3显示抗凝剂对人血清芳香基硫酸酯酶活性的影响。

图4显示保存状态对人血清芳香基硫酸酯酶活性的影响。

图5是4-MU与荧光读数值的标准曲线。

图6是用3份血清样本确定反应时间的[4-MU]-时间曲线。

图7是血清样本不同的稀释条件下的[4-MU]-时间曲线。

图8是芳香基硫酸酯酶在正常人血清和肺癌等癌症患者血清中的活性的对照。

图9是芳香基硫酸酯酶在正常人全血和肺癌等癌症患者全血中的活性的对照。

图10显示芳香基硫酸酯酶在正常人血清和肺癌等癌症患者血清中的活性相对应的灵敏度-特异性关系。

具体实施方式

(1)反应参数的确定

1.反应参数

1.1抗凝剂对活性的影响(图3)

从图中可以看出，随着抗凝剂浓度的增加：

EDTA对活性影响不明显

肝素钠和柠檬酸钠对活性影响较明显，随剂量增加，活性下降为了保证酶的活性，我们选择不带抗凝剂的血清作为实验样本。

1.2保存状态对活性的影响(图4)

从图4可以看出：

室温保存条件下，血清酶活性随存放时间增长而下降，且比较明显，从第2日起，每日下降10％左右

4度保存条件下，血清酶活性随存放时间增长变化不明显

反复冻融10次，活性下降20％左右

为了保证酶的活性不受影响，我们选择保存条件为-20℃。

1.3基础酶学性质实验确定的反应参数：

OD-[P]呈直线

[P]-time在前期呈直线

反应初速度v-[E]呈直线(当[S]＞＞[E]0)

1.3.1 OD-[4-MU]标准曲线的确定：为了保证荧光读数值跟4-MU浓度成线性关系，作图5(重复实验中结果一致性较好)：

1.3.2[4-MU]-时间曲线的确定：

选用3份血清样本来确定反应时间，结果显示(图6)：[4-MU]的读数值在图5范围内，认为36h内呈线性；

为保证测量的时间选取在线性范围内，同时与背景(对照)数值有明显差异，确定反应时间为24h。

1.3.3血清样本不同的稀释条件下的[4-MU]-时间曲线(图7)

为保证血清样本稀释的倍数的选取在线性范围内，确定采取1∶8稀释，再加入20μL于反应体系中。

2.反应参数的确定：血清稀释至1/8，取20μl进行酶活反应，24h后测定荧光读数，同时测定OD-[4-MU]标准曲线，再将(OD样本-OD对照.(水))换算为[4-MU]

(2)实验步骤：

采血5mL左右，加入真空、带分离胶且不含抗凝血剂的试管，室温静置30min左右，水平离心机，3000转/分钟，离心10min，将最上层血清吸出/倾倒出，转至1.5mL EP管/或其他类型未用过的小管，冷冻(-20摄氏度)至使用。

测定活性时，取50μl血清加入350μl的100mM醋酸钠缓冲液(pH5.4)中。

取20μl上述已稀释过的血清，加入180μl反应体系(含100mM醋酸钠，pH6，8mM 4-MUS)。

置温箱(37℃)反应24小时后，加入1ml终止缓冲液(500mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH12)，进行荧光测定。

利用标准样品4-MU(纯产物)作OD-[4-MU]标准曲线，再将血清反应读数按照此标准曲线进行换算，得到每个反应的[4-MU]。

根据上述[4-MU]，得到该血清ARS的活力，即每分钟每升酶蛋白能转化的底物摩尔数，或者得到该血清ARS的比活力，即每分钟每毫克酶蛋白能转化的底物摩尔数。

数据处理方式I：

测定缓冲液(含等浓度的醋酸钠和终止液成分)中标准样品即4-MU(0.003mM)的OD，记为ODs

测定对照反应(以20μl醋酸钠缓冲液替代血清的反应)的OD，记为OD0

(ODn-OD0)/[4-MU]n＝ODs/[4-MU]s

[4-MU]n＝(ODn-OD0)*0.003mM/ODs

可以算得样品n反应得到的产物4-MU的量，即参与反应的底物4-MUS的量

可以得到样品n的活性，即每分钟每升酶蛋白能转化的底物摩尔数

公式为：[4-MU]n/(L*24*60)

单位换算成nmol/min/L

数据处理方式II：

测定缓冲液(含等浓度的醋酸钠和终止液成分)中标准样品即4-MU(0.003mM)的OD，记为ODs

测定对照反应(以20μl醋酸钠缓冲液替代血清的反应)的OD，记为OD0

(ODn-OD0)/[4-MU]n＝ODs/[4-MU]s

[4-MU]n＝(ODn-OD0)*0.003mM/ODs

可以算得样品n反应得到的产物4-MU的量，即参与反应的底物4-MUS的量.

