CN101151052A - 分层纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了形成分层纳米颗粒的方法，该方法包括提供悬液，该悬液包括在第一种液体中的核心颗粒，将第二种液体加入至悬液中，并向悬液中加入反应物、或反应物的前体。第二种液体与第一种液体是不能混溶的。如果反应物加入至悬液中，则该反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，以形成分层纳米颗粒。如果将反应物的前体加入至悬液中，则前体转变成反应物，该反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，以形成分层纳米颗粒。

Description

分层纳米颗粒
技术领域
本发明涉及分层纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
一般认为可控药物递送能提高癌症化疗药物的安全性和临床功效，这些化疗药物由于非特异性的毒性一般会产生严重的副作用。解决这个问题的一种方式是优选将细胞毒性药物递送给肿瘤。几个研究组已经明确，直径范围在50-250nm的具有适当的物理化学特性的纳米球形颗粒，在静脉注射后一天至两天的时间内可从体循环选择性地分布至肿瘤肿块内。这是由于许多肿瘤内微脉管系统的异常结构所引起的。多种类型的纳米颗粒递送系统已经进行了试验性地应用，但大多数受到了明显的限制，从而排除了它们最终用于医疗应用的用途。
主要的限制因素如下：
1)其物理稳定性太差，不能提供足够长的血液循环从而保证积聚到肿瘤(例如脂质体)内，
2)从大多数类型纳米颗粒的释放率太快，不能为肿瘤提供突击剂量(concentrated dose)，
3)目前开发的稳定的纳米颗粒其药物载量非常低，且释放速率缓慢，不足以递送适当的治疗剂量，
4)许多类型的纳米颗粒系统会被免疫系统(即网状内皮系统)迅速地检测到，并从血流中清除，导致小部分药物到达肿瘤。
用作药物递送载体的大多数材料实质上是有机的：聚合物、脂质体、树状大分子等。相反，相对于有机递送基质，陶瓷材料提供许多优势。例如，二氧化硅颗粒是生物学惰性的，具有亲水表面。它们也是无毒、高度生物相容的，可在低温下合成以便能维持药物的分子结构。而且，在大量化学环境中，其尺寸和孔隙度保持稳定。溶胶-凝胶技术，一种无机室温聚合技术(见图1)已经被用来成功地将有机分子包封在氧化物基质内。
在过去的几年中，本发明人已经开发了用来生产用于可控释放应用的陶瓷颗粒的技术(WO01/62332)。该技术组合使用了溶胶-凝胶化学和油包水(W/O)乳液合成，使活性分子包封在陶瓷颗粒中。颗粒的粒径通过乳滴的尺寸来控制，释放动力学通过溶胶-凝胶化学来控制。为了使用这种方法产生单分散型纳米颗粒，要使用稳定的微乳液。在这种系统中，水滴的尺寸通常限于几纳米至几十纳米，甚至在存在大量的奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald ripening)时，最终的粒径仍限制在不超过100nm。使用不稳定的乳液系统可获得较大的粒径，但得到的颗粒呈现很宽的粒径分布，在例如肿瘤被动靶向的需要对粒径进行精确控制的应用中，这是不合乎需要的。尽管使用Stber法(在稀释介质中的籽晶生长)能完成这种对粒径的精确控制，但这种类型的方法不能提供在乳液中的区室化(compartmentalisation)，这种区室化对于保证活性材料在胶凝过程中的包封是必需的。因此Stber法不适合用来合成用于可控释放用途的颗粒。在专利WO01/62332中概述的技术的另一个限制是，其不能产生具有延缓、连续或脉冲式释放次序的颗粒。一旦陶瓷颗粒被导入进液体中，它们立即开始释放。通过产生核心-外壳结构可以克服这种缺点，在这种结构中活性分子位于被空外壳包围的核心中，该外壳用作扩散屏障，并防止活性组分快速地滤出。
在过去十年中已经进行了大量的工作，试图获得活性分子从特定基质的复杂和特定的释放模式。已经研究了药物从各种递送载体中的延缓释放、定时释放或连续释放。为了获得这些复杂的释放模式，递送系统可以基于改变递送材料的物理化学性质或改变系统的形态学，如使用多层结构。所有这些系统使用多种形式的有机基质：聚合物凝胶、脂质体、纤维、微胶囊、片剂等。颗粒，更具体来说纳米颗粒，并没有进行这些类型应用的研究。
