DE102006037702A1

DE102006037702A1 - Multifunktionelle Magnetkomposite für die Stammzelltherapie und/oder -Diagnostik

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Publication number: DE102006037702A1
Application number: DE200610037702
Authority: DE
Original assignee: MUELLER SCHULTE DETLEF
Current assignee: MUELLER SCHULTE DETLEF
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2008-02-14

Abstract

Die Erfindung betrifft multifunktionelle Polymerträger, in die magnetische Kolloide und Wirksubstanzen, z. B. in Form von Wachstumsfaktoren, eingekapselt sind und an deren Oberfläche Stammzell- und Zielzellrezeptoren-erkennende Liganden gekoppelt sind. Aufgrund der komplementären Erkennungsstrukturen können die multifunktionellen Träger sich spezifisch sowohl an die Stammzellen als auch an das Zielgewebe anlagern. Dadurch wird eine gewebe- bzw. zellspezifische Stammzelltherapie zur Behandlung diverser Erkrankungen ermöglicht. Die zielgerichtete Applikation der multifunktionellen Träger läßt sich noch dadurch steigern, daß die Träger aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften mit Hilfe eines statischen Magnetfeldes verschoben und auf diese Weise an das Zielgewebe bzw. an die Zielzellen dirigiert werden können (homing). Durch die zusätzliche Freisetzung der eingekapselten Wirksubstanzen wird die Gewebegeneration des pathogenen Gewebes durch eine verstärkte Stammzellproliferation unterstützt.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind multifunktionelle, mit Wirksubstanzen beladene Magnetkomposite, die in der Lage sind, sich mit Stammzellen zu verbinden. Aufgrund der magnetischen Eigenschaften lassen sich die Zell-Magnetkomposit-Komplexe durch ein äußeres, statisches Magnetfeld in vivo zielgerichtet an Zellen oder Gewebe pathogener Natur dirigieren, so dass eine direkte gewebespezifische Applikation ermöglicht wird. Die Wirksubstanzen können in einer weiteren Anwendungsform kontaktfrei über ein äußeres, hochfrequentes magnetisches Wechselfeldes (Induktion) oder mittels Ultraschall freigesetzt werden. Neben der therapeutischen Aufgabe fungieren die Magnetkomposite darüber hinaus als kontrastverstärkende Mittel im Rahmen der Magnetresonanz-Diagnostik.
Aufgrund der speziellen Komposition sind die multifunktionellen Magnetträger in der Lage, für die medizinische Diagnostik und Therapie vier Grundfunktionen synergetisch zu erfüllen. Diese Grundfunktionen betreffen die zielgerichtete Gewebeapplikation der Stammzellen, deren Proliferation und/oder deren Differenzierung sowie deren Nachweis über Magnetresonanzkontrastverfahren.
Magnetkomposite vornehmlich in Form magnetischer Nano- oder Mikropartikel sind seit langem aus dem Stand der Technik bekannt und werden besonders für die Biomolekül- und Zellseparation sowie als kontrastverstärkende Mitte u.a. in der Magnetresonanz-Tomographie eingesetzt.
In den US Patentschriften No. 5,898,071 , 5,512,439 , 5,492,814 , 6,072,945 werden magnetische, silanisierte oder polymerbeschichtete Magnetpartikel beschrieben, die zur Aufreinigung von Nukleinsäuren oder Kontrastverstärkung im MRI ("Magnetic Resonance Imaging") benutzt werden.
In dem US-Patent 5,508,164 werden Verfahren zur Bindung von Zellorganelen mit Hilfe silanisierter Glasspartikel beschrieben.
Alle vorgenannten Techniken und Produkte sind ausschließlich für die Diagnostik einsetzbar und können aufgrund ihrer eingeschränkten Funktionalität nicht für zielgerichtete Zell- oder Gewebetherapien genutzt werden.
Für eine zielgerichtete Gentherapie werden von C. Mah et al. (Mol. Therapy Vol. 6, 106–112, 2002) virale Vektoren eingesetzt, die an einen Magnetträger gekoppelt sind. Mitsumori et al., Int. J. of Hyperthermia, Vol. 10, 785, 1994, verwenden induktiv aufheizbare Magnetliposome zur Überwärmung (Hyperthermie) von Tumorzellen.
Auf der Suche nach neuen Therapieansätzen bei Tumor-, degenerativen- oder kardiovaskulären Erkrankungen hat die Stammzellforschung in den letzten Jahren neue, interessante Perspektiven eröffnen können. Hematopoetische Stammzellen, die heute die bestcharakterisierten Stammzellen darstellen, sind zwar bereits klinisch für die Behandlung von Brusttumoren, Leukämie und Immundefizienzen eingesetzt worden, nach wie vor ist jedoch eines der zentralen Anliegen, pathogenes Gewebe bzw. verloren gegangene Organfunktionen mit Hilfe der Stammzelltherapie und unter Umgehung der bisherige invasiven chirurgischen Interventionen zu ersetzen bzw. wiederherzustellen. Um das erreichen zu können besteht ein wesentlicher Forschungsschwerpunkt darin, eine gezielte Differenzierung der Stammzellen sowohl in vivo als auch in der Gewebekultur zu erreichen. Diese Stammzellen sollen in die Lage versetzen werden, verschiedene therapeutische Aufgaben wie z.B. die Reparatur geschädigter Herzmuskelzellen, den Ersatz von Dopamin- oder Insulin-produzierenden Zellen oder die Erneuerung von Bindegewebe oder Blutzellen zu erfüllen.
Dieses Ziel, das therapeutische Potential der Stammzellen für die Regeneration von geschädigtem Gewebe bzw. insuffizienten Gewebefunktionen ausnutzen zu können, wird vor allem durch die zielgerichtete Platzierung bzw. Fixierung der Stammzellen im erkrankten Gewebe (homing, anchoring) mit Hilfe der Magnetkomposite erreicht.
Bisher wurde versucht, die Stammzellen mit invasiven chirurgischen Maßnahmen in bestimmte pathologisch veränderte Körpergewebe zu implantieren. Neben der Umgehung dieser invasiven Methoden besteht ein weiteres Anliegen darin, durch die Applikation dieser Magnetkomposite eine verstärkte Kontrastierung in der computertomographischen Gewebeabbildung (Magnetic Resonance Imaging) herbeizuführen, um dadurch zu einem verbesserten Nachweis (Biomonitoring) des Zielgewebes und/oder der applizierten Zellen z.B. im Bereich des Herzen, der Leber, des Knochenmarks, der Nieren oder des Pankreas zu gelangen.
In den letzten Jahren wurden dazu magnetische Nanopartikel eingesetzt, die einen empfindlichen Nachweise im Rahmen des MRI ermöglichen. So konnten z.B. K.A. Rinds et al. (Blond, Vol. 102, 867–872, 2003) unter Benutzung magnetischer, Fluoreszenz-markierter Mikropartikel einen Einzelzellnachweis von hematopoetischen CD34+ Zellen und mesenchymalen-Stammzellen führen.
Die Internalisierung von Dextran-beschichteten superparamagnetischen Nanopartikeln und Magnetliposomen in CD34-hematopoetische Zellen und CD34+ Stammzellen mit dem Ziel eines grundsätzlichen homing-Nachweises wurde ebenfalls beschrieben (H. E. Daldrup et al. (Radiology, Vol. 234, 197–205, 2005).
Die physiologischen Effekte von intravenös infiltrierten Mesenchymale Stammellen, die zuvor mit Poly-L-Lysin beschichteten Magnetkolloiden markiert wurden, sind von G.T. Yocum et al. (Radiology, Vol. 235, 547–552, 2005) untersucht worden. Dabei ergaben sich keinerlei Nachteile in bezug auf die hämatologischen Blutwerte.
Sämtliche vorgenannten Ansätze beziehen sich vornehmlich auf das Monitoring von Zellen oder Stammzellen. Therapeutische Ansätze mit Hilfe eines spezifischen Zell-homings in Verbindung mit synergetischer Anwendung spezieller Signalfaktoren mit dem Ziel einer gesteuerten Zelldifferenzierung in Verbindung mit einer Geweberegeneration sind mit den Verfahren und Mitteln aus dem Stand der Technik nicht möglich, so dass das Potential der Stammzellen Technologie in bezug auf therapeutische Zwecke nicht ausgeschöpft werden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die eine verbesserte und gewebespezifische Applikation von Stammzellen ermöglichen, um sie dadurch einer gezielteren Therapie zugänglich zu machen. Neben dem eigentlichen homing oder anchoring sollen die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren darüber hinaus simultan in der Lage sein, Wirksubstanz freizusetzen. Darunter werden erfindungsgemäß solche Substanzen, Signalfaktoren, Chemokine, Interleukine oder proteolytische Enzyme definiert, die in der Lage sind, eine Zelldifferenzierung, Vaskularisierung, Zellproliferation, Angiogenese, Myogenese und/oder Geweberegeneration zu unterstützen bzw. zu beschleunigen.
Beispiele für solche, die Erfindung jedoch nicht einschränkende Wirksubstanzen sind: Transkriptionsfaktoren (z.B. Oct-4), stromal derived factor (SDF-1α), granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (G-CSF, GM-CSF), transforming growth factor (z.B. TGF-β1), fibroblast growth factor (FGF), monocyte-chemoattractant Protein (MCP-1), Angiogenese Faktoren, Mitogene, vascular endothelial growth factors (VEGF-A, VEGF-C), Angiopoetine, placental growth factor (PLGF), Interleukine (z.B. IL-8), Cytokin-Inhibitoren, epidermal growth factor (EGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), nerve growth factor (NGF), Insulin-Wachstumsfaktor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), hepatocyte growth factor (HGF) oder stem cell factor (SCF).
In einer weiteren Anwendungsform können die Magnetkomposite auch in kombinatorischer Weise dazu genutzt werden, als kontrastverstärkende Mittel im Rahmen der Magnetresonanz-Diagnostik zu fungieren. Wie aus den zitierten Stand der Technik hervorgeht, sind paramagnetische und superparamagnetische Substanzen aufgrund der induzierten magnetischen Inhomogenitäten in der Lage die T1- und/oder T2-gewichteten Relaxationen zu verkürzen und dadurch eine Kontrastverstärkung herbeizuführen. Durch die Applikation der erfindungsgemäßen multifunktionellen Mittel kann dadurch neben der therapeutischen Aufgabe in vivo überraschenderweise auch parallel ein diagnostisches Monitoring der Stammzellen bewerkstelligt werden.
Um diese kombinatorischen Aufgaben erfüllen zu können, werden Magnetkomposite zum Einsatz gelangen, die mehrere chemische, physiologische und/oder physikalische Funktionen erfüllen, die über die der aus dem Stand der Technik bekannten herkömmlichen Magnetpartikel deutlich hinausgehen.
Magnetkomposite mit den erfindungsgemäßen Eigenschaften bestehen aus Polymerträgern, in die magnetische Nanopartikel bzw. Magnetkolloide eingekapselt sind und sich an Stammzellen und/oder Zielzellen anlagern oder mit Ihnen verbinden können.
Unter "verbinden" wird der Einschluss bzw. die Einkapselung der Magnetkomposite in das Zellinnere z.B. durch Transzytose, Endozytose, Pinozytose oder die Anlagerung an die Zellmembran definiert. Dabei kann die Verbindung sowohl unspezifisch über ionische oder dispersive Bindungskräfte (van der Waals) als auch rezeptorvermittelt – z.B. über die CD-Rezeptoren – verlaufen.
Durch die Einkapselung der Magnetkolloide bzw. magnetischen Nanopartikeln lassen sich die Magnetkomposite mit Hilfe eines äußeren Magnetfeldes dreidimensional bewegen bzw. verschieben. D.h., der Magnetismus ist eine Grundvoraussetzungen, die Magnetkomposit-Zell-Komplexe örtlich zu verschieben. Dies ermöglicht die Platzierung der Magnet-Zell-Komplexe in bestimmte Körperareale bzw. Gewebe. Die Aufgabe einer gewebespezifischen Applikation wird dadurch erfüllt. Außer der dynamischen Lenkung der Komplexe mit Hilfe der magnetischen Kräfte können starke magnetische Felder, wie sie z.B. durch Elektromagnete oder Neodym-Bor-Eisen-Magnete erzeugt werden, auch dazu genutzt werden, nach einem rezeptorvermittelten oder durch direkte Applikation erfolgten Gewebe-homing durch Anlegen solcher Magnete die Komposite im Zielgewebe zu fixieren (anchoring). Für die Applikationen kommen grundsätzlich die aus der Medizin bekannten Verfahren wie z.B. intrakoronare arterielle Infusion, intravenöse Infusion, transendokardiale Injektion, transepikardiale Injektion oder transkoronare Veneninjektion zur Anwendung.
