CN101173258B - 普通变形杆菌脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种普通变形杆菌脂肪酶突变体及其应用，属于生物技术领域。该普通变形杆菌脂肪酶突变体是将野生型变形杆菌脂肪酶的氨基酸残基序列进行突变后得到的蛋白质：1)第102位的缬氨酸突变为异亮氨酸；2)第197位的甘氨酸突变为丝氨酸；3)第229位的精氨酸突变为组氨酸。编码普通变形杆菌脂肪酶突变体的全长基因，其序列为SEQ IDNO.1，长861bp。表达产物重组脂肪酶，分子量为31.5kDa。突变脂肪酶在制备生物柴油方面的应用，可高效地催化制备生物柴油。该脂肪酶突变体酶活性高，反应条件温和，在食品加工、生物柴油及洗涤用品添加剂中有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

Description

普通变形杆菌脂肪酶突变体及其应用

一、技术领域

本发明涉及一种普通变形杆菌脂肪酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

二、背景技术

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases，EC 3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，能够分解脂肪，催化天然底物油脂(甘油三酯)水解，产生游离脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，具有底物专一性，其天然底物一般为不溶于水的长链脂肪酸酰基酯(Karl-Erich Jaeger et al.，1994)。脂肪酶广泛应用于食品加工、药物制备、洗涤化工、环境治理、皮革加工、造纸、农药和生物能源等工业。动物、植物以及微生物都可以产生脂肪酶，由于微生物脂肪酶具有较高的催化活性和稳定性，并且易于生产、几乎不受季节和气候的影响，成为商品脂肪酶的主要来源。目前，已经有多种微生物脂肪酶用于工业化生产。

碱性脂肪酶广泛应用于洗涤剂、皮革加工、生物能源和食品加工等工业，需求量较大。位置非特异性脂肪酶具有较高的催化效率，会降低产品的生产成本。目前，人们广泛筛选脂肪酶产生菌，并对脂肪酶基因克隆、表达和定向进化，提高脂肪酶活性降低产品的生产成本。

普通变形杆菌(Proteus Vulgaris)产生碱性脂肪酶，通过检索，查到下列关于普通变形杆菌产生碱性脂肪酶的文献：【文摘】普通变形杆菌的细胞广泛分布在自然界中，易于分离获得。郁福庆等，现代卫生微生物学，北京：人民卫生出版社，1995：132。【文摘】在土壤中分离一株碱性脂肪酶产生菌，鉴定为普通变形杆菌，克隆脂肪酶基因(Genebank U33485)，进行原核表达，纯化后比活力为2000U/mg蛋白。最适pH为9.0，在pH为7.0-11.0时比较稳定，最适温度为50℃，当T≤40℃时，可以保持99％的脂肪酶活力。具有催化位置非特异性，不耐有机溶剂。

酶定向进化技术(enzyme directed evolution)是最近20年来发展起来的新技术，不需要深入了解蛋白质的结构和功能的关系，并适合一切蛋白质的改造，改变酶的催化特性，大大拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围。酶定向进化技术有多种方法。其中，易错PCR和DNA改组技术快速、高效并且实用，应用较广。通过定向进化提高脂肪酶活性，从而可以降低脂肪酶催化生产产品的生产成本。通过检索，查到下列关于普通变形杆菌产生碱性脂肪酶的文献：【文摘】将来自于Candida antarctica(ATCC 32657)，Hyphozyma sp.(CBS648.91)和Crytococcus tsukubaensis(ATCC 24555)的脂肪酶基因克隆后，通过DNAshuffling后筛选得到的突变脂肪酶对二乙基-3-(二氯苯基)戊二醛(diethyl 3-(3’，4’-dichloro phenyl)glutarate DDG)的活性分别比Candida antarctica(ATCC 32657)脂肪酶、Candida antarctica(ATCC 32657)脂肪酶、Crytococcus tsukubaensis(ATCC 24555)脂肪酶提高了20倍、11倍和13倍，同时突变脂肪酶的稳定性增强。Wen-Chen Suen等，ProteinEngineering，Design&Selection，2004，17(2)：133-140。【文摘】对来源于嗜热古菌Aeropyrumpernix的酯酶进行定向进化，利通过两轮易错PCR和筛选，获得了一株最优突变体，其总活力与野生型相比提高约6倍。王秋岩.，微生物学报，2006，46(2)：259～262

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是定向进化野生型普通变形杆菌脂肪酶，获得脂肪酶活性提高的进化脂肪酶，并对突变酶进行纯化。

