CN101172096A - 双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统 - Google Patents

Abstract

一种双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统，包括磁性微球载体及双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置；其中磁性微球载体为超顺磁性纳米级微粒与其它物质结合的结合体；双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置包括直流电源、控制器、电子开关驱动电路、主电路和电磁铁；磁性微球载体在所述双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置产生的频率为0.25～80Hz，磁感应强度0.1T～1.2T的双极性方波的振荡磁场内产生聚积和振动。本发明性微球载体含超顺磁性纳米级微粒，具有强的磁响应性，在无外加磁场时磁性可以很快消失，容易排出体外。装置能够获得上升沿和下降沿变陡的电流脉冲能够实现性微球载体的聚集和振荡，实现对搭载物质的有效释放。

Description

双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统

技术领域

本发明涉及医疗装置，具体是一种双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统。

背景技术

对于大多数药物传递系统而言，多数聚合物的释药为扩散释放，因此药物释放受多种因素影响而较难控制。药物智能传递系统中脉冲释药系统为解决这类问题提供了科研方向，即通过环境影响如：温度、光、超声波、微波和磁场等物理与pH、葡萄糖等化学刺激信号使材料的结构与功能发生变化，实施对药物释放信号的空间及时间控制。如：美国专利：U S Patent5,019,372 1991年所述，利用乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)将牛血清与钐钴(SmCo)永磁体包埋，在体外施加振荡磁场，能将牛血清释放速率提高5-10倍。但这类磁性植入式缓释制剂中永磁体的代谢存在一定的问题。随着近年来纳米粒子研究的发展，磁性材料也进入了纳米粒子的研究应用阶段。如中国专利：1)将磁场作用于磁性颗粒的应用方法，申请号：200610027027；2)多西紫杉醇磁微球及其制作方法，申请号：200410044113；3)一种磁性高分子微球及其制备方法，申请号：01105116；4)磁性药物靶向治疗的药物定位方法，申请号：02155353；所公开的技术，可见超微磁性粒子制备技术已日趋成熟。由纳米Fe₃O₄制备的超顺磁性微粒，具有强的磁响应性，在无外加磁场时磁性可以很快消失，纳米Fe₃O₄能够最终排出体外，是理想的医用磁性微粒。

磁性微粒在振荡磁场中会产生聚积、移动和振荡，而磁场的产生装置为电磁铁，呈感性，电感量大，严重影响了电流脉冲的形状，使振荡电流的上升、下降沿陡度不够。要获得磁场中磁性微粒的较好的聚积和振荡效果，应建立振荡幅度大的磁场，必须提高电流脉冲上升、下降的速度，因为上升沿和下降沿的延迟使电流达到稳态的时间变长，影响了电流脉冲频率的提高。

在电流脉冲下降沿，负载电感释放能量阻止电流下降，会产生较高的感应电压，需要采用某些措施吸收电感能量。目前，类似装置常采用在负载串联阻尼电阻、RC网络等方法。

而在振荡磁场促进纳米磁性微球载体中药物的释放，特别是在双极性陡脉冲磁场下促使超顺磁性纳米载药微球的局部聚集和控制药物释放的装置目前未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于磁靶向治疗的双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统，它采用双极性高陡度振荡脉冲磁场对以纳米磁性微粒为载体的载药微粒产生作用，通过该上升、下降沿高陡度的电流脉冲磁场的建立，能够加速电流上升，提高电流幅值，实现负载能量的回馈，能够磁性微球载体具有靶向聚集及良好的药物控制释放能力。

本发明针对磁性微球载体靶向控释的关键技术问题--产生强磁场强度的交变脉冲磁场，提出用双极性脉冲电流产生振荡磁场，双极性电流脉冲的标准波形，其特点是在输出电流期间幅值恒定，在无输出期间电流为零，电流波形周期性变化。

本发明涉及的系统包括磁性微球载体及控制其聚集和振动的双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置。

