CN101155909A - 用于培养细胞的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将物质引入到多层细胞工厂内的方法。将物质灌注到例如连接到细胞工厂的漏斗和管道的物质转移设备内，物质转移设备将物质直接转移到布置为使其层大体上垂直延伸的细胞工厂内。本发明也涉及细胞培养系统。

Description

用于培养细胞的系统和方法

技术领域

本发明涉及将物质引入到多层细胞工厂内的方法。本发明也涉及包括多层细胞工厂的细胞培养系统。

背景技术

多层细胞工厂广泛地用作试验室细胞工作的部分。细胞工厂可从不同的供货商处获得，例如Nunc A/S，Roskilde，Denmark和CorningIncorporated Life Sciences，Acton，MA 01720，USA。可以获得不同尺寸的带有不同层数的适合于不同用途的细胞工厂(cellfactory)。例如，这些细胞工厂的10叠(十层)形式被发现是特别地有用的，因为可以以相对地少的额外工作、设备或空间来产生大量的细胞。然而，当前用于填充这些细胞工厂的标准方法具有一些问题，这导致了高的时间和劳动成本和/或导致不满意的填充和收获，这意味着比其他方式可能的低的细胞产量。

即使当前的标准方法可以被改进以用于具有不同层数的细胞工厂，但现在为简化起见仅将描述用于十层细胞工厂的基本的接种和收获过程。所给出的数字应看作合适的例子。

为将细胞接种到十层细胞工厂内，将1500ml的使用合适的介质的具有希望的每毫升细胞浓度的细胞悬浮液引入到细胞工厂内。细胞应处于完全均质的悬浮液内且大致同时均匀地进入到所有层内，以避免在不同层内的不同细胞个数。

待接种到细胞工厂内的细胞最初在组织培养烧瓶内生长。当细胞从组织培养烧瓶中被收获时，它们悬浮在合适的介质中。细胞和介质(细胞悬浮液)被转移到小瓶内。对于十层细胞工厂，一般地从组织培养烧瓶准备三瓶每瓶500ml的细胞悬浮液。三个瓶将每个大体上包含相同的细胞个数。细胞悬浮液从三个瓶转移到中间容器中，在中间容器中保持细胞悬浮液直至为接种细胞而将其引入到细胞工厂。根据一个现有技术方法，中间容器可以具有大瓶形式或根据另一个现有技术方法，具有移液管形式，这将在以下更详细描述。

为收获细胞，首先将介质从细胞工厂去除而细胞保持接附到每层的底片。然后，将200至500ml的例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的冲洗物质引入到细胞工厂以从细胞冲洗残余的介质。然后去除冲洗物质且将100至150ml的例如Accutase^TM或Trypsin的解离酶引入到细胞工厂的层且将细胞工厂在37℃下温育数分钟。当细胞已分离时，将200至400ml的介质引入到细胞工厂内以停止酶的作用。此停止酶反应的功能是以上所述使用冲洗物质从细胞冲洗残余介质的一个原因。如果不使用冲洗物质，则解离酶将不有效地工作。

存在两个目前用于接种和收获10叠细胞工厂的现有技术方法。第一个方法在附图的图1中图示。根据此第一方法，大瓶2包含待引入到多层(例如10层)细胞工厂4内的所有细胞悬浮液。细胞悬浮液经由连接到大瓶2的底部部分的管道6被引入到细胞工厂4内。夹7控制了细胞悬浮液的流动。为具有通过管道6的细胞悬浮液的有效流动，大瓶2放置在大块8上，使得当夹打开时，重力将导致细胞悬浮液从大瓶流到细胞工厂4。细胞工厂4的十层10a至10j通过通道相互连接。此现有技术方法的优点是细胞工厂4可以放置为使得层10a至10j垂直地站立，如在图1中示出。这使得层10a至10j大体上同时被填充，因为相互连接的通道将迅速地将细胞悬浮液从一个垂直站立的层扩展到下一个垂直站立的邻近的层。然而，此方法存在一些缺点。细胞必须小心处理，所以为无菌性原因，当以细胞悬浮液填充大瓶2时，它必须保持在层流空气流(LAF)台内。也因为大且重的瓶2需要块8来保持包含细胞悬浮液的大瓶，所以大瓶2相对于细胞工厂4的高度不可调整。因此，一方面大瓶2必须提升足够高，使其底部部分位于借助于重力填充细胞工厂4的满意的高度水平，且另一方面大瓶2的位置越高，则对于操作者瓶的填充越不便，操作者将不得不努力使其臂在LAF台的罩下方以能将细胞悬浮液引入到大瓶2内。即使在将大瓶2放置在块8上前填充大瓶2也是非常困难的，且对于操作者是劳累的。此外，大块8和瓶2因其庞大性可能危及LAF台内的空气流动。旋转大瓶2内的细胞悬浮液以获得均质性也是非常困难的。此方法的另一个缺点是，它要求将整个大瓶连同接附的管道6一起高压灭菌。此方法的再另一个缺点是不容易允许随后添加冲洗物质或酶。