技术方案

野生型普通变形杆菌脂肪酶突变体，其特征在于，将野生型变形杆菌脂肪酶脂肪酶的氨基酸残基序列进行下列三种突变中的一种或几种突变组合后得到的蛋白质：

1)第102位的缬氨酸突变为异亮氨酸；

2)第197位的甘氨酸突变为丝氨酸；

3)第229位的精氨酸突变为组氨酸。

定向进化野生型普通变形杆菌脂肪酶提高脂肪酶活性后得到的编码普通变形杆菌脂肪酶突变体的全长基因，其序列为SEQ ID NO.1，长861bp。其碱基组成为

碱基      数目     百分比

A         264      30.66

C         138      16.03

G         186      21.60

T         273      31.71

G+C       324      41.96

该基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID NO.2。其表达产物重组脂肪酶，分子量为31.5kDa。突变脂肪酶在制备生物柴油方面的应用，可高效地催化制备生物柴油，最佳反应条件为：40℃，125rpm，酶添加量为7.5％，甲醇分三批加入，每次加入与菜籽油等Mol的甲醇，0.1Mol正己烷，1.0g硅胶。

有益效果

迄今为止，人们已经发现包括细菌、放线菌、酵母和其它真菌在内的大约65个属的微生物及病毒具有产脂肪酶的能力。其中对Pseudomonas aeruginosa脂肪酶、Candidaantarctica脂肪酶、Crytococcus tsukubaensi脂肪酶、Rhizopus arrhizus脂肪酶等进行定向进化，获得了高活性或高温度稳定性的突变子。本发明人克隆的普通变形杆菌脂肪酶基因，在国际首次报道通过定向进化技术获得的高活性突变子基因。

本发明通过PCR技术普通变形杆菌(ProteusVulgaris)获得脂肪酶编码基因，在该基因两端分别加上Xbal和Bgl II限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pLLP-ST II连接并转化大肠杆菌表达宿主菌TOP10F’，实现了异源表达。通过Error-PCR和DNA Shuffling技术定向进化脂肪酶后获得了高活性脂肪酶突变子。我们获得的突变体比活力约为野生型脂肪酶的6.8倍，达到47600 U/mg，最适pH值为9.0，在pH 6～11范围内较稳定。最适温度为50℃，当T≤40℃时较稳定。并具有催化位置菲特异性，有利于用于生物柴油、食品和皮革加工等工业。

利用本发明突变脂肪酶，具有高活性和位置非特异性，有利于生物柴油的催化制备，在工业应用上具有优势。

四、附图说明

图1 Proteus Vulgaris T6脂肪酶基因的扩增

1：DNA分子量标准；2、阴性对照；3：Proteus Vulgaris T6脂肪酶基因

图2重组质粒pLLP-STII-PL1的构建

图3纯化重组脂肪酶SDS-PAGE分析

图4 TLC分析脂肪酶水解三油酸甘油酯产物

1-5分别为0h、2h、4h、6h、8h脂肪酶水解三油酸甘油酯产物；6，诺维信公司脂肪酶lane 6，Novozyme

五、具体实施方式

(一)普通变形杆菌(ProteusVulgaris)的分离

称取过100目的菜园土壤100g，0.2g CaCO₃，1000ml蒸馏水，121℃灭菌25min，三层滤纸过滤，1000g离心5min，除去沉淀，制备成土壤浸提液。配制脂肪酶产生菌分离培养基(40％土壤浸提液、0.85％葡萄糖、0.45％酵母提取物、0.1％罗丹明B、2.0％琼脂、pH 7.2。121℃灭菌20min)。

三角瓶中加入50ml蒸馏水，加入适量玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却后，加入2g土壤，150rpm 15min，吸取5μl上层清液，稀释100倍后，吸取10μl涂布吐温80脂肪酶筛选培养基平板和罗丹明B脂肪酶筛选培养基(Manish K.Tripathi，Uma Roy，Umesh K.Jinwal.Cloning，sequencing and structural features of a novel Streptococcus lipase[J].Enzyme andMicrobial Technology，2004，34：437-445 Kouker，G.and Jaeger.K.E.Specific and sensitiveplate assay for bacterial lipases[J].Apply Environmental Microbiology，1987，53：211-213)平板。在37℃培养箱中培养培养2d，观察菌落形态，根据是否产生荧光圈确定是否产酶，测量菌落直径和白色沉淀圈和荧光圈的直径。将平板初筛所得到的菌株接种到相应的种子培养基，细菌37℃，180rpm培养过夜，真菌30℃，180rpm培养2d，放线菌28℃，180rpm培养4d后，吸取1ml菌液接种到灭菌的含200ml发酵培养基的500ml三角瓶中，37℃，180rpm培养36h，将发酵液10000g离心，0.45μm膜过滤。