所述磁性微球载体为超顺磁性纳米级微粒与其它物质结合的结合体。所述其它物质为具有生物活性的药用物质，或其它在产业上需要通过磁性载体运载进行定点释放的物质；所述超顺磁性纳米级微粒与其它物质结合的方式为：物理结合如通过吸附(如：静电、磁性、弱作用力等)、混合、相嵌、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附等；化学结合如配位、键合等及生物性结合如抗原与抗体、配体与受体、单链DNA或单链RNA或SiRNA配位结合而形成的结合。

所述超顺磁性纳米级微粒首选纳米级的Fe₃O₄制备的超顺磁性微粒。

所述产生电流脉冲振荡磁场装置，可产生正向、负向的双极性电流脉冲，脉冲周期、幅值可调。产生双极性电流脉冲的电路，由全桥电路实现，四个桥臂开关采用全控型电力电子器件。

本发明系统涉及的双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置是这样构成的，它包括直流电源、控制器、电子开关驱动电路、主电路和电磁铁，其中主电路包括续流阻断二极管，全桥电路和储能电容，全桥电路为四个电子开关组成的全桥结构的双极性转换开关阵列，每个电子开关上并联寄生二极管；电子开关是绝缘栅极型功率管IGBT，通过控制器产生的控制信号，由主电路的电子开关，将直流电源输出转换为双极性脉冲电压，由输出端输出后施加于电磁铁的线圈上，在电磁铁线圈中产生双极性脉冲电流；在主电路的直流电压输入端，由串连在输入端的续流阻断二极管和并联在输入端的储能电容及每个电子开关上并联寄生二极管构成负载能量回馈电路。

所述装置在输出电流关断期间，电磁铁线圈能量通过寄生二极管释放到储能电容，储能电容电压高于电源电压，加速了电流脉冲的下降；在下一个电流脉冲上升沿，储能电容能量快速释放，当储能电容电压等于电源电压后，再由电源供电。储能电容能量快速释放加速了电流脉冲的上升；从而获得双极性的陡持长脉冲。

上述磁性微球载体在上述装置产生的频率为0.25～100Hz，磁感应强度0.1T～2.0的双极性方波的振荡磁场内产生聚积和振动。

本发明与现有技术相比，具有以下技术效果：

(1)载体含超顺磁性纳米级微粒，具有强的磁响应性，在无外加磁场时磁性可以很快消失，容易排出体外。

(2)装置能够获得上升沿和下降沿变陡的电流脉冲，的上升沿变陡。

在电流脉冲下降时，将电磁铁负载能量转移到电容C₁中，C₁的电压高于直流电源电压。在装置输出电流时，电容C₁能量快速释放，提升上升沿的陡度。

(3)装置能够使电流脉冲的下降沿变陡，实现了电流幅值的提升，提高了磁场强度。

(4)双极性脉冲振荡磁场比单极性脉冲振荡磁场和正弦振荡磁场具有更好的振荡效果。

附图说明

图1为本发明的系统构成图；

图2为本发明主要电路原理图；

图3为本发明电磁铁的结构示意图；图中1、主磁路铁芯；2、线圈；3、骨架；4、轴向拉杆；5、基座夹件；6、主磁路轭铁；7、径向拉杆；8、机架；9、升降架；10、手轮；11螺柱；8、螺母；13、活动衔铁连接件；14、活动衔铁；15、固定螺栓；16、绝缘夹件；17、固定衔铁。

图4本发明电磁铁气隙断口横截面磁感应强度分布图；

图5本发明电磁铁气隙断口纵截面磁感应强度分布图；

图6负载电流和电压实验波形；

图7不同电流波形产生磁场聚焦情况；

图8磁性Fe₃O₄壳聚糖纳米粒透射电镜照片(×100000)；

图9超顺磁性质粒明胶微球(磁场下呈串珠状)光镜图(×400倍)；

图10超顺磁性链霉素PELA微球(磁场下呈串珠状)光镜图(×400倍)；

图11超顺磁性质粒明胶微球粒径分布图；

图12超顺磁性链霉素PELA微球粒径分布图；

图13链霉素药物释放实验(累计药物释放量)；

图14链霉素药物释放实验(每天药物释放量)；

图1314中：系列1：磁性链霉素PELA微球，每天用磁场；系列2：磁性链霉素PELA微球，21天后用磁场；系列3：链霉素PELA微球；

图15超顺磁性质粒明胶微球释放实验(累计质粒释放量)；

图16转染后第四天荧光显微镜图(释放出的质粒用于平滑肌细胞)；

图17超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒磁滞回线图；

图18超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒、壳聚糖、纳米Fe3O4的红外线光谱图(FT-IR)；

