CN101151273A - Ac－PHSCN－NH2的酸加成盐 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了Ac－PHSCN－NH2的酸加成盐，制备Ac－PHSCN－NH2的酸加成盐的方法，Ac－PHSCN－NH2的酸加成盐的药物组合物，利用Ac－PHSCN－NH2的酸加成盐及其药物组合物来治疗与血管生成和异常血管化相关的疾病的方法，以及通过盐形式来预防Ac－PHSCN－NH2降解的方法。

Description

Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐
本申请要求于2005年2月1日提交的美国临时申请第60/649,308号的优先权，本文以参考的方式将其整体引入。
1.发明领域
本发明总体上涉及抗血管生成肽Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐，制备Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的方法，含有Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的药物组合物，利用Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐及其药物组合物治疗与血管生成和异常血管化相关的疾病的方法，以及通过盐的形成来防止Ac-PHSCN-NH2的降解的方法。
2.发明背景
大多数形式的癌症源自实体肿瘤(Shockley等，Ann.N.Y.Acad.Sci.1991，617：367-382)，已经证实其在临床上对诸如利用单克隆抗体和免疫毒素的治疗有抗药性。根据对实体瘤的持续生长需要血管生成(即，新血管形成)的认识，开发了用于癌症的抗血管生成疗法(Folkman，Ann.Surg.1972，175：409-416；Folkman，Mol.Med.1995，1(2)：120-122；Folkman，Breast Cancer Res.Treat.1995，36(2)：109-118；Hanahan等，Cell 1996，86(3)：353-364)。在动物模型中已经证实了抗血管疗法的有效性(Millauer等，CancerRes.1996，56：1615-1620；Borgstrom等，Prostrate 1998，35：1-10；Benjamin等，J.Clin.Invest.1999，103：159-165；Merajver等，Proceedingsof Special AACR Conference on Angiogenesis and Cancer 1998，Abstract#B-11，January 22-24)。在缺乏血管生成时，实体瘤的内细胞层得不到充分的滋养。另外，血管生成(即异常血管化)与无数的其它疾病(例如，眼部的新生血管疾病、视网膜黄斑退化、类风湿关节炎等等)有关。
相反，正常组织不需要血管生成，除非在特定的环境下(例如，损伤修复、月经周期中的子宫内膜增生)。因此，肿瘤细胞与正常组织对血管生成的需求明显不同。重要的是，与正常细胞相比，肿瘤细胞对血管生成的依赖性在数量上高于正常组织与肿瘤细胞在细胞复制和细胞死亡方面的差异，这常被应用于癌症的治疗中。
在缺氧条件下的肿瘤细胞中，血管生成可由结合到局部脉管系统中的内皮细胞上的特定受体上的细胞因子，如血管内皮细胞生长因子和/或成纤维细胞生长因子启动。活化的内皮细胞分泌重塑相关组织基质和调节诸如整合素的粘附因子的酶。基质降解后，内皮细胞增殖并向着缺氧的肿瘤迁移，这导致新的血管的产生和成熟。
Ac-PHSCN-NH2为一种有效抑制血管生成的肽(Livant的美国专利第6,001,965号；Livant的美国专利第6,472,369号)。但是，在Ac-PHSCN-NH2溶解在溶液中或作为固体储存时会二聚化而产生失活的形式，这是一个明显的问题。因此，亟需防止Ac-PHSCN-NH2在液相和固相条件下降解的方法。
3.发明概述
本发明通过提供Ac-PHSCN-NH2(SEQ ID NO.1)的酸加成盐，制备Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的方法，含有Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的药物组合物，利用Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐及其药物组合物治疗与血管生成和异常血管化相关的疾病的方法，以及通过盐的形成来防止Ac-PHSCN-NH2的降解的方法满足了这些和其它需求。
第一方面，提供了抗血管生成肽Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐。在某些实施方案中，所述酸选自盐酸、甲磺酸、乙酸、乙醇酸、硫酸、(+)樟脑磺酸、苦杏仁酸、水杨酸、琥珀酸、氢溴酸、硝酸和磷酸。在优选的实施方案中，所述酸为盐酸。在特定的实施方案中，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐被纯化。在另一些实施方案中，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐被冻干。
本发明还提供了Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐溶液，在23-25℃600小时后，其单体高于约85％。在一个实施方案中，在23-25℃超过800小时后，所述酸加成盐溶液是纯的，例如，高于99％纯度。
第二方面，提供了包含抗血管生成肽Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的药物组合物。所述药物组合物通常包含Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐和药学上可接受的媒介物，该药学上可接受的媒介物包括稀释剂、载体或赋形剂。在其它的因素之中，稀释剂、载体或赋形剂的选择依赖于所期望的给药方式。
第三方面，本发明提供了治疗或预防疾病或病症的方法，所述疾病或病症以异常的血管化或异常的血管生成为特征。该方法通常涉及对需要这种治疗或预防的患者给予治疗有效剂量的可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2的盐。所述方法可进一步包括给予有效剂量的非Ac-PHSCN-NH2酸加成盐的抗血管生成剂。在某些实施方案中，欲治疗的所述疾病或病症为癌症，例如乳腺癌、肾癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、软骨肉瘤或血管肉瘤。在另一实施方案中，欲治疗的所述疾病为克隆氏病。
第四方面，本发明提供了包含容器的试剂盒，该容器含有Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐。在一个实施方案中，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐为冻干的。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括含有无菌水溶液的容器。在其它的实施方案中，所述试剂盒包括含有不是Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的抗血管生成剂的容器。所述试剂盒还可包括注射器和/或说明书。
4.附图的简要说明
图1为Ac-PHSCN-NH2的盐酸盐的合成示意图
图2所示为Ac-PHSCN-NH2的游离碱和Ac-PHSCN-NH2的盐酸盐的的单体与二聚体的浓度以时间为函数的溶液相比较图。
图3所示为Ac-PHSCN-NH2的游离碱和Ac-PHSCN-NH2的盐酸盐的单体与二聚体的浓度以时间为函数的固相比较图。
图4所示为Ac-PHSCN-NH2的游离碱、Ac-PHSCN-NH2的甲磺酸盐和Ac-PHSCN-NH2的硝酸盐的单体与二聚体的浓度以时间为函数的溶液相比较图。
图5所示为Ac-PHSCN-NH2的游离碱、Ac-PHSCN-NH2的甲磺酸盐和Ac-PHSCN-NH2的硝酸盐的单体与二聚体的浓度以时间为函数的固相比较图。
5.发明的详细描述
现参考本发明的实施方案进行详细说明。当本发明用这些实施方案进行描述时，应理解，并不意欲将本发明限定到这些实施方案。相反，应涵盖替换、改变和等价物，只要其包含在所附述权利要求所定义的本发明的精神和范围内
5.1Ac-PHSCN-NH 2 的盐
现发现，Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐形式可显著地防止该肽的降解。据此，本发明提供了Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐、制备Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的方法、包含Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的药物组合物、利用Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐及其药物组合物治疗血管生成和异常血管化相关疾病的方法以及通过盐形式来防止Ac-PHSCN-NH2降解的方法。
所形成的肽优选为纯的或基本纯的，且理想地基本为均质的(即，不含污染的肽或蛋白等等)。“基本纯的”指这样的肽制剂，其中所述肽占该制剂总重量的至少90％重量，优选至少为95％重量。“基本上均质的”制剂指基于所述制剂中的肽的总重量，含有至少99％重量的所述肽的肽制剂。
Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐可用有机和无机酸形成。示例性的有机酸通常包括羧酸和磺酸，例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、乙醇酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、3-(4-羟苄基)安息香酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、2-乙烷-二磺酸、2-羟乙烷磺酸、苯磺酸、反丁烯二酸、草酸、乳酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-八-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、t-丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸和己二烯二酸。本领域所属技术人员公知其它的有机酸。在某些实施方案中，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐由甲磺酸、乙酸、乙醇酸、(+)樟脑磺酸、苦杏仁酸、水杨酸、琥珀酸、或上述的组合形成。
示例性的无机酸包括氢氟酸、高氯酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氯酸、硫氰酸、次磷酸(hypophosphorus acid)、亚硝酸、氰酸、铬酸、亚硫酸、亚磷酸或叠氮酸。本领域所属技术人员公知其它的无机酸。在一些实施方案中，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐由氢溴酸、硝酸、盐酸、磷酸或上述的组合形成。在其它的实施方案中，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐由盐酸形成。
通常，Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐可通过任何本领域所属技术人员公知的常规的方法来制备。这些方法包括利用气态酸来饱和Ac-PHSCN-NH2的溶液，在Ac-PHSCN-NH2溶液中加入酸溶液等等。在一些实施方案中，通过向溶解在蒸馏水中的Ac-PHSCN-NH2溶液加入略超过1当量(例如，1.05当量)的酸来制备Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐。该酸加成盐通常以固体的形式从水性混合物中分离。