称取9g硅胶G，加入18ml 0.6％羧甲基纤维素纳，搅拌均匀后铺平板，硅胶板(12×15cm)自然干燥，110℃活化2h后备用。试管中加入9ml pH7.0磷酸缓冲液，终浓度100mM三油酸甘油酯，2ml粗酶，37℃，200rpm。在0，2，4，6，8h取反应液500μl，加入0.5ml正己烷中萃取产物。加样量2μl，展层剂为石油醚、乙醚和乙醇(70/30/2，V/V/V)，层析结束后，自然干燥，碘蒸汽显色。如果在反应初期就可以水解三油酸甘油酯的二位酯键，产生1，3-甘油二酯和1，2-甘油二酯，说明菌株T6脂肪酶即可以水解三油酸甘油酯的2位酯键，也可以水解1，3位酯键，具有催化位置非特异性。

按伯杰氏细菌鉴定手册(第九版.北京：科学出版社，1989)方法，对菌株进行形态学及生理生化鉴定。结果初步表明菌株T6为普通变性杆菌。按分子克隆实验指南中方法对菌株T6进行分子生物学鉴定，以菌株T6基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物16SF和16SR进行PCR扩增，扩增产物约1.5kb。PCR产物纯化后测序，递交菌株GenBank，登录号为DQ453959。将菌株T6的16S rDNA核苷酸序列与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列进行比对，结果菌株T6的16S rDNA核苷酸序列与普通变形杆菌(Proteus vulgaris)菌株CIP103181T的16S rDNA的核苷酸序列(AJ301683)的同源性最高，相似性达到99％，近一步证明菌株T6为普通变性杆菌。

(二)普通变形杆菌脂肪酶基因的克隆

将培养至OD₆₀₀约0.6的普通变形杆菌T6培养液离心收集菌体，用上海赛百盛公司基因组DNA提取基因组DNA。

参考Genbank中Proteus Vulgaris脂肪酶基因序列(GenBank，登录号U33485)，利用Vector NTI 9.0软件自行设计普通变形杆菌脂肪酶基因引物序列。

上游引物：5’-GGAAGATCTATGTCAACTACATATCCAAT-3’

下游引物：5’-TGCTCTAGAGCACAGCTTTTTACTT GCTAAGA-3，上游引物下划线碱基为Bgl II酶切位点，下游引物下划线碱基为Xbal酶切位点，由上海生工协助合成。

在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，普通变形杆菌T6基因组DNA10ng，4U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃ 3min；30×(94℃30s，52℃ 30s，72℃1min)；72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用天为时代试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。用计算机分析测序结果，发现一个长861bp的ORF，即普通变形杆菌脂肪酶基因，编码一个由287个氨基酸组成的蛋白质。

(三)表达载体的构建

将PCR产物纯化后，加Bgl II Xbal双酶切灭活，乙醇沉淀，ddH₂O重溶，与适量的NheI和BamH I限制酶消化的载体pLLP-ST II(购自深圳勤宝升公司)连接，转化大肠杆菌TOP10F’。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。

(四)普通变形杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的表达

将含有普通变形杆菌脂肪酶基因的表达质粒转化大肠杆菌表达宿主菌株TOP10F’(购自深圳勤宝升公司)，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1∶40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。提取细胞膜可溶性物质，Ni-NTA层析柱一步纯化，电泳鉴定。

(五)普通变形杆菌脂肪酶定向进化

易错PCR

反应体系：100μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)    0.5μl

10×易错PCR缓冲液        10μl

dNTP mix(各2.5mmol/l)    10l

dCTP(100mmol/l)          1μl

dTTP(100mmol/l)          1μl

模板DNA                  4μl

上游引物(10μmol/l)      2μl

下游引物(10μmol/l)      2μl

MgCl₂(2.5mmol/L)         10μl

MnCl₂(5mmol/l)           10μl

灭菌双蒸水补足至100μl。

PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃解链4min，72℃退火1min，50℃延伸温度1min，35个循环，72℃退火10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。使用PCR产物纯化试剂盒纯化，用灭菌双蒸水洗脱产物。2％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下检测，估算浓度。将剩余样品吹干，加入适量灭菌双蒸水溶解，估计DNA浓度，-20℃保存备用。