已变得流行的第二个方法是使用移液管来将细胞悬浮液引入到细胞工厂内。虽然操作相对地小的移液管可能比大瓶更容易，但此第二方法也具有一些缺点。为以1500ml的细胞悬浮液填充十层细胞工厂要求填充和排空50ml的移液管30次或100ml的移液管15次(更大的移液管将难于操作)。这样的移液不仅费时而且耗体力。填充可能典型地需要20分钟。因为细胞工厂的工作方式，使用如此长的时间来接种细胞工厂可能导致细胞在层内非常不均匀地分布。其发生原因是为在细胞悬浮液内移液，细胞工厂必须在其背部是平的，使得填充孔向上，即垂直于图1中示出的第一方法的定向。这意味着根据第二方法向具有水平对齐的层的细胞工厂内的移液将导致细胞悬浮液直接行进到底部层且在一些时间后仅非常缓慢地开始填充其他层，使得顶部层接收如果有也很少的细胞。在移液进整个细胞悬浮液(细胞和介质)所用的时间内，细胞已经开始沉淀到底部，因此导致工厂内细胞的非均匀分层。

发明内容

本发明的目的是减轻现有技术方法的缺点。本发明的另一个目的是在多层细胞工厂内完成容易和快速的接种和收获过程。这些和其他的将在下文中变得显见的目的通过由独立权利要求限定的方法、细胞培养系统和使用来实现。

本发明基于这样的见解，即将物质更有效地处理和引入到多层细胞工厂内可以通过允许排除例如根据所描述的第一现有技术方法的大瓶，或根据所描述的第二现有技术方法的移液管的中间容器来实现。换言之，本发明允许将物质直接引入到多层细胞工厂内而不需要中间容器来保持物质直至将其输送到细胞工厂内。

本发明也基于这样的见解，即通过再引导具有垂直地站立的层的多层细胞工厂的流体连通入口接口，可以获得快速和均匀的细胞工厂的层的填充。因此，通过在细胞工厂处于垂直地站立位置时再引导多层细胞工厂的流体连通入口接口为面向上，允许将细胞悬浮液或其他物质灌注到细胞工厂内。灌注动作可以与现有技术方法相反更快速且允许更容易地操作。

根据本发明的第一方面，提供了将物质引入到多层细胞工厂内的方法。方法包括将物质转移设备连接到细胞工厂的入口、将细胞工厂布置为使得细胞工厂的层大体上垂直地延伸，其中所述的布置在将物质转移设备连接到细胞工厂的入口之前、之后或同时进行，且将物质从独立容器通过直接将物质转移到细胞工厂内的物质转移设备灌注。

因此，本发明的第一方面允许利用垂直延伸的层来均匀地填充层且将其与将物质经由物质转移设备直接灌注到细胞工厂内组合。换言之，物质可以从独立容器以连续流而不停止地输送到细胞工厂内。因此避免了现有技术的中间物质保持容器且使得能快速填充。独立容器应看作孤立容器，它不必结构上连接到细胞工厂或物质转移设备，但如果希望它可以保持为不与任何其他系统部件接触。这从操作和无菌性角度看是有利的。

独立容器可以是从其灌注物质的任何类型的器皿、烧瓶、瓶或其他装置。例如，在物质是包含待接种在细胞工厂内的细胞的细胞悬浮液的情况中，独立容器可以是小瓶，从组织培养烧瓶内将收获的细胞转移到该小瓶内，如在“背景技术”中事先描述。在物质是冲洗物质或悬浮的解离酶的情况下，独立容器可以是瓶，由供货商将溶液或悬浮液提供到该瓶内。

灌注的动作不仅允许了更快速的填充，而且也更不消耗操作者的体力。处理小瓶比处理连接到管道的笨拙的大瓶更方便。同样，不同于引入了因重复移液导致的污染的风险的耗费体力的从瓶的重复移液，从这样的瓶的单次灌注动作较不费力且可能从无菌性角度更安全。用于将细胞接种到细胞工厂内或从细胞工厂收获细胞所要求的总时间可能对总的细胞健康有影响。良好的细胞活性经常取决于尽可能快地使细胞返回到其家环境(例如潮湿的37℃温育器)。本发明使得能比以上所述的现有技术显著地更快地在工厂内处理细胞。

在本申请中，在双重的情况下，垂直地延伸层在此意味着层相互靠近站立，使得所有层具有距细胞工厂放置其上的“地面高度水平”大体上相同的距离。与垂直地延伸层相反，水平地延伸层将一个位于另一个上方且每一个具有距地面高度水平不同的距离。