图19超顺磁性壳聚糖(SPFCN)、质粒结合试验电泳图。

具体实施方式

实施例1.纳米磁性(Fe₃O₄)微粒的超顺磁性

以化学共沉淀法制备超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒：将适量硫酸亚铁铵与硫酸铁铵混合物[Fe2+/Fe3+(mol)＝1.2]，溶于含2％壳聚糖(w/v)的乙酸溶液中(pH，5.5)配制成A液，移入500mL三颈烧瓶中；配制6mol/L NaOH(或1.5mol/L NH3·H2O)成B液；在氮气保护下，快速搅拌中加热A液至55℃。滴入B液，维持反应10min；降低搅拌速度，加热混合液至85℃，维持反应90min；加适量戊二醛，维持反应30min。将所得悬浮液调节pH；得黑色胶状沉淀，蒸溜水洗涤后，真空干燥，得干粉产物。室温保存。

1)用样品振动磁强计测定超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒结果(见图17)：

环境温度：290.45K

样品质量M＝0.0179g(克)；矫顽力。Hc＝1.74Oe；

饱和磁化时磁场强度Hs＝19228Oe；比磁化强度Ms＝8.223emu/g；

剩磁磁场为0时，单位质量的剩余磁矩Mr＝0.0199emu/g。

2)超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒投射电镜检测，其粒径范围为7-20纳米。(见图8)

实施例2.磁性微粒与载体(壳聚糖)化学结合

按实施例1得超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒，用傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)对超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒、壳聚糖、纳米Fe3O4进行光谱分析。(见图18)：

上图为磁性壳聚糖纳米粒(A)、纳米Fe3O4(B)和壳聚糖(C)的红外光谱，壳聚糖(图4C)的羟基O-H和氨基N-H伸缩振动吸收峰在3100-3600cm-1之间，由于氢键作用而变宽，在1646.53cm-1处有伯氨基特征的剪式弯曲振动吸收峰；1024.65与1093.93cm-1为吡喃环上C-O-C的伸缩振动吸收峰(Fig4.C)。纳米Fe3O4在633.12cm-1处有特征吸收峰(Fig4.B)。而在磁性壳聚糖微粒中(Fig4.A)，1646.53cm-1的伯氨基特征峰消失，在1606.89cm-1出现了戊二醛交联壳聚糖形成的Schiff碱吸收峰，与通常的Schiff碱吸收峰相比，发生了红移，而糖环上C-O-C伸缩振动吸收峰红移至1110cm-1左右；同时，Fe3O4特征吸收峰红移至619.36cm-1。这些都可能是Schiff碱和羟基与Fe3O4的Fe的配位而导致的。由此说明，在壳聚糖Fe3O4纳米粒中存在着壳聚糖和纳米Fe3O4之间的配位作用。

实施例3.磁性微粒与质粒静电吸附：

超顺磁性纳米磁性壳聚糖微粒(SPFCN)、质粒结合试验(见图19)

按氮/磷比(N/P)从1∶2；1∶1.5；1∶1.2 5；1∶1；1.25/1；1.5/1；2.0/1；2.5/1；3.0/1，将SPFCN(氮含量为0.007g/L)，溶入1ml自酸钠缓冲液中(pH5.4)，加热至55℃，将浓度0.3mg/ml质粒加入，旋涡搅拌20s，55℃下复合1小时。用琼脂糖凝胶电泳观察质粒与SPFCN结合情况，Marker为λEcoT14 I digest。结果(见图19)。