DNA改组

首先用DNaseI消化，Proteus Valgaris T6脂肪酶基因溶于10mM Tris-HCl(pH7.4)49μl，15℃平衡5min，2000倍稀释的DNaseI(1U/)1μl，15℃作用5min，90℃，10min终止反应，2％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收50bp-200bp的DNA片段。

无引物PCR

反应体系：100μl

DNaseI消化片段             10μl

10×Taq DNA聚合酶缓冲液    2μl

10×dNTP mix(各2.5mmol/1)  2μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)      0.5μl

加灭菌双蒸水至100μl

PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃解链1min，50℃延伸温度1min，72℃退火3min，45个循环，72℃退火10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

有引物PCR

反应体系：100μl

无PCR产物稀释30倍          1μl

10×Taq DNA聚合酶缓冲液    2μl

上游引物(10μmol/l)           2μl

下游引物(10μmol/l)           2μl

10×dNTP mix(各2.5mmol/l)    2μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)         0.5μl

加灭菌双蒸水至100μl

PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃解链1min，72℃退火3min，50℃延伸温度1min，45个循环，72℃退火10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

将易错PCR产物和DNA改组产物酶切，纯化试剂盒纯化，与适量的NheI和BamHI限制酶消化的载体pLLP-ST II(购自深圳勤宝升公司)连接，转化TOP10F’。待转化细胞长成菌落后，平板上加入含0.01％罗丹明B、1％橄榄油乳化液、20μg/ml IPTG的60℃的LB固体培养基，30℃诱导表达，培养5h后，用灭菌牙签挑取荧光圈较大的菌株接种于含Amp 100μg/ml的离心管中，培养过夜，加入终浓度为200μg/ml的Amp，100μg/ml的IPTG诱导表达。同时接种于含500μl LB培养液的离心管中，培养过夜，加30％灭菌甘油-20℃保存。

在离心管中培养过夜的突变库菌株，取适量菌液加入96孔板于自动微量酶标仪600nm处测定细胞密度值OD₆₀₀，然后将剩余离心管中的细胞提取膜可溶性物质；取一96孔板进行酶活力筛选，以对硝基苯酚辛酸酯作为酶水解底物，反应体系为0.2ml，缓冲体系为50mmpl/l磷酸缓冲液(pH7.0)，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mM，膜可溶性物质适量，用酶标仪测定410nm的光吸收值。选择OD410/OD₆₀₀值较大的克隆子，再对这些克隆子进行3次以上的比活力检测及筛选，最后得到的潜在的阳性突变子进行序列的测定。

将突变子基因序列，氨基酸序列与野生型基因序列，氨基酸序列进行对比，找出突变碱基和突变氨基酸。对比突变体EF3.3和野生型Proteus Vulgaris T6脂肪酶的氨基酸序列，三个突变点为102位Val突变成Ile，197位Gly突变成Ser，229位Arg突变成His。

(六)突变体酶学性质研究

在pH7.0，0.5mmol/L PBS缓冲液中于不同温度下测定纯化重组脂肪酶的活力，测定重组脂肪酶最适反应温度。将纯化重组脂肪酶在pH7.0，0.5mmol/L PBS缓冲液中分别于40，50，60，70和80℃保温1h，然后测定残余酶活力，确定重组脂肪酶温度稳定性。结果表明最适温度为50℃，当T≤40℃时较稳定。

配制不同pH的0.5mmol/l缓冲液，PBS缓冲液(pH 5.0-9.0)，Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0-12.0)。在37℃于不同pH的缓冲液下以PNPB为底物测定纯化重组酶的活力。将纯化重组酶在不同pH的缓冲液中分别于37℃保温30min，然后在37℃于pH 7.0Na2HPO₄-NaH2PO₄缓冲液中测定残余酶活力。结果表明最适pH值为9.0，在pH 6～11范围内较稳定。

序列表

<110>南京农业大学

<120>普通变形杆菌脂肪酶突变体及其应用

<130>说明书

<140>00

<141>2007-09-06

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>普通变形杆菌(Proteus Vulgaris)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(861)