如先前所提及，本发明基于再引导多层细胞工厂的流体连通入口接口的可能性的见解。这在本发明的第二方面中设想。根据本发明的第二方面，提供了用于将物质引入到具有用于接收物质的入口的多层细胞工厂的方法。方法包括将包括其自己的用于接收物质的入口的物质转移设备连接到细胞工厂的入口且直接将物质转移到细胞工厂的入口。方法也包括当物质转移设备的入口的开口面积面向与细胞工厂的入口的开口面积不同的另一个方向时，将物质灌注到物质转移设备的入口内。有利地，物质转移设备的入口可以相对于细胞工厂的入口可移动。换言之，如果物质转移设备具有连接到细胞工厂的入口的第一端部和代表了物质转移设备的入口的第二端部，则第二端部可以相对于第一端部可移动，以使得第一端部能以非零度的角度相对于第二端部布置。

应注意的是，根据此方面的方法也适合于且包括根据本发明的第一方面将物质引入到垂直地延伸的层内的构思。根据本发明的第二方面执行的物质灌注也可以适合于从如先前解释的独立的容器执行。

对于本发明的第一方面和第二方面，通过将物质转移设备合适地定尺寸可以使得物质灌注的动作更安全且更快速。因此，根据本发明的至少一个实施例，将物质灌注到具有比细胞工厂的入口更大的开口面积的物质转移设备的入口内。

对流体连通入口接口的此放大也在本发明的分开的第三方面中表达。根据本发明的此第三方面，提供了用于将物质引入到具有用于接收物质的入口的多层细胞工厂的方法，所述的入口具有第一开口面积。方法包括将包括具有大于所述的第一开口面积的第二开口面积的入口的物质转移设备连接到细胞工厂的入口，将细胞工厂布置为使得细胞工厂的层大体上垂直地延伸，其中所述的布置在将物质转移设备连接到细胞工厂的入口前、后或同时进行，和将物质经由物质转移设备的入口灌注到细胞工厂内。

具有大于细胞工厂的入口的接收入口的物质转移设备可以看作放大了开口且因此便于将物质灌注到放大的开口内的适配器。类似于先前的方面，根据第三方面的灌注从独立的容器合适地进行。

此外，为进一步便于物质的灌注，物质转移设备的尺寸不仅相对于细胞工厂入口而且相对于灌注源合适的考虑。因此，在所有以上所述的方面的范围内，根据本发明的至少一个实施例，在从独立的容器灌注的情况中，灌注物体的动作包括将物质从独立的容器的出口灌注到具有比所述的出口的开口面积更大的开口面积的物质转移设备的入口内。

合适地，所述的独立的容器是瓶，其中物质可以从瓶的顶部部分灌注出。应注意的是，从瓶的顶部部分的灌注一般地意味着从瓶颈的顶部的灌注。然而，开口可能位于独立的容器的顶部部分的其他部位。在容器的顶部部分，例如在瓶颈的顶部具有开口的优点是容器不需要提供有阀或密封件来防止包含在其内的物质流出。这可以与图1中示出的现有技术的中间大瓶相比较，在现有技术中必须打开阀以抽出物质而非根据本发明的简单的灌注。应进一步注意的是，不仅是瓶，而且具有从其可以灌注物质的顶部部分的任何其他类型的容器代表了可构想的替代。

已经发现有利的是使用漏斗来实现所述的物质转移设备的入口，其具有比细胞工厂的入口更大的开口面积。也发现有利的是，使用漏斗来实现所述的物质转移设备的入口，其具有比独立容器的出口更大的开口面积。漏斗可以实现两个关系，即它可以提供比细胞工厂的入口和独立容器的出口更大的开口面积。因此，根据对于所有以上方面可构想的本发明的至少一个实施例，物质转移设备包括漏斗或空心的且其入口开口比其出口开口更大或更宽的类似的用具，其中物质的灌注或引入的动作包括将物质灌注到漏斗内。

漏斗的出口侧合适地连接到一些类型的导管，例如可以用于将物质引导到细胞工厂的入口内的管道。为实现位置可变性且允许细胞工厂的垂直地站立的层通过细胞工厂的水平地面向的入口接收物质，导管或其至少部分合适地相对于细胞工厂的入口可移动。这允许漏斗入口大体上面向上以接收待灌注的物质。替代地，漏斗可以相对于导管可移动，例如可枢转。因此，一旦漏斗和导管已连接到入口以此使漏斗的入口获得了接口的功能，则最初由细胞工厂的入口所代表的细胞工厂的流体连通入口接口可以以多种方式从大体上水平地面向再引导为大体上垂直地面向。然而，当前考虑为有利且简单的是使用柔性和可弯曲的管道，管道在其端部的一个处连接到漏斗且在其另一个端部处连接到细胞工厂。如果要求，则连接到细胞工厂的管道的端部包括或接附到配合细胞工厂的入口的适配器。