在过去十年里已经对具有特定的结构、光学和表面特性的核心-外壳胶体材料进行了大量的研究。这些胶体在大量领域中的潜在应用推动了此领域内的研究。大多数研究工作都集中在通过将指定颗粒包被或包封在不同材料制成的外壳内而改变其表面特性。核心可以是金属氧化物、半导体、量子点(quantum dot)、磁性颗粒、结晶颗粒等，而外壳通常能改变颗粒表面的电荷、功能性和反应性，也可增强胶体核心的稳定性和分散性。换句话说，核心的材料与外壳材料不同，最普遍报道的核心-外壳结构是具有聚合物外壳的陶瓷核心，或反过来。在文献中也已经报道了含有被包封的活性组分和用不同类型陶瓷材料包被的陶瓷核心。
在文献中已经报道了几种方法来使用溶胶-凝胶合成法经W/O微乳化作用生长陶瓷颗粒。一种这样的方法依靠通过调节合成参数来获得较大的粒径。尽管通过控制参数如前体浓度、水浓度、PH、温度、离子强度、反应时间可调节粒径，但对颗粒的生长有一定的限制。由于反胶团的内在特性，使用这种方法很难产生大于100nm的单分散性颗粒。文献中报道的另一种方法包括提取颗粒籽晶(particle seeds)，将其干燥，然后将这些籽晶再分散到新鲜的W/O微乳液中，接着加入更多的醇盐前体来生长颗粒。这种方法有两个缺点。首先，在提取和干燥步骤中，颗粒会不可逆地聚集成为微米尺寸的凝聚体，其次，该程序加入了附加的分离步骤以从液体中回收固体颗粒，这样会明显降低总收率。还有另一种方法可用来增加粒径，该方法描述于图2中。但在此情况下，活性分子仅能被包封在核心中。另外，醇盐前体需要消耗水进行反应，这一事实限制了颗粒的生长。由于形成W/O微乳液规定了水的用量，因此仅能获得有限的水供应量。实际上，系统中引入的水并不是所有都能用于溶胶-凝胶反应，因为一些水与表面活性剂发生了结合。当加入更多的醇盐时，更多的水被消耗，能用于进一步水解和生长的水则更少。
因此需要一种分层纳米颗粒，其中掺杂剂位于并局限于纳米颗粒的核心和/或包围核心的一层或多层覆层上，并且需要制备这种纳米颗粒的方法。也需要一种方法能够制备核心-外壳陶瓷纳米颗粒，其具有一个以上的被包封的分子物种(掺杂剂)或具有包封在不同的独立位置或覆层(即外壳)中的活性组分(掺杂剂)。这种方法可开启大量的新的潜在应用，例如，除了上述的药物可控释放以外，光存储器、数据加密或防伪油墨(security ink)。
发明内容
本发明的目的是克服或基本上改进上述缺点中的至少一个缺点。进一步的目的是至少部分地满足上述需求中的至少一种需求。
从广义上的形式来说，本发明提供了一种形成分层纳米颗粒的方法，该方法包括在核心颗粒的存在下将催化剂与反应物接触，因此反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，以形成分层纳米颗粒。催化剂、反应物和核心颗粒可放置在流体中。流体可以是液体。催化剂可位于核心颗粒之上和/或之中和/或周围。催化剂可以是反应物反应的催化剂。催化剂可位于颗粒的表面上。反应可包括水解、缩合、缩聚、交联、聚合、沉淀和胶凝化中的一种或多种。可以有包围核心颗粒的掺杂剂，反应物的反应可将掺杂剂包封在覆层中。核心颗粒可形成分层纳米颗粒的核心。因此，分层纳米颗粒一旦形成，可包括至少部分被覆层包围或包封的核心颗粒。核心颗粒可完全被覆层包围或包封。核心颗粒可以是单个颗粒或两个或多个颗粒的凝聚体。核心颗粒可包括与覆层相同的材料或可包括不同的材料。
在一个形式中，本发明提供了形成分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
-提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的核心颗粒；和
-在核心颗粒的存在下将催化剂与反应物接触，
因此反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，以形成分层纳米颗粒。
在液体中提供核心颗粒的步骤可包括在第一种液体中形成核心颗粒。在一个实施方式中，在接触步骤之前颗粒与第一种液体不分离。第一种液体可以是非极性的。
接触步骤可重复一次或多次，从而形成多层覆层。接触步骤可包括以下的步骤：
-将第二种液体加入至悬液中，所述的第二种液体包括催化剂；和
-向悬液中加入反应物、或反应物的前体；
其中，如果将反应物加入悬液中，则反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，如果将反应物的前体加入悬液中，则前体转变为反应物，反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层。催化剂可溶解在第二种液体中。第二种液体可以与第一种液体不混溶。催化剂可以是前体转变为反应物和/或从反应物形成覆层的催化剂。