测定样品n的酶蛋白量：用牛血清蛋白(BSA)作对照，紫外分光光度计λ＝280nm来检测，得到样品n的酶蛋白浓度，记为Mn，可以算得样品n的酶蛋白量，记为Mgn.

可以得到样品n的酶比活性，即每分钟每毫克酶蛋白能转化的底物摩尔数。

公式为：[4-MU]n/(Mgn*24*60)

单位换算成nmol/min/mg

实验所用仪器：

水平离心机：Heraeus Labofuge 400R

检测仪器：

(i)基本构造如图2所示的用于检测芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的检测仪器，它可以在特定的波长激发和检测荧光信号。其中激发波长的范围是100-600nm，检测波长的范围是100-1000nm。这种检测仪器能够实现自动化，批量化的操作；或者

(ii)荧光分光光度计：HITACHI F-2500 FluorescenceSpectrophotometer

电热恒温培养箱：天津市中环实验电路有限公司

蜗旋振荡器：IKA MS2 Minishaker

移液器：吉尔森1mL，200μl，20μl

(3)实验数据：

1.正常人(15例)和癌症患者(肺癌7例、胃癌1例、卵巢癌3例、胰腺癌1例、乳腺癌1例)每种血清标本重复三次实验。全部测量数据见图8。

表1

2.正常人和癌症患者相对应的血清标本的活力均值

表2

	正常人血清	癌症患者血清
			样本数目	15	13
活力均值(nmol/min/L)	109.2658±36.6046	155.4093±51.9724

将正常人血清(共15样本)与癌症患者血清(共13样本)进行T检测，得到p＝0.005415＜0.01。

3.实验数据相对应的灵敏度-特异性关系见图10。

4.标准的确定：

根据灵敏度-特异性的关系，我们选择灵敏度和特异性相对数值都高的实验数据作为标准。

参考文献：

1.Wozniak，A.，et al.，Neoplasma，2002.49(1)：p.10-5.

2.Gasa，S.，et al.，Cancer Res，1980.40(10)：p.3804-9.

3.Rozwodowska，M.，et al.，Pol Merkuriusz Lek，2004.17(99)：p.252-4.

4.Chetrite，G.S.，et al.，Anticancer Res，2005.25(4)：p.2827-30.

5.Dzialoszynski，L.M.，et al.，Clin Chim Acta，1966.14(4)：p.450-3.

6.George，G.G.，et al.，Anal Chem，1969.41(14)：p.2006-9.

7.Sherman，W.R.，et al.，Biochem.J.1967.102：p.905-9.

8.Bostick，W.D.，et al.，Clin Chem，1978.24(8)：p.1305-16.

Claims (14)

1.一种检测芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的试剂盒，包括4-甲基伞形酮硫酸盐和4-甲基伞形酮。

2.权利要求1的试剂盒，它用于检测癌症和其他疾病，以及相应的疗效监测。

3.权利要求1的试剂盒，其中癌症是肺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、肠癌、鼻咽癌、肾癌、膀胱癌、淋巴癌、胆囊癌、壶腹癌、阴茎癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、大肠癌、肝外胆管癌、软组织肉瘤、精原细胞瘤、尤文氏肉瘤、白血病、骨肉瘤、脑瘤、恶性淋巴瘤。

4.权利要求1的试剂盒，使用的生物学样本为人的全血、血清、尿液、唾液、痰液、淋巴液以及其他组织液。

5.权利要求1的试剂盒，其中4-MUS的浓度范围是0.1-100mM。

6.权利要求1的试剂盒，其中4-MU的浓度范围是1-10000nM。

7.权利要求1的试剂盒，其中还包括缓冲剂及终止液。

8.权利要求7的试剂盒，其中缓冲剂是醋酸钠。

9.权利要求8的试剂盒，其中醋酸钠的浓度范围是1-10000mM，pH的范围是1-14。

10.权利要求7的试剂盒，其中终止液是碳酸钠/碳酸氢钠。

11.权利要求10的试剂盒，其中碳酸钠/碳酸氢钠的浓度范围是1-50000mM，pH的范围是1-14。

12.一种特制的、专门用于检测芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的检测仪器，它可以在特定的波长激发和检测荧光信号。

13.权力要求12的检测仪器，其中激发波长的范围是100-600nm。

14.权力要求12的检测仪器，其中检测波长的范围是100-1000nm。

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