使用柔性管道的优点，除其在实际接种和/或收获过程期间的益处外，在于管道可以折叠以在高压灭菌时仅要求小的空间。在管道和漏斗被高压灭菌前折叠的管道可以合适地连接到漏斗。

应理解的是，作为使用例如可连接到漏斗的柔性管道的分开的导管的替代，漏斗和导管可以形成为一件。在这样的情况中，漏斗和导管合适地由相同的材料制成，例如由塑料材料制成。如果漏斗和导管制成为分开的件，则它们可以由不同的材料形成，例如玻璃漏斗可连接到塑料或硅树脂导管。

从上文应清楚的是，本发明的放大的接收开口和导管的组合，其中放大的接收开口和导管的至少一个可相对于多层细胞工厂的入口移动，使得操作者能容易地将物质经由所述的放大的接收开口和导管灌注到细胞工厂内。在连接到柔性管道的漏斗的情况中，可获得另外的优点。优点在于，由于管道的柔性和紧凑性，它可以作为单元与细胞工厂包装。

从细胞工厂收获细胞比将细胞放入细胞工厂内更复杂。因此，可应用于本发明所包括的所有类型的物质转移设备的另一个优点是，容易灌注入大量的不同类型的液体而不必在罩内同时操纵大瓶。因此，在将细胞悬浮液灌注到细胞工厂内后，可以使用同一个物质转移设备来添加其他试剂而不移除它或不必向大瓶添加试剂。进一步的优点是，例如接附到管道的漏斗的物质转移设备的相对小的尺寸不危及LAF台内的空气流。

根据本发明的至少一个实施例，在物质转移设备包括漏斗的情况中，提供保持器设备用于保持漏斗。通过调整漏斗可安装到其上的保持器设备可将漏斗布置在细胞工厂的入口上方希望的高度处。保持器设备可以包括任何合适的高度可调整的机构，例如臂在其上可上下位移的垂直台。臂可以包括爪或环或其他装置以用于保持漏斗。作为使用垂直台的替代，可构想在希望的高度处将漏斗安装到LAF台的侧。高度可调整的保持器设备的使用不限制于保持漏斗，而是可以应用于本发明所包括的任何物质转移设备，因此允许控制物质转移设备的物质接收入口的高度，即垂直高度水平。

标准细胞工厂一般地包括可以相同地起作用的两个开口。如果物质转移设备被固定地保持，则它可以在整个收获过程期间保持连接到细胞工厂的开口的一个。细胞工厂的其他开口则可以用于灌注出物质而与物质转移设备连接的开口可以用于添加新的试剂。

在细胞工厂上使用一个作为入口且另一个作为出口的两个开口或连通口，使得能有效地且快速地操作整个接种和收获过程。因此，根据本发明的不限制于漏斗和管道的实施例的至少一个实施例，在将任何物质引入到细胞工厂内前，包含在细胞工厂内的材料可以通过与细胞工厂的入口分开的细胞工厂的出口去除。在此情况中，所述的材料可以例如是当接种细胞到细胞工厂内时细胞悬浮在其内的介质、用于冲洗细胞的冲洗物质、用于分离细胞的酶等。在有利的情况中，当物质转移设备柔性地连接到细胞工厂时，在物质转移设备的开口和工厂之间的连接的柔性允许去除物质而不干扰物质转移设备的开口。

现在从上文应清楚的是，根据本发明的任何方面的物质转移设备可以合适地用于将细胞接种到细胞工厂内和用于将例如冲洗溶液或解离酶的其他试剂作为从细胞工厂收获细胞的部分插入。

因此，根据本发明的至少一个实施例，物质包括用于在细胞工厂内接种细胞的细胞悬浮液。细胞悬浮液包括悬浮在介质中的细胞。商用介质的例子包括DMEM和MEM等。一般地，在细胞工厂培养哺乳动物细胞，然而也可以在细胞工厂内培养其他类型的细胞。

物质转移设备的内部体积合适地小于在细胞工厂内待接种的细胞悬浮液的总体积。因为物质转移设备不需保留任何物质而相反将物质直接通向细胞工厂内，所以这是可以的。例如组合的漏斗和管道的物质转移设备因此可以看作细胞工厂的入口的延伸。所述的小的内部体积特别地与细胞悬浮液的量有关，因为细胞悬浮液通常具有比其他可通过物质转移设备灌注到细胞工厂内的物质相当地更大的体积。然而，如果希望，则物质转移设备可以选择为使其内部体积小于在接种和收获过程中所使用的任何其他物质的体积。