在另一种形式中，本发明提供了制备分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
-提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的核心颗粒；
-将第二种液体加入至悬液中，所述的第二种液体包括反应物反应的催化剂；和
-向悬液中加入反应物、或反应物的前体，以便使反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层。
在另一个形式，本发明提供了形成分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
-提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的核心颗粒；
-将第二种液体加入至悬液中，所述的第二种液体与第一种液体不混溶；和
-向包括第二种液体的悬液中加入反应物、或反应物的前体；其中，如果将反应物加入至包括第二种液体的悬液中，则反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，如果将反应物的前体加入至包括第二种液体的悬液中，则前体转变为反应物，由此形成的反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，以形成分层纳米颗粒。第二种液体可包括催化剂。如果第二种液体不包括催化剂，则反应物能够不需要催化剂而形成覆层，和/或前体能够不需要催化剂而形成反应物。例如，如果第二种液体是含水的，前体可以是硅烷，其在没有催化剂的情况下发生水解。
在另一种形式中，该方法包括：
-提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的核心颗粒；
-将第二种液体加入至悬液中，所述的第二种液体包括反应物反应的催化剂；和
-向悬液中加入反应物的前体，以便使前体转变为反应物，并使反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层。
第二种液体与第一种液体可以不混溶。加入第二种液体的步骤可包括将第二种液体沉积在核心颗粒上，例如核心颗粒的表面上。如果前体加入至悬液中，则前体可以能够与第二种液体反应而形成反应物，即它可以是反应物的前体。反应物可以是可缩合的物种、可交联的物种或可聚合的物种。反应物的反应可在核心颗粒上形成固体层或凝胶层，可包括反应物的缩合、交联和/或聚合。核心颗粒可以是纳米颗粒，且直径可以在大约5和150nm之间，或可以是亚微米颗粒，且直径可以小于大约500nm。核心颗粒和/或覆层可以是固体，可以是多孔的，例如微孔的和/或中孔性的。第二种液体可包括掺杂剂，由此覆层的形成将掺杂剂包封在覆层中。加入第二种液体和加入反应物的步骤可以重复一次或多次，从而形成多层覆层。核心颗粒和每层覆层各自地可以具有掺杂剂或没有掺杂剂，如果存在，掺杂剂可以是相同的或不同的。该掺杂剂或每种掺杂剂可以是可释放的物质，可以从纳米颗粒中释放。该方法可产生包括多个分层纳米颗粒的纳米颗粒状物质，由此提供悬液的步骤包括提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的多个核心颗粒。核心颗粒、和纳米颗粒状物质的分层纳米颗粒各自在形状上可以是同质的或者可以在形状上是异质的。它们可以是单分散的，或可以具有狭窄的粒径分布，或者它们可以具有很宽的粒径分布。
在本发明的一个方面，提供了制备分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
a)提供悬液，所述悬液包括在第一种非极性液体中的核心颗粒、第一种表面活性剂和任选的第一种助表面活性剂；
b)向悬液中加入含水液体，所述的含水液体包括用于缩合可缩合物种的催化剂，也任选地包括掺杂剂或多种掺杂剂的组合；
c)加入第二种非极性液体、第二种表面活性剂和任选的第二种助表面活性剂，所述的第二种非极性液体与第一种非极性液体不混溶；和
d)向悬液提供可缩合的物种(反应物)，这样可缩合物种在催化剂的存在下缩合而形成至少部分包围核心颗粒的覆层，从而产生分层纳米颗粒。