从图19中可见，当氮/磷比(N/P)逐渐增加时，图中表现为质粒特异性明亮条带的亮度逐渐减弱，说明质粒从点样孔跑出的浓度逐渐减少，当氮/磷比(N/P)达2.5/1(泳道9)时，泳道9中未出现质粒特异性明亮条带，说明此时SPFCN已将质粒全部结合，致使质粒不能从点样孔跑出。

实施例4.磁性微粒与药物复合形成微球

(1)超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球[SPCPGM]的制备(见图9)

用交联固化法制备SPCPGM，分别将超顺磁性壳聚糖纳米粒(Fe3O4，约800mg)5ml(醋酸缓冲液配制pH5.5)，加热至55℃，将20％(w/v)浓缩质粒(pDsVEGF165Red1-N1)8ml加热至55℃，旋涡混和20s，复合1小时；加入预热50℃的20％明胶溶液(w/v)，搅拌混合成复合溶液。将此复合溶液滴入均质机(10,000rpm)搅拌下50℃的石蜡油中；显微镜观察到成微球后。冰浴降温至4℃。加入适量37％甲醛及异丙醇，维持搅拌1小时。用乙醚、去离子水洗涤5-8次，离心(8,000rpm，5min)收集微球(保留洗涤液并测定其中质粒的含量)，冻干，-20℃保存。

非磁性的壳聚糖质粒pDsVEGF165Red1-N1明胶微球(CPGM)的制备与上述方法类似，仅第一步用壳聚糖替代超顺磁性壳聚糖。

同样，不含质粒DNA的超顺磁性壳聚糖明胶微球(SPCGM)，也用类似的方法制备，取其制备过程中的洗涤液，用于核酸蛋白测定仪测定DNA浓度时设定零点值。

微球的载药量及包封率测定

新制三批微球，收集各组洗涤液，离心(8,000rpm，5min)，取上清液UV法在波长260nm下测定pDsVEGF165Red1-N1质粒浓度(用不含质粒的微球洗涤液调定设备零点值，以消除辅料的干扰)。并分别称量微球重量。

按下列公式计算微囊的载药量和包封率

包封率＝[(投入药量-上清液中药量)/投入药量]×100％

载药量＝[(投入药量-上清液中药量)/微球重量]×100％

SPCPGM和CPGM包封率和载药量测定

壳聚糖pDsVEGF165Red1-N1质粒明胶微球：包封率97.56±1.69％(w/w)；载药量65.20±1.52％(w/w)；SPCPGM：包封率98.51±1.34％(w/w)；载药量53.42±1.54％(w/w)。

(2)超顺磁性链霉素PELA微球的制备(见图10)

用双乳化(W/O/W)溶剂蒸发法制备超顺磁性链霉素PELA微球：将适量PELA溶入二氯甲烷+乙酸乙酯混合液中成油相；将5％硫酸链霉素2.5mL与5mL超顺磁性壳聚糖纳米球混悬液(约350mg)旋涡混合成内水相；将适量1％pluronic F-68(w/v)加入30mL 2％PVA水溶液中(w/v)成外水相。将内水相加入油相超声乳化10min(功率100W)得W/O初乳；再将初乳注入外水相中，置均质机下均质5-10s(10000转/分)，得复乳。搅拌挥发12小时祛除有机溶剂，蒸溜水洗涤，离心(3000转/分)倒出上清液，(所有洗涤液均收集用于测定其中链霉素含量)即得超顺磁性链霉素PELA微球湿粉。冻干得干粉，-4℃保存。

作为对照用的链霉素PELA微球亦参照此法制备，仅内水相中加非磁性壳聚糖溶液。

超顺磁性链霉素PELA微球的粒径分布。(见图12)

包封率和载药量测定

两种微球包封率和载药量分别为：链霉素PELA微球：包封率47.56±1.39％；载药量55.20±1.52％；超顺磁性链霉素PELA微球：包封率48.51±1.39％；载药量33.42±1.54％。