如已提及，可以通过物质转移设备灌注的其他物质包括冲洗物质、解离物质和用于悬浮被接种、冲洗或分离的细胞的添加的介质，即任何涉及培养细胞的液体。因此，根据本发明的至少一个实施例，所述的物质包括例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的用于冲洗已接种到细胞工厂内的细胞的冲洗物质，或例如Accutase^TM或Trypsin的用于松开附着的细胞的解离酶，或用于供给松开的细胞且停止解离酶的任何酶作用的介质。如果希望，则在引入解离酶后，可以将细胞工厂连同细胞和解离酶在温育器内温育。合适地，在温育前，将物质转移设备从细胞工厂分离且在温育后再连接，以允许灌注入介质。物质转移设备的例如管道的端部的已分离部分合适地以非接触方式在LAF台内保持，以避免污染，因此允许再连接。在管道的情况中，管道的部分可接附，例如绑到邻近的结构，例如绑到包括在先前所描述的保持器设备内的垂直台或臂，同时保持使管道的端部不接触所述的结构或任何其他附近的结构。作为替代，可以在温育后使用另一个物质转移设备。

应注意的是，本发明的所有方面可应用于将物质引入到多层细胞工厂内。即使为简化起见将背景描述保持为十层细胞工厂，但本发明也可应用于具有其他层数的多层细胞工厂。例如，当前存在具有单层、两层、四层、十层或四十层的商用细胞工厂。本发明可应用于这些替代中的任一个，以及在此范围内或甚至超过此范围的任何将来的层数，例如五十层。

现在已根据本发明的至少三个方面描述了将物质引入到多层细胞工厂内的方法。另外，也存在涉及细胞培养系统的本发明的第四方面。因此，根据本发明的第四方面提供了细胞培养系统。系统包括具有用于接收物质的入口的多层细胞工厂。系统也包括具有可连接到细胞工厂的入口的第一端部和具有用于接收物质的入口的第二端部的物质转移设备。已接收的物质被直接转移到细胞工厂内。物质转移设备的入口具有比细胞工厂的入口更大的开口面积，且所述的第二端部可相对于所述的第一端部移动以使得所述的第一端部能相对于所述的第二端部以非零度的角度布置。

如先前所论述，物质转移设备的入口可以合适地垂直地朝向(向上)而细胞工厂的入口可以水平地朝向(侧向)。因此，当物质经由物质转移设备被引入到细胞工厂内时，所述的非零度的角度可以有利地为大约90度。然而，也可以构想其他的非零度的角度。

细胞培养系统也可以合适地包括物质可从其灌注的独立容器。细胞培养系统也可以包括高度可调整的保持器设备。独立容器、物质转移设备和保持器设备可以具有先前所描述的特征的任一个。因此，本发明的第四方面包括结合本发明的先前所描述的方面所描述的任何实施例或任何特征，只要这些实施例或特征与所述的细胞培养系统相容。

根据本发明的第五方面提供了在多层细胞工厂内培养细胞的方法。根据第五方面的方法包括将物质以与先前所描述的方面类似的方式引入，且因此应理解为包括结合本发明的先前所描述的方面所描述的任何实施例或任何特征，只要这些实施例或特征与此方法相容。根据本发明的第五方面的方法包括：

-将物质转移设备连接到细胞工厂的入口，

-将细胞工厂布置为使得细胞工厂的层大体上垂直地延伸，其中连接和布置可以以任何次序执行，

-将细胞悬浮液通过直接转移介质和细胞到细胞工厂内的物质转移设备灌注，和

-将介质合适地以保持连接到细胞工厂的入口的物质转移设备从细胞工厂灌注出。

此方法包括其中关心对介质的分析且其中不要求灌注出细胞的情况。然而，此方法也包括其中细胞悬浮在灌注出的介质中的情况。方法也包括使用任何其他物质，例如以下描述的冲洗物质或解离物质。

因此，根据第五方面的方法可以选择地也包括：

-将例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的冲洗物质经由物质转移设备灌注到细胞工厂内以冲洗层，和

-将冲洗物质从细胞工厂灌注出。

一般地，希望从细胞冲洗残余介质，然而在一些情况中这可能不是必需的，且因此以上的使用冲洗物质的步骤是选择的。

此外，根据第五方面的方法可以选择地也包括：

-将例如Accutase^TM或Trypsin的解离酶经由物质转移设备灌注到细胞工厂内以使细胞从层壁松开，

-断开物质转移设备，

-将具有细胞和解离酶的细胞工厂在温育器内温育，

-再连接物质转移设备或替代地将另一个物质转移设备连接到细胞工厂的入口，

-将介质经由物质转移设备灌注到细胞工厂内以停止酶反应和供给细胞，和

-将介质从细胞工厂灌注出，其内合适地包括有悬浮细胞。

一般地，希望以酶将细胞解离。然而，一些细胞可能不以解离酶分离且因此以上使用解离酶的步骤是选择的。

现在从上文应清楚的是，本发明使得操作者将物质经由物质转移设备直接灌注到布置为使其层垂直地站立的多层细胞工厂内，而不需要中间物质保持容器。有利的实施例是管道与漏斗的组合，然而如以上所解释，其他替代也是由本发明可构想和设想的。概括地，物质转移设备可以看作具有至少两个部分。一个部分相对于另一个部分可移动或可枢转。这允许通向垂直地站立的层的大体上水平地面向的入口被转变或延伸为物质可灌注到其内的物质转移设备的大体上面向上的入口。