Als Magnetkolloide können ferromagnetische, ferrimagnetische oder superparamagnetische Nano- oder Mikropartikel Verwendung finden, die vorzugsweise eine Partikelgröße von 5 bis 500 nm aufweisen und über eine Magnetisierung von 30 bis 140 Am²/kg^–1 verfügen. Die zu diesem Zweck vorzugsweise verwendeten Substanzen sind z.B. Magnetit (Fe₃O₄) oder γ-Fe₂O₃ mit einer Magnetisierung von 50–95 Am²/kg^–1. Auch Eisenoxyhydroxid (FeOOH) mit einer Partikelgröße von 5–100 nm sind für die Einkapselung geeignet. Die Herstellung solcher Verbindungen ist aus dem Stand der Technik allgemein bekannt: Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, US Patente 5,898,071 , 5,512,439 , 6,072,945 .
In der Regel werden dabei Eisen(III) und Eisen(II)-Salzlösungen mit variierenden molaren Verhältnissen (2:1, 0,5:1 bis 4:1) durch Zugabe von Basen in entsprechend kolloidale Magnetdispersionen („Magnetkolloide") überführt. Weitere Substanzen, die die oben beschriebenen Eigenschaften erfüllen und damit für eine Einkapselung in die Magnetkomposite in Frage kommen, sind z.B. Ferrite der allgemeinen Formel Me_1-xZn_xFe₂O₄, worin Me Kobalt oder Nickel sein kann.
Ein weiterer, wesentlicher Aspekt bei der Herstellung der Magnetkolloide ist die Stabilisierung der Teilchen in bezug auf das durch die van-der-Waals'schen Kräfte ausgelöste Agglomerieren. Zur Umgehung dieses Phänomens werden den Magnetpartikeln oberflächenaktive Stoffe zugesetzt, die allgemein unter der Bezeichnung „Tenside", „Emulgatoren", „Stabilisatoren", „Komplexbildner", „surfactants" oder „dispersants" bekannt sind und im folgenden durchweg als „Stabilisatoren" bezeichnet werden. Sie verhindern das Absetzen der Magnetteilchen in einer wäßrigen Phase wie sie den physiologischen Bedingungen im Körper analog sind. Solche stabilisierten kolloidalen Dispersionen sind auch unter der Bezeichnung „Ferrofluide" bekannt. Sie werden heute auch kommerziell angeboten, z.B.: FerroTec Corp., USA, Advanced Magnetics, USA, Taibo Co, Japan, Liquids Research Ltd, Wales, BASF, Deutschland, Schering AG, Deutschland.
Die verwendeten Stabilisatoren sind entweder kationischer- oder anionischer Natur oder nicht-ionisch. Geeignete Verbindungen hierfür sind z.B.: Laurinsäure, Alkylarylpolyäthersulfate, Laurylsulfonat, Alkylarylpolyäthersulfonate, Phosphatester, Alkoholäthersulfate, Zitrate, Ölsäure, Alkylnaphtalensulfonate, Polystyrolsulfonsäure oder Petroliumsulfonate als anionische Substanzen, Dodecyltrimethylammoniumchlorid als kationische Tenside sowie Nonylphenoxypolyglycidol, Alkylaryloxypolyäthoxyäthanole, Nonylphenol, Polyäthylenglykole oder Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymere, als nicht-ionische Substanzen.
Zur Herstellung der Magnetkomposite, die sowohl die chemischen Funktionalitätskriterien im Hinblick auf die Stammzell-Anbindung als auch die Biokompatibilitätskriterien hinsichtlich der physiologischen Applikation erfüllen, kommen folgende Polymersysteme zur Anwendung: Poly- und Oligosaccharide, Polysaccharid-Derivate wie Stärke, Dextrine, Dextran, Agarose, Hyaluronsäure, Hydroxyäthylzellulose, Alginat weiterhin Chondroitinsulfat, Heparin, Heparansulfat, Glycosaminoglycane, Keratansulfate, Chitosan, ferner synthetische Polymere wie Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyurethane, Polyoxyäthylene, Polylactide, Polyglycolide, Polycyanacrylate, Polyhydroxyäthylmethacrylat sowie Copolymere oder Blockcopolymere dieser Substanzen. Ferner sind Proteine wie z.B. Gelatine, Casein, Collagen, Albumin, Fibrinogen oder Polyaminosäuren geeignet. Die Herstellung der nano- oder mikropartikulären Magnetkomposite geschieht in der Regel durch Zumischen der entsprechenden Polymere zu der Eisensalzlösungen. Während des anschließenden basenkatalysierten Fallprozesses werden die gebildeten magnetischen Nanopartikeln von den Polymeren adsorbiert und bilden eine feste Hülle um die Magnetpartikel. Dieser Beschichtungsprozess kann durch Beschallen mit Ultraschall unterstützt werden. Die Polymeren werden üblicherweise in einem 3 bis 10fachen molaren Überschuß in bezug auf die Eisensalze zugesetzt.
Neben den kolloidstabilisierenden Eigenschaften weisen die vorgenannten Polymere und Proteine zum einen eine hohe Biokompatibilität auf, wodurch Eliminierungsreaktionen seitens des reticulo-endothelialen Systems (RES) verzögert werden und dadurch die Bluthalbwertszeiten auf mehrere Stunden verlängert werden können, zum anderen lassen sich an die Matrix Bioliganden z.B. in Form von Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren, Lektinen, Oligosacchariden, Oligopeptiden, Proteinen, Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle oder DNA/RNA-Fragmenten chemisch binden, die eine rezeptorvermittelte Zellanbindung bzw. das Gewebe-homing fördern.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung der Magnetkomposite besteht in der Einkapselung der Magnetkolloide in Liposome oder Membranvesikel. Dabei handelt es sich um aus Phospholipiden oder oberflächenaktiven Substanzen bestehende kugelförmige Einzel- oder Doppelmembran-Vesikel, die sich im Falle der Liposome mittels eines Lösungsmittel-Verdampfungsverfahrens herstellen lassen (G. Gregoriadis, FERS Letters, Vol. 36, 292, 1973). Hierbei wird durch Verdampfen der organischen Phase – in der Regel Methylenchlorid oder Chloroform – in der 1–10 Gew-% Lipide gelöst sind, ein dünner Film erzeugt, der anschließend in einer Pufferlösung suspendiert wird. Dieser Suspensionsprozess kann wahlweise durch Behandlung mit Ultraschall oder mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (z.B. Ulta-Turrax, Fa. Janke & Kunkel) oder durch Extrusion durch einen entsprechenden Membranfilter (Porengröße zwischen 50 und 100 nm) optimiert werden. Die Einkapselung der therapierelevanten Wirksubstanzen wie beispielsweise Wachstums- oder Signalfaktoren geschieht durch die Zugabe derselben zu den jeweiligen Lipid-Puffer-Suspensionen.
Da die die Liposome konstituierenden Phospholipide, z.B. Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidyglycerin, Phosphatidylserin, Sphingomyelin (SM), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinosit, Monosialoganglioside (MG) Bestandteile der normalen Zellmembran sind, erfüllen die Liposome die für eine in vivo Applikation erforderlichen Biokompatibilitätskriterien. Bei der Herstellung dieser Liposome können die molaren Verhältnisse der Lipide untereinander als auch in bezug auf die Zusammensetzung in bestimmten Grenzen variiert werden. Beispiele für solche Zusammensetzungen sind: PC:Cholesterin:GM: 2:1:0,14; SM:GM: 1:0,07; SM:GM:Cholesterin: 2:0,13:1; SM:PC:Cholesterin: 1:1:1; PC:Cholesterin:PE: 1:1:0,2. Durch zusätzliche Pfropfung von Polyethylenglykolen (PEG) auf die Vesikelmembran können die Bluthalbwertszeiten dieser Liposome noch um den Faktor 2,5 erhöht werden. Die Konzentration der PEG substituierten Lipide liegt dabei in der Regel zwischen 3 und 15% Gew-%, vorzugsweise zwischen 4–7%, bezogen auf den Gesamtlipidgehalt. Das Verhältnis PEG zu Sialinsäure-substituierten Lipiden ist in der Regel 1:1. Die Molmasse des PEGs kann variiert werden, wobei im Hinblick auf eine Biokompatibilitätsverbesserung Molmassen von 800 bis 2000 vorzuziehen sind. Die Kopplung der PEG Spezies sowie der für das homing erforderlichen Bioliganden (anti-CD-Antikörper z.B.) an die Lipidmembran erfolgt vorzugsweise über die allgemein bekannten Carbodiimid/N-Hydroxysuccinimid- oder Glutaraldeyd-Verfahren. Die molaren Phospholipid-Verhältnisse der biokompatiblen Liposome sind z.B.: SM:PC:Cholesterin:PEG-PE: 1:1:1:0,2. Neben der PEG-Pfropfung verringert auch die Substitution mit Sphingomyelin die Phagozytose um > 80%.
Zur Einkapselung der Magnetkolloide in die Liposome wird ein Dialyseverfahren verwendet. Dazu werden die Liposome in Gegenwart eines stabilisierten Magnetkolloides gegen einen Puffer über mehrere Tage hinweg dialysiert. Hierfür kommen vorzugsweise Laurinsäurestabilisierte Kolloide zum Einsatz. Während des Dialyseprozesses werden die Stabilisatormoleküle gegen die Phospholipide ausgetauscht. Es bilden sich so in Liposome eingekapselte Magnetpartikel aus.
Über die physiologischen Vorteile hinaus, die die Liposome aufgrund ihrer ausgeprägten Biokompatibilität bieten, eröffnet die Verwendung von Liposomen als Wirkstoffträger überraschenderweise die Möglichkeit, die Freisetzung der Wirksubstanzen mit Hilfe einer Ultraschallbehandlung zu bewerkstelligen. Aufgrund der Labilität der Lipidmembran kann diese mit Hilfe einer Ultraschalleinstrahlung aufgebrochen werden. Hierfür kommen üblicherweise Frequenzen im Bereich von 0,6 bis 2,5 MHz und einer Leistung von 0,3 bis 2,5 W/cm² zum Einsatz. Aufgrund der durch die Ultraschallwellen ausgelösten Scherkräfte wird die Liposommembran aufgebrochen, so dass deren Inhalt freigesetzt wird. Die Ultraschallbehandlungen dauern in der Regel bis zu 30 Sekunden, wobei auch mehrere kürzere Intervall-Bestrahlungszeiten möglich sind. Für die erfindungsgemäßen Mittel haben sich besonders die Lipidkomponente Dioleoylphosphatidylethanolamin enthaltende kationische Liposome als geeignet erwiesen, da sie direkt an die Stammzellen binden. Der Anteil dieser Komponente in der Lipidmembran beträgt in der Regel 2–10 Mol-%.
Neben der Anwendung der Liposome konnte überraschenderweise auch gezeigt werden, daß sich auch Membranvesikel in Form magnetischer Nano- oder Mikrobläschen als Transportvehikel für die Stammzellen nutzen lassen. Grundsätzlich werden die Membranvesikel durch Beschallen von oberflächenaktiven Substanzen in Gegenwart der einzukapselnden Wirksubstanz mittels Ultraschall hergestellt. Dabei gelangen in der Regel Frequenzen im Bereich von 10–50 kHz zur Anwendung. Um die Vesikel als Transportsysteme für die Stammzellen nutzen zu können, werden vorzugsweise solche Vesikel-bildenden Substanzen verwendet, die eine positive Ladung tragen und dadurch befähigt sind, sich in effizienter Weise an die Stammzellen anzulagern. Beispiele hierfür sind Polyethylenimin, Dialkylamino-alkyl-Polysaccharid-Derivate, z.B. Dextran oder Stärke, oder Polylysin. Desweiteren sind auch solche Substanzklassen wie z.B. Albumin, heterobipolare Tenside oder Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Blockcopolymere verwendbar, die ein ausgeprägtes Vesikel-Bildungsverhalten aufweisen.
Zusätzlich zu der Beschichtung oder Einkapselung der magnetischen Nanopartikeln mit den oben genannten Polymeren eröffnen die erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise eine weitere Möglichkeit zur Einkapselung der magnetischen Kolloide in eine sphärisches Magnetkapsel. Hierfür kommen die allgemein bekannten Verfahren wie inverse Suspensionsvernetzung (suspension-crosslinking), Emulsionspolymerisation, inverse Suspensionspolymerisation, das Präzipitationsverfahren oder der Solvent-Evaporations-Prozeß aus organischer Phase zur Anwendung.