在固相和溶液相中Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐比游离碱要稳定得多。无意受任何理论的限制，认为该酸加成盐能够防止由半胱氨酸介导的Ac-PHSCN-NH2的氧化二聚化作用。防止Ac-PHSCN-NH2降解的酸加成盐由例如甲磺酸、乙酸、乙二酸、硫酸、(+)樟脑磺酸、苦杏仁酸、水杨酸、琥珀酸、氢溴酸、硝酸和磷酸来制备，在一些实施方案中，所述酸加成盐由盐酸来制备。
在溶液相和固相中，Ac-PHSCN-NH2游离碱和Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐(例如HCl)的稳定性差异是十分显著的。在一些实施方案中，在室温超过500小时后，所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的单体高于约85％。相反，在相同的时间内，Ac-PHSCN-NH2的游离碱已完全转变为其它的产物(例如二聚体)。在固相中类似，在例如23-25℃的室温超过800小时后，Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐(例如HCl)纯度超过约99％，而在相同的时间后，游离碱的纯度仅高于约82％。
5.2分析
本领域所属技术人员应理解，本文所描述的用于检测Ac-PHSCN-NH2盐的抗血管生成活性的体外和体内分析仅是示例性的，而不是全部，而且可以利用的变化同样对本领域所属技术人员是显而易见的。
5.2.1内皮细胞迁移的分析
为了进行内皮细胞(EC)的迁移检测，通过向每个通透小室(transwells)中加入200μL的胶原溶液而用I型胶原(50μg/mL)包被通透小室，随后在37℃过夜孵育。将该通透小室装配在24孔板中，并将化学吸引剂(chemoattractant)(例如，成纤维细胞生长因子-2[FGF-2])加入到底舱中的总体积为0.8mL的培养液中。将已利用胰蛋白酶从单层培养物中分离的EC，如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用无血清培养液稀释至约106细胞/mL的终浓度，并且将0.2mL的该细胞悬浮物加到每一通透小室的上舱中。可以在上舱和下舱中均加入Ac-PHSCN-NH2的盐，并在饱和湿度下在37℃进行迁移5小时。从培养板中取出该通透小室，利用DIFFQUIK，一种吉姆萨染料(Dade Behring，Deerfield，IL)来染色。通过棉签刮除从上舱中去除未迁移的细胞，分离膜，加载到载玻片上，在高倍视野(400×)下计数来确定迁移的细胞数量。
5.2.2抗侵入活性的生物学分析
现有技术(Kleinman等，Biochemistry 1986，25：312-318；Parish等，1992，Int.J.Cancer 52：378-383)已详细描述了诸如EC或肿瘤细胞(例如，PC-3人前列腺癌细胞)在称为MATRIGELTM入侵分析系统的分析中入侵穿过重建的基底膜(MATRIGELTM，从EHS小鼠肉瘤中制备的可溶性基底膜制剂，BD Biosciences，San Jose，CA)的能力。MATRIGELTM为重建的基底膜，其含有IV型胶原、层粘蛋白(laminin)、诸如串珠素(perlecan)的硫酸肝素蛋白多糖，它们结合并使bFGF、玻璃粘连蛋白(vitronectin)以及转化生长因子-β(TGF-β)、尿激酶型血浆纤维蛋白酶原活化因子(uPA)、组织血浆纤维蛋白酶原活化因子(tPA)以及称为血浆纤维蛋白酶原活化因子I型抑制剂(PAI-I)(Chambers等，Cane.Res.1995，55：1578-1585)定位。本领域已经承认，在对靶向细胞外受体或酶的化合物的分析中获得的结果预示这些化合物功效(Rabbani等，Int.J.Cancer 1995，63：840-845)。
这些分析利用通透小室的组织培养插入物。入侵细胞被定义为能够横跨通过MATRIGELTM以及聚碳酸酯膜的上方并粘附到该膜的底部的细胞。含有聚碳酸酯膜(8.0μm孔径)的通透小室(COSTAR，Corning LifeSciences，Coming，NY)用MATRIGELTM来包被，MATRIGELTM被稀释在无菌的PBS中以获得75μg/mL的终浓度(60μL的稀释MATRIGELTM每插入物)，并放置在24孔板的小孔中。所述膜在生物安全柜中干燥过夜，随后加入100μL的含抗生素的DMEM(GlBCO，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)在振荡台上再水化1小时。通过抽吸从每一插入物中移去DMEM，并在24孔板的每一孔中加入0.8mL的DMEM/10％FBS/抗生素，使得其环绕该通透小室的外周(″下舱″)。将新鲜的DMEM/抗生素(100μL)、人Glu-血浆纤维蛋白酶原(5μg/mL)和任意的待测试的抑制剂加入到通透小室的内部的顶端(″上舱″)。用胰蛋白酶消化待测试的细胞并重悬在DMEM/抗生素中，随后以800,000细胞/mL的终浓度加入至通透小室的上舱。将上舱的终体积调整到200μL。随后在饱和湿度、5％CO2气氛下培养组装的培养板72小时。培养后，固定细胞并用DIFFQUIK染色，随后用棉签刮上舱以去除Matrigel和任何没有通过所述膜侵入的细胞。利用X-ACTO刀片从通透小室中分离该膜，并用PERMOUNT将其放置在载玻片上，该PERMOUNT是基于甲苯的合成树脂的加载介质(Biomeda，Foster City，CA)，加上盖玻片，在高倍视野下计数(400×)。从计数的5-10个视野中确定侵入的细胞的平均数，并以Ac-PHSCN-NH2盐浓度为函数作图。
5.2.3抗血管生成活性的管形成分析
内皮细胞，例如可制备或商业获得的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人微血管内皮细胞(HMVEC)，以2×105细胞/mL的浓度与纤维蛋白原(5mg/mL，以1∶1(v/v)比溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中)混合。加入凝血酶(5单位/mL终浓度)，并将该混合物立即转移至24孔培养板(0.5mL每孔)。允许纤维蛋白凝胶形成，随后与测试混合物一同加入VEGF(血管内皮细胞生长因子)和bFGF(碱性纤维蛋白生长因子)至小孔中(每孔5ng/mL终浓度)。该细胞在37℃、5％CO2下孵育4天，这时，计数每一孔的细胞并分类为圆形、伸长无分枝、伸长带有分枝或伸长带有2个或更多个分枝。结果表示为对于每一化合物浓度的5个不同的孔的平均值。通常，在血管生成抑制剂存在下，细胞保持圆形或形成未分化的小管(例如，0或1分枝)。本领域承认此分析可以预测体内血管生成(抗血管生成)功效(Min等，Cancer Res.1996，56：2428-2433，)。
在可选择的分析中，将内皮细胞培养在MATRIGELTM中观察内皮细胞管形成(Schnaper等，J.Cell.Physiol.1995，165：107-118)。将内皮细胞(1×104细胞/孔)转移到MATRlGELTM-包被的24孔培养板上并在48小时后定量管的形成。通过将其在转移内皮细胞的同时或在随后的不同时间点加入来测定抑制剂。通过加入以下物质也可刺激管的形成，(a)诸如bFGF或VEGF的促进血管生成的生长因子，(b)分化刺激剂(例如，PMA[佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯])或(c)上述的组合。
不希望受到理论的限制，此分析通过将内皮细胞呈递到特定类型的基底膜，即迁移和分化的内皮细胞可能首先遇到的基质层上来模仿血管生成。除结合的生长因子外，在MATRIGELTM(以及原位的基底膜)发现的基质成分或其蛋白水解产物可以是内皮细胞管形成的刺激物，这使得该模型与前述的纤维蛋白凝胶血管生成作用模型互补(Blood等，Biochim.Biophys.Acta 1990，1032：89-118；Odedr等.Pharmac.Ther，1991，49：111-124，).
5.2.4增殖抑制分析
在96孔板中可测定本发明化合物抑制EC增殖的能力。利用I型胶原(明胶)来包被该培养板的小孔(0.1-1mg/mL PBS中，0.1mL每孔，室温30分钟)。洗涤培养板后(3×w/PBS)，在每孔中接种3,000-6,000细胞并使其在含0.1-2％FBS的内皮细胞生长培养液(EGM；Clonetics，CambrexCorporation，East Rutherford，NJ)或M199培养液中贴壁4小时(37℃/5％CO2)。在4小时终末，除去该培养液和任何未贴壁的细胞，并在每孔中加入新鲜的含bFGF(1-10ng/mL)或VEGF(1-10ng/mL)的培养液。最后加入待测试的化合物，并将培养板孵育(37℃/5％CO2)24-48小时。向每孔加入MTS(Promega，Madison，WI)并孵育1-4小时。随后检测与细胞数量成比例的490nm处的吸光度，来确定对照小孔与含测试化合物的小孔间的增殖差异。利用培养的贴壁的肿瘤细胞也可建立类似的分析系统。但是，在此形式中，可省略胶原。将肿瘤细胞(例如，3,000-10,000/孔)接种，并使其贴壁过夜。随后向小孔中加入无血清培养液，并使细胞同步化24小时。随后向每孔加入含10％FBS的培养液来刺激增殖。将待检测的化合物加入一些小孔中。24小时后，加入MTS到培养板中，展开分析并如上所述来读数。
5.2.5Caspase-3活性
通过检测caspase-3(半胱天冬酶-3)的活性可确定本发明化合物促进EC凋亡的能力。利用I型胶原(明胶)来包被P100培养板，并将5×105EC接种在含10％FBS的EGM中。24小时后(37℃、5％CO2)，用含2％FBS、10ng/ml bFGF和需要测试的化合物的EGM来代替该培养液。6小时后收集该细胞，在1％Triton中制备细胞裂解物，并利用EnzChekCaspase-3Assay Kit#1(分析试剂盒)(Molecular Probes，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)根据厂商说明书来分析。
5.2.6角膜血管生成模型
所采用的方案基本上与Volpert等，J.Clin.Invest.1996，98：671-679所述相同。简言之，麻醉雌性Fischer大鼠(120-140g)，将包含Hydron小珠(用于插入到角膜中的小珠，其通过已知含量的CpG寡脱氧核苷酸、硫糖铝(sucralfate)(10mg，Bulch Meditec，Vaerlose，Denmark)和乙醇中的hydron聚合物(120mg/l ml乙醇；Interferon Sciences，New Brunswick，NJ)混合(如Kenyon等，Invest Ophthalmol Vis Sci 1996，37：1625-1632所述)，并将该混合物涂敷至15×15mm2的合成网(Sefar America，Inc.，KansasCity，MO)上制成)构成的小珠(pellets)(5μl)，bFGF(150nM)和待测试的化合物植入到小切口中，该切口形成于距角膜与巩膜的边缘1.0-1.5mm。移植后第5和7天评价新血管化。第7天，麻醉动物，并用诸如胶状碳的染料来灌注以染色血管。随后安乐死动物，用福尔马林固定角膜。展平角膜并照相来评价新血管化的程度。通过对总血管面积或长度成像或简单地通过血管计数来定量新血管。
5.2.7MATRIGEL TM 栓分析
基本如Passaniti等，1992，Lab 15 Invest.67：519-528所述来进行该分析。将冰冷的MATRIGELTM(例如500μL)(Collaborative BiomedicalProducts，Inc.，Bedford，MA)与肝素(例如50μg/ml)、FGF-2(例如400ng/ml)与待测试化合物混合。在一些分析中，可以用诸如肿瘤细胞来替代bFGF，作为血管生成刺激物。将MATRIGELTM混合物皮下注射到4-8周大的无胸腺小鼠的靠近腹部中线处，优选每只小鼠进行3次注射。该注射的MATRIGELTM形成一个可触及的固体凝胶体。选择注射部位使得每一动物均接受阳性对照栓(例如FGF-2+肝素)、阴性对照栓(例如，缓冲液+肝素)和包含要测试其对血管生成的作用的化合物，例如(FGF-2+肝素+化合物)的栓。所有处理优选进行3个平行实验。在注射后7天或观察血管生成的另一理想时间通过颈脱位来处死动物。延腹中线分离小鼠皮肤，回收MATRIGELTM栓，并在高分辨率下立即观察。随后将栓分散在水中，并在37℃孵育过夜。根据厂商说明利用Drabkin′s溶液(例如从Sigma获得)来测定血红蛋白(Hb)水平。所述栓中Hb的量是血管生成的一种间接分析值，因为其反映了样品中血液的含量。此外，或可选择地，在处死动物之前，可对动物注射含高分子右旋糖苷的0.1ml缓冲液(优选PBS)，该右旋糖苷可偶联荧光团。利用荧光光度计来测定分散在栓中的荧光含量也可作为栓中的血管生成的检测值。用抗CD31单克隆抗体(mAb)(CD31为“血小板-内皮细胞粘附因子或PECAM”)标记也可确定栓中的新血管形成和微血管密度。