实施例5.本发明双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置的构成

参见附图1、2，双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置是这样构成的，它包括直流电源、控制器、电子开关驱动电路、主电路和电磁铁，其中主电路包括续流阻断二极管D₅，全桥电路和储能电容C₁，全桥电路为四个电子开关J₁～J₄组成的全桥结构的双极性转换开关阵列，每个电子开关上并联寄生二极管D₁～D₄；电子开关是绝缘栅极型功率管IGBT，通过控制器产生的控制信号，由主电路的电子开关，将直流电源输出转换为双极性脉冲电压，由输出端输出后施加于电磁铁的线圈上，在电磁铁线圈中产生双极性脉冲电流；在主电路的直流电压输入端，由串连在输入端的续流阻断二极管D₅和并联在输入端的储能电容C₁及每个电子开关上并联寄生二极管构成负载能量回馈电路。

上述控制器可以采用Philips公司的单篇机P89C58X2或其它带32KFlash程序存储器的51内核单片机。所述驱动电路采用市售的IGBT驱动模块，如信号为57962L的驱动模块。

实施例5  电磁铁结构

参见附图3，电磁铁包括主磁路铁芯1、绕在主磁路铁芯骨架3上的线圈2，主磁路轭铁6，其中电磁铁主磁路轭铁一端安装在基座架件上，另一端安装绝缘夹件16，两夹件与机架连接，它们之间由四根轴向拉杆4连为一体是主磁路铁芯定位。在主磁路铁芯一个极端上具有固定衔铁17，另一个极端上具有活动衔铁14，该活动衔铁的顶端具有螺杆11，螺杆通过螺母安装机架的升降架9上，螺杆的顶端具有手轮，转动手轮，可以使活动衔铁相对固定衔铁作移动，从而改变它们之间的距离。实施例中的铁芯的尺寸为：高70cm，宽50cm。铁芯的截面积，即两极间气隙的截面积为10cm×10cm。气隙缺口高度为10-20cm可调。在该气隙缺口内置入磁性微球载体，就会使其产生聚集和振荡。

将实施例1～4制备的磁性微球载体置于实施例4装置产生的频率为0.25～80Hz，磁感应强度大于0.1T～1.2T的双极性方波的振荡磁场内产生聚积和振动。

实施例6装置的负载电流和电压实验波形实验

实测数据：装置的发射电流50A，产生磁场的磁感应强度为1.3T，U_s＝36V，线圈电阻0.8Ω，线圈电感量0.46H，电子开关采用1700V、100A的IGBT模块。利用BELL公司型号为Mode 17010 Gauss/teslameter测试了实验装置的磁感应强度，在输出双极性脉冲电流为50A时，磁感应强度峰值为1.3T。在电流为30A，磁感应强度峰值为0.75754T。装置产生的波形参见附图6，图中下面波形为输出电压，上面波形为输出电流，可见波形为双极性脉冲，脉冲前沿有明显提升，下降沿有较高的陡度。

本发明装置的工作原理如下：

(1)控制器的产生控制信号，通过电子开关驱动电路驱动发送机主电路的电子开关，将直流电源输出转换为双极性脉冲电压，由a、b端输出后施加于电磁铁线圈，在电磁铁线圈中产生双极性脉冲电流。

(2)调节直流供电电源的输出电压，改变输出电流脉冲的幅值，使电流幅值小于电子开关通过的最大电流；

(3)在电流脉冲下降沿，电磁铁负载释放能量，通过全桥电子开关寄生二极管存储到回馈电容C₁中，电容C₁的端电压U_C1随着负载电感能量的释放而增大，电流脉冲迅速下降，当负载电流衰减到零时，U_C1增大到V₂。由于在电流脉冲下降沿期间电磁铁电压等于U_C1，U_C1的上升加速了电流的下降，使电流下降沿更陡。

(4)电容C₁的计算：

$C_1>\frac{L_1{I_0}^2}{{U_T}^2-{U_s}^2}$

U_T为电子开关额定耐压，L₁为电磁铁电感量，U_s为直流电源电压，I₀为发射电流峰值。

(5)在电流脉冲上升沿，电容C₁由于在前一个脉冲下降沿的储能，U_C1＞＞U_s，二极管D₅截止，电容C₁先释放能量。由于此时电容C₁电压较高，加速了电流上升。在U_C1＝U_s时，转由直流电源供电。储能电容C₁的作用，加速了电流上升沿的陡度，并提高了电流脉冲的幅值。