第二种非极性液体可以与第一种非极性液体相同或不同。第二种表面活性剂可以与第一种表面活性剂相同或不同。第二种助表面活性剂可以与第一种助表面活性剂相同或不同。可加入第二种非极性液体、第二种表面活性剂和第二种助表面活性剂，这样第一种非极性液体加第二种非极性液体与第一种表面活性剂加第二种表面活性剂的比例、和与第一种助表面活性剂加第二种助表面活性剂的比例，基于v/v、v/w、w/w、v/mol或w/mol保持恒定。悬液可以在大约1和70℃之间的温度下提供，或该方法可包括将悬液的温度调至大约1和70℃之间的温度，普遍地在大约15和40℃之间，更普遍地在大约20和30℃之间，即环境温度。可以使用较低的温度，只要该温度下分散相和连续相不会冻结。有时可使用较高的温度，取决于两个相的挥发性和沸点以及表面活性剂的转化温度。步骤d)可包括向悬液提供可水解的物种以形成分层纳米颗粒，所述的可水解物种能够在含水液体中水解以形成可缩合的物种。步骤d)可包括在含水液体中将可水解物种水解和在含水液体中将可缩合物种缩合以形成覆层的步骤。该方法可包括将悬液在足够的温度下(例如大约1和70℃之间)保持足够的时间(例如大约6和96小时之间)以水解可水解物种、以及任选地缩合可缩合物种的步骤。步骤b)至d)可重复至少一次，或可重复2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10次。在每次重复中，含水液体可包括掺杂剂或多种掺杂剂的组合，或可不包括掺杂剂，并且如果有的话，在任意一次重复中的掺杂剂可以与任意的其他次重复中的掺杂剂相同或不同。每次重复可形成一层，每层可包括掺杂剂，或可不包括掺杂剂。掺杂剂或每种掺杂剂可以是可释放的物质，或可以是不可释放的物质。核心颗粒的直径可以在大约5和150nm之间，或直径可以小于500nm。覆层或每层覆层的平均厚度可以在大约1和100nm之间，或在大约1和50nm之间、5和75nm之间、或5和30nm之间。该方法可以控制该层或每层的厚度。核心颗粒可以是多孔的，可以是微孔的和/或可以是中孔性的，其孔径可以在大约0.5和20nm之间。核心颗粒可包括掺杂剂，其与该覆层或任意一层或所有覆层中的掺杂剂可以是相同的或不同的。在任意一次重复中的可水解物种与任意其他次重复中的可水解物种可以是相同的或不同的。悬液和含水液体中之一或两者都可包括表面活性剂。该方法可产生包括多个分层纳米颗粒的纳米颗粒状物质，由此提供悬液的步骤包括提供悬液，所述悬液包括在第一种非极性液体中的多个核心颗粒。
该方法可另外包括下列步骤中的一个或多个步骤：
e)从第一种非极性液体中至少部分地分离分层纳米颗粒或纳米颗粒状物质；
f)用含水液体洗涤分层纳米颗粒或纳米颗粒状物质；
g)用有机液体洗涤分层纳米颗粒或纳米颗粒状物质；
h)将分层纳米颗粒或纳米颗粒状物质干燥。
步骤f)可在室温下进行，或可以在高达80℃(例如，在大约20、30、40、50、60、70或80℃)下进行。步骤g)的有机液体可以是极性的或非极性的。其极性的选择取决于掺杂剂在有机液体中的溶解性。步骤g)可在室温下进行，或可以在高达70℃(例如，在大约20、30、40、50、60或70℃)下进行，但应该在或低于有机液体的沸点的温度下进行。步骤f和g可以进行超过一次，并可以以任意的次序进行，或省略一个或两个步骤。例如，该方法可包括(以该次序)步骤e和h，或步骤e、f和h，或步骤e、g和h，或步骤e、f、g和h，或步骤e、g、f和h，或步骤e、g、f、g和h，或可包括一些其他次序的步骤。步骤h可以以防止或抑制聚集的方式进行，例如步骤h可包括在W01/62332(Barbé和Bartlett，“Controlled Release Ceramic Particles，Compositions thereof，Processes of Preparation and Methods of Use(可控释放的陶瓷颗粒、其组合物、制备方法和使用方法)”)中所述的冷冻干燥。步骤h可直接在步骤e后实施。在这种情况下，在该阶段存在的大量表面活性剂可防止颗粒间的物理接触，从而抑制聚集。
在一个实施方式中，提供了制备其中或其上具有掺杂剂的分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
a)提供稳定悬液，所述悬液包括在非极性液体中的核心颗粒、表面活性剂和任选的助表面活性剂；
b)向悬液中加入含水液体，所述的含水液体包括掺杂剂和用于缩合可缩合物种的催化剂；