Beim Suspensionsvernetzungsverfahren wird eine wäßrige Polymerlösung, in der das magnetische Kolloid dispergiert ist, in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und anschließend mit einem geeigneten bi- oder trifunktionellen Vernetzer vernetzt. Wasserlösliche Polymere, die für dieses Verfahren vorzugsweise in Frage kommen, sind z.B. Serumalbumin, Proteoglycane, Glykoproteine, Polyvinylalkohol, Zellulose, Agarose, Dextran, Pullulan, Alginate, Hyaluronate, Stärke, Polyhydroxyäthylmethacrylat. Als organische Phase eignen sich Öle wie Paraffinöl, Pflanzenöl, Siliconöl, Baumwollsaatöl oder organische Lösungsmittel wie Xylol, Cyclohexan, Chloroform, Butanol, Heptanol, Toluol, Benzol, Essigester, Hexan, Heptan, Octan oder chlorierte Kohlenwasserstoffe sowie Mischungen derselben. Da die angestrebte computertomographische Kontrastverstärkung besonders von Teilchengrößen im Bereich von 50 bis 300 nm realisiert wird, muß der Suspensionsprozeß in diese Richtung gesteuert werden. Diese Aufgabe wird überraschenderweise durch Zugabe von 0,1 bis 10 Gew-% Tensiden bzw. oberflächenaktiven Stoffen erreicht, die der organischen Phase zugesetzt werden. Diese Stoffe sind z.B. Polyoxyäthylenaddukte, Polyoxyäthylensorbitolester, Polyäthylenpropylenoxid- Blockcopolymeren, Alkylphenoxypolyäthoxyäthanole, Fettalkoholglycoläther-Phosphorsäureester, Sorbitan-Fettsäureester, Polyoxyäthylenalkohole, Polyoxyäthylensorbitan-fettsäurester oder Polyoxyäthylensäuren angehören, zugegeben. Die Volumenverhältnisse von organischer Phase zur Polymer/Magnetkolloid-Phase variieren dabei zwischen 10:1 und 60:1, die der Polymer-Phase zur Magnetkolloid-Phase in der Regel zwischen 1:0,2 und 1:1, vorzugsweise zwischen 1:0,5 und 1:0,8, wobei das Polymer-Magnetkolloid-Verhältnis durch die jeweilige Menge des Festkörperanteiles im Kolloid bestimmt wird. Diese liegt in der Regel zwischen 5 und 30 Gew.-%. Der Magnetfestkörperanteil im Polymeren beträgt vorteilhafterweise 20 bis 60 Gew.-%. Dieser hohe Magnetkolloid-Anteil, durch den sich die erqfindungsgemäßen Mittel grundlegend von den herkömmlichen magnetischen Polymerträgern unterscheiden, wird deswegen gewählt, da die magnetischen Manipulationen der Zellen sowie die Effizienz des induktiven Aufheizens, d.h. die bei vorgegebenen Induktionsbedingungen erzielte Aufheizung bzw. Aufheizrate direkt von der Menge des Magnetanteils in den Zellen bzw. in den an den Zellen anhaftenden Magnetkompositen bestimmt wird.
Geeignete Vernetzer für die Polymermatrix sind di- und trifunktionelle Substanzen, die mit den funktionellen Gruppen der Matrix (z.B. Hydroxyl-, Carboxyl-, Aminogruppen) reagieren können. Geeignete Beispiele hierfür sind: Alkyldihalogenide, Glutaraldehyd, Di- und Triisocyanate, Divinylsulfon, Bromcyan, Triallylisocyanurat, Divinyläthylenharnstoff Epichlorhydrin, 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid, 1,4-Butandioldivinyläther, Divinylsuccinat, Divinylglutarat, Divinyladipat. Die Menge des Vernetzers, die in erster Linie durch die Feinheit des Magnetkolloids festgelegt wird, beträgt in der Regel 0,5–5 Mol%, bezogen auf den Polymeranteil. Durchweg höhere Vernetzungsgrade sind erforderlich, um im Falle sehr feiner Kolloide ein Herausdiffundieren aus der Matrix zu verhindern.
Analog zum Vernetzungsverfahren in Suspension bietet auch die inverse Suspensionspolymerisation die Möglichkeit, die Magnetkolloide in definierter Weise einzukapseln. Dazu wird ein wasserlösliches Vinylmonorner in einer mit dem Monomeren nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und anschließend unter Zugabe geeigneter Stabilisatoren radikalisch polymerisiert. Verfahren dieser Art sind dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt. Als Monomere kommen wasserlösliche Monomere wie z.B. Vinylpyrrolidon, Acrylamid, 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, Hydroxyäthylacrylat, N-Isopropylacrylamid, Acrylsäure, Methacrylsäure sowie Mischungen derselben in Frage. Die Suspensionsphasen entsprechen durchweg den bei der Suspensionsvernetzung angegebenen organischen, nicht mit Wasser mischbaren Phasen. Als Suspensionsstabilisatoren kommen in der Regel dieselben Stabilisatoren zur Anwendung wie beim vorgenannten Vernetzungsverfahren. Innerhalb dieser Verfahrenstechnik hat sich für die Einkapselung vor allem 2-Hydroxyäthymethacrylat als vorteilhaft erwiesen, da das Polymere einerseits die Voraussetzungen eines Hydrogels erfüllt, andererseits aufgrund seiner chemischen Struktur hochfunktionell ist. Für die Einkapselung mit diesem Polymeren haben sich Stabilisatoren in Form von synthetischen Polymersystemen wie z.B. Polymethylmethacrylat, Methacryloyl-Endgruppen enthaltendes Polymethylmethacrylat, Polystyrol, Polystyrolderivate oder Polybutadienderivate als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Mengenverhältnisse von Polymer zu Magnetkolloid sind analog denen im vorgenannten Vernetzungsverfahren.
Eine weitere Methode zur Einkapselung der Magnetkolloide leitet sich aus den bekannten Verfahren zur Herstellung von Polymerpartikeln mit Hilfe der Emulsionspolymerisation ab. Diese wird vorteilhafterweise, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt ist, (D. Horak et al., Biotechn. Progr. Vol. 15, 208–215, 1999) entweder durch Zugabe anionischer Tenside wie Polyacrylsäure oder Dodecylbenzolsulfonat, nicht-ionischer Tenside wie Alkylphenylpolyäthylenglykole oder Polyäthylenglykoltrimetyl-nonyläther, kombinierte Zugabe anionischer und nicht-ionischer Tenside oder aber unter emulgatorfreien Bedingungen durchgeführt, wobei letztere Verfahrensweise wahlweise in Gegenwart von Natriumchlorid erfolgen kann.
Unter Zugrundelegung dieser Verfahrenstechnik konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, daß durch Zugabe von mit lipophilen oder semi-lipophilen Tensiden stabilisierte Magnetkolloide zum Emulsionspolymerisationsansatz diese in die sich bildenden Polymerpartikel eingekapselt werden. Geeignete oberflächenaktive Substanzen sind solche, die einen HLB-Wert (Hydrophilic-Lipophilic-Balance) von 1–12 aufweisen. Beispiele hierfür sind: Polyäthylenpropylenoxid-Blockcopolymere, Alkylphenoxypolyäthoxyäthanole, Polyoxyäthylenalkohole, Polyoxyäthylen-sorbitanfettsäurester, Sorbitanfettsäureester. Folgende Reaktionsansätze haben sich als geeignet erwiesen: Monomerkonzentration 0,7–5,2 Mol/Liter, Initiatorkonzentration 1–10 mMol/Liter, Stabilisatorkonzentration 0,1–80 mMol/Liter; die Natriumchlorid Konzentration kann wahlweise bis zu 20 mMol/Liter betragen. Diese Ansätze liefern Magnetpartikel mit Partikelgrößen zwischen 300 nm und 4 μm.
Zur Herstellung der Magnetpartikel nach dem Solvent-Evaporations-Prozeß, der eine spezielle Methode innerhalb der Präzipitatonstechnologie darstellt, geht man in der Regel von einem Zweiphasensystem aus, das aus einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Polymerphase und einem wäßrigen Dispersionsmittel besteht. Dabei wird die lipophile Polymerphase, in der zunächst das Magnetkolloid dispergiert wird, unter definierten Rührbedingungen in der wäßrigen Phase suspendiert. Durch den Kontakt mit der wäßrigen Phase fällt das Polymere unter Verdampfen des Lösungsmittels in Form isolierter Partikel aus. Erfahrungsgemäß können mit Hilfe der Rührgeschwindigkeit sowie durch Zugabe von oberflächenaktiven Substanzen sowohl zur organischen- als auch zur Suspensionsphase die Partikelgrößen im Bereich von 1–250 μm variiert werden. Alternativ läßt sich die organische Polymerphase auch mit Hilfe einer Sprühvorrichtung in die hydrophile Phase eintragen. Sprühsysteme und Verfahren dieser Art sind allgemeiner Stand der Technik. Polymere, die sich für ein solches Herstellungsverfahren eignen, sind grundsätzlich solche Polymere, die in organischen Lösungsmitteln, nicht aber in wäßrigem Milieu löslich sind. Beispiele hierfür sind: Poly(lactid-co-glycolid), Polymethacrylat, Polyamide, Polyester, Polyvinyläther, Polyvinylacetale, Polyvinylketone, Polyvinylhalogenide, Polyvinylester oder Polycarbonate. Geeignete Lösungsmittel für diese Polymeren sind erfahrungsgemäß z.B.: Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Chloroform oder Aceton Eines der zentralen Anliegen der vorliegenden Erfindung ist die Anlagerung oder Inkorporation der Magnetkomposite an oder in die Stammzellen sowie das anschließende rezeptorvermittelte Gewebe-homing.
Zur Anlagerung werden Bioliganden an die Magnetkomposite kovalent gekoppelt, die sowohl die spezifische Anlagerung der Magnetkomposite an die Stammzellen als auch an die Zielzellen bzw. das Zielgewebe ermöglichen. Diese Aufgabe wird durch Ankopplung von vorzugsweise solchen Antikörpern erfüllt, die z.B. spezifisch gegen den CD34, CXCR4, CD133, C117/c-Kit, den Stammzell-Rezeptoren, gerichtet sind. Dieses komplementäre Prinzip wird schon seit geraumer Zeit auch in der Bioanalytik zur Separation dieser Zellen genutzt. Alternativ zur Kopplung des Antikörpers sind auch Antikörper-Fragmente, z.B. Fab oder F(ab)₂ in analoger Weise geeignet, diese Aufgabe zu erfüllen. Um die synergetische Wirkweise der erfindungsgemäßen Magnetkomposit-Stammzell-Komplexe zu nutzen, werden simultan mit den Stammzell-bindenden Antikörpern auch solche Rezeptor-erkennenden Bioliganden gekoppelt, die ein spezifisches Zell- bzw. Gewebe-homing vermitteln.
Bei diesen homing-vermittelnden Bioliganden handelt es sich um Biomoleküle, die in der Lage sind, sich komplementär an Strukturen (Rezeptoren) auf den Zielzellen bzw. dem Zielgewebe anzuhaften. Das sind vorzugsweise Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die gegen Zellmembran-exprimierte Moleküle (Rezeptoren z.B.) oder Tumormarker gerichtet sind und dadurch das spezifische anchoring/homing des Stammzell-Magnetkomposit-Komplexes im oder an das Zielgewebe oder die Tumorzellen ermöglichen. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch nicht einschränkende Zielstrukturen sind: c-Kit Rezeptor, Chemokin Rezeptor CXCR4, vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR1), epidermal growth factor receptor (EGFR), Selektine, Integrine, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1), very late antigen (VLA), interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM), CD44, CD133, desweiteren Tumormarker bzw. -Antigene wie tumorassoziiertes Transplantationsantigen (TATA), onkofetales Antigen, tumorspezifisches Transplantationsantigen (TSTA), tumorassoziiertes Antigen (TAA), p53-Protein, Insulin-Wachstumsfaktor-Rezeptor (IGFR-1), luteinisierender Hormon-Rezeptor (LH), human epidermal growth factor receptor (Her2), Tyrosinkinase Rezeptor (Her2/neu), 9.2.27 Proteoglycan sulfat, Tyrosinase, MAGE-1, β-catenin, MUC-1, CD20, CAMPATH-1, Lewis CA-125,, FAP-α, Melanom-Antigene (MAGE-1, MAGE-B2, DAM-6, DAM-10), Mucin (MUC1), alpha-Fetoprotein (AFP), Helicose-Antigen (HAGE), humanes Papilloma Virus (HPV-E7), Caspase-8 (CASP-8), CD3, CD10, CD28, CD30, CD25, CD64, Interleukin-2, Interleukin-9, Mamma-CA-Antigen, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), GD2-Antigen, Melanocortin-Rezeptor (MCIR), 138H11-Antigen. Die entsprechenden Antikörper können dabei wahlweise als monoklonale oder polyklonale Antikörper, als Antikörper-Fragmente (Fab, F(ab')₂), als Einzelkettenmoleküle (scFv), als „Diabodies", „Triabodies", „Minibodies" oder bispezifische Antikörper eingesetzt werden.
Im Hinblick auf ein besonders effizientes homing hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, die anti-CD34-Antikörper und die Zielzell-vermittelnden Antikörpern im Verhältnis 1:2 bis 1:5 zu koppeln.
Neben der Anwendung von Antikörpern, die vor allem gegen Tumorantigene gerichtet sind, lassen sich darüber hinaus weitere Bioliganden für ein gewebespezifische Anwendungen nutzen. Dazu zählen beispielsweise Polysaccharide in Form der Hyaluronsäure, die an CD44 Marker binden können, Glykoproteine wie Lektine, Asialoglykoproteine für eine leberspezifische Applikation, Integrine- oder Selektine-bindende Liganden für ein Angiogenese- bzw. Lymphozyten-homing.
Mit Hilfe der immobilisierten, komplementären Bioliganden lassen sich die Magnetkomposit-Stammzell-Komplexe direkt an das Zielgewebe dirigieren, so dass sich deren therapeutisches Potential direkt am Ort des pathogenen Gewebes entfalten kann. Durch diesen kombinatorischen Ansatz ist erstmals die Möglichkeit gegeben, die Stammzell-Therapie wesentlich wirksamer zu gestalten.