考虑到管道和漏斗的组合，这合并到本发明的第六方面中。根据此第六方面提供了漏斗的使用。特别地，连接到管道的一个端部的漏斗的使用以将物质在管道的另一个端部处引入到多层细胞工厂内。本发明的第六方面包括结合本发明的先前所描述的方面所描述的任何实施例或任何特征，只要这些实施例或特征与使用连接到管道的漏斗相容。

附图说明

图1示意性地图示了根据现有技术的用于将细胞接种到多层细胞工厂内的方法。

图2和图3示意性地图示了根据本发明的至少一个实施例的细胞培养系统。

图4示意性地图示了根据本发明的至少一个实施例的其中操作者将物质引入到多层细胞工厂内的方法。

具体实施方式

在图1中图示的现有技术方法在“背景技术”中已事先论述，对此在此进行参考而不进行任何进一步论述。

参考图2和图3，图中示意性地图示了根据本发明的至少一个实施例的细胞培养系统20。细胞培养系统20包括多层细胞工厂22、在此图示为连接到管道46的漏斗44的物质转移设备42和用于保持物质转移设备42的保持器设备62。

在此图示的多层细胞工厂22具有十层24a至24j，然而也可以构想其他的层数。每层24a至24j具有由两个对置的相对地宽的板状矩形壁侧25和在所述的对置的矩形壁侧的边缘部分相互连接的四个相对地窄的条形壁侧26限定的流体接收体积。矩形几何形状仅是例子，且也可构想其他几何形状。一个或多个通道(未示出)允许层相互流体连通。

多层细胞工厂分别提供有第一流体连通口28和第二流体连通口30，它们二者可以用作入口或出口。在图示的例子中，仅第一流体连通口28用作入口。第二流体连通口30提供有塞32，塞32可去除以将第二流体连通口30用作出口。两个口28、30与所述的一个或多个通道流体连通，一个或多个通道又与层24a至24j流体连通。如在图中图示，细胞工厂22的层24a至24j垂直地站立，这意味着由所述的相对地宽的板状矩形壁侧25的每一个所限定的几何平面垂直于细胞工厂22居于其上的水平地面。在多层细胞工厂22的此位置，流体连通口28、30的开口水平面向，即它们从细胞工厂22沿平行于水平地面的线延伸。因此，通过用作入口的第一连通口28的流动的方向将大体上是到细胞工厂22内的水平流动。

物质转移设备42在此图示为连接到其内灌注物质的漏斗44的管道46，然而其他替代也是可以的。例如，作为漏斗的替代，替代的是使用具有例如U形或V形截面的鞘或滑动件，其中滑动件向下向细胞工厂倾斜或向已连接的管道倾斜，且其中物质可以灌注到U形或V形的开口内且沿滑动件经由管道或直接向下流动到细胞工厂内。另一个替代是简单地使用具有连接到细胞工厂的入口的一个端部和提供有裂缝以将管道的端部裂开且因此提供足够大的面积以接收待灌注物质的另一个端部的管道。

现在转回到图2和图3，且特别地转回到图2，其中管道的端部部分的一个提供有适配器48以将管道连接到待用作到细胞工厂22内的入口的第一连通开口28。管道46的长度应选择为使得一方面可获得有效的物质流动且另一方面当其被转动或旋转时可允许细胞工厂22的容易的操作，以保证被引入的物质到达层24a至24j的所有内壁侧(例如用于保证来自细胞悬浮液的细胞将变得接附到所有内壁侧且大体上均匀地沿所有内壁侧分布)。漏斗44连接到管道46的另一端。漏斗44在此例子中具有带从较小的端部延伸且延伸到管道内的管部分的空心锥形形式。漏斗44定尺寸且构造为捕获待灌注到其内的物质且引导物质向下到管道46内。如从图中可见，漏斗44的大的流体接收开口，即翻转的锥形形状的几何底部面向上且垂直于水平地面平面，且因此当细胞工厂22定位为使得层24a至24j垂直地站立时，也垂直于流体连通口28、30面向的方向。也可以注意的是，漏斗44的开口面积，即翻转的锥形形状的几何底部的面积相当地大于流体连通口28、30的开口面积。