c)加入第二种非极性液体、第二种表面活性剂和任选的第二种助表面活性剂；和
d)向悬液中加入可水解的物种，以形成在其中或其上具有掺杂剂的分层纳米颗粒，所述的可水解物种能够在含水液体中水解以形成可缩合的物种。
悬液和含水液体中之一或两者都可包括表面活性剂。表面活性剂可溶解于含水液体或悬液或两者中。
在另一个实施方式中，该方法包括：
a)提供一种乳液，其包括分散在非极性液体中的水滴，所述的乳液另外包括表面活性剂和任选的助表面活性剂，其中水滴包括用于在水解过程中缩合第一种可缩合物种的催化剂；
b)向乳液中加入第一种可水解的物种，所述的第一种可水解物种能够在水滴中水解而形成第一种可缩合物种，从而在非极性液体中形成核心颗粒的悬液；
c)向悬液中加入含水液体，所述的含水液体包括用于缩合第二种可缩合物种的催化剂；
d)向悬液中加入第二种表面活性剂和任选的第二种助表面活性剂的溶液；和
e)向悬液中加入第二种可水解的物种，所述的第二种可水解的物种能在含水液体中水解以形成第二种可缩合的物种。
乳液可以是油包水(W/O)乳液。在加入第一种可水解物种(步骤b)或第二种可水解物种(步骤e)后，可水解物种可以水解而分别形成第一种或第二种可缩合的物种，然后由于催化剂的作用缩合形成至少部分包围核心颗粒的覆层。第一种可水解物种和第二种可水解物种可以是相同的或不同的。步骤c)至e)可重复至少一次，或可以重复2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10次，由此每次重复形成至少部分包围核心颗粒的覆层。在每次重复中，含水液体可包括掺杂剂或可不包括掺杂剂，在任意一次重复中的掺杂剂与任意的其他次重复中的掺杂剂可以是相同的或不同的。乳液和/或含水液体可包括掺杂剂，选自核心颗粒和(多层)覆层的至少一个区域可包括至少一种掺杂剂。
在另一个实施方式中，提供了制备分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
a)提供包括表面活性剂和非极性液体、以及任选的助表面活性剂的表面活性剂溶液；
b)向表面活性剂溶液中加入水溶液，该水溶液包括用于缩合第一种可缩合物种的催化剂，并任选地包括第一种掺杂剂(核心掺杂剂)；
c)从表面活性剂溶液和水溶液形成乳液；
d)向乳液中加入第一种可水解物种，所述的第一种可水解物种能够在水溶液中水解而形成第一种可缩合物种；
e)将乳液在足够的温度下保持足够的时间，用于从第一种可水解物种形成核心颗粒的悬液；
f)将含水液体加入至悬液中，所述的含水液体包括用于缩合第二种可缩合物种的催化剂、和任选的第二种掺杂剂(覆层掺杂剂)；
g)向悬液中加入第二种表面活性剂和任选的第二种助表面活性剂的溶液；和
h)向悬液中加入第二种可水解的物种以形成分层纳米颗粒，其中第二种可水解物种能在含水液体中水解而形成第二种可缩合的物种。
在加入第一种可水解物种或第二种可水解物种后，可水解的物种可水解而分别形成第一种或第二种可缩合物种，然后可由于催化剂的作用发生缩合。
乳液可以是微乳液。
在另一个实施方式中，提供了制备分层纳米颗粒的方法，该方法包括：
a)提供包括表面活性剂和非极性液体、以及任选的助表面活性剂的表面活性剂溶液；
b)向表面活性剂溶液中加入水溶液，该水溶液包括用于缩合第一种可缩合物种的催化剂，并任选地包括第一种掺杂剂；
c)从表面活性剂溶液和水溶液形成乳液；
d)向乳液中加入第一种可水解物种，所述的第一种可水解物种能够在水溶液中发水解而形成第一种可缩合物种；
e)将乳液在足够的温度下保持足够的时间，用于从第一种可水解物种形成核心颗粒的悬液；
f)将含水液体加入至悬液中，所述的含水液体包括用于缩合第二种可缩合物种的催化剂、和任选的第二种掺杂剂；
g)向悬液中加入第二种表面活性剂和任选的第二种助表面活性剂的溶液；和
h)向悬液中加入第二种可水解的物种以形成分层纳米颗粒，其中第二种可水解物种能在含水液体中水解而形成第二种可缩合的物种；
i)从非极性液体中至少部分地分离分层纳米颗粒；
j)用有机液体洗涤分层纳米颗粒；
k)用含水液体洗涤分层纳米颗粒；
l)用有机液体(与步骤j的有机液体可以是相同的或不同的)洗涤分层纳米颗粒；和
m)将分层纳米颗粒干燥。