(6)双极性脉冲电流通过电磁铁线圈，沿着线圈轴线方向在电磁铁间隙内产生极性不断反转的脉冲磁场，电磁铁的高导磁性增强了磁场强度。

(7)在气隙处与气隙轴线垂直的端面上，在气隙内的磁场较强，越往外，磁场强度越小。在电磁铁气隙内置入装有超顺磁微粒的试管，超顺磁性微粒在出现激励磁场时，超顺磁性微粒被磁化并受磁场力作用，朝着磁场强度大的地方运动，即向着气隙处聚集，达到了超顺磁性微粒聚焦目的。

(8)气隙内的振荡磁场带动超顺磁性磁微粒载体自身的运动，脉冲磁场的间歇性、反极性和微粒重力的作用，使得超顺磁体产生剧烈振荡。

(9)通过控制器预置发射信号频率、改变直流电源电压，电磁铁可以产生不同磁场强度和频率的振荡磁场，调节超顺磁性微粒的聚焦速度和得到不同的振荡效果。

(10)电磁特性仿真。通过对电磁铁模型进行了仿真，并绘制出缺口处磁感应强度的分布图。图4和图5分别给出了气隙断口横截面和纵截面的磁感应强度分布云图。颜色越深的区域表示磁感应强度越高。

实施例7本发明装置产生的磁场对磁性载药微球载体控制效果对比实验(附图7)

1、装置的电流脉冲上升沿提升，使输出电流远大于无负载能量回馈电路时的输出电流，增强了磁场脉冲强度。

如取C₁＝500μF，U_s＝36V，L₁＝0.46H，R₁＝0.8Ω，f＝1Hz，计算出发送电流为41.6A，如采用普通全桥，按同样参数计算，最大发送电流为15A左右。

2、装置能够使电流脉冲的下降沿变陡

在电流脉冲下降期间，负载电感能量转移到电容C₁中，电容C₁的电压迅速上升，使电感负载电压上升，使电流下升沿变陡。

3、实现了电流幅值的提升，提高了磁场强度。

电流脉冲上升沿提升，使输出电流远大于无负载能量回馈电路时的输出电流，增强了磁场脉冲强度。

4、双极性脉冲振荡磁场比单极性脉冲振荡磁场和正弦振荡磁场具有更好的振荡效果。

在电磁铁线圈施加426V、50Hz的交流电，试验观察发现，磁性微球载体虽能聚集，但移动非常缓慢。

5、在电磁铁线圈施加单极性方波电流，观察发现，磁性颗粒聚集效果很差，磁性颗粒不发生振动。

结论：在本装置产生的双极性方波电流作用下，磁微粒载体聚集速度快(比双极性无陡脉冲、单极性及正弦波电流作用下的聚集速度快)，激励电流上升、下降陡，磁性微粒发生振动剧烈(图7中a为双极性陡脉冲振荡磁场作用的效果)。

实施例9双极振荡陡脉冲磁场促进超顺磁性载药微球药物释放实验

(1)双极振荡陡脉冲磁场促进超顺磁性PELA微球链霉素释放的实验。

超顺磁性链霉素PELA微球制备见实施例4

微球体外溶出度实验

按《中国药典》溶出度测定第一法(转篮法)，用ZRS-6型智能溶出试验仪行体外溶出度实验。以三种方式观测药物溶出情况：A组，超顺磁性链霉素PELA微球，加用振荡磁场；B组，超顺磁性链霉素PELA微球，第21天加用振荡磁场；C组，链霉素PELA微球。每组观测两份样品，每份样品0.050g，滤布包裹，分别装入转篮中，各置于1000mL溶出液中。振荡磁场干预方法：陡脉冲磁场强度为1200mT(毫特斯拉)，频率为50-80Hz。磁场干扰时间点为：A组，按每次取样前2小时，每次陡脉冲磁场作用时间为1小时。B组，第21天后用陡脉冲磁场干扰，每次干扰方式同A组。C组，陡脉冲磁场干扰同A组，作空白对照。