5.2.8小鸡尿囊膜(CAM)血管生成分析
基本上如Nguyen等，Microvascular Res.1994，47：31-40所述来进行该分析。将含血管生成因子(bFGF)或肿瘤细胞加抑制剂的网放在8天大的鸡胚CAM上，并且在样品种植后观察CAM 3-9天。通过确定含血管的网的面积百分数来定量血管生成作用。
5.2.9利用肿瘤细胞通过Matrigel栓分析体内评价血管生成抑制作用 和抗肿瘤作用
在此分析中，将肿瘤细胞，例如1×106-5×106个3LL Lewis肺癌细胞或大鼠前列腺MatLyLu细胞株与MatrigelTM混合，随后根据5.2.7节所述方案注射到小鼠的腰部。约5至7天后，可观察到肿瘤细胞团和强烈的血管生成反应。在实际的肿瘤环境中，通过将其包含在所述栓中来评价化合物的抗肿瘤和抗血管生成作用。然后测定肿瘤重量、Hb水平或荧光水平(处死前注射右旋糖苷-荧光团偶联物)。为了分析Hb或荧光，首先要用组织匀浆器来匀浆所述栓。
5.2.10皮下(s.c.)肿瘤生长的异种移植物模型
用MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)和MatrigelTM(1×106细胞，0.2mL)皮下注射(s.c.)动物的右腹侧来接种裸鼠。肿瘤生长至200mm3并随后用测试组合物处理(100μg/动物/天，腹膜内每天给予一次)。每隔一天测量肿瘤体积，并于处理两周后处死动物。切除肿瘤，称重并用石蜡包埋。通过H&E[苏木精伊红染色]、抗CD31、Ki-67、TUNEL和CD68染色来分析该肿瘤的组织切片。
5.2.11转移的异种移植物模型
还利用实验性转移模型(Crowley等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1993，90：5021-5025)测试本发明化合物对晚期转移的抑制作用。晚期转移涉及肿瘤细胞的贴附和溢出、局部侵入、接种、增殖和血管生成作用等步骤。用报告基因转染的人前列腺癌细胞(PC-3)接种裸鼠，该报告基因优选绿色荧光蛋白(GFP)基因，但可选择的有编码酶类如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶或LacZ的基因。此方法使得可以利用任一这些标志物(GFP的荧光测定或酶活性的组织化学比色测定)来跟踪这些细胞的命运。注射细胞，优选静脉内注射(i.v.)，约14天后鉴定转移，特别是在肺中，但也可以是区域性淋巴结、股骨和脑中的转移。这模拟人前列腺癌中天然发生的转移的器官向性。例如，将GFP-表达的PC-3细胞(1×106细胞每只小鼠)静脉内注射入裸鼠的尾静脉(nu/nu)。用测试组合以100μg/动物/天每天一次腹膜内给予动物。通过荧光显微镜或光学显微组织化学，或通过研磨组织并对可检测的标记进行定量分析来对单一转移细胞和病灶进行观察和定量。
5.2.12PHSCN和功能性衍生物在体内对自发性转移的抑制
大鼠的乳腺癌系统采用Mat BIII大鼠乳腺癌细胞(Xing等，Int.J.Cancer 1996，57：423-429)。将肿瘤细胞，例如悬浮在0.1mL PBS中的约106的肿瘤细胞接种到雌性Fisher大鼠的乳房脂肪垫中。在接种时，腹腔内植入14-天Alza渗透性微型泵(Mountain View，CA)来给予测试化合物。将所述化合物溶解在PBS(例如，200mM储藏液)中，无菌过滤并放入微型泵中以约4mg/kg/天的释放速率释放。对照动物仅接受微型泵中的载体(PBS)或载体对照肽。在约14天处死动物。在用本发明的化合物处理的大鼠中，可观察到原发肿瘤的体积显著减小，脾脏、肺、肾和淋巴结的转移数量明显减少(以离散的病灶计数)。组织和免疫组织化学分析显示在受治疗的动物中肿瘤的坏死和死亡信号增加。在肿瘤区域中可观察到大的坏死区，没有新生血管化。与131I偶联(每分子肽1个或2个I原子)的人或兔PHSCN和其衍生物是有效的放射治疗剂，并发现其效力比未偶联的多肽高至少2倍。相反，用对照肽处理对肿瘤大小或转移没有产生明显变化。
5.2.13LL Lewis肺癌：原发肿瘤生长
此肿瘤株作为肺癌在C57BL/6小鼠中自发产生(Malave等，J.Nat′l.Cane.Inst.1979，62：83-88)。它通过在皮下(s.c.)接种到C57BL/6小鼠中传代来繁殖，并在半异源C57BL/6×DBA/2F1小鼠或在异源的C3H小鼠中测试。通常，将6只动物每组用于皮下(s.c.)接种，或10只用于肌肉内(i.m.)接种。肿瘤可以以2-4mm的块来进行皮下接种，或以约0.5-2×106个细胞的悬浮细胞肌肉内或皮下接种。在接种24小时后，或等到可确诊到特定大小的肿瘤时(通常约400mg)开始治疗。每天腹腔内给予测试化合物，持续11天。接着对动物进行称重、触诊和检测肿瘤大小。肌肉内接种12天后，未接受治疗的对照受体中的典型肿瘤重量为500-2500mg。典型的存活时间中值为18-28天。使用阳性对照化合物，例如在第1-11天以20mg/kg/每天注射环磷酰胺。计算的结果包括动物体重、肿瘤大小、肿瘤体积、存活时间。为了确证治疗活性，对测试组合物进行两个多剂量分析测试
5.2.143LL Lewis肺癌：原发性生长和转移模型
本领域公知该分析方法(Gorelik等，J.Nat′l.Canc.Inst.1980，55：1257-1264；Gorelik等，Rec.Results Cane.Res.1980，75：20-28；Isakov等，Invasion Metas.2：12-32(1982)；Talmadge等.，J.Nat’l.Canc.Inst.982，6P：975-980；Hilgard等，Br.J.Cancer 1977，35：78-86)。测试小鼠为雄性C57BL/6小鼠、2-3个月大。在皮下、肌肉内或足垫内接种后，这种肿瘤产生转移，优选在肺中。对于该肿瘤的某些株，原发性肿瘤产生抗转移作用，在转移阶段的研究前必须首先被切除(还可参见美国专利第5,639,725号)。
利用0.3％胰蛋白酶溶液处理切碎的肿瘤组织以从实体瘤中制备单细胞悬液。用PBS(pH 7.4)洗涤细胞3次，并悬浮在PBS中。通过此方法制备的3LL细胞的活存性通常为约95-99％(利用台盼蓝染色排除)。将悬浮在0.05ml PBS中的活肿瘤细胞(3×104-5×106)皮下注射到C57BL/6小鼠的背侧区域或一只前足垫中。在背侧皮下注射106细胞后3-4天出现可视的肿瘤。每两天通过测径器检测肿瘤出现的天数和所建立的肿瘤的直径。每周以1至5个剂量的肽或衍生物给予治疗。在另一实施方案中，所述肽通过渗透性微型泵来递送。
在涉及背侧肿瘤切除的实验中，当肿瘤达到约1500mm3大小时，将小鼠随机分成2组：(1)原发性肿瘤被完全切除；或(2)实施假手术，肿瘤被完整保留。尽管500-3000mm3的肿瘤抑制转移瘤的生长，但1500mm3为可被安全地再切除并具有高的存活性而不会局部再生的原发肿瘤的最大体积。21天后，处死所有动物并进行尸检。
去除肺并称重。将肺固定在Bouin′s溶液中(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并记录可见的转移瘤的数量。利用配备有含千分尺的双目镜立体显微镜在8×放大倍数下，检测转移瘤的直径。根据所记录的直径，可以计算出每一转移瘤的体积。为了确定每个肺的转移瘤的总体积，将明显可见的转移瘤的数量乘以转移瘤的平均体积。为了进一步测定转移瘤的生长，可以检测肺细胞中整合的125IdUrd(碘脱氧鸟苷)(Thakur等，J.Lab，Clin.Med.1977，89：211228)。在肿瘤切除后10天，将25μg的荧光脱氧鸟苷接种到含肿瘤的腹膜内(且，如果使用，切除了肿瘤的小鼠)。30分钟后，向小鼠给予1μCi的125IdUrd。1天后，取出肺和脾脏并称重，利用伽玛计数仪来检测125IdUrd的整合。
在具有足垫肿瘤的小鼠中，当肿瘤达到8-10mm直径时，将小鼠随机分为两组：(1)具有肿瘤的腿部在膝关节上方被结扎后被切除；或者(2)鼠保持完整，作为非切除的含肿瘤的对照。(排除麻醉、应激或手术的可能作用，切除含肿瘤的小鼠中的无肿瘤腿对后续的转移没有已知的影响)。切除后10-14后处死小鼠。并如上所述来评价转移。
统计学：代表转移瘤发生率的值和它们在肿瘤小鼠的肺中的生长不是正态分布的。因此，可用非参数的统计诸如Mann-Whitney U-检验进行分析。Gorelik等(1980，如上所引)的这一模型研究显示了肿瘤细胞接种体的大小决定了转移生长的程度。手术小鼠肺中的转移率不同于原发性肿瘤小鼠。因此，在已用较大剂量的3LL细胞(1-5×106)接种而诱导出原发肿瘤并随后手术切除的小鼠肺中，肿瘤数量明显低于未手术的含肿瘤小鼠，虽然转移瘤的体积明显高于非手术对照组。利用125IdUM的整合检测肺转移瘤，在最初用1063LL细胞接种的肿瘤切除小鼠和含肿瘤小鼠的肺中没有发现明显的差异。切除接种105肿瘤细胞后所产生的肿瘤却戏剧性地加速了转移瘤的生长。这些结果与局部肿瘤切除后小鼠的存活吻合。已经重复地观察到局部肿瘤切除后转移瘤生长的加速现象(例如，参见美国专利第5,639,725号)。这些观察对实施肿瘤手术的患者的预后有提示作用。
5.3Ac-PHSCN-NH 7 盐的治疗应用
根据本发明，将Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物向患有以异常血管化或异常血管生成为特征的疾病或病症的患者给药，患者优选动物，包括但不限于人、哺乳动物或非人动物，诸如牛、马、绵羊、猪、家禽、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等等，更优选哺乳动物，并最优选人。异常血管化或异常血管生成包括异常新血管化，例如形成新血管、较大血管、较多分枝的血管以及任何其它的机制，所述机制是不适当的或增加了向患病组织或位点的血液携带能力，在所述患病组织或位点的新血管化对所述疾病或病症的存在或发展是具有辅助作用或是必需的。Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物可用于治疗异常的血管化或异常的血管生成。
在一些实施方案中，以异常血管化或异常血管生成为特征的疾病包括癌症(例如，任何血管化的肿瘤，优选实体肿瘤，包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤、软骨肉瘤)，关节炎、糖尿病、动脉硬化、动静脉的癌、畸形、角膜移植物新血管形成、延迟的伤口愈合、糖尿病视网膜病、年龄相关的黄斑变性、肉芽肿、烧伤、血友病关节病、类风湿关节炎、增生性瘢痕、新生血管性青光眼、骨不连骨折、Osier-Weber综合症、牛皮癣、化脓性肉芽肿、晶体后纤维膜增生症(retrolental fibroplasia)、翼状胬肉、硬皮病、沙眼、血管粘附、眼部新血管形成、寄生性疾病、手术后过度增生、毛发生长抑制、黄斑变性(包括于和湿型)、类风温关节炎和骨关节炎。在另外的实施方案中，以异常血管化和异常血管生成为特征的疾病包括癌症、黄斑变性、克隆氏病和类风湿关节炎。
此外，在某些实施方案中，将Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物给予患者，优选人，作为以异常血管化或异常血管生成为特征的疾病或病症的预防措施。因此，Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物可作为具有以异常血管化或异常血管生成为特征的疾病的患病体质的患者的预防措施给药。因此，Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物可用于预防一种疾病或病症并同时治疗另一种疾病或病症(例如，预防关节炎的同时治疗癌症)。
5.4治疗/预防性给药
Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物可有益地用在人药或兽药中。如上5.3节所述，Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物可用于治疗或预防以异常血管化或异常血管生成为特征的多种疾病或病症。
当用于治疗或预防上述疾病或病症时，可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐可单独地或与其它的治疗剂联合给药或使用。可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐可单独地或与一种或多种其它药物活性试剂(例如，其它抗癌症剂、其它抗血管生成剂例如螯合剂锌、青霉胺、钼酸盐等等)，包括本文所述的其它酸加成盐联合给药或使用。
任选的包含一种或多种Ac-PHSCN-NH2盐的药物组合物中的Ac-PHSCN-NH2盐可以口服给药。可以是药物组合物形式的所述Ac-PHSCN-NH2盐也可通过任何其它常规途径来给药，例如，通过输注或快速注射，通过上皮或粘膜皮肤层(例如，口服粘膜、直肠或肠粘膜等等)。给药可以是系统给药或局部给药。可使用多种递送系统(例如，包封在脂质体中、微颗粒、微胶囊等等)来给予本发明的化合物和/或药物组合物。给药方法包括但不限于皮肤内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、颅内、阴道内、透皮、直肠、通过吸入、局部特定地对耳、鼻、眼或皮肤给药。优选的给药方式可由医生来判断，并部分依赖于医学疾病的位置。在大多数情况下，给药会产生将本发明化合物和/或药物组合物的释放入血的效果。
在具体的实施方案中，将一种或多种Ac-PHSCN-NH2盐和/或其药物组合物给予至需要治疗的区域是理想的。这可通过，例如非限制地通过手术过程中的局部输注，局部应用例如与手术后的伤口敷料联合，通过注射，通过导管的方式，通过栓剂的方式，通过植入的方式(所述植入物是多孔、非多孔的、或凝胶材料，包括膜，例如硅铝膜或纤维)给药。在一个实施方案中，可在癌症或关节炎的位点(或以前的位点)直接注射给药。
在某些实施方案中，通过任何适合的途径，包括心室内、鞘内和硬膜外注射将一种或多种Ac-PHSCN-NH2盐，任选地以药物组合物的形式引入到中枢神经系统是理想的。可通过心室内导管来进行心室内注射，例如与贮液器，如Ommaya连接的导管。
Ac-PHSCN-NH2盐，任选药物组合物的形式，还可通过吸入直接给予到肺。为了通过吸入的给药，盐和/或其药物组合物可通过许多不同的设备常规地递送至肺。例如，可利用含低沸推进物(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体)的小罐的Metered计量吸入器(“MDI”)来将本发明的化合物直接递送至肺中。
可选择地，也可用干粉吸入器(″DPI″)设备来将Ac-PHSCN-NH2盐，任选地以药物组合物的形式给予至肺。DPI设备通常使用诸如气体爆发的机制在容器中产生干粉烟云，该烟云随后可被患者吸入。DPI设备也是本领域公知的。常用变体为多剂量DPI(″MDDPI″)系统，其能够递送多种治疗剂量。MDDPI设备可从例如AstraZeneca、Glaxo Wellcome、IVAX、ScheringPlough、SkyePharma和Vectura等公司获得。例如，用于吸入器或吸药器中的凝胶胶囊和药筒可被制备成含有Ac-PHSCN-NH2盐和用于这些系统的合适粉状基料，如乳糖或淀粉。
另一可用于将可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐递送至肺的设备为液体喷雾设备，其由例如Aradigm Corporation(Hayward，CA)提供。液体喷雾系统利用极小的喷嘴孔来雾化液体药物制剂，随后可被直接吸入肺中。
在一些实施方案中，使用雾化器将可以是药物组合物形式的本发明的化合物递送至肺。雾化器利用例如超声波能量使液体药物制剂形成气雾剂，从而形成容易吸入的细小颗粒(参见例如，Verschoyle等，British J.Cancer，1999，80，增刊2，96，本文以参考的方式将其引入)。雾化器的例子包括由Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd提供的设备。(参见，Armer等，美国专利第5,954,047号；van der Linden等，美国专利第5,950,619号；van der Linden等，美国专利第5,970,974号)以及Batelle PulmonaryTherapeutics(Columbus，Ohio)提供的设备。
在其它的实施方案中，使用电流体力学(″EHD″)气雾剂设备来递送可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐至肺。EHD气溶胶设备利用电能来气雾化液体药物溶液或悬浮液(参见例如，Noakes等，美国专利第4,765,539号)。EHD气溶胶设备相比现有的肺递送技术能更有效地递送药物至肺。
在其它的实施方案中，可以在囊泡，特别是脂质体中递送可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐(参见，Langer，1990，Science，249：1527-1533；Treat等.，in″Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer，″Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；通常参见″Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，″Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，New York，pp.353-365(1989))。
在其它的实施方案中，可通过控释系统，优选口服控释系统来递送可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐。在一个实施方案中，可利用泵(参见上述引用的Langer；Sefton，1987，CRC Crit Ref Biomed Eng.14：201；Saudek等，1989，N.Engl.J Med.321：574)。
在其它的实施方案中，可使用聚合体材料(参见“Medical Applicationsof Controlled Release，”Langer and Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；″Controlled Drug Bioavailability，″Drug Product Design andPerformance，Smolen and Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger andPeppas，1983，J Macromol.Sci.Rev.Macromol Chem.23：61；还参见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在其它的实施方案中，可将聚合材料用于口服缓释系统。优选的聚合物包括羧甲基纤维素钠、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素和羟基乙基纤维素(最优选的是羟基丙基甲基纤维素)。其它的优选的纤维素醚已有描述(Alderman，Int.J.Pharm.Tech.& Prod.Mfr.，1984，5(3)1-9)。影响药物释放的因素对于本领域所属技术人员是公知的并在本领域中已有描述(Bamba等，Int.J.Pharm.，1979，2：307)。
在其它的实施方案中，可用肠衣包被的制剂来口服缓释给药。优选的包被材料包括具有pH-依赖性溶解性的聚合物(即pH-控释)，具有缓慢或pH-依赖性膨胀率、分解率或溶解率的(即时间控释)聚合物，由酶降解的聚合物(即酶控释)，以及形成由增加的压力来破坏的硬包被层的聚合物(即压力控释)。
在其它的实施方案中，将渗透性递送系统用于口服缓释给药(Verma等.，Drug Dev.Ind.Pharm.，2000，26：695-708)。在其它的实施方案中，将OROS(ALZA Corp.，Mountain View，CA)渗透设备用于口服缓释递送设备(Theeuwes等，美国专利第3,845,770号；Theeuwes等，美国专利第3,916,899号)。
在其它的实施方案中，可以将控释系统放置在本发明化合物和/或药物组合物的靶的附近，从而仅需要系统剂量的一小部分(参见，例如，Goodson，in″Medical Applications of Controlled Release，″如上所引用，vol.2，pp.115-138(1984))。也可使用如Langer，1990，Science 249：1527-1533所述的其它控释系统。
5.5药物组合物
现有的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种Ac-PHSCN-NH2盐，优选纯化的形式，和合适量的药学上可接受的载体，从而提供适合对患者给药的形式。当对患者给药时，Ac-PHSCN-NH2盐和药学上可接受的载体优选是无菌的。当本发明的化合物被静脉内给药时，水是优选的载体。盐溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。适合的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖。蔗糖、凝胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。本发明的药物组合物，如果需要，还可包含较小量的湿化剂或乳化剂或pH缓冲剂。此外，也可使用佐剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和染色剂。
包含Ac-PHSCN-NH2盐的药物组合物可通过常规的混合、溶解、造粒、制成糖衣丸、研磨、乳化、装入胶囊、封装或冻干等方式来制备。可利用一种或多种生理可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂通过常规的方式来制备药物组合物，该载体、稀释剂、赋形剂或佐剂有利于将本发明的化合物加工成可药学使用的制剂。适合的制剂依赖于所选择的给药途径。
本发明的药物组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、颗粒、胶囊、含液体的胶囊、粉剂、缓释制剂、栓剂、乳化剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮剂、或适于使用的其它形式。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体为胶囊(参见例如，Grosswald等，美国专利第5,698,155号)。合适的药物载体的其它例子在现有技术中有描述(参见Remington′sPharmaceutical Sciences，Philadelphia College of Pharmacy and Science，第17版，1985)。
对于局部给药，可以将Ac-PHSCN-NH2盐配制成溶液、凝胶、药膏、霜剂、悬浮液等等，这是本领域公知的。系统性制剂包括设计成注射制剂，例如皮内、皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射给药的那些制剂，以及设计来透皮、透粘膜、口服或肺给药的那些制剂。系统性制剂可制备成与可提高气道粘液的纤毛清除或降低粘液粘度的其它活性试剂组合。这些活性试剂包括但不限于钠通道阻断剂、抗生素、N-乙酰半胱氨酸、同型半胱氨酸和磷酸。
在一些实施方案中，根据常规程序将Ac-PHSCN-NH2盐配制成适予向人静脉内给药的药物组合物。通常，用于静脉内给药的Ac-PHSCN-NH2盐是无菌等渗水性缓冲液溶液。为了注射，可以将Ac-PHSCN-NH2盐配制在水溶液，优选生理相容性缓冲液，例如Hanks′溶液、Ringer′s溶液或生理盐水缓冲液中。所述溶液可含有配制性试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。如果需要，该药物组合物还可包含增溶剂。用于静脉内给药的药物组合物可任选地包含局部性麻醉剂，例如缓解注射部位疼痛的利诺卡因。通常地，所述成分可以分开提供或混合成单位剂型，例如在显示活性试剂质量的密封容器，如安瓿或小袋的中的冻干粉末或无水浓缩物。当Ac-PHSCN-NH2盐通过灌输给药时，其可被分散，例如利用含无菌药物级水或盐水的灌输安瓿分散。当Ac-PHSCN-NH2盐通过注射给药时，可提供用于一次用量的注射用无菌水或盐水，以在给药前可以将所述成分混合。