在本发明的另一个方面，提供了一种分层纳米颗粒，其包括核心颗粒(即核心)和至少部分地包围所述核心颗粒的一层或多层覆层。分层纳米颗粒可以是球体。核心颗粒可以是固体，可以是多孔的固体，例如微孔或中孔性的固体，可以是球体或非球体。核心的平均直径可以在大约5和500nm之间。覆层或每层覆层可以各自地是固体层或凝胶层。选自核心和一层或多层覆层的分层纳米颗粒的至少一个区域可包括掺杂剂、或多种(例如，2、3、4、5或超过5种)掺杂剂。因此，可以有核心掺杂剂和/或一层或多层覆层掺杂剂。掺杂剂或每种掺杂剂可以基本上均匀地分布在包括所述掺杂剂的区域内。因此，例如如果纳米颗粒包括核心和单层覆层，且核心包括核心掺杂剂，而覆层包括覆层掺杂剂，则核心掺杂剂可以基本上均匀地分布在核心中，覆层掺杂剂可以基本上均匀地分布在覆层中。分层纳米颗粒可以是微孔的或中孔性的陶瓷纳米颗粒。核心和一层或多层覆层每种都可独自地是微孔的或中孔性的。覆层或每层覆层、和任选的核心颗粒可独自地包括水解硅烷，例如水解烷氧基硅烷，并且可包括二氧化硅和/或聚倍半硅氧烷。覆层或每层覆层、和任选的核心颗粒可独自地包括陶瓷或氧化物，例如金属氧化物。如果核心和一层或多层覆层中的一个以上包括掺杂剂，则这其中的每个中的掺杂剂可以是相同的或不同的。掺杂剂或每种掺杂剂可独自地是可释放的或不可释放的。分层纳米颗粒可以能够顺序释放和/或延缓释放一种或多种可释放的掺杂剂。分层纳米颗粒的平均直径在大约10和500nm之间。核心和覆层或每层覆层可独自地是微孔的或中孔性的，可以具有大约0.5和10nm之间的孔隙。覆层或每层覆层可独自地具有大约1和50nm之间的平均厚度。掺杂剂可以是无机物质或有机物质。它可以是盐、或染料、催化剂、活性材料或活性物质，例如生物活性物质(例如蛋白质、多糖、酶、药物、肽等)、磁性物质、放射性核素、放射性示踪剂或一些其他类型的掺杂剂。
在一个实施方式中，提供了一种分层纳米颗粒，其包括多孔的核心颗粒和多孔覆层，所述核心颗粒包括第一种掺杂剂，所述多孔覆层包括至少部分包围所述核心颗粒的第二种掺杂剂。第一种和第二种掺杂剂中至少之一可从分层纳米颗粒中释放。因此纳米颗粒可包括多孔的核心颗粒和多孔的覆层，所述多孔的核心颗粒包括第一种可释放的掺杂剂，所述多孔的覆层包括至少部分地包围所述核心颗粒的第二种可释放的掺杂剂。纳米颗粒能够顺序释放第二种可释放的掺杂剂和第一种可释放的掺杂剂。
在另一个实施方式中，提供了一种分层纳米颗粒，该纳米颗粒包括含有第一种可释放掺杂剂的多孔核心颗粒、包围该核心颗粒的第一层多孔覆层、和第二层多孔覆层，所述第一层覆层不包括可释放的掺杂剂，所述第二层多孔覆层包括至少部分包围第一层多孔覆层的第二种可释放的掺杂剂。纳米颗粒能够顺序地释放第二种可释放的掺杂剂和第一种可释放的掺杂剂，在第二种与第一种掺杂剂的释放之间有一定的延迟。延迟的时间长度可取决于第一层覆层的厚度和孔隙度。
在另一个实施方式中，提供了一种分层纳米颗粒，该纳米颗粒包括不含有可释放掺杂剂的核心颗粒、和多孔覆层，所述多孔覆层包括至少部分包围所述核心颗粒的可释放掺杂剂。核心颗粒可包括不可释放的掺杂剂，例如用于对纳米颗粒着色的不可释放的颜料。核心可以是多孔的或无孔的。核心可包括磁性材料，这样分层纳米颗粒是有磁性的。
在另一个实施方式中，提供了一种分层纳米颗粒，该纳米颗粒包括无孔的核心颗粒和不包括可释放掺杂剂的多孔覆层，所述核心颗粒包括可释放的掺杂剂、或任选地由可释放的掺杂剂组成，所述的多孔覆层至少部分地包围核心颗粒。纳米颗粒能够在一定的延迟后释放掺杂剂。延迟的长度可取决于多孔覆层的厚度和孔隙度。覆层可具有不可释放的掺杂剂，例如用于对纳米颗粒着色的不可释放的颜料。
本发明也提供了一种纳米颗粒状物质，其包括多个根据本发明的分层纳米颗粒。纳米颗粒状物质可以是单分散的，或可以具有狭窄的粒径分布。
本发明也提供了一种通过本发明的方法制造的分层纳米颗粒。本发明还提供了一种纳米颗粒状物质，其包括多个根据本发明的分层纳米颗粒、或是由本发明的方法制造的分层纳米颗粒。
在本发明的另一个方面，提供了将可释放的物质递送至流体的方法，该方法包括将根据本发明的分层纳米颗粒或多个根据本发明的分层纳米颗粒与流体接触，其中(多个)分层纳米颗粒其中和/或其上具有可释放的物质(例如，在覆层或核心颗粒中至少之一中)，流体能够至少部分地从分层纳米颗粒中释放可释放的物质。
流体可以是含水流体，例如生物学流体，或可以是不含水的流体，例如有机溶剂。接触可包括将(多个)分层纳米颗粒与流体进行搅拌、振动、涡旋、超声处理或另外进行搅动。该方法可包括将可释放的物质释放至流体中，并可包括以可控的方式释放可释放的物质。可释放物质的释放可以是可控的变速释放，由此可释放物质的释放速率以可控的和/或预先设定的方式随时间而变化。