溶出液采用Ringer’s人工模拟体液，配方：NaCl 8.5g；KCl 0.2g；CaCl0.2g；NaHCO3 0.2g；加水至1000mL。设置温度(37±1)℃，转篮速度100转/分。第一次于溶出试验开始后12h；以后每隔24h采样，至26天结束。每次取样5m1，用0.4μm滤膜过滤，每次均须补加模拟体液，以维持溶出液体积不变。每个时间点取样三次，样品药物浓度用上述ELISA法测定。据标准吸光度曲线计算不同时间微囊释放链霉素的量，计算累计释放量，绘制体外释放曲线。

图13、图14给出了链霉素PELA微球及超顺磁性链霉素PELA微球，在陡脉冲磁场下，链霉素溶出的释放曲线。从中可以看出，各组PELA微球体外链霉素溶出时间均超过三周，有明显缓释作用，24小时各组药物释放量均低于总释放量10％，突释不明显；分析其原因，药物分子从微球中溶出，主要是靠浓度梯度经高分子微球中网孔渗出，可能是本次实验微球制备中高分子包裹材料中加入了小分子试剂乙酸乙酯，使其占据了微球中的微孔，阻挡了药物分子的快速扩散，因而无明显突释现象。

A组从第1天既开始加用陡脉冲磁场，每日药物溶出量明显高于另两组(3倍左右)。B组于第21天加用陡脉冲磁场，当日药物溶出量同样提高了3.38倍，统计学方差分析，A组与第B、C组之间，药物溶出量均有显著性差异(q检验，P＜0.001)；B组与C组前21天(未加用振荡磁场)相比，药物溶出量组间差别无统计学意义(q检验，P＞0.05)。

药物释放周期：此缓释体系在实验的第26天时，仍有较大的溶出速率，此时A组药物的释药百分率约为76％。实验后期体系应仍有药物释放，提示此体系可能有较长的释药周期。

(2)双极振荡陡脉冲磁场促进超顺磁性质粒明胶微球质粒释放的实验

超顺磁性质粒明胶微球制备见实施例4

为模拟质粒(pDsVEGF165Red1-N1)在支架内成血管及成骨的过程，本次试验将超顺磁性质粒明胶微球填入人工骨支架内进行释放试验，以三种方式观测药物释放情况：(见图15)

A组，超顺磁性质粒明胶微球(SPCPGM)+陡脉冲磁场；

B组，超顺磁性质粒明胶微球不用陡脉冲磁场；

C组，壳聚糖pDsVEGF165Red1-N1质粒明胶微球。

每组观测6份样品，每份微球样品2.00mg(SPCPGM含质粒约1.06mg，壳聚糖pDsVEGF165Red1-N1质粒明胶微球含质粒约1.30mg)，置25ml三角烧瓶中，加10ml 0.01M PBS(pH 7.4)中，于衡温水浴振荡器中(37℃)，振荡频率为100次/分钟。

每次采样0.5ml，同时补充PBS以维持释放介质体积不变。6份样品每个时间点平行取样，用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪(260nm)测定释放液中质粒的含量，取其均值，计算每日及累计质粒释放量，绘制体外释放曲线。释放出质粒的溶液调整pH值后，加入细胞培养液中，观察细胞转染效果。

双极振荡陡脉冲磁场干预方法：

双极振荡陡脉冲磁场强度为800mT(毫特斯拉，mT)，频率为50-80Hz。干扰时间点，每天一次：A组，按每次取样前1小时，每次陡脉冲磁场作用时间为1小时。B组，不用陡脉冲磁场干扰。C组，陡脉冲磁场干扰方法同A组。

超顺磁性质粒明胶微球质粒释放实验结果(见图14)