Die Kopplungen der verschiedenen sowohl gegen den CD34 Oberflächenmarker als auch gegen die Zielzellstrukturen gerichteten Antikörper erfolgen nach den bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Bioliganden an polymere Träger (A.S. Hoffman et al., Trans. Amer. Soc. Artif. Organs, Vol. 18, 10, 1972). Als Kopplungsmedien kommen z.B. Bromcyan, Carbodiimide, Hexamethylendiisocyanat, Tosylchlorid, Tresylchlorid, 2-Fluor-1-methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, Epichlorhydrin, N-Hydroxysuccinimid, Chlorcarbonat, Isonitril, Hydrazide, Glutaraldehyd, 1,1',-Carbonyl-diimidazol, 1,4-Butandiol-diglycidyläther in Frage. Besonders günstig sind darüber hinaus die Kopplungen der Bioliganden über Spacer-Moleküle, das sind heterobifunktionelle, reaktive Verbindungen, die sowohl mit den funktionellen Gruppen der Magnetkomposite (Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Aminogruppen) als auch mit dem Bioliganden eine chemische Bindung eingehen können. Beispiele hierfür sind: Succinimidyl-4-(N-maleiimido-methyl)-cyclohexan-1-carboxylat, 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinimidester, 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, Sulfosuccinimidyl-2-(p- azidosalicylamido)äthyl-1,3'-dithiopropionat, Succinimidyl-4-(N-maleiimido-methyl)-cyclohexan-1-carboxylat, N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinirnidester.
Neben der Rezeptor-vermittelten gewebespezifischen Applikation der Stammzellen besteht eine weitere Anwendungsform der vorliegenden Erfindung darin, die Magnetkomposite in die Stammzellen einzukapseln und sie sodann mit Hilfe eines starken Magneten in das Zielgewebe zu transportieren (trafficking). Zu diesem Zweck werden die magnetischen Nanopartikel mit solchen Polymerhüllen versehen, die die Stammzellen dazu veranlassen, sie über einen Endozytose-Mechanismus in das Zellinnere einzuschleusen. Es hat sich gezeigt, daß überraschenderweise solche Polymere oder Stabilisatoren dazu befähigt sind, eine Endozytose auszulösen, die über eine kationische Hülle verfügen. Solche positiv geladenen Polymerbeschichtungen können beispielsweise über Diethylaminoethyl-, Dimethylaminoethyl-, Trimethylaminoethyl- oder Dimethylaminopropyl-substituierte Polymere erzeugt werden. Die Einführung solcher Gruppen in die Polymermatrix geschieht nach bekannten Methoden z.B. über die Substitution von Oxiran-substituierten Polymeren mit den entsprechenden Aminoverbindungen. Diese Reaktionsweisen sind bei der Herstellung von Ionenaustauscher-Harzen dem Fachmann auf diesem Gebiet grundsätzlich bekannt. Polymere, die sich für eine solche Substitution besonders eignen sind z.B. Polyvinylalkohole und Polysaccharide sowie deren Derivate wie Dextran, Agarose oder Stärke. Eine weitere Gruppe von Polymeren, die hierzu auch geeignet sind, stellen die Chitosane und die Polyethylenimine dar, die naturgemäß kationische Gruppen tragen. Die dafür vorzugsweise auszuwählenden Molmassen liegen zwischen 5 und 100 kDa. Die bevorzugte Darstellungsweise dieser Verbindungsklasse geschieht in Analogie zur Herstellung der Magnetkolloide, wobei die Ausfällung der Eisensalze in Gegenwart der entsprechenden kationischen Polymeren durchgeführt wird. Das molare Verhältnis Polymer zu Magnetkolloide beträgt in der Regel 1:1 bis 5:1. Die Inkorporationsfähigkeit der kationischen Magnetkomposite in die Stammzellen kann in einer weiteren Anwendungsform auch dazu genutzt werden, eine verbesserte Gentransfektion herbeizuführen. Aufgrund der entgegengesetzt geladenen Zellmembran sind die kationischen Träger befähigt, die Zellmenbran zu überwinden und in das Innere der Zelle zu diffundieren. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die kationischen Magnetkomposite auch Genvektoren zu binden in der Lage sind und sich dazu eignen, die Vektoren unter Ausnutzung der magnetischen Kräfte in beschleunigter Form in das Zellinnere zu transportieren, um dort eine Gentransfektion auszulösen (magnetofection).
Dazu werden im ersten Schritt Genvektoren mit den kationischen Magnetkompositen inkubiert und anschließend mit den Zellen vorzugsweise in einer Kulturschale in Kontakt gebracht. Durch Anlegen eines starken Handmagneten oder Elektromagneten an die Unterseite der Kulturschale wird die Transfektion ausgelöst. Die magnetinduzierte Transfektion geschieht üblicherweise über einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten. Danach wird die Standardkultivierung über 2 bis 5 Stunden fortgesetzt. Für die magnetofection werden üblicherweise Magneten mit einer Magnetfeldstärke von 0,2 bis 0,8 Tesla benutzt.
Vektoren, die im Sinne einer verbesserten Stammzellen-Therapie in Frage kommen, sind entweder einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren oder Plasmide, die z.B. als Antisens bestimmte Gene regulieren oder abschalten, oder eine Zelldifferenzierung, Transdifferenzierung, Plastizität, anchoring, Signaltransduktion oder Zellproliferation herbeiführen können.
Neben dieser, die Inkorporation der Magnetkomposite in die Stammzelle fördernde Beschichtung, konnte darüber hinaus auch gezeigt werden, daß die Kopplung des HIV-Tat Peptides, einem Transkriptionsverstärker, an die Magnetkomposite eine bis zu 10fach verbesserte Aufnahme der Partikel in die Stammzellen bedingt.
Um eine besonders gute Voraussetzung für ein Magnetfeld-gesteuertes homing zu ermöglichen, müssen die Magnetkolloide mit einer möglichst hohen Konzentration in den Zellen vorliegen. Es konnte gezeigt werden, daß bei einer Teilchengröße zwischen 50 und 150 nm eine Magnetteilchenanzahl von 50–100 in der Zelle ausreicht, um eine magnetische Steuerung zu vermitteln. Die für eine lokale Manipulation erforderlichen Magnetfeldstärken liegen dabei im Bereich von 0,5 bis 2 Tesla. Diese Magnetfeldstärken können entweder mit einem Neodym-Bor-Eisen Handmagneten oder mit einem Elektromagneten erzeugt werden. Alternativ reichen auch bereits Teilchenzahlen von deutlich unter 50 aus, um ein magnetisches Ansprechverhalten zu vermitteln. Voraussetzung dafür sind eingekapselte Magnetpartikel mit einer Größe von 200 bis 800 nm.
Infolge der verzögerten Aufnahme solch großer Teilchen in die Stammzellen kann eine Elektroporationsmethode, wie sie aus der Zelltechnologie bekannt sind, verwendet werden. Dazu werden die Stammzellen in ein inhomogenes elektrisches Feld gebracht und nach Ausrichtung im Feld mit Hilfe eines Mikrosekunden Pulses verschmolzen. Im Rahmen der erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren haben sich folgende Elektroporationsparameter als vorteilhaft erwiesen: Spannung: 250–900 V, Pulslänge: 60–300 μs, Anzahl der Pulse: 1–2, Pulsintervall: bis 5 Sekunden, Zellzahl: 1 × 10⁵–10⁶. Vorzugsweise werden hierfür in Liposome eingekapselte Magnetpartikel verwendet. Geräte für die Elektroporation sind kommerziell z.B. von der Firma Bio-Rad Gene Pulser Xcell^TM erhältlich. Alternativ lassen sich auch die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden wie Nukleofektion oder Lipofektion dafür anwenden.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren besteht darin, die Magnetkomposite unter Verwendung eines äußeren hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes zu erwärmen. Diese Prinzip, das bereits seit langem zur Überwärmung (Hyperthermie) von Tumorzellen angewendet wird, um eine selektive Apoptose herbeizuführen, kann auch für eine verbesserte Anwendungen im Rahmen der Stammzell-Therapie verwendet werden.
Ausgangspunkt der Entwicklung sind thermosensitive Polymere, in die die Magnetpartikel eingekapselt werden. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch nicht einschränkende thermosensitiven Polymere sind N-Isopropylacrylamid, Hydroxypropylzellulose, Polyvinylalkohol, Agarose oder Gelatine. Unter Benutzung eines definierten Frequenzfensters (weitere Erläuterungen s. weiter unten) lassen sich nur die Magnetpartikel aufheizen, das übrige organische Gewebe wird dabei nicht miterwärmt. Infolge der induktiven Erwärmung der Polymermatrix werden physikalische Strukturveränderungen ausgelöst, die im Falle der N-Isopropylacrylamid und der Hydroxypropylcellulose zu einem deutlichen Entquellungsvorgang bzw. Schrumpf führen. Im Falle des Polyvinylalkohols, der Agarose und der Gelatine werden die Polymerkapseln dagegen weitgehend aufgelöst. Wie aus dem Stand der Technik bekannt ( WO 2005/042142 und PCT/EP03/05614 ), lassen sich beide Prinzipien dazu nutzen, durch Einkapselung von Medikamenten kontaktfrei-steuerbare Depots zu entwickeln, indem die induzierte Wärme die Freisetzung auslöst. Während die vorgenannten Verfahrensweisen sich rein auf die Applikation von Medikamenten oder Hormonen beschränken, können die thermosensitiven Träger überraschenderweise auch zur einer verbesserten Anwendungen der Stammzell-Technologie genutzt werden.
Eines der zentralen Anliegen innerhalb der Stammzell-Therapie ist neben dem homing und anchoring auch parallel dazu die Zelldifferenzierung und -proliferation. Beides sind Grundvoraussetzungen für eine erfolgreiche Anwendungen im Rahmen der Stammzelltherapie. Um diesen Erfordernissen Rechnung zu tragen, werden heute Wirkfaktoren eingesetzt, die eine Zelldifferenzierung, Zellwachstum, Myogenese oder Angiogenese bewirken. Beispiele hierfür sind der Stammzell-Faktor (SCF) oder der granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), die die Myogenese und Angiogenese in einem Infarktherd und/oder Heilung des Infarktes durch verstärkte Makrophagen-Infiltration unterstützen können.
Die erfindungsgemäßen Mittel bieten hier nun eine Möglichkeit, durch Einkapselung dieser Wirkfaktoren in die thermosensitive Matrix und durch anschließende Anwendungen des hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes diese gezielt und in dosierter Form freizusetzen. Der Aspekt der Dosierung spielt dabei eine entscheidende Rolle, da die volle Entfaltung der Wirkfaktoren konzentrationsgesteuert ist.
Zur Realisierung dieser Aufgabe werden die Magnetkolloide simultan mit den entsprechenden Wirksubstanzen in die thermosensitive Matrix eingekapselt. Um eine ausreichende Beladung der Kapseln mit den Wirksubstanzen zu gewährleisten, werden Magnetkomposite vorzugsweise mit einer Teilchengröße zwischen 300 und 900 nm eingesetzt. Durch gezielte Zudosierung der entsprechenden Mengen des betreffenden Kolloides lassen sich die magnetischen Eigenschaften und analog damit die Aufheizeigenschaften des Magnetkomposits gezielt steuern. Die Konzentrationen der Magnetkolloide im Monomeransatz betragen in der Regel 10 bis 30 Gew.-% bezogen auf die Monomerphase, wobei der Feststoffanteil des Eisenoxids im Kolloid in der Regel 5–20 Gew-% beträgt. Es werden hierfür inverse Suspensionsverfahren (Wasser-in-Öl) angewendet, die eine effiziente und rasche Einkapselung der verschiedenen Substanzen ermöglichen. Zur Herstellung der thermosensitiven Polymeren, die üblicherweise als 5–30%ige Lösungen eingesetzt werden, kommen je nach Polymerart folgende Verfahren zum Einsatz:

1. N-Isopropylacrylamid: Radikalische Polymerisation in Suspension,
2. Hydroxypropylzellulose: Vernetzung in Suspension
3. Gelatine, Agarose und Polyvinylalkohol: Suspension des gelösten Polymeren bei erhöhten Temperaturen und Verfestigung beim Abkühlen.

N-Isopropylacrylamid wird zusammen mit dem betreffenden Kolloid in einer organischen, nicht mit Wasser mischbaren Phase unter Rühren suspendiert und dabei radikalisch polymerisiert wird. Die Modalitäten für die Synthese von magnetischen Mikro- und Nanopartikeln gehen aus Patentanmeldung PCT/EP03/05614 hervor und können von Fachmann auf diesem Gebiet jeder Zeit nachvollzogen werden.