在一个实施方式中，可释放的物质是药物，流体是体液，例如患者的血液。该实施方式包括将药物给予患者的方法，所述的方法包括将根据本发明的分层纳米颗粒、或多个根据本发明的分层纳米颗粒递送给患者，例如递送至患者的血液中，所述的(多个)分层纳米颗粒其中和/其上带有药物。例如药物可以是抗癌药物。(多个)分层纳米颗粒的直径可以在大约10和500nm之间，或大约50和300nm之间。递送可以是静脉内(IV)递送，可以包括将包括(多个)纳米颗粒的悬液注射给患者。悬液可包括悬浮的流体。适合用于注射的悬浮流体是公知的，可包括盐水、林格式溶液、葡萄糖溶液、果糖溶液、右旋糖溶液、氨基酸溶液、蛋白质水解产物、乳酸钠溶液或一些其他的含水液体。本发明也提供了根据本发明的分层纳米颗粒在对患者给药中的应用，所述的分层纳米颗粒之中和/或之上带有药物。
在本发明的另一个方面，提供了用于将可释放的物质递送至流体的根据本发明的分层纳米颗粒、或多个根据本发明的分层纳米颗粒。
本发明也提供了根据本发明的分层纳米颗粒在选择性吸附混合物的至少一种组分中的应用。本发明进一步提供了用于选择性吸附混合物中的至少一种组分的分层纳米颗粒。
附图说明
现在将通过实施例并参考附图描述本发明的优选形式，其中：
图1显示存在碱时溶胶-凝胶反应的顺序；
图2显示生产仅有核心包含掺杂剂的多层纳米颗粒的方法的流程图；
图3显示生产具有多种掺杂剂的多层纳米颗粒的方法的流程图；
图4显示在NP-9/1-戊醇/环己烷/NH4OH/TEOS系统中产生的颗粒的TEM显微照片(平均尺寸55±5nm)；
图5显示具有核心-外壳结构的均一的二氧化硅颗粒的TEM图像；
图6显示二氧化硅颗粒上表面活性剂残余物的TGA/DTA测量图；
图7显示在下列微乳液系统中产生的二氧化硅颗粒的TEM显微照片：a)NP-5/环己烷/NH4OH/TMOS，b)NP-9/1-戊醇/环己烷/NH4OH/TMOS，和c)Triton X-100/甲苯/NH4OH/TMOS；
图8显示TEM显微照片，说明了通过顺序添加TMOS的颗粒生长情况：a)核心(22nm)，b)第一次加入1.2mmol TMOS(27nm)，c)第二次加入(31nm)，d)第三次加入(33nm)，e)第四次加入(36nm)；
图9显示TEM显微照片，说明了通过顺序添加TMOS的颗粒生长情况：a)核心(50nm)，b)第一次加入1.2mmol TMOS(83-92nm)，c)第二次加入(91-106nm)，d)第三次加入(102-120nm)，e)第四次加入(108-129nm)，f)第五次加入(128-146nm)；
图10显示说明新的生长方法原理的示意图；
图11显示核心-外壳结构的TEM显微照片：a)明视野图像(暗的区域表示重元素)，b)暗视野图像(亮的区域表示重元素)；
图12显示核心-外壳结构的TEM显微照片，显示了梁损害(beamdamage)：a)明视野图像，b)在EDX谱线轮廓(EDX line profile)后的暗视野图像；
图13显示显微照片，说明了加入方法对核心-外壳颗粒粒径的影响。
图14显示使用下列方法合成的颗粒的TEM显微照片：a)4个周期(核心+4个外壳)，和b)5个周期(核心+5个外壳)；
图15显示使用不同的稀释比例生长的颗粒的TEM显微照片，其中稀释比例(新鲜乳液的体积/籽晶乳液的体积)为：A)2，B)3，C)4，D)5。
a)样品1，掺杂铜的二氧化硅核心，额外加入的水相为1.333mol/LNH4OH，Cu为10.14mg/mL，其形式为Cu(NH3)4 2+，
b)样品2，掺杂铜的二氧化硅核心，额外加入的水相为1.333mol/LNH4OH，没有铜；
图16显示使用不同的混合籽晶乳液和新鲜乳液的方法制备的颗粒的TEM显微照片；
图17显示使用TEOS形成的颗粒核心，以及使用TMOS形成的外壳的TEM显微照片(合成条件与图5中所使用的条件相同)；
图18显示用Ormosil外壳包被的二氧化硅核心的TEM显微照片；
图19显示具有表2中列举的组成的样品的TEM显微照片；
图20显示具有表1中列举的组成并悬浮在丙酮中的样品的照片；
图21显示具有表3中列举的组成的样品的TEM显微照片；
图22显示具有表3中列举的组成并悬浮在丙酮中的样品的照片；
图23显示具有表4中列举的组成的样品的照片：a)冻干(SiO2/NaCl重量比：15％)，b)悬浮在Milli-Q水中；
图24显示悬液中的和用二氧化硅外壳包被的In2O3纳米晶体显微照片；