漏斗44被保持器设备62保持在细胞工厂22的入口28上方的垂直高度水平处，因此使得重力能有利地影响从漏斗44经由管道46且到细胞工厂22内的物质流动。保持器设备62在此图示为包括稳定底板64的台，垂直导向杆66从底板64延伸。包括夹紧端部70的水平延伸的臂68可沿垂直导向杆66上下移动，以此夹紧端部70的垂直高度水平可调整。漏斗44由臂68的夹紧端部70保持，以此漏斗44相对于细胞工厂22的入口28的高度可调整。

图3图示了如何将管道46合适地接附到保持器设备62而无污染待再连接到细胞工厂22的管道端部的风险，例如在细胞工厂22及其内含物已温育后。在此图中图示了管道46已绑到臂68的部分72，部分72位于导向杆66的与夹紧端部70侧对置的另一个侧上。注意到管道46的接附点略微从管道端部分开，以允许管道端部无任何接触直至它再连接到细胞工厂22。

图4示意性地图示了根据本发明的至少一个实施例的其中操作者将物质引入到多层细胞工厂22内的方法。在图2和图3中图示的细胞培养系统现在放置在标准LAF台80内。为设置细胞培养系统可能需要大约五分钟，且将例如1500ml的细胞悬浮液经由漏斗44和管道46灌注到细胞工厂22内也可能需要大约五分钟。这可以与典型地需要至少20分钟来将相同的量引入到细胞工厂22的现有技术方法相比较。如在图中示出，操作者可以容易地将其臂插入到LAF台80的罩82下方，以将物质从独立的瓶84灌注到漏斗44内。取决于待引入到细胞工厂22内的物质的体积，可以使用不同个数的瓶。例如，当最初从常规的组织培养烧瓶收获细胞时，常规的是将1500ml的细胞悬浮液合适地分为三瓶。当操作者将第一瓶排空时，他或她容易地取到下一瓶且将其内含物向下灌注到漏斗内，等等。对于冲洗或解离物质，通常使用单一的瓶等则足矣。应注意的是，漏斗可以比待灌注到细胞工厂内的物质的体积相当地小。这是因为漏斗仅用于捕获且引导被灌注的物质而非包含它。因此，漏斗可以放置在赋予有效流动的高度处且这对于操作者灌注仍是方便的，尽管LAF台的屏蔽罩。

从上文应清楚的是，本发明提供了将物质向多层细胞工厂内的快速引入，这导致了物质在所有层上的有效和均匀的分布。在接种细胞时这是特别地有利的，因为细胞应优选地均匀地接附且分布在所有层内。也应清楚的是，整个过程是方便的，因为同一个物质转移设备可以用于所有待引入到多层细胞工厂内的物质。实际上，物质转移设备可以保持连接到细胞工厂，同时将物质从细胞工厂去除以允许随后将新的物质引入而无任何宝贵的时间的损失。

Claims (31)

1.一种将物质引入到多层细胞工厂内的方法，其包括：

将物质转移设备连接到细胞工厂的入口，

将细胞工厂布置为使得细胞工厂的层大体上垂直地延伸，其中所述的布置在将物质转移设备连接到细胞工厂的入口前、后或同时进行，以及

将物质从独立容器经由直接将物质转移到细胞工厂内的物质转移设备灌注到细胞工厂内。

2.一种将物质引入到具有用于接收物质的入口的多层细胞工厂内的方法，其包括：

将物质转移设备连接到细胞工厂的入口，物质转移设备包括其自己的入口，用于接收物质，且直接将物质转移到细胞工厂的入口，和

当物质转移设备的入口的开口区面向与细胞工厂的入口的开口区不同的另一个方向时，将物质灌注到物质转移设备的入口内。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中灌注物质的动作包括将物质灌注到具有比细胞工厂的入口更大的开口面积的物质转移设备的入口内。

4.一种将物质引入到具有用于接收物质的入口的多层细胞工厂内的方法，所述的入口具有第一开口面积，该方法包括：

将包括具有大于所述的第一开口面积的第二开口面积的入口的物质转移设备连接到细胞工厂的入口，

将细胞工厂布置为使得细胞工厂的层大体上垂直地延伸，其中所述的布置在将物质转移设备连接到细胞工厂的入口前、后或同时进行，和

将物质经由物质转移设备的入口灌注到细胞工厂内。

5.根据权利要求2或4所述的方法，其中灌注物质的动作包括将物质从独立容器灌注到直接将物质转移到细胞工厂内的物质转移设备内。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中从独立容器灌注物质的动作包括将物质从独立容器的出口灌注到具有比所述的出口的开口面积更大的开口面积的物质转移设备的入口内。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的独立容器是瓶，其中从独立容器的出口灌注物质的动作包括将物质从瓶的顶部部分灌注出。