对于透粘膜给药，在制剂中使用适于穿透所述屏障的渗透剂。这种渗透剂通常在本领域是公知的。
用于口服给药的药物组合物可以是例如片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、颗粒、粉剂、乳刑、胶囊、糖浆或西也剂形式。口服给药的药物组合物可包含一种或多种任选的试剂，例如甜味剂如果糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯或糖精；调味剂如胡椒薄荷、鹿蹄草油，或樱桃调色剂和防腐剂，以提供药物学可口的制剂。此外，如果是片剂或丸剂形式，可将所述组合物包被以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在一定的延长时期中提供持续作用。包围渗透活性驱动化合物的选择性渗透膜也适于本发明的口服给药。在后述的这些平台中，来自环境的围绕所述胶囊的液体被该驱动化合物吸收，该驱动化合物肿胀而通过缝隙释放所述药剂或药剂的组合物。这些递送平台可提供基本上零级(zero order)的递送特性，这与即刻释放制剂的锥形特征相反。也可使用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或甘油硬脂酸酯。口服组合物可包含标准载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些载体优选为药物级的。
对于口服液体制剂，例如悬浮液、西也剂和溶液，适合的载体、赋形剂或稀释剂包括水、盐水、亚烷基二醇(alkylene glycol)(例如丙二醇)、聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)、油、醇、pH4-6的略酸性缓冲液(例如约5.0mM至约50.0mM的乙酸、柠檬酸、抗坏血酸)等等。此外，也可加入调味剂、防腐剂、调色剂、胆盐、酰基肉毒碱等等。
对于口腔给药，药物组合物可以常规方式配制成片剂、锭剂等等。
适于通过雾化器和液体喷雾装置和EHD气雾剂装置使用的液体药物制剂通常包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。优选地，所述药学上可接受的载体是液体，如醇、水、聚乙二醇或碳全氟化合物。任选地，可以加入另一材料来改变本发明化合物的溶液或悬浮液的气雾剂特性。优选地，该材料是液体，如醇、乙二醇、聚乙二醇或脂肪酸。配制适合气雾剂装置使用的液体药物溶液或悬浮液的其它方法也是本领域所属技术人员公知的(参见例如，Biesalski的美国专利第5,112,598号；Biesalski的美国专利第5,556,611号)。
Ac-PHSCN-NH2盐也可配制成直肠或阴道用药物组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，即含有常规的栓剂基质，如可可油或其它甘油酯。除了上述制剂外，Ac-PHSCN-NH2盐也可以制成贮存制剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)给药或通过肌肉内注射。因此，例如Ac-PHSCN-NH2盐可与适合的聚合体或疏水性材料(例如可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或配制成难溶衍生物，例如难溶盐。
最后，Ac-PHSCN-NH2盐可如Mazar等的标题为″ImprovedFormulations of Anti-Angiogenic Peptides″(抗血管生成肽的改良制剂)的共同未决申请：2005年2月1日提交的美国临时中请号60/648,391和2006年2月1日提交的正在等待申请号的国际申请(代理人案件号28932.0013)所述进行配制，本文将其每一个均全文引入作为参考。可以使用的制剂包含可稳定Ac-PHSCN-NH2盐而防止自发性串联二聚化或更高的寡聚化的其它化合物。因此，本申请所描述的任何药物组合物还可包含一种或多种这种其它化合物。优选地，该其它的化合物为生物相容的pK约为5的酸性缓冲液，例如柠檬酸盐、乙酸盐或2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)。所述酸性缓冲液优选浓度为约25mM或50mM的柠檬酸盐。该缓冲液可加入甘氨酸作为赋形剂和填充剂，优选以约50mg/ml的浓度加入。该制剂可进一步包含一种或多种还原剂，例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇或谷胱甘肽。所述制剂还可包含以冻干保护量存在的的冻干保护剂(lyoprotectant)，例如约50-600摩尔冻干保护剂：l摩尔肽。所述冻干保护剂是一种或多种糖(例如蔗糖或海藻糖)，一种或多种氨基酸(例如谷氨酸或组氨酸一钠)，一种或多种甲胺(例如甜菜碱)，一种或多种易溶盐(lyotropic salt)(例如，硫酸镁)，和/或一种或多种多羟基化合物(例如，丙三醇、赤藓醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇和丙二醇)。
5.6剂量
Ac-PHSCN-NH2盐或其药物组合物，通常以有效实现预期目的的量来使用。用于治疗或预防以异常血管化或异常血管生成为特征的疾病或病症时，可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐以治疗有效剂量来给药或使用。
在本文所公开的特定病症或状态的治疗中有效的Ac-PHSCN-NH2盐的量将依赖于该病症或状态的特性，且可通过如上所述的本领域公知的标准临床技术来确定。此外，可任选地使用体外或体内分析来辅助鉴定优化的剂量范围。给予的Ac-PHSCN-NH2盐的量当然地依赖于待治疗的个体、个体的体重、病痛的严重程度、给药方式和开处方医生的判断等其它因素。
例如，所述剂量可以以药物组合物的形式通过单次给药、多次应用或控释来递送。剂量可以间歇地重复、可单独提供或与其它的药物组合提供，并可持续给药，只要疾病状态或病症的有效治疗需要。
口服给药的合适剂量范围取决于药物的效力，但通常为0.001mg至200mg，优选0.01mg至50mg，更优选0.1至50mg本发明的化合物每千克体重。利用本领域所属技术人员公知的方法可容易地确定剂量范围。
静脉内(i.v.)给药的合适剂量范围为约0.01mg至约100mg每千克体重。鼻内给药的合适剂量范围通常为0.01mg/kg体重至50mg/kg千克体重或0.10mg/kg体重至10mg/kg体重。栓剂通常包含约0.01毫克至约50毫克本发明的化合物每千克体重，并包含约0.5％至约10％重量的活性组分。皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、硬膜外、舌下或颅内给药的推荐剂量为约0.001mg至约200mg每千克体重。可从体外或动物模型实验系统中得到的剂量-效应曲线推断出有效剂量。这些动物模型是本领域公知的。
在具体的实施方案中，给药的剂量并不基于体重，而是绝对量，例如，1-1000mg每剂。在具体的实施方案中，所述剂量为10-750mg每剂，例如，20mg、100mg或600mg每剂。在具体的实施方案中，所述药物制剂每周1次至几次(例如2、3、4或7次)给药。
在人体内使用之前，优选如上所述在体外和体内分析Ac-PHSCN-NH2盐的所需治疗或预防活性。例如，可用体外分析来确定给予Ac-PHSCN-NH2盐或Ac-PHSCN-NH2盐的组合是否是治疗以异常血管化为特征的疾病所优选的。还可用动物模型系统来证实Ac-PHSCN-NH2盐是有效的且安全的。
优选地，本文所述的Ac-PHSCN-NH2盐的治疗有效剂量会提供治疗益处，而不会产生实质性的毒性。
Ac-PHSCN-NH2盐的毒性可用标准的药物学方法来确定，且本领域的技术人员能够容易地确定。毒性与治疗作用的剂量比为治疗指数。Ac-PHSCN-NH2盐在治疗疾病和病症中优选地显示出特别高的治疗指数。本文所述的Ac-PHSCN-NH2盐优选处于包括有效剂剂量而无或几乎无毒性的循环浓度范围内。
5.7联合治疗
在某些实施方案中，可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐可与至少一种其它治疗剂联合使用，该其它治疗剂不是Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐，例如不是联合使用的酸加成盐。可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐和所述治疗剂可发挥加成作用或优选地协同作用。在一些实施方案中，任选药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐的给药可与另一种治疗剂的给药同时进行。在另外一些实施方案中，Ac-PHSCN-NH2盐或其药物组合物在其它的治疗剂给药之前或之后给药。这两种药剂的给药可分开进行，或在同一组合物中同时进行。在具体的实施方案中，所述其它治疗剂是抗血管生成剂或化疗剂。
在具体的实施方案中，可以是药物组合物形式的Ac-PHSCN-NH2盐可与使用其它化疗剂(例如烷基化试剂，如氮芥(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、苯丁酸氮芥、六甲基蜜胺、硫替派)，烷基磺酸酯(例如白消安)，亚硝基脲、三嗪)，抗代谢物(例如叶酸类似物、嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶、氟尿苷、阿拉伯糖苷等等)，嘌呤类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁等等)，天然产物(例如长春碱、长春新碱、依托泊苷(etoposide)、威猛(tertiposide)、更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素(mithrmycin)、丝裂霉素C(mitomycin)、左旋天门冬酰胺酶(L-asparaginase)、干扰素α)，铂配位复合物(例如顺铂、卡铂等等)，米托蒽醌(mitoxantrone)，羟基脲，甲苄肼，激素和拮抗剂(例如强的松、羟基乙酸孕酮、乙酸甲羟孕酮、甲地孕酮(megestrol acetate)、二乙基已烯雌酚、乙炔雌二醇、它莫西芬(tamoxifen)、睾丸酮丙酸酯(testosterone propionate)，氟羟甲基睾丸素(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)等等)，抗血管生成剂或抑制剂(例如血管抑素(angiostatin)、视黄酸(retinoic acids)和紫杉醇、雌二醇衍生物、噻唑嘧啶(thiazolopyrimidine)衍生物等等)，细胞凋亡诱导剂(例如阻断抑制凋亡的致癌基因的反义寡核苷酸、肿瘤抑制剂、TRAIL、TRAIL多肽、Fas-相关因子1、白介素-1β-转化酶、磷酸酪氨酸抑制剂、RXR类维生素A受体激动剂、喹诺酮衍生物等等)和螯合剂(青霉胺、锌、曲恩汀(trientine)等等))的治疗联合使用。
5.8治疗性试剂盒
本发明提供了治疗性试剂盒，该试剂盒包含在容器中的Ac-PHSCN-NH2盐或其药物组合物。所述治疗性试剂盒还包含在相同或分开的容器中的一种或多种其它化合物(例如化疗剂、天然产物、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或这些化合物的药物组合物。
治疗性试剂盒可具有单一容器，包含Ac-PHSCN-NH2盐或其药物组合物，含有或不含有其它组分(例如，其它化合物或这些其它化合物的药物组合物)，或者可具有用于各组分的不同容器。优选地，本发明的治疗性试剂盒包含Ac-PHSCN-NH2盐或其药物组合物，包装成与第二化合物(优选地化疗剂、天然产物、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物的共给药联合使用。所述试剂盒的组分可在对患者给药之前预混合或各组分分别在不同的容器中。