<223>

<400>1

atgtcaacta catatccaat tgttttagtt catggtttat ctggttttga tgatgtcgtc    60

ggttatcctt atttttatgg tatccgcgac gcattagaaa aagatggtca taaagttttc    120

accgcatctc tttctgcatt taactctaac gaagttcgtg gagaacaact ttgggaattt    180

gtgcaaaaag ttctcaaaga aaccaaagca aaaaaagtaa atttaatcgg tcatagccaa    240

ggtccattag cttgtcgtta tgttgctgca aaacatgcta aaaatatcgc ttctgttacc    300

tctattaatg gtgtaaacca cggatcagag attgcggatc tagtgcgacg tattatgcgc    360

aaagatagtg tgcctgaata tattgctgat gcagttatga aagctattgg tactattatt    420

tctacatttt caggtaatcg tggtaatcca caagatgcta ttgctgcatt agaagcatta    480

acaactgaaa atgtgatgga atttaataaa aagtatccac aagggctgcc agccattcgt    540

ggtggtgaag gtaaagaagt cgtaaatggt gttcattatt attcatttgg tagttatatc    600

caaggtctga ttgccggcga aaaaggtaat ttattggacc ctactcatgc tgcaatgcgt    660

gtattaagtg cattctttac tgaacatgaa aatgacggtt tggtgggtcg tacaagtatg    720

cgattaggta aactaattaa agatgattat gctgaagatc atctggacat ggtaaaccag    780

gttgcaggtc tagtagggcc tggtgaagat attgtagcta tttataccaa ccatgcgaat    840

ttcttagcaa gtaaaaagct g                                              861

<210>2

<211>287

<212>PRT

<213>普通变形杆菌(Proteus Vulgaris)

<220>

<221>普通变形杆菌脂肪酶突变体的基因推导的氨基酸序列

<222>(1)..(287)

<223>

<400>2

Met Ser Thr Thr Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Leu Ser Gly Phe

1                   5                       10                  15

Asp Asp Val Val Gly Tyr Pro Tyr Phe Tyr Gly Ile Arg Asp Ala Leu

                20                      25                    30

Glu Lys Asp Gly His Lys Val Phe Thr Ala Ser Leu Ser Ala Phe Asn

        35                     40                     45

Ser Asn Glu Val Arg Gly Glu Gln Leu Trp Glu Phe Val Gln Lys Val

    50                      55                      60

Leu Lys Glu Thr Lys Ala Lys Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gln

65                     70                      75                   80

Gly Pro Leu Ala Cys Arg Tyr Val Ala Ala Lys His Ala Lys Asn Ile

                  85                      90                    95

Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn His Gly Ser Glu Ile Ala

             100                     105                 110

Asp Leu Val Arg Arg Ile Met Arg Lys Asp Ser Val Pro Glu Tyr Ile

          115                     120                 125

Ala Asp Ala Val Met Lys Ala Ile Gly Thr Ile Ile Ser Thr Phe Ser

   130                      135                     140

Gly Asn Arg Gly Asn Pro Gln Asp Ala Ile Ala Ala Leu Glu Ala Leu

145                     150                     155                  160

Thr Thr Glu Asn Val Met Glu Phe Asn Lys Lys Tyr Pro Gln Gly Leu

                    165                     170                   175

Pro Ala Ile Arg Gly Gly Glu Gly Lys Glu Val Val Asn Gly Val His

               180                     185                    190

Tyr Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr Ile Gln Gly Leu Ile Ala Gly Glu Lys

         195                     200                     205

Gly Asn Leu Leu Asp Pro Thr His Ala Ala Met Arg Val Leu Ser Ala

    210                     215                     220

Phe Phe Thr Glu His Glu Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg Thr Ser Met

225                     230                     235                  240

Arg Leu Gly Lys Leu Ile Lys Asp Asp Tyr Ala Glu Asp His Leu Asp

                  245                     250                     255

Met Val Asn Gln Val Ala Gly Leu Val Gly Pro Gly Glu Asp Ile Val

             260                     265                     270

Ala Ile Tyr Thr Asn His Ala Asn Phe Leu Ala Ser Lys Lys Leu

         275                      280                    285

Claims (3)

1.野生型普通变形杆菌脂肪酶突变体，其特征在于，将野生型变形杆菌脂肪酶脂肪酶的氨基酸残基序列同时进行下列三种突变组合后得到的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2：

1)第102位的缬氨酸突变为异亮氨酸；

2)第197位的甘氨酸突变为丝氨酸；

3)第229位的精氨酸突变为组氨酸。

2.编码权利要求1所述普通变形杆菌脂肪酶突变体的基因，其序列为SEQ ID NO.1。

3.权利要求1所述的普通变形杆菌脂肪酶突变体在食品加工、生物柴油及洗涤用品添加剂中的应用。

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