Für die Applikationen besonders im biomedizinischen Bereich hat es sich gezeigt, dass Homopolymere aus N-Isopropylacrylamid allein nicht für eine in vivo Applikation nutzbar sind. Dies hängt mit der Phasenübergangstemperatur der Poly-N-Isopropylacrylamids zusammen, die herstellungsbedingt allgemein zwischen 27 und 34°C liegt. Da diese Temperaturen bereits unterhalb der normalen Körpertemperatur liegen, bedeutet das, das die angestrebten und anwendungsrelevanten Änderungen der physikalischen Struktur im Polymergel bereits stattgefunden haben. Um diese spezifischen Eigenschaften dennoch für die in vivo Applikation nutzen zu können, werden Copolymerisationen des N-Isopropylacrylamids mit Carboxylgruppen-haltigen Comonomeren wie Acrylsäure oder Methacrylsäure vorgenommen, die die Phasenübergangstemperatur zu höheren Werten verschieben, so dass die Funktion der erfindungsgemäßen Mittel in Verbindung mit der induktiven Erwärmung in vollem Umfang genutzt werden kann. So weisen nano- und mikropartikuläre Acrylsäure- und Methacrylsäure-Copolymerisate, deren Comonomerengehalt zwischen 0,5 und 3 Mol% liegt, einen maximalen Schrumpf oberhalb von 38°C auf.
Bei der Einkapselung von Wachstums- bzw. Wirkfaktoren in die N-Isopropylacrylamid-Matrix besteht das Hauptproblem darin, die empfindlichen Wirksubstanzen, bei denen es sich durchweg um Proteine handelt, durch die Polymerisationsbedingungen nicht nachhaltig zu schädigen bzw. zu inaktivieren. Um diesem Umstand Rechnung zu tragen, hat es sich überraschenderweise als vorteilhaft erwiesen, den Wirksubstanzen strukturpräservierende Zusätze zuzugeben. Beispiele für solche Substanzen, deren Konzentration im Monomeransatz in der Regel zwischen 0,1 und 5 Gew.-% beträgt, sind: Inosit, Polyvinylalkohol, Mannit, Sorbit, Aldonit, Erythrit, Sucrose, Glycerin, Xylit, Fructose, Glucose, Galactose oder Maltose.
Nachdem die Polymerträger ihren Wirkort erreicht haben, können sie durch Anlegen eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes, das sich außerhalb des eigentlichen Wirk- bzw. Reaktionsbereiches der Polymerträger befindet, auf die entsprechenden Phasenübergangstemperaturen erwärmt werden. Durch die erzeugte Wärme wird ein Schrumpfprozess in dem Polymergel induziert, der eine rasche Freisetzung der eingekapselten Wirkstoffe aus der Matrix auslöst.
Die Zeiten, die die Wirksubstanz benötigt, um aus dem Gel herauszudiffundieren hängen grundsätzlich von der Größe des Gels, der Molmasse des Wirkstoffes, der Temperatur des Gels sowie dem Vernetzungsgrad des Trägers ab. Allgemein gilt, dass geringer vernetzte Gele (0,1 bis 1% Vernetzung) sowie Nano- und Mikropartikel eine sehr rasche Diffusion der Wirksubstanz zulassen als höher vernetzte Polymere (> 1% Vernetzung) bzw. makroskopische Gele. So können niedermolekulare Substanzen (Molmasse < 10 kDa) innerhalb einer Minute zu 80% aus einem 1% vernetzten Nanopartikel, mittlere Teilchengröße 430 nm, beim Erwärmen auf > 40°C hinausdiffundieren, während dieselben Wirksubstanzen in einem ca. 5 μm Gelpartikel dafür etwa 5 bis 10 Min. benötigen. Höhermolekulare Wirkstoffe wie z.B. Proteine benötigen unter analogen Bedingungen entsprechend längere Zeiten: > 10 Minuten. Um die Freisetzungsraten der Wirkstoffe zu verändern, bieten die erfindungsgemäßen Mittel, wie oben gezeigt, eine Reihe einstellbarer bzw. veränderbarer Parameter wie Teilchengröße, Comonomerengehalt, Art des Comonomeren, Erwärmung und/oder Vernetzungsgrad, die gewünschten Eigenschaften der Trägermedien so zu verändern, dass eine bestmögliche Anpassung an die jeweiligen Aufgaben möglich ist.
Die Synthese magnetischer Hydroxypropylzellulose-Komposite erfolgt analog den Verfahren, die aus der Patentanmeldung WO 20065/042142 hervorgehen. Dazu werden in der Regel Pflanzenöle mit einer Viskosität von 50 bis 200 cp (20°C) als kontinuierliche Phase verwendet, in der das Polymere als 1–10%ige Lösung dispergiert und während der Suspensionsprozesses mit Divinylsulfon zu festen perlförmigen Partikeln vernetzt wird.
Die Herstellung der thermosensitiven Magnetkomposite auf der Basis von Gelatine, Agarose oder Polyvinylalkohol erfolgt entsprechend den Verfahren, wie sie aus DE 3900945 hervorgehen. Hierzu werden in der Regel 1–10%ige Lösungen des betreffenden Polymeren in Wasser, DMF oder Ethylenglykol bei Temperaturen oberhalb 80°C hergestellt. Nach Abkühlung auf 40–50°C werden sodann die entsprechenden Magnetkolloide und die im Sinne der Aufgabenstellung erforderlichen Wirksubstanzen zugesetzt. Während der anschließenden Dispersion in einer Ölphase werden Polymertröpfchen gebildet, die sich bei der anschließenden Abkühlung auf Raumtemperatur zu festen sphärischen Magnetkompositen verfestigen. Die Teilchengrößen lassen sich dabei durch die Art des mechanischen Suspendierens einstellen. Durch herkömmliches Rühren unter Zuhilfenahme eines herkömmlichen KPG-Rührers können je nach Rührgeschwindigkeit (500 bis 2000 U/Min) Teilchengrößen zwischen 10 bis 100 um realisiert werden. Teilchengrößen < 10 μm lassen sich dagegen mittels eines Dispergierwerkzeuges, das nach dem "Rotor-Stator-Prinzip" arbeitet (z.B. Ultra-Turrax, IKA Werke), erzeugen. Die hierbei benötigten Rührgeschwindigkeiten liegen in der Regel oberhalb von 10.000 U/min. Die Partikelgrößen der Magnetkomposite können bei diesem Verfahren im Bereich von 500 bis 3000 nm eingestellt und dementsprechend den speziellen Applikationen angepaßt werden.
Um im Sinne der Aufgabenstellung zu einer gezielten Zellproliferation und -differenzierung zu gelangen, werden den Polymer- bzw. Monomerphasen zur Herstellung der thermosensitiven Magnetkomposite vor dem Vernetzungs- bzw. Verfestigungsprozess 0,1 bis 10 Gew-% einer oder mehrerer Wirksubstanz(en), ausgewählt aus der Gruppe der Transkriptionsfaktoren, Wachstumsfaktoren, cell-colony stimulating factors, Transformationsfaktoren, chemoattractant Proteins, Angiogenese Faktoren, Mitogene, Angiopoetine, Interleukine, Chemokine oder Stammzell-Faktoren, zugesetzt.
Der letzte Syntheseschritt zur Herstellung thermosensitiver Magnetkomposite betrifft die Kopplung der komplementären Bioliganden, die sowohl die Stammzellbindung als auch das Gewebe-homing ermöglichen. Hierfür kommen analoge Kopplungsverfahren zum Tragen, wie sie für die Polymer-Magnetkomposite zuvor beschrieben wurden. Auch die Mengenverhältnisse der verschiedenen Bioliganden in bezug auf das homing und die Stammzell-Bindung sind analog den obigen Beispielen.
Neben dem rezeptorvermittelten homing können die mit den betreffenden Wirksubstanzen beladenen Magnetkomposite auch mit Hilfe der bekannten Verabreichungsmethoden wie Injektion, Implantation, Infiltration oder Punktion an die gewünschten physiologischen Wirkorte bzw. Gewebekompartimente appliziert werden. Die gewebespezifische Applikation der Magnetpartikel kann noch dadurch verstärkt werden, dass die Teilchen mit Hilfe von Elektro- oder starken Permanentmagneten, die von außen in die Nähe des Wirkortes platziert werden, punktuell an die gewünschten Stellen dirigiert bzw. fixiert werden können (anchoring).
Die induktive Aufheizung der Magnetkomposite geschieht bisher ausschließlich über die Einkapselung herkömmlicher Eisenoxide als Heizelemente. Da die induktiv erzeugten Temperaturen im Inneren der Magnetkomposite in bezug auf die Freisetzung der verschiedenen Wirksubstanzen eine signifikante Rolle spielt, wurden über diese Substanzen hinaus auch solche magnetischen Werkstoffe verwendet, deren Curie-Temperatur im Bereich von 40 bis 100°C liegen. Hintergrund diese Ansatzes ist das Verhalten von Ferro- oder Ferrimagneten in einem Induktionsfeld. Es ist bekannt, daß sich diese Stoffe nur bis zum Curiepunkt aufheizen lassen und oberhalb dieser Temperatur schlagartig in den Paramagnetismus übergehen; Paramagneten lassen sich jedoch unter den hier gewählten Induktionsbedingungen nicht weiter aufheizen, d.h., sie oszillieren bei eingeschaltetem Feld exakt um diesen Curie-Punkt. Somit stellen diese Werkstoffe sich selbstregulierende Heizelemente dar. Der Ansatz der Temperaturregelung über Curie-Niedertemperatur-Werkstoffe wurde erstmals in den Offenlegungsschriften DE 3502998 und DE 4201461 für eine gezielte Tumorhyperthermie beschrieben.
Um dieses Prinzip der exakten Wärmeregulierung auch für die vorliegende Erfindung nutzen zu können, wurden neben den herkömmlichen Eisenoxidpartikeln auch Curie-Niedertemperatur-Werkstoffe eingesetzt. Eine Möglichkeit zu diesen Werkstoffen zu gelangen, besteht in der Herstellung von Ferriten der allgemeinen Formel Me_1-xZn_xFe₂O₄, worin Me Kobalt oder Nickel ist. Durch sukzessive Substitution des Zinks lassen sich die gewünschten Curie-Temperaturen realisieren. Geeignet für den Temperaturbereich von 43 bis 50°C sind Ferrite mit der Zusammensetzung: Co_0,4Zn_0,6Fe2O4 und Ni_0,2Zn_0,8Fe₂O₄. Weitere, die Erfindung nicht einschränkende Verbindungsklassen, die die Bedingungen einer niedrigen Curie-Temperatur erfüllen, sind Eisen/Seltenerdlegierungen mit der Zusammensetzung Fe₁₇Pr₂ und Fe17Er2.
Zur induktiven Erwärmung der vorgenannten Magnetkomposite bedarf es einer speziellen Auslegung des Magnetfeldes in bezug auf die Magnetfeldstärke sowie die Frequenz. Es werden hierfür in der Regel stromdurchflossene Spulen benutzt, die von einem Hochfrequenzgenerator gespeist werden. Solche Spulensysteme und Hochfrequenzgeneratoren sind allgemeiner Stand der Technik und werden kommerziell angeboten. Die Abmessungen der Spulen richten sich nach den jeweiligen Probengrößen; sie weisen allgemein einen Durchmesser von 5–40 cm und eine Länge von 10–30 cm auf. Die erforderliche Ausgangsleistung der HF-Generatoren liegt normalerweise zwischen 0,5 und 1,5 kW. Zum Aufheizen der Magnetproben können grundsätzlich zwei Generatoreinstellungen gewählt werden: a) hohe Frequenz im Bereich von 5–80 MHz und niedrige Magnetfeldstärke von 100–500 A/m oder b) niedrige Frequenz von 0,2–5 MHz in Verbindung mit einer hohen Magnetfeldstärke von 5000–50000 A/m. Beide Feldparameterkombinationen gewährleisten eine ausreichende Energieabsorption der Magnetpartikel innerhalb eines kurzen Applikationszeitraumes (< 5 Minuten). Da die Energieabsorption der magnetischen Kolloide und demzufolge die Aufheizung der magnetischen Polymerpartikel von verschiedenen Substanzparametern wie Kolloiddispersität, Kolloidzusammensetzung, Kolloidkonzentration sowie der Art der Wärmekapazität der Polymermatrix abhängt, müssen zur Einstellung einer konkreten Temperatur die Induktionsbedingungen an die jeweiligen Proben adaptiert werden. So absorbieren größere Magnetteilchen durchweg weniger Energie pro Masse als feinere Teilchen mit derselben Zusammensetzung. Demzufolge sind für die induktive Aufheizung grobdisperser Kolloide (> 1 μm) hohe magnetische Feldamplituden von > 8 kA/m notwendig, um eine signifikante Energieaufnahme bei einer Frequenz von < 1000 kHz zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu reichen bei feindispersen Kolloiden mit einer Partikelgröße < 300 nm bereits Feldstärken von 2–5 kA/m bei einer Frequenz von < 1000 kHz für ein effizientes Aufheizen aus.