所述试剂盒的组分可以以一种或多种液体溶液的形式提供，优选地，以水溶液，更优选地以无菌水溶液的形式提供。本发明的试剂盒的组分还可以固体提供，该固体可以通过添加适合的溶剂来转化为液体，该溶剂优选在另外的不同的容器中提供。
治疗性试剂盒的容器可以是小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或装固体或液体的任何其它装置。通常，当有多种组分时，所述试剂盒包括可以分开给药的第二小瓶或其它容器。所述试剂盒还可包括用于药学上可接受的液体的另一容器。
优选地，治疗性试剂盒包含能够给予该试剂盒中的其它成分的设备(例如一种或多种针头、注射器、滴眼器、移液管等等)。
6.实施例
本发明参考以下实施例作进一步说明，这些实施例详细描述了Ac-PHSCN-NH2盐的制备和检测稳定性的方法。许多改变，包括对材料和方法的改变对于本领域技术人员来说是显而易见，这些改变都包括在本发明的范围内。
6.1实施例1：Ac-PHSCN-NH 2 盐酸盐的制备
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2，TFA盐的制备
Rink Amide AM树脂(Novabiochem，EMD Biosciences，Inc.，San Diego，CA)用20％哌啶DMF溶液(二甲基甲酰胺；1mL每100mg树脂)处理3分钟，用氮气搅动，并将反应混合物过滤并用DMF洗涤一次。此步骤另外重复两次。用DMF洗涤树脂三次，并用二氯甲烷洗涤三次。将Fmoc-Asn(trt)-OH(3当量)、HBTU(3当量)和HOBt(3当量)溶解在DMF(1mL每100mg树脂)中并加入至上述树脂，随后加入N-甲基吗啉(NMM)(6当量)，并且将该混合物搅拌1小时。过滤该反应混合物并用DMF洗涤该树脂三次，二氯甲烷洗涤该树脂三次。重复此连接步骤。上述的Fmoc脱保护和连接步骤依次使用Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(trt)-OH和Fmoc-His(trt)-OH来提供结合至树脂的Fmoc-His(trt)-Ser(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)。用20％哌啶的DMF溶液(1mL每100mg树脂)处理该树脂三分钟，用氮气搅动，并将该反应混合物过滤并用DMF洗涤一次。此步骤另外重复两次。用DMF和二氯甲烷各洗涤该树脂三次。将Ac-Pro-OH(3当量)、HBTU(3当量)和HOBt(3当量)溶解在DMF(1mL每100mg树脂)中并加入到上述树脂中，随后加入N-甲基吗啉(NMM)(6当量)，并且将该混合物搅拌1小时。过滤该反应混合物并用DMF洗涤该树脂三次，二氯甲烷洗涤该树脂三次，以获得结合了Ac-Pro-His(trt)-Ser(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)的RinkAmide AM树脂。用TFA/TIS/水(95∶2.5∶2.5，1mL每100mg树脂)处理该树脂并用氮气搅动2小时。过滤该反应混合物，并用TFA/TIS/水洗涤该树脂1次，用二氯甲烷洗涤3次。在真空中去除溶剂，并将所得到的剩余物用醚研磨3次以得到粗的Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2，TFA盐。
利用此一般程序，从2g的Rink Amide AM树脂(加载：0.63mmol/g)中制备出708mg的粗Ac-PHSCN-NH2，TFA盐。
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2，TFA盐的纯化
将溶解在最小量的甲醇和水中的上述粗肽利用具有PhenomenexSynergihydro-RPC18柱(250mm×21.2mm)的制备性反相HPLC(Beckman)来纯化。利用3-100％梯度的B来洗提该肽30分钟，流速为20mL/分钟，其中溶剂A为含0.1％三氟乙酸的水，溶剂B为含0.1％三氟乙酸的乙腈。在220nm处检测。通过利用梯度3-100％B(Waters)，将用Phenomenex hydroRP(250mm×4.6mm)的分析性HPLC检测的纯度＞95％的组分合并，并通过旋转蒸发浓缩至约2-4ml并冻干。将样品再溶解在水中，并转移至配衡2g的小瓶中并再次冻干。
利用此方法，从338mg的粗材料中获得了140mg的纯Ac-PHSCN-NH2，TFA盐：ES MS m/z(M+H)+598.2；HPLC：99％纯度。
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2
将Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2，TFA盐(140mg，0.197mmol)溶解在2mL的蒸馏水中并加入Amberlyst A-26(OH)树脂(4.2毫当量/g，273mg，5.8当量)。在室温搅拌混合物5分钟。轻轻倒出水溶液，用蒸馏水洗涤该树脂2次，混合水层，并冻干得到81mg(69％)的蓬松白色固体Ac-PHSCN-NH2：ES MS m/z(M+H)+598.2；HPLC：94％单体，6％二聚体。
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2盐酸盐
在室温下，将Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2(77mg，0.13mmol)溶解在蒸馏水中，立即加入1M盐酸(0.13mL，0.13mmol)。涡旋该混合物一次，随后冷冻并冻干产生蓬松白色固体的Ac-PHSCN-NH2盐酸盐：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.00(s，1H)，8.57-8.26(m，2H)，8.21-8.03(m，2H)，7.45-7.36(m，2H)，7.13(s，1H)，7.09(s，1H)，6.94(s，1H)，4.79-4.59(m，1H)，4.50-4.25(m，4H)，3.74-3.56(m，3H，与水的峰重叠)，3.25-3.15(m，2H，与水的峰重叠)，3.11-2.98(m，1H)，2.88-2.72(m，2H)，2.57-2.38(m，2H，与DMSO的峰重叠)，2.02(s，3H)，1.92-1.65(m，4H)；HPLC：93％单体，7％二聚体。
Ac-PHSCN-NH2合成的过程如图1所示。
6.2实施例2：Ac-PHSCN-NH 2 游离碱的制备
将Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2盐酸盐(301mg，0.475mmol)溶解在4.7mL的蒸馏水中，并加入Amberlyst A-26(OH)树脂(4.2微当量/g，623mg，5.5当量)。在室温搅拌该反应混合物5分钟。轻轻倒出水溶液，用蒸馏水洗涤该树脂2次，冻干混合水层得到139mg(49％)的蓬松白色固体的题述化合物：1H NMR(300MHz，DMSO d6)δ8.56(brs，1H)，8.23-7.84(m，3H)，7.59-7.52(m，1H)，7.33(s，1H)，7.12(s，1H)，7.07-7.00(m，1H)，6.97-6.77(m，2H)，5.19-4.98(m，1H)，4.62-4.16(m，5H)，3.70-3.51(m，3H)，3.03-2.72(m，4H)，2.53-2.36(m，2H，与DMSO的峰重叠)，2.00(s，3H)，1.90-1.75(m，2H)，1.74-1.63(m，2H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；C23H35N9O8S分析计算值：N，21.09。实测值：19.66(肽含量，93％)。氯含量(IC)：0.01％。
6.3实施例3：不同盐形式的Ac-PHSCN-NH 2 游离碱的制备
在室温下，将Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2(1mL每20mg的肽)溶解在蒸馏水中，立即加入适合的酸(1.05当量)。涡旋该混合物一次，随后冷冻并冻干产生蓬松白色固体。
6.4实施例4：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 甲磺酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(51mg，0.073mmol)和甲磺酸(5μL，0.077mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(49mg，98％)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.98(s，1H)，8.57-8.22(m，2H)，8.18-7.91(m，2H)，7.42-7.34(m，2H)，7.18-7.06(m，2H)，6.95(s，1H)，4.79-4.58(m，1H)，4.57-4.22(m，4H)，3.23-3.12(m，3H)，3.06-2.71(m，4H)，2.34(s，3H)，2.00(s，3H)，1.90-1.64(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；C24H39N9O11S2分析计算值：N，21.09；S，9.24。实测值：N，15.88(肽含量，87％)；S，8.40.氯含量(IC)：0.0002％。
6.5实施例5：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 乙酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(22mg，0.034mmol)和乙酸(2.1μL，0.036mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(20mg，87％)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.61-8.48(m，1H)，8.26-7.86(m，3H)，7.73-7.60(m，1H)，7.33(s，1H)，7.13(s，1H)，7.06-6.97(m，1H)，6.95-6.82(m，2H)，4.63-4.22(m，5H)，3.70-3.57(m，4H，与水的信号重叠)，2.99-2.88(m，3H)，2.85-2.72(m，2H)，2.63-2.34(m，2H，与DMSO的信号重叠)，2.00(s，3H)，1.91(s，3H)，1.86-1.64(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；30氯含量(IC)：0.09％。
6.6实施例6：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 乙醇酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(23mg，0.036mmol)和乙醇酸(2.9mg，0.038mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(24mg，99％)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.60-8.48(m，1H)，8.25-7.85(n，3H)，7.69-7.58(m，1H)，7.33(s，1H)，7.13(s，1H)，7.08-6.98(m，1H)，6.95-6.81(m，2H)，4.63-4.22(m，6H)，3.90(s，2H)，3.57-3.12(m，8H，与水的信号重叠)，3.04-2.87(m，3H)，2.84-2.72(m，2H)，2.65-2.37(m，2H，与DMSO的信号重叠)，2.00(s，3H)，1.89-1.64(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；氯含量(IC)：0.09％。