A组从第1天即开始加用陡脉冲磁场，每日药物溶出量明显高于另两组(4倍左右)。统计学方差分析，A组与第B、C组之间，药物溶出量均有显著性差异(q检验，P＜0.001)；B组与C组，药物溶出量组间差别无统计学意义(q检验，P＞0.05)。

药物释放周期：此缓释体系在实验的第22-25天时，陡脉冲磁场组，溶出速率减慢，此时质粒的释药百分率接近68％。而未用陡脉冲磁场组质粒的释药百分率近似值分别为：SPCPGM：10％；壳聚糖pDsVEGF165Red1-N1质粒明胶微球：14％。因此，可以认为，1.SPCPGM及CPGM多孔植入体中质粒缓释时间还可持续较长时间。2.本次实验条件下，陡脉冲磁场能促进含SPCPGM多孔骨植入体中质粒溶出，三周时能增加原有的质粒溶出量达3-6倍。释放出质粒的溶液细胞转染实验结果显示：仍能够转染细胞，并能使细胞表达红色荧光蛋白(见图16)。

由此可说明，陡脉冲磁场，能够促进含SPCPGM多孔骨植入体中质粒溶出释放。其机理可能有：1.超顺磁性微球整体随陡脉冲磁场振荡运动，起到了局部搅拌器的作用；2.磁性纳米Fe3O4在微球中振动，使微球产生了缝隙，建立了药物渗透通道，加上纳米粒振动的挤压和吸引作用，增加微球中质粒的溶出。而撤出陡脉冲磁场时，可能因高分子材料的弹性回位及纳米粒的占位，这些缝隙便缩小或关闭，从而回复了质粒原有的释放速度。

Claims (4)

1.一种双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统，其特征是：包括磁性微球载体及控制其聚集和振动的双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置；其中

(1)所述磁性微球载体为超顺磁性纳米级微粒与其它物质结合的结合体；

(2)所述双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置包括直流电源、控制器、电子开关驱动电路、主电路和电磁铁，其中主电路包括续流阻断二极管(D₅)，全桥电路和储能电容(C₁)，全桥电路为四个电子开关组成的全桥结构的双极性转换开关阵列，每个电子开关上并联寄生二极管；电子开关是绝缘栅极型功率管IGBT，通过控制器产生的控制信号，由主电路的电子开关，将直流电源输出转换为双极性脉冲电压，由输出端输出后施加于电磁铁的线圈上，在电磁铁线圈中产生双极性脉冲电流；在主电路的直流电压输入端，由串连在输入端的续流阻断二极管(D₅)和并联在输入端的储能电容(C₁)及每个电子开关上并联寄生二极管构成负载能量回馈电路；

(3)所述磁性微球载体在所述双极性陡磁场脉冲振荡磁场装置电磁铁产生的频率为0.25～100Hz，磁感应强度0.1T～2.0T的双极性方波的振荡磁场内产生聚积和振动。

2.根据权利要求1所述的双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统，其特征是：所述超顺磁性纳米级微粒首选纳米级的Fe₃O₄制备的超顺磁性微粒。

3.根据权利要求1所述的双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统，其特征是：所述其它物质为具有生物活性的药用物质；所述超顺磁性纳米级微粒与其它物质结合的方式包括：物理结合、化学结合及生物性结合。

4.根据权利要求1所述的双极性陡磁场脉冲振荡磁场下磁性微球载体的靶向控释系统，其特征是：所述电磁铁包括主磁路铁芯(1)、绕在主磁路铁芯骨架(3)上的线圈(2)及主磁路轭铁(6)，其中电磁铁主磁路轭铁一端安装在基座架件上，另一端安装绝缘夹件(16)，两夹件与机架连接，它们之间由四根轴向拉杆(4)连为一体使主磁路铁芯定位。在主磁路铁芯的一个极端上具有固定衔铁(17)，另一个极端上具有活动衔铁(14)，该活动衔铁的顶端具有螺杆(11)，螺杆通过螺母安装机架的升降架(9)上，螺杆的顶端具有手轮(10)，转动手轮，可以使活动衔铁相对固定衔铁作移动，从而改变它们之间的距离。

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