Speziell für die Nutzung des thermosensitiven Prinzips eröffnet sich durch Einkapselung von metallischen Kolloiden überraschenderweise die Möglichkeit, die Komposite auch induktiv zu erwärmen. Hierfür kommen besonders die Kolloide der Ni- und Kupferreihe wie beispielsweise Goldkolloide in Frage, die auch aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität für den in vivo Einsatz geeignet sind. Kolloide dieser Art werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt, durchweg durch Reduktion der entsprechenden Metallsalze oder durch Metallsprühverfahren gewonnen. Metallkolloide werden darüber hinaus auch vielfältig kommerziell angeboten (Sigma, Aldrich, Fluka).
Für die Einkapselung der Metallkolloide werden diese in der Regel den Monomer- bzw. Polymermischungen vor der Suspension zugesetzt. Während des anschließenden Verfestigungs- oder Vernetzungsvorganges in der Suspension werden die Kolloide dann analog zu den Magnetkolloiden in die Polymermatrix eingekapselt. Der Metallanteil in den Polymerteilchen beträgt in der Regel zwischen 2 und 15 Gew.-%.
Aus praktischer Sicht ist es bei der Herstellung der Komposite von Vorteil, die Kolloid-Monomer/Polymer-Mischung kurzzeitig mit Hilfe eines Ultraschallfingers oder in einem Ultraschallbad zu beschallen, um eine feine Dispersion des Kolloids in dem Polymerträger zu gewährleisten. Durch die homogene Verteilung des Kolloides ist eine entsprechend bessere Wärmeverteilung in der Polymermatrix möglich, die ihrerseits eine kontinuierliche Freisetzung der eingekapselten Wirksubstanz gewährleistet.
Durch die Einkapselung vor allem von Goldkolloiden ist die Möglichkeit gegeben, die Erwärmung des Magnetkomposite nicht nur über eine hochfrequentes Magnetfeld, sondern auch über die Bestrahlung mit nahem Infrarotlicht (780–830 nm, > 25 W/cm²) zu bewerkstelligen.
Die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren werden im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
In einer Lösung, bestehend aus 24 ml p-Xylol und 48,5 ml 2-Butanol, in der 12.5 mM Celluloseacetat-butyrat (Mw 65 kDa, Fa. Sigma) gelöst sind, werden 2,4 ml eines nach Shinkai et al. (Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991) hergestellten und mit Ölsäure stabilisierten Magnetkolloids mit einer mittleren Teilchengröße von 74 nm (Lichtstreuung Malvern Mastersizer), suspendiert. Zu dieser Lösung wird eine Mischung, bestehend aus 12 ml über Stickstoff destilliertem 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, 3.8 ml Glycidylmethacrylat, 0,95 ml Äthylendimethacrylat und 0,25 g 2,2'-Azobis(iso-butyronitril) (Sigma), zugegeben. Die Mischung wird 20 Min mit Stickstoff durchspült und sodann 18 Stunden bei 70°C unter Stickstoffzuvor in einem Standard-Rührgefäß polymerisiert (Rührgeschwindigkeit: 1200 U/Min). Das anfallende Produkt wird mehrfach mit Aceton und Äthanol gewaschen unter Zuhilfenahme eines entsprechenden Zentrifugationsschrittes. Es fallen sphärische Magnetpartikel mit einer durchschnittlichen Größe von 970 nm (Malvern Mastersizer) an. Anschließend werden die Partikel in einem Gemisch aus Äthanol und Dimethylsulfoxid (DMSO) (4:2) suspendiert und 12 Stunden mit 20 ml Diethylamin bei Raumtemperatur zur Umsetzung gebracht. Das tertiäre Aminogruppen enthaltende Produkt wird mehrfach mit Athanol gewaschen und schließlich in absolutem Äthanol aufbewahrt. Sodann wird das Produkt unter Sterilbedingungen getrocknet. Zur Bindung der Magnetkomposite an mesenchymale multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC) werden 10 × 10⁶ in zwei ml Delbeccos's modifiziertem Eagle Medium suspendierte Zellen mit 1,6 mg der Magnetkomposit-Suspension für drei Stunden bei 37°C inkubiert. Ungebundene Zellen werden per magnetischer Separation mittels eines Neodym-Bor-Eisen-Magneten abgetrennt. Dabei werden 87% der Stammzellen an die Oberfläche der Magnetpartikel gebunden.
Die so gewonnenen Magnetkomposit-Zell-Komplexe können in vivo per Injektion oder Infusion appliziert werden.
Beispiel 2
Der Monomer- und Magnetkolloidansatz aus Beispiel 1 wird in einer organischen Phase, die aus 84 ml p-Xylol, in dem 0,5% eines Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Blockcopolymers (PE 6200, BASF) und 0,8% Prisorine 3700 gelöst sind, unter Rühren (1200 U/Min) und ständiger Stickstoffeinleitung (5 ml/min) suspendiert und sodann 18 Stunden bei 70°C polymerisiert. Nach Waschen mit Aceton und Äthanol gemäß Beispiel 1 fallen Partikel mit einer mittleren Teilchengröße von 670 nm an.
0,3 g des über P₂O₅ im Vakuum getrockneten Produktes werden sodann mit 2 ml über Molekularsieb getrocknetem, absolutem Dimethylsulfoxid, in dem 0,6 mMol 4-Dimethylaminopyridin und 0,3 mMol 2-Fluor-1-methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, gelöst sind, versetzt und 45 min bei Raumtemperatur aktiviert. Das Produkt wird mehrfach abwechselnd mit absolutem DMSO und absolutem Aceton gewaschen sowie zweimal mit 0,05 M Bicarbonat-Puffer, pH 9.0. 15 μg anti-CXCR4-IgG (Clon 12G5, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), gelöst in 2 ml des Waschpuffers, werden mit dem Magnetkomposit über einen Zeitraum von 6 Stunden bei 4°C inkubiert. Zur Desaktivierung wird der Träger für 3 Stunden bei 4°C in 5 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8.4, in dem 1% Glycin gelöst ist, und, nach Waschen mit 2 × destilliertem Wasser, anschließend 6 h in 4 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer/5% Glycerin/0,1% Serum Albumin, pH 7.5, inkubiert. Nach mehrfachem Waschen der Magnetpartikel mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung werden die Magnetpartikel analog Beispiel 1 mit zwei ml der mesenchymalen Progenitorzell-Suspension gemäß Beispiele 1 für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Dabei werden 56% der Progenitorzellen an den Träger gebunden. Nach entsprechender Applikation ist dieser Komplex befähigt, sich an pathogenes Gewebe, das verstärkt SDF-1α freisetzt, anzulagern. Durch Anlegen eines statischen Magneten mit einem Magnetfeld von > 0,8 Tesla an das pathogene Gewebe kann der Magnetkomposit-Zell-Komplex dort fixiert werden.
Beispiel 3
7,5 ml 10 Gew-% N-Isopropylacrylamid, 2 Gew-% Acrylamid, 0,5 Gew-% N,N'-Methylenbisacrylamid und 2,4 Gew-% Acrylsäure enthaltende wäßrige Lösung werden für 20 Min. mit Argon durchspült. Anschließend werden 2,5 ml Magnetkolloide EMG 507, (Fa. FerroTec, USA) und 0,5 ml 5 N NaOH Lösung zugesetzt. Die Mischung wird 5 Min. unter Eiskühlung in einem Ultraschallbad (60 W) beschallt. Es folgt die Zugabe von 2 ml PBS-Puffer, pH 7.2, in dem 0,1% humanes Serum Albumin (HSA), 0,5% Inosit, 0,1% Polyvinylalkohol (Mw: 24 kDa) und 80 μg VEGF (RecHuVEGF ProSpec-Tang TechnoGene Ltd. USA) gelöst sind. Nach Zugabe von 1,2 ml 35%iger Ammoniumperoxodisulfat-Lösung zu der wäßrigen Phase wird diese in 300 ml Xylol, in denen 0,8% Prosorine 3700 und 0,1% Igepal 520 gelöst sind, unter Rühren (1200 U/Min.) und Eiskühlung sowie einem kontinuierlichen Argonstrom dispergiert. Nach 20 Sek. werden 0,4 ml N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin zugefügt und die Mischung 8 Min. bei 10°C weitergerührt. Danach läßt man die Mischung für weitere 20 Min. bei 15°C abreagieren. Es erfolgt die Abtrennung der magnetischen Phase durch Aufgeben der Magnetfraktion auf eine mit Stahlwolle dichtgepackte Glassäule (Füllvolumen: ca. 5 ml; Innendurchmesser: 1,2 cm), die von einem ringförmigen Neodym-Bor-Eisen-Magneten umgeben ist. Die retendierte Fraktion wird anschließend mit insgesamt 50 ml PBS-Puffer, pH 7.2, gewaschen (Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min). Die Magnetpartikel werden zweimal mit 10 ml 0,005 M HCl gewaschen und nach Entfernung des Magneten durch Aufgabe von 5 ml 0,1 M Morpholino-ethansulfonsäure-Puffer (MES), pH 4,8, (Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/Min) von der Trennsäule eluiert. Es fallen Magnetkomposite mit einer mittleren Teilchengrößen von 560 nm an. Dem Eluat werden 285 mg N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat zugegeben; Reaktionszeit: 30 Min. bei Raumtemperatur. Nach der Aktivierung wird der Träger auf die Magnet-Trennsäule aufgegeben und mit insgesamt 10 ml Eiswasser gewaschen. Die gewaschene Magnetfraktion wird nach Wegnahme des Magneten mit 4 ml MES-Puffer, pH 5.5, eluiert und mit 2 ml bidest Wasser, in dem 25 μg anti-CD34-IgG gelöst sind, über einen Zeitraum von 12 h bei 4°C inkubiert. Es wird danach mit 20 ml PBS-Puffer/0,5% Tween 20, pH 7.2, gewaschen und die Magnetfraktion mit 5 ml 0,05 Tris/HCl-Puffer/1% Ethanolamin, pH 8.5, eluiert. Das Eluat wird für 5 Stunden in dieser Elutionslösung belassen. Nach Waschen des Trägers mit 40 ml PBS-Puffer, pH 7.2, unter Zuhilfenahme der Magnettrennsäule wird mit 4 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung eluiert und das Eluat mit 4 ml der Zell-Suspension gemäß Beispiel 1 über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Es werden 72% der Stammzellen an die Magnetkomposite gebunden. Nach Applikation des Komplexes werden durch Anlegen eines hochfrequenten Magnetfeldes (30 kA/m; 0,3 MHz, Spulendurchmesser: 35 cm, 4 Windungen) innerhalb von 4 Min. 45% des eingekapselten VEGF freigesetzt, das zur Stimulation der Angiogenese genutzt wird.
Beispiel 4
1,2 ml Magnetkolloid, das nach der Vorschrift von Shinkai et al. (Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991) hergestellt wurde, werden mit 5 ml einer wäßrigen 10 Gew-%igen Hydroxypropylcellulose Lösung versetzt und 2 Min in einem Ultraschallbad (60 W) unter Eiskühlung beschallt. Nach Zugabe von 50 μg G-CSF wird die Suspension durch Zugabe von 2,5%iger NaOH Lösung auf pH 10,5 eingestellt. Sodann werden 120 μl Divinylsulfon zugegeben. Es folgt die Suspension unter Stickstoffzufuhr in 150 ml Olivenöl (Viskosität 95 cp), in dem 0,6 Gew-% Tween 80, 0,1 Gew-% Prisorine 3800 und 1,2 Gew-% Span 85 gelöst sind, mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (Ultra-Turrax, IKA Werke, 12.000 U/Min.). Der Dispergiervorgang wird für 10 Min. unter Stickstoffeinleitung (5 ml/min) fortgesetzt. Danach läßt man die Reaktionsmischung noch weitere 30 Min. unter leichtem Rühren bei 4°C abreagieren. Das Produkt wird anschließend mit Hilfe der Magnet-Trennsäule abgetrennt und dreimal mit je 30 ml PBS-Puffer, pH 7.2, nachgewaschen. Nach der Elution mit PBS-Puffer, pH 7.2, fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 0,74 um an. Das Produkt wird über einen Zeitraum von 5 Tagen lyophilisiert. Sodann werden 3 ml über Molekularsieb getrocknetes Dimethylsulfoxid, in dem 0,6 mMol 4-Dimethylaminopyridin und 0,3 mMol 2-Fluor-1-methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, gelöst sind, zugegeben. Reaktionszeit: 45 Min bei Raumtemperatur. Das Produkt wird mehrfach abwechselnd mit absolutem Äthanol und Tetrahydrofuran und schließlich zweimal mit 0,05 M K-Phosphat-Puffer, pH 8.0, unter Zuhilfenahme der Magnet-Trennsäule gewaschen. Es wird anschließend mit 3 ml 0,05 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7.2, eluiert. Dem Eluat werden 0,5 ml desselben Puffers, in dem 35 μg anti-CXCR4-IgG gelöst sind, zugesetzt. Reaktionszeit: 12 h bei 4°C unter leichtem Schütteln. Zur Desaktivierung wird der Träger für 3 Stunden bei 4°C in 5 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8.5, in dem 1% Glycin gelöst ist, inkubiert. Nach Waschen mit bidest Wasser wird die Magnetfraktion anschließend 12 h in 4 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer/5% Glycerin/0,1% Serum Albumin, pH 7,5, aufbewahrt. Nach mehrfachem Waschen der Magnetpartikel mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung werden die Magnetpartikel gemäß Beispiel 1 mit zwei ml einer Zell-Suspension für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Es resultieren Magnetkomposit-Zell-Komplexe, die sich mittels eines Neodym-Bor-Eisen- Handmagneten (0,5 Tesla) gezielt verschieben lassen.