6.7实施例7：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 硫酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(23mg，0.036mmol)和1.8M硫酸(21μL，0.038mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(23mg，92％)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.84-8.67(m，1H)，8.43-8.24(m，2H)，8.16-7.93(m，2H)，7.38-7.22(m，2H)，7.13(s，1H)，7.08(s，1H)，6.94(s，IH)，4.77-4.57(m，1H)，4.49-4.24(m，4H)，3.70-3.41(m，6H，与水的信号重叠)，3.18-3.06(m，3H，与水的信号重叠)，3.04-2.90(m，2H)，2.87-2.71(m，2H)，2.01(s，3H)，1.91-1.65(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；C23H37N9O12S2分析计算值：N，18.12；S，9.22。实测值：N，16.88(肽含量，93％)；S，7.76.氯含量(IC)：0.09％。
6.8实施例8；Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 D-(+)-樟脑磺酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(23mg，0.036mmol)和D-(+)-樟脑磺酸(8.7mg，0.037mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(29mg，100％)：1H NMR(300MHz，DMSOd6)δ8.92-8.83(m，1H)，8.45-8.23(m，2H)，8.17-7.88(m，2H)，7.38-7.27(m，2H)，7.13(s，1H)，7.09(s，1H)，6.94(s，1H)，5.13(brs，1H)，4.78-4.57(m，1H)，4.49-4.23(m，4H)，3.72-3.48(m，5H，与水的信号重叠)，3.20-3.09(m，2H，与水的信号重叠)，3.05-2.62(m，6H)，2.53-2.34(m，3H，与DMSO的信号重叠)，2.30-2.18(m，1H)，2.01(s，3H)，1.95-1.66(m，7H)，1.33-1.22(m，2H)，1.05(s，3H)，0.74(s，3H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；氯含量(IC)：0.09％。
6.9实施例9：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 苦杏仁酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(23mg，0.036mmol)和苦杏仁酸(5.8mg，0.038mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(30mg，112％)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.61-8.49(m，1H)，8.25-7.86(m53H)，7.68-7.57(m，1H)，7.44-7.25(m，6H)，7.13(s，1H)，7.07-7.00(m，1H)，6.96-6.81(m，2H)，4.99(s，2H)，4.63-4.20(m，5H)，3.54-3.10(m，10H，与水的信号重叠)，3.04-2.88(m，3H)，2.83-2.72(m，2H)，2.65-2.37(m，2H，与DMSO的信号重叠)，2.00(s，3H)，1.90-1.63(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；氯含量(IC)：0.01％。
6.10实施例10：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 水杨酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(23mg，0.036mmol)和水杨酸(5.4mg，0.039mmol)制备蓬松白色固体的该化合物：1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.50-8.29(m，2H)，8.27-7.92(m，3H)，7.73(dd，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.37-7.28(m，2H)，7.18-7.02(m，3H)，6.94(s，1H)，6.80-6.72(m，2H)，4.70-4.24(m，6H)，3.58-3.24(m，8H，与水的信号重叠)，3.12-2.89(m，5H)，2.84-2.71(m，2H)，2.66-2.37(m，2H，与DMSO的信号重叠)，2.00(s，3H)，1.92-1.63(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；氯含量(IC)：0.01％。
6.11实施例11：Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH 2 琥珀酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(21mg，0.032mmol)和琥珀酸(4.1mg，0.035mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(25mg，108％)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.61-8.50(m，1H)，8.25-7.85(m，3H)，7.66-7.56(m，1H)，7.34(s，1H)，7.13(s，1H)，7.07-7.00(m，1H)，6.96-6.79(m，2H)，4.63-4.20(m，5H)，3.69-3.57(m，3H，与水的信号重叠)，3.04-2.71(m，5H)，2.65-2.38(m，2H，与DMSO的信号重叠)，2.41(s，4H)，2.00(s，3H)，1.90-1.63(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；氯含量(IC)：0.01％。
6.12实施例12：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 氢溴酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(21mg，0.032mmol)和4.8％氢溴酸(38.1μL，0.034mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(23mg，105％)：1HNMR(300MHz，DMSO d6)δ9.00(s，1H)，8.50-8.22(m，2H)，8.14-7.90(m，2H)，7.41(s，1H)，7.36(s，1H)，7.14(s，1H)，7.10(s，1H)，6.95(s，1H)，4.80-4.58(m，1H)，4.49-4.24(m，4H)，3.72-3.56(m，3H，与水的峰重叠)，3.23-2.93(m，5H)，2.88-2.71(m，2H)，2.65-2.36(m，2H，与DMSO的峰重叠)，2.01(s，3H)，1.91-1.66(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；C23H36N9O8S分析计算值：N，18.58；Br，11.78。实测值：N，16.85(肽含量，91％)；Br，10.80。氯含量(IC)：0.01％。
6.13实施例13：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 硝酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(21mg，0.032mmol)和4.8％氢溴酸(38.1μL，0.034mmol)制备蓬松白色固体的该化合物(23mg，109％)：1H NMR(300MHz，DMSOd6)δ8.95-8.83(m，1H)，8.60-8.23(m，2H)，8.19-7.89(m，2H)，7.40-7.29(m，2H)，7.14(s，1H)，7.10(s，1H)，6.95(s，1H)，5.16(brs，1H)，4.79-4.58(m，1H)，4.57-4.24(m，4H)，3.72-3.49(m，5H，与水的峰重叠)，3.21-3.08(m，3H，与水的峰重叠)，3.05-2.88(m，2H)，2.86-2.71(m，2H)，2.64-2.37(m，2H，与DMSO的峰重叠)，2.01(s，3H)，1.93-1.57(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；C23H36N10O11S分析计算值：C，41.81；N，21.20。实测值：C，40.20；N，19.82(肽含量，93％)。氯含量(IC)：0.06％。
6.14实施例14：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 磷酸盐
根据实施例3的过程从游离碱(20mg，0.031mmol)和8.5％磷酸(22.1μL，0.032mmol)备蓬松白色固体的该化合物(22mg，105％)：1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.53-8.41(m，1H)，8.35-7.98(m，3H)，7.95-7.76(m，1H)，7.35(s，1H)，7.13(s，1H)，7.08-6.88(m，3H)，4.67-4.57(m，1H)，4.52-4.21(m，5H)，3.71-3.25(m，5H)，3.19-2.72(m，5H)，2.63-2.35(m，2H，与DMSO的峰重叠)，2.01(s，3H)，1.90-1.64(m，4H)；ES MS m/z(M+H)+598.3；C23H36N10O11S分析计算值：N，18.12；P，4.45。实测值：N，16.69(肽含量，92％)；P，3.94。氯含量(IC)：0.06％。
6.15实施例15；Ac-Pro-His-Cvs-Asn-NH 2 游离碱和盐酸盐的溶液 相稳定性比较
将1.657mM的Ac-PHSCN-NH2蒸馏水溶液和1.653mM的Ac-PHSCN-NH2盐酸盐蒸馏水溶液置于25±1℃水浴中。定时取出等份(800μL)并利用HPLC来测定二聚化的量。
在Waters HPLC上采集所有HPLC光谱，该Waters HPLC包含Breeze软件、Waters 2487双λ吸光度检测器、Waters 1525二元HPLC泵和Waters717加自动采样器。柱子为Phenomenex Synergi 4μHydro-RP 8OA，250×4.60mm 4μ微米。如下表所述采用40分钟(minute)梯度。
移动相A：0.1％TFA乙腈溶液
移动相B：0.1％TFA水溶液
  时间   流速(mL/分钟)   ％A   ％B
  0   1.0   3.0   97.0
  30.0   1.0   100   0
  33.0   1.0   100   0
  33.5   1.0   3.0   97.0
  35.0   1.0   3.0   97.0
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2单体的HPLC峰位于约9.2分钟，ATN-161二聚体的峰位于约10.0分钟，结合二者来确定每一样品中这两种的百分比。
研究结果见下表。图2图示了该结果。
表1：游离碱
  时间   ％单体   ％二聚体
  0h   93.3   6.7
  69h   82.6   17.4
  140h   76.5   23.5
  188h   71.9   28.1
  236h   65.7   34.3