8.根据权利要求1至7的任一项所述的方法，其中所述的物质转移设备包括漏斗，其中灌注或引入物质的动作包括将物质灌注到漏斗内。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的物质转移设备包括在其端部的一个处连接到漏斗的管道，其中连接物质转移设备的动作包括将管道的另一个端部连接到细胞工厂的入口。

10.根据权利要求8或9所述的方法，包括调整用于在细胞工厂的入口上方的选择的高度处保持漏斗的保持器设备，且将漏斗安装到保持器设备，使得漏斗位于选择的高度处，其中调整和安装的动作可以以任何次序进行。

11.根据权利要求1至10的任一项所述的方法，其中所述的物质包括用于在细胞工厂内接种细胞的细胞悬浮液。

12.根据权利要求11所述的方法，其中物质转移设备的内部体积小于在细胞工厂内待接种的细胞悬浮液的总体积。

13.根据权利要求1至10的任一项所述的方法，其中所述的物质包括例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的冲洗物质，以用于冲洗已接种在细胞工厂内的细胞。

14.根据权利要求1至10的任一项所述的方法，其中所述的物质包括例如Accutase^TM或Trypsin的解离酶，以用于使已接种的细胞从层壁松开。

15.根据权利要求13或14所述的方法，包括在将所述的物质引入到细胞工厂前，通过与细胞工厂的入口分开的细胞工厂的出口去除包含在细胞工厂内的其他材料。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的物质转移设备在去除所述的其他材料的动作期间保持连接到细胞工厂的入口。

17.一种细胞培养系统，其包括：

具有用于接收物质的入口的多层细胞工厂，和

物质转移设备，具有：

可连接到细胞工厂的入口的第一端部，和

具有用于接收物质的入口的第二端部，以此将接收到的物质直接转移到细胞工厂内，

其中物质转移设备的入口具有比细胞工厂的入口大的开口面积，且其中所述的第二端部可相对于所述的第一端部移动，以使得所述的第一端部能相对于所述的第二端部以非零度的角度布置。

18.根据权利要求17所述的系统，其中所述的物质转移设备包括漏斗，其中物质转移设备的入口为漏斗的较宽开口。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述的物质转移设备包括在其端部的一个处可连接到漏斗的管道，其中管道的另一个端部是可连接到细胞工厂的入口所述的第一端部。

20.根据权利要求18或19所述的系统，包括高度可调整的保持器设备，以将漏斗保持在细胞工厂的入口上方的选择的高度处。

21.根据权利要求17至20的任一项所述的系统，包括具有出口的独立容器，物质可从出口灌注到物质转移设备内以直接转移到细胞工厂内。

22.根据权利要求21所述的系统，其中物质转移设备的入口具有比独立容器的所述的出口的开口面积更大的开口面积。

23.根据权利要求22所述的系统，其中所述的独立容器是瓶，且其中独立容器的出口位于瓶的顶部部分处。

24.根据权利要求17至23的任一项所述的系统，其中所述的细胞工厂包括与细胞工厂的入口分开的出口，以使得在物质转移设备连接到细胞工厂的入口时能从细胞工厂移除物质。

25.一种在多层细胞工厂内培养细胞的方法，其包括：

将物质转移设备连接到细胞工厂的入口，

将细胞工厂布置为使得细胞工厂的层大体上垂直地延伸，其中连接和布置可以以任何次序执行，

将细胞悬浮液通过直接转移介质和细胞到细胞工厂内的物质转移设备灌注，和

将介质从细胞工厂灌注出。

26.根据权利要求25所述的方法，包括：

将例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的冲洗物质经由物质转移设备灌注到细胞工厂内以冲洗层，和

将冲洗物质从细胞工厂灌注出。

27.根据权利要求25或26所述的方法，包括：

将例如Accutase^TM或Trypsin的解离酶经由物质转移设备灌注到细胞工厂内以使细胞从层壁松开，

断开物质转移设备，

将具有细胞和解离酶的细胞工厂在温育器内温育，

再连接物质转移设备或替代地将另一个物质转移设备连接到细胞工厂的入口，

将介质经由物质转移设备灌注到细胞工厂内，以停止酶反应和供给细胞，和

将介质从细胞工厂灌注出，其内合适地包括有悬浮细胞。

28.根据权利要求25至27的任何一项所述的方法，其中在将冲洗物质或介质从细胞工厂灌注出的动作期间，所述的物质转移设备保持连接到细胞工厂的入口。

29.连接到管道的一个端部用于在管道的另一个端部处将物质引入到多层细胞工厂内的漏斗的使用。

30.根据权利要求29所述的使用，包括进行在根据权利要求1至16或25至28中的任一项所述的方法内限定的动作。

31.根据权利要求29所述的使用，其中所述的漏斗、管道和多层细胞工厂形成了根据权利要求17至24的任一项所述的细胞培养系统的部分。

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