Durch induktive Aufheizung in einem Magnetfeld (30 kA/m; 0,3 MHz, Spulendurchmesser: 35 cm, 4 Windungen) werden über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur 63% des G-CSF freigesetzt. Das Produkt läßt sich zur Behandlung von Infarkten einsetzen.
Beispiel 5
2 ml einer 5 gew-%igen wäßrigen Gelatinelösung werden mit 50 mg Ni_0,24Zn_0,76Fe₂O₄ (Teilchengröße 30–80 nm, Tc = 75°C), das durch 24-stündiges Sintern bei 800°C einer entsprechenden molaren Mischung aus NiCl₂, ZnSO4 und FeOOH und anschließende Pulverisierung in einer Kugelmühle hergestellt wurde, versetzt und 20 Min. bei 40°C im Ultraschallbad behandelt. Der Lösung werden sodann 40 μg VEGF zugesetzt. Die Mischung wird in 35 ml 0,5 Gew-% Brij 72 und 0,3 Gew-% PE 6200 enthaltendes und auf 45°C vorgeheiztes Rapsöl (Viskosität 140 cp) eingetragen und mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (24.000 U/Min) unter Stickstoffzufuhr suspendiert. Nach 30 Sekunden wird die Mischung unter Eiskühlung abgekühlt. Die gebildeten Magnetpartikel werden per Zentrifugation von der Ölphase abgetrennt und mehrfach mit kaltem Wasser nachgewaschen. Es fallen Magnetteilchen mit einer mittleren Größe von 645 nm an. Danach werden die Magnetpartikel mehrfach mit Petroläther und schließlich fünfmal mit 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7.5, gewaschen und in 4 ml dieses Puffers suspendiert. Es werden 2 ml 1,5%ige Glutardialdehyd-Lösung zugesetzt und die Magnetpartikel über einen Zeitraum von 2 h bei Raumtemperatur aktiviert. Es folgt intensives Waschen mit Wasser und PBS-Puffer, pH 7.2, unter Zuhilfenahme der magnetischen Trennsäulentechnik gemäß Beispiel 3. Die Kopplung des anti-VEGF1(Chemicon International USA)-Antikörpers erfolgt durch Inkubation mit 2 ml 0,05 M Na-Phosphat-Puffer-Lösung, pH 7.2, die 45 μg anti-VEGF1 gelöst enthält. Das gewonnene Produkt wird mehrmals mit sterilem PBS-Puffer, pH 7.2, gewaschen. Die Anbindung der mesenchymalen multipotenten adulten Progenitorzellen an die Magnetkomposite erfolgt analog Beispiel 1. Bei der anschließenden induktiven Aufheizung in einem Magnetfeld (30 kA/m; 0,3 MHz, Spulendurchmesser: 35 cm, 4 Windungen) werden nach zehnminütiger Exposition > 80% des VEGF freigesetzt. Durch den Einsatz dieser Komposite kann ein Herzgewebe-homing sowie eine Regeneration der Herzfunktion herbeigeführt werden.
Beispiel 6
0,8 g Polyvinylalkohol, Molmasse 84 kDa, werden in 10 ml Ethylenglykol bei 140°C gelöst. Nachdem die Lösung auf 65°C heruntergekühlt ist, werden der Lösung 3 ml Ferrofluide 507 (Fa.. FerroTec, USA) zugesetzt. Es folgt eine zweiminütige Behandlung im Ultraschallbad bei 80°C. Danach läßt man die Dispersion auf 70°C herunter kühlen. Die Lösung wird sodann in 120 ml auf 70°C vorgeheiztem Rapsöl (Viskosität 140 cp), in dem 1,2 Gew-% Pluronic 6200 und 0,5 Gew-% Prisorine 3700 gelöst sind, unter Rühren (2000 U/min) für zwei Minuten suspendiert. Danach wird das Rührgefäß mit Eis auf Raumtemperatur heruntergekühlt. Nach ca. 4 Minuten fallen perlförmige Teilchen aus. Es wird 15 Minuten unter Eiskühlung weitergerührt. Danach werden 80 ml Petrolether zugefügt und die magnetische Teilchenfraktion per Zentrifugation abgetrennt. Es wird mehrfach mit Petrolether, Methanol und Eiswasser nachgewaschen. Nach Trocknung im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 634 nm an. Die gewonnenen Magnetpartikel werden sodann mit 2,5 ml Epichlorhydrin und 5 ml 3 M NaOH Lösung zwei Stunden bei 60°C umgesetzt. Danach erfolgt intensives Wachen mit Athanol und bidest Wasser unter jeweiliger Zwischenschhaltung eines Zentrifugationsschrittes. Das Produkt wird mit einer Lösung, bestehend aus 5 ml Wasser, 2 ml Äthanol und 3 ml Diäthylamin, versetzt und über einen Zeitraum von 12 h bei 30°C zur Reaktion gebracht. Es wird intensiv mit bidest Wasser nachgewaschen. Nach mehrfachem Waschen der Magnetpartikel mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung werden die Magnetkomposite analog Beispiel 1 mit einer Progenitorzell-Suspension für 30 Min. bei 37°C inkubiert; es bildet sich ein Magnetkomposit-Zell-Addukt, der sich mittels eines Handmagneten analog Beispiele 1 (0,5 Tesla) dreidimensional verschieben läßt.
Beispiel 7
30 mg Chitosan werden in 10 ml 0,8%iger Essigsäure unter Rühren aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 4 ml in Wasser suspendiertes Magnetkolloid gemäß Beispiel 1 zugegeben. Um eine homogene Dispersion zu bekommen, wird die Mischung 10 Sekunden mit einem Hochleistungsultraschallfinger (Bandelin Sonoplus UW 2200, 40% Leistung) unter Eiskühlung beschallt. Dieser Suspension werden unter starker Rühren (1500 U/Min) 4 ml 0,2%ige Na-Tripolyphosphat-Lösung zugetropft. Nach zweiminütigem Rühren werden die Magnetteilchen auf der Magnet-Trennsäule (s. Beispiel 3) aufgegeben. Man läßt die Mischung langsam (0,5 ml/Min.) durchtropfen. Nach dem Durchlauf wird fünfmal mit ca. 20 ml 30%igem Ethanol nachgewaschen. Dem schließt sich fünfmaliges Waschen mit PBS-Puffer, pH 7.2, an, gefolgt von mehrfachem Waschen mit bidest. Wasser. Die magnetische Polymerfraktion auf der Säule wird sodann nach Wegnahme des Magneten mit 10 ml bidest. Wasser eluiert. Es fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 370 nm an. Durch 2-stündiger Inkubation der so gewonnenen Teilchen mit einer Zellsuspension gemäß Beispiel 1 werden 56% der Nanokomposite in die Zelle eingekapselt.
Beispiel 8
In 34 ml bidest Wasser werden 8 g FeCl₃/6W und 4 g FeCl₂/4W gelöst und kurzeitig im Ultraschallbad behandelt. Die Lösung wird durch einen 0,4 μm Sterilfilter filtriert. Der Lösung werden sodann 17 ml 14 M NH₃ tropfenweise zugegeben. Es wird 2 Min nachgerührt. Sodann wird die magnetische Fraktion mit Hilfe eines Handmagneten gesammelt. Die Magnetfraktion wird mit 50 ml bidest Wasser versetzt und nochmal per Handmagnet abgesetzt. Dieser Vorgang wird insgesamt 6mal wiederholt. 2 ml des Präzipitats werden mit 38 mg Laurinsäure versetzt und 2 Min bei 90°C gerührt. 9 ml einer Vesikel Dispersion, die durch Ultraschallbehandlung mittels des Ultraschallfingers (s. Beispiel 7) einer Phospholipid-VEGF-Mischung bestehend aus Dimyristoylphosphatidylglycerin Na-Salz/Phosphatidylethanolamin-Polyethylengycolbiotin/VEGF (Phospholipid-Konzentration: 8,4 μM/ml; molares Verhältnis 9/1/0,5) gewonnen wurde, werden zusammen mit dem stabilisierten Magnetkolloid für 72 h bei 37°C dialysiert (Spectra/Por Dialyse Röhrchen, Spectrum medical Industries, Los Angeles, CA, Molmassen-Ausschlußgrenze 12,000–14,000). Der Dialyse-Puffer (5 mM N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonsäure, pH 7.0, TES) wird alle 5 Stunden ausgewechselt. Überschüssige Vesikel werden mittels der Stahlwolle-gefüllten Säule (s. Beispiel 3) abgetrennt. Nach der Separation wird die Magnetfraktion mehrfach mit 4 ml TES-Puffer nachgewaschen. Danach werden die Magnetliposome nach Entfernen des Magneten durch dreimalige Elution mit je 2 ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung gewonnen. Es werden Magnetvesikel mit einer mittleren Teilchengröße von 255 nm erhalten. Durch Beschallen der Vesikel mit einem 1 MHz Ultraschall-Puls über einen Zeitraum von 30 Sekunden wird die vesikuläre Struktur der Liposome aufgebrochen und > 90% des VEGFs freigesetzt.
Beispiel 9
1,54 g n-Decyltrimethylammoniumbromid und 2,28 ml 1 M NaOH werden in 400 ml einer Wasser-Methanol Lösung (75–25) gelöst. Danach werden 1,32 g Tetramethoxysilan unter starker Rühren (1000 U/min) und 1 ml Ferrofluide 507 (Fa. FerroTec) zugesetzt. Nach 15stündigem Rühren wird die Magnetfraktion mittels der Magnet-Trennsäule gemäß Beispiele 3 abgetrennt und mehrfach mit Äthanol und Wasser gewaschen. Es fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 540 nm an.
Die Magnetpartikel werden im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und anschließend mit 5,5 ml absolutem über Na-Metall absolutiertem Toluol unter Zugabe von 2,0 ml 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan für 3 h bei 105°C unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht. Es folgt mehrfaches Waschen mit Athanol und Aceton. 3 ml der Oxiranring-haltigen Produkte werden sodann mit einer Lösung bestehend aus 2 ml 2-Diethylamino-ethylamin und 3 ml Athanol über einen Zeitraum von 12 h bei Raumtemperatur zu einem tertiären Amin umgesetzt. Es folgt intensives Waschen mit Athanol und bidest Wasser unter Zuhilfenahme der Magnet-Trennsäulentechnik. Das Produkt wird mit 3 ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung eluiert. Durch 2stündige Inkubation mit einer Zell-Suspension gemäß Beispiel 1 werden die Magnetpartikel an die Membran der Stammzellen gebunden. Die so gewonnenen Produkte lassen sich mit Hilfe eines Elektromagneten (> 1 Tesla) am Ort der Applikation fixieren.
Beispiel 10
Magnetträger werden analog Beispiel 9 hergestellt. Nach dem Trocknen der Basis-Partikel werden 5 ml Wasser, das zuvor mit verdünnter HNO₃ auf pH 3.5 eingestellt wurde, und 2,0 ml 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan zugesetzt und die Mischung unter ständigem Rühren 2 h bei 105°C zur Reaktion gebracht. Danach wird mehrfach mit Äthanol, Aceton und Wasser gewaschen. Das entstandene Diolgruppen-enthaltende Produkt wird anschließend durch Zugabe von 2 ml konzentrierter Essigsäure, in der 300 mg NaJO₄ gelöst sind, 1 h bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter leichtem Rühren zu einem Aldehydgruppen-tragenden Produkt umgesetzt.
Nach mehrfachem Waschen mit Wasser werden die gewonnenen Magnetpartikel mit 3 ml 0,05 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7.2, in dem 35 μg anti-CD34-IgG gelöst sind, versetzt und der Reaktionsansatz über einen Zeitraum von 6 h bei 15°C leicht gerührt. Nach mehrfachem Waschen mit PBS-Puffer und steriler physiologischer Kochsalzlösung erhalt man Magnetkomposite, die sich vollständig and eine Zellsuspension gemäß Beispiel 1 anlagern können.