  309h   61.1   38.9
  357h   56.7   43.3
  404h   48.6   51.4
  477h   31.3   68.7
  525h   16.8   83.2
  622h   0   100
表2：盐酸盐
  时间   ％单体   ％二聚体
  0h   100   0
  69h   96.7   3.3
  140h   93.9   6.1
  188h   93.6   6.4
  236h   93.2   6.8
  309h   93.3   6.7
  357h   93.3   6.7
  404h   92.7   7.3
  477h   91.6   8.4
  525h   91.0   9.0
  622h   89.3   10.7
6.16实施例16：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 游离碱和盐酸盐的固相 稳定性比较
0.8-1.2mg的Ac-PHSCN-NH2和Ac-PHSCN-NH2盐酸盐样品称重加到HPLC样品小瓶中，并在25±1℃存储。在0时间点取出。定时取出并用蒸馏水稀释产生1mg/mL的溶液。如实施例15所述通过HPLC来测定二聚化的量。研究结果见以下表格。图3图示了该结果。
表3：游离碱表        4：盐酸盐
  时间   ％单体   ％二聚体
  0h   91.5   8.5
  73h   90.0   10.0
  143h   88.5   11.5
  243h   87.3   12.7
  312h   86.0   14.0
  410h   86.2   13.8
  576h   84.8   15.2
  677h   93.9   16.1
  818h   82.1   17.9
  时间   ％单体   ％二聚体
  0h   100   0
  73h   100   0
  143h   100   0
  243h   100   0
  312h   100   0
  410h   100   0
  576h   99.7   0.3
  677h   99.3   0.7
  818h   100   0
6.17实施例17：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 游离碱和甲磺酸盐和硝 酸盐的溶液相稳定性比较
将Ac-PHSCN-NH2甲磺酸盐(31.0mg，93.5％单体，0.0418mmol)在25mL容量烧瓶中溶解在蒸馏水中得到1.67mM溶液。在第二个25mL容量烧瓶中，将Ac-PHSCN-NH2硝酸盐(29.0mg，93.5％单体，0.0410mmol)溶解在蒸馏水中以得到1.64mM溶液，并在第三个25mL容量烧瓶中，将Ac-PHSCN-NH2游离碱(26.3mg，94.5％单体，0.0416mmol)溶解在蒸馏水中以得到1.66mM溶液。在0h时间点取出每一溶液。将容量烧瓶放置在25±0.5℃的水浴中，并定时取出0.7mL等份，如实施例15所述通过HPLC来分析该溶液。研究结果见以下表格。图4图示了该结果。
表5：游离碱
  时间(h)   ％单体   ％二聚体
  0   92.2   7.8
  69   73.9   26.1
  140   69.3   30.7
  213   65.0   35.0
  332   57.5   42.5
  408   53.6   46.4
  479   49.0   51.0
  549   43.8   56.2
  645   31.1   68.9
  720   17.8   82.2
表6：甲磺酸
  时间(h)   ％单体   ％二聚体
  0   92.6   7.4
  69   77.4   22.6
  140   69.7   30.3
  213   62.8   37.2
  332   52.0   48.0
  408   45.5   54.5
  479   39.5   60.5
  549   33.3   66.7
  645   25.7   74.3
  720   20.7   79.5
表7：硝酸
  时间(h)   ％单体   ％二聚体
  0   94.0   6.0
  69   77.3   22.7
  140   73.2   26.8
  213   73.0   27.0
  332   71.4   28.6
  408   71.1   28.9
  479   69.2   30.8
  549   63.6   36.4
  645   54.1   45.9
  720   46.0   54.0
  836   1.5   98.5
  836   15.2   84.8
  836   36.0   64.0
6.18实施例18：Ac-Pro-His-Ser-Cvs-Asn-NH 2 游离碱和甲磺酸盐和硝 酸盐的固相稳定性比较
将11个Ac-PHSCN-NH2甲磺酸盐样品(0.7-1.0mg每份样品)、12个Ac-PHSCN-NH2硝酸盐样品(0.7-1.0mg每份样品)和12个Ac-PHSCN-NH2游离碱样品(0.7-1.0mg每份样品)称重放入HPLC样品小瓶中，并储存在25±0.5℃的孵育器中。定时取出每一肽的样品小瓶并将该材料溶解在足量的蒸馏水中以产生1mg/mL溶液，如实施例15所述通过HPLC来分析该溶液。研究结果见以下表格。图5图示了该结果。
表8：游离碱
  时间(h)   ％单体   ％二聚体
  0   93.9   6.1
  161   88.4   11.6
  335   87.5   12.5
  498   85.4   14.6
  670   85.2   14.8
  832   84.3   15.7
  1003   83.0   17.0
  1170   83.5   16.5
  1363   82.4   17.6
  1506   81.4   18.6
  1698   80.8   19.2
表9：甲磺酸
  时间(h)   ％单体   ％二聚体
  0   93.2   6.8
  161   92.8   7.2
  335   92.5   7.5
  498   93.0   7.0
  670   92.3   7.7
  832   92.8   7.2
  1003   92.8   7.2
  1170   92.7   7.3
  1363   91.4   8.6
  1506   92.4   7.6
  1698   91.9   8.1
表10：硝酸
  时间(h)   ％单体   ％二聚体
  0   92.0   8.0
  161   92.6   7.4
  335   92.2   7.8
  498   92.8   7.2
  670   92.3   7.7
  832   92.3   7.7
  1003   92.6   7.4
  1170   92.3   7.7
  1363   93.3   6.7
  1506   92.6   7.4
  1698   92.4   7.6
最后，应理解有许多实施本发明的可替换的方式。因此，所给出的实施方案应视为是示例性而非限制性的，而且本发明并不限于本文所给出的详细描述，而是可以在所附的权利要求的范围和等价范围内进行改进。本文引用的所有公开出版物和专利文献以参考的方式引入。
                序列表
<110>阿特努奥恩公司
<120>Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐
<130>9715-022-228
<140>
<141>
<150>60/649,308
<151>2005-02-01
<160>1
<170>PatentIn Version 3.2
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>纤连蛋白衍生物(抗血管生成肽)
<400>1
Pro His Ser Cys Asn
1               5

Claims (31)

1.Ac-PHSCN-NH2(SEQ ID NO.1)的酸加成盐。
2.如权利要求1所述的酸加成盐，其中所述酸选自甲磺酸、乙酸、乙醇酸、硫酸、(+)樟脑磺酸、苦杏仁酸、水杨酸、琥珀酸、氢溴酸、硝酸和磷酸。
3.如权利要求1所述的酸加成盐，其中所述酸是盐酸。
4.药物组合物，其包含如权利要求1所述的酸加成盐和药学上可接受的媒介物。
5.治疗或预防患者以异常的血管化或异常的血管生成为特征的疾病或病症的方法，所述方法包含给予需要该治疗或预防的患者治疗有效量的如权利要求1所述的酸加成盐。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述酸加成盐是纯化的。
7.治疗或预防患者以异常的血管化或异常的血管生成为特征的疾病或病症的方法，所述方法包含给予需要该治疗或预防的患者治疗有效量的如权利要求4所述的药物组合物。
8.如权利要求5所述的方法，该方法是治疗方法，还包含给予需要该治疗的患者治疗有效量的不是所述酸加成盐的抗血管生成剂。
9.如权利要求7所述的方法，该方法是治疗方法，还包含给予需要该治疗的患者治疗有效量的不是所述酸加成盐的抗血管生成剂。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述血管生成疾病是癌症。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、肾癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、软骨肉瘤或血管肉瘤。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述血管生成疾病是癌症。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、肾癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、软骨肉瘤或血管肉瘤。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述酸是盐酸。
15.稳定Ac-PHSCN-NH2防止其降解的方法，所述方法包括向Ac-PHSCN-NH2添加酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述降解是由于二聚化引起的。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述酸选自甲磺酸、乙酸、乙醇酸、硫酸、(+)樟脑磺酸、苦杏仁酸、水杨酸、琥珀酸、氢溴酸、硝酸和磷酸。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述酸是盐酸。
19.包含权利要求1所述酸加成盐的溶液，其在23-25℃约600小时后，所述盐的单体高于85％。
20.如权利要求19所述的溶液，其中所述酸是盐酸。
21.Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐，其在23-25℃约800小时后基本上是纯的。
22.如权利要求21所述的酸加成盐，其纯度高于99％。
23.如权利要求21所述的酸加成盐，其中所述酸是盐酸。
24.如权利要求1所述的酸加成盐，其是冻干的。
25.如权利要求24所述的酸加成盐，其中所述酸是盐酸。
26.试剂盒，包括含有Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐的第一容器。
27.如权利要求26所述试剂盒，其中所述Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐是冻干的。
28.如权利要求27所述试剂盒，还包括含无菌水溶液的第二容器。
29.如权利要求26所述试剂盒，还包括注射器。
30.如权利要求26所述试剂盒，还包括含抗血管生成剂的另一容器，该血管生成剂不是Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐。
31.Ac-PHSCN-NH2的酸加成盐用作药物的应用。
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