Beispiel 11
10 ml einer 1,5%igen Stärkelösung werden bei 80° mit 4 ml Magnetkolloid gemäß Beispiel 8 versetzt und 3 Min mit Ultraschall bei 50°C behandelt. Danach wird die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Teilchen werden mit Hilfe des Magnetsäulen-Trennverfahrens (s. Beispiel 3) mehrfach mit bidest Wasser gewaschen. Es entstehen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 85 nm. Das im Vakuum getrocknete Produkt wird anschließend mit 3 ml Epichlorhydrin und 5 ml 4 M NaOH für 2 h bei 55°C unter starkem Rühren umgesetzt. Dem schließt sich intensives, abwechselndes Waschen mit Wasser und Athanol an. Das Produkt wird anschließend mit 5 ml 10%iger Aminocapronsäure Lösung, die mittels verdünnter NaOH auf einen pH von 10,5 eingestellt wurde, 16 h bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach mehrfachem Waschen mit Wasser werden 2,5 ml 0,1 M MES-Puffer, pH 4.5, in dem 0,2 mM N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat und 0,4 mM N-Hydroxysuccinimid gelöst sind, zugegeben. Die Mischung wird für 30 Min. bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Durch nachfolgende Aufgabe des Reaktionsproduktes auf die mit Stahlwolle gefüllte Trennsäule (s. Beispiel 3) werden überschüssige Reaktanden entfernt. Die retendierte Magnetpartikelfraktion wird dreimal mit je 5 ml Eiswasser nachgewaschen. Nach Entfernen des Magneten erfolgt die Elution mit 3 ml 0,05 M MES-Puffer, pH 5.5. Das Eluat wird mit 1,5 ml desselben MES-Puffers, in dem 35 μg Anti-CD34-Fab-Fragment und 58 μg Folsäure gelöst sind, versetzt und über einen Zeitraum von 6 Stunden bei 4°C mit der Antikörper-Fraktion gekoppelt. Das Konjugat wird über die Stahlwolle-gefüllte Säule abgetrennt und zehnmal mit je 10 ml eiskaltem 0,05 M Na-Phosphat-Puffer/1% Inosit/0,1% Human Serum Albumin (HSA), pH 7.2, nachgewaschen. Dem schließt sich fünfmaliges Waschen mit 0,05 M Glycin-Puffer, pH 10.5, an, gefolgt von zweimaligem Waschen mit bidest Wasser. Nach Wegnahme des Handmagneten wird die Magnetfraktion mit 5 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 8.5, eluiert. Das Eluat wird mit 4 ml 1 M Glycin/Liter enthaltendem Tris-Puffer, pH 8.5, 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um restliche aktive Gruppen zu entfernen. Die Magnetfraktion wird sodann über die magnetische Säule abgetrennt und fünfmal mit 0,05 M Phosphat-Puffer/0,05% HSA, pH 7.2, nachgewaschen. Nach erfolgter Elution des Magnetpartikelfraktion mit 4 ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung werden die Magnetpartikel mit zwei ml der Zellsuspension gemäß Beispiele 1 über einen Zeitraum von zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Dabei werden 66% der Magnetpartikel an die Progenitor-Zellen gebunden, die sich mittels eines Neodym-Bor-Eisen-Magneten lokal verschieben lassen und in der Lage sind, sich an Tumorzellen spezifisch anzulagern.
Beispiel 12
5 ml des Magnetkolloides das nach der Vorschrift von Shinkai et al. (Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991) hergestellt wurde, wird mehrfach mit Wasser unter Verwendung der Stahlwolle gefüllten Trennsäule (s. Beispiel 3) gewaschen. Anschließend wird die mit 5 ml bidest Wasser eluierte Magnetfraktion 30 Min mit 10 ml 0,1 M HCl bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgt wiederum mehrfaches Waschen mit bidest Wasser bis zur Neutralität der Waschlösung. Nach Elution der Magnetfraktion mit 4 ml bidest Wasser wird das Eluat mit 2 ml einer 5%igen wäßrigen Polyethylenimin-Lösung (Fa. Aldrich, Mw 10.000) versetzt und 15 Min unter Eiskühlung in einem Ultraschallbad beschallt. Die Magnetfraktion wird anschließend auf die magnetische Trennsäule gegeben und mehrfach mit bidest Wasser nachgewaschen. Nach Elution mit 4 ml physiologischer Kochsalzlösung erhält man eine Magnetfraktion, die Teilchen mit einer Größe von 175 nm enthalten. Eine einstündige Inkubation der Magnetteilchen mit einer Zell-Suspension analog Beispiel 1 bei 37°C ergibt eine 45%ige Einlagerung der Magnetkomposite in das Zellinnere.

Claims

Multifunktionelle, Bioliganden-tragende Magnetkomposite für die Stammzell-Therapie und Gewebediagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß in Polymerteilchen, die befähigt sind, sich an Stammzellen allein oder an Stammzellen und andere Zellen zu binden, magnetische und/oder metallische Kolloide und/oder biologische Wirksubstanzen eingekapselt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Magnetkomposite verwendeten Polymere aus Gruppe der Polysaccharide, Polycyanacrylate, Polyacrylate, Polyaminosäuren, Polyaminosäure-g-Dextran, Polylactide, Polyglycolide, Polyethylenimin, Gelatine, Hyaluronsäure, Pullulane, Dextran-g-Polyethylenglykol-Alkyläther, Agarose, Pektine, Dextran, Silicagele, Polyvinylalkohol, Polyetherester, Dextran-g-Polyethylenglykol-Alkyläther, Heparin, Dextransulfate, Chitosan, Cellulose, Polyacrolein, Polyester, Collagen, Cellulosederivate, Poly-N-Isopropylacrylamid, Poly-N-substituierte Acrylamide, Poly-N-substituierte Methacrylamide, Hydroxypropylcellulose, Poly(ε-caprolactone), Alginate, Polyoxyethylene-Propylene, linearen Copolymeren, Pfropfcopolymeren oder Blockcopolymeren derselben, ausgewählt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere aus thermosensitiven Polymeren bestehen, die beim Erwärmen einen Schrumpf aufweisen oder sich auflösen.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Kolloide ferromagnetische, ferrimagnetische oder superparamagnetische oder Ferrite oder magnetische Substanzen mit einer Curie-Temperatur im Bereich von 40°C bis 100°C sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der magnetische Anteil in den Teilchen 5 bis 60 Gew-% beträgt.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die metallischen Kolloide aus der Gruppe der Ni- oder Kupferreihe ausgewählt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirksubstanzen aus der Gruppe der Effektoren, Wachstumsfaktoren, Translokationsfaktoren, Cytokine, Chemokine oder transforming growth factors ausgewählt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirksubstanzen Apoptose verstärkende oder abschwächende Substanzen sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerteilchen mit den Oberflächenrezeptoren koppelnde, reaktive Gruppen aufweisen.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die koppelnden Gruppen mit Antikörpern, Antikörper-Fragmenten (Fab, F(ab')₂), Einzelkettenmolekülen (scFv), „Diabodies", „Triabodies", „Minibodies" oder bispezifischen Antikörpern, Oligosacchariden, Blutgruppenantigenen, Oligonukleotiden, Polynukleotiden, Enzymen, Lektinen, Asialoglykoproteine, Avidin, Streptavidin, Biotin, Zellrezeptoren, Antikörpern gegen Zellrezeptoren, Zelloberflächenmarkern, Lektinen und/oder Glykoproteinen umgesetzt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die koppelnden Gruppen mit einem Antikörper oder Antikörper-Fragment, das gegen den CD34, c-Kit/CD117 oder CXCR4 Oberflächenmarker gerichtet ist, umgesetzt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die koppelnden Gruppen mit den Tat-Peptid umgesetzt sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerteilchen kationische Gruppen in Form von sekundären, tertiären oder quarternären Aminogruppen enthalten.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß an die Polymerteilchen Genvektoren, Plasmide oder Nukleinsäuren in Form von Einzel- oder Doppelsträngen gebunden sind.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerteilchen an Stammzellen, Knochenmarks-Stammzellen, pluripotente Stammzellen, embryonale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, adulte Stammzellen, nicht-hämatopoetische mesenchymale Stammzellen, embryonale Stammzellen, fetale hämatopoetische Stammzellen und fetale nicht-hämatopoetische mesenchymale Stammzellen, Hämangioblasten, Nabelschnur-Stammzellen, mesenchymale multipotente adulte Progenitor Zellen, endotheliale Progenitor-Zellen, tissue-committed progenitor cells, neurale Vorläuferzellen, myogenetische Progenitorzellen, Keratinocyten Stammzellen, epitheliale Darm- oder Haut Stammzellen, Leber-Stammzellen, hepatische Stammzellen, Lungen Stammzellen, stromale Knochenmarks Zellen und/oder pankreatische Stammzellen und/oder pathogenes Gewebe gebunden sind
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen eine Größe von 10 nm bis 5000 μm aufweisen.
Multifunktionelle Magnetkomposite, gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerteilchen mit einem bi- oder trifunktionellen Vernetzer vernetzt sind.
Verfahren zur Herstellung multifunktioneller Magnetkomposite mit eingekapselten und freisetzbaren Wirksubstanzen zur Bindung an Stammzellen und eine oder mehrere Zellarten gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetkomposite mittels Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymersiation, inverser Suspensionspolymerisation, inverser Suspensions-Vernetzung, inverser Suspensionspräzipitation, Solvent-Evaporationsverfahren, ionischer Vernetzung, Suspensionspräzipitation oder Polymeradsorption hergestellt werden.
Verfahren gemäß Ansprüchen 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass die inverse Suspensionspolymerisation, die inverse Suspensionsvernetzung, die inverse Suspensionspräzipitation oder die ionische Vernetzung in einer mit dem Polymeren oder Monomeren nicht mischbaren organischen Phase durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Phase aus Pflanzenöl oder Mineralöl mit einer Viskosität von 50 bis 200 cp oder einem mit Wasser nicht mischbaren organischem Lösungsmittel besteht.
Verfahren gemäß Ansprüchen 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetkolloide und/oder metallischen Kolloide und/oder Wirksubstanz vor der Suspension zugesetzt werden und die Polymerteilchen während des Suspensionsvorganges durch Zugabe von di- oder trifunktionellen Verhetzern verfestigt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerteilchen durch Suspension einer auf über 40°C erwärmten, Gelatine-, Agarose- oder Polyvinylalkohol-Lösung in einer organischen Phase durch Abkühlen auf Raumtemperatur gebildet werden.
Verfahren gemäß Ansprüchen 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine wäßrige Monomerlösung, in der magnetische und/oder metallische Kolloide und/oder Wirksubstanzen dispergiert sind, nach Zugabe eines multifunktionellen Verhetzer in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase unter mechanischer Zerkleinerung suspendiert wird und während des Suspensionsvorganges durch Zugabe eines Radikalinitiators zu nano- oder mikropartikulären Teilchen polymerisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Magnetkomposite N-Isopropylacrylamid, N-substituierte Acrylamide, N-substituierte Methacrylamide oder Mischungen derselben verwendet werden.
Verfahren gemäß Ansprüchen 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Monomerlösung 0,05 bis 10 Mol% Comonomere zugesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass als Comonomere Acrylatderivate, Methacrylat-Derivate, Acrylsäure, Acrolein, Methacrylsäure, Acrylamid, Vinylacetat oder Hydroxyethylacrylat oder Mischungen derselben zugesetzt werden.
Verfahren gemäß Ansprüchen 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Monomerlösung oder der Polymerlösung ferromagnetische-, superparamagnetische- oder ferrimagnetische Substanzen oder Ferrite oder magnetischen Substanzen mit einer Curie-Temperatur von 40°C bis 100°C zugesetzt werden.
Verfahren gemäß Ansprüchen 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der organischen Phase 0,05 bis 15 Gew.-% einer oder mehrerer oberflächenaktiven Substanz(en) zugesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass an das Magnetkomposit Peptide, Proteine, Antikörper, Antigene, Enzyme, Zellrezeptor-Antikörper, Antikörper gegen Tumormarker, Antikörper gegen Tumorantigene, Antikörper gegen Zellmarker (Cluster Differentiation), Antikörperfragmente, künstlich hergestellte Antikörper, abgewandelte Antikörper, Antikörperkonjugate, Oligosaccharide, Glykoproteine, Lektine, Nukleinsäuren, Streptavidin oder Biotin gekoppelt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass an das Magnetkomposit Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die gegen den CD34 Zelloberflächenmarker gerichtet sind, gekoppelt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Magnetkomposit Wirksubstanzen eingekapselt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanzen aus der Gruppe der Wachstumsfaktoren, Effektoren, Inhibitoren, Cytostatika, Antikörper, Cytokine, Enzyme, Immunmodulatoren, Antigene, Proteine, Peptide, Lektine, Glykoproteine, Nukleinsäuren, Antisense-Nukleinsäuren, Plasmide, Oligosaccharide, Antibiotika und/oder Generika ausgewählt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die eingekapselten Wirksubstanzen mittels eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes oder mittels Ultraschall freigesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld eine Amplitude von > 3000 A/m und eine Frequenz im Bereich von 0,2 bis 5 MHz hat
Verwendung der Magnetkomposite gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 als Träger für Stammzellen, die mit Hilfe magnetischer Kräfte im Rahmen einer Stammzell-Therapie in oder an pathogenes Gewebe oder Zellen gelenkt werden können und dort mit Hilfe der magnetischen Induktion oder des Ultraschalls Wirksubstanzen für die Therapie, die Proliferation der Zellen und/oder Zelldifferenzierung freisetzen.
Verwendung der Magnetkomposite gemäß einem der Anspräche 1–17 für die Behandlung von Parkinson, Alzheimer, Verbrennungen, Diabetes, Arthritis, Herzkrankheiten, Schlaganfall, Osteoarthritis, Rückenmark-Verletzungen, Nieren oder Lebererkrankungen bzw. -versagen oder Tumoren.