图25显示CuPC(黑线，λmax：556nm)和联钌吡啶(Rubpy)(灰线，λmax：390nm)在中性水中的UV-可见光光谱；
图26显示样品LNK-822(黑线，λmax：615nm)和LNK-824(灰线，λmax：450nm)在SBF中32天后的UV-可见光光谱；
图27显示下列样品的释放率曲线：a)样品LNK-822(1.022g冻干粉末在37℃的20mL SBF中，λmax＝615nm)，b)样品LNK-824(0.6055g冻干粉末在37℃的20mL SBF中，λmax＝450nm)，其中冻干粉末含有15wt％的SiO2和85wt％的NaCl；
图28a-f显示根据本发明的不同分层纳米颗粒的图解示意图；
图29显示使用UV/可见光吸收测量的样品(A)LNK-879和(B)LNK-880的释放率曲线。2g冻干粉末悬浮在37℃的20mL SBF中(其中冻干粉末含有15wt％的SiO2和85wt％的NaCl)：▲CuPC，λmax＝615nm，■Rubpy，λmax＝450nm)；
图30显示通过加入更多乳液组分合成具有ORMOSIL表面的包封染料的二氧化硅纳米颗粒的流程图；
图31显示通过加入更多乳液组分产生的具有ORMOSIL表面的二氧化硅纳米颗粒的TEM图像：(a)种入TEOS；(b)种入混合的前体；(c)TEOS形成的核心-外壳颗粒；(d)和(e)具有ORMOSIL外壳的二氧化硅核心；(f)ORMOSIL核心和外壳，如表6中所详述；
图32显示不同表面活性剂浓度下的二氧化硅颗粒的TEM图像：(a，b)0.2mol/L NP-9和0.2mol/L 1-戊醇制成的籽晶颗粒，74-86nm；(c)0.4mol/L NP-9、无1-戊醇制成的核心+2层颗粒，109-123nm；(d)0.4mol/L NP-9、无1-戊醇制成的核心+3层颗粒，132-152+20nm；(e)0.6mol/L NP-9、无1-戊醇制成的核心+2层颗粒，106-126nm；(f)0.6mol/L NP-9、无1-戊醇制成的核心+3层颗粒，132-145+20nm；(g)0.4mol/L NP-9、0.4mol/L 1-戊醇制成的核心+2层颗粒，100-131nm；(h)0.4mol/L NP-9、0.4mol/L 1-戊醇形成的核心+3层颗粒，128-179nm；
图33显示通过将根据本发明的两种生长技术组合而生产分层二氧化硅纳米颗粒的流程图；
图34显示通过将两种生长技术组合，以[H2O]/[表面活性剂]＝6的摩尔比例产生的二氧化硅颗粒的TEM图像：(a)籽晶：50-60nm，TEOS1.2mmol，H2O 36mmol，[H2O]/[TEOS]＝30；(b)核心+1层：61-76nm，TEOS 4.8mmol，H2O 36mmol，[H2O]/[TEOS]＝7.5；(c)核心+2层：95-113nm，TEOS 9.6mmol，H2O 72mmol，[H2O]/[TEOS]＝7.5；(d)核心+3层：100-135nm，TEOS 14.4mmol，H2O 72mmol，[H2O]/[TEOS]＝5；(e)核心+4层：136-166nm，TEOS 24mmol，H2O 144mmol，[H2O]/[TEOS]＝6；(f)核心+5层：146-172nm，TEOS 33.6mmol，H2O 144mmol，[H2O]/[TEOS]＝4.3；(g)核心+7层：200-240nm，TEOS52.8mmol，H2O 216mmol，[H2O]/[TEOS]＝4.1；
图35显示通过将两种生长技术组合，以[H2O]/[表面活性剂]＝9的摩尔比例产生的二氧化硅颗粒的TEM图像：(a)籽晶：50-61nm，TEOS1.2mmol，H2O 54mmol，[H2O]/[TEOS]＝45；(b)核心+1层：70-87nm，TEOS 4.8mmol，H2O 54mmol，[H2O]/[TEOS]＝11.3；(c)核心+2层：95-117nm，TEOS 9.6mmol，H2O 162mmol，[H2O]/[TEOS]＝16.9；(d)核心+3层：158-172nm，TEOS 14.4mmol，H2O 162mmol，[H2O]/[TEOS]＝11.3；(e)核心+4层：两种粒径的纳米颗粒，TEOS 24mmol，H2O 378mmol，[H2O]/[TEOS]＝15.8；(f)核心+5层：宽粒径纳米颗粒，TEOS 33.6mmol，H2O 378mmol，[H2O]/TEOS]＝11.3；
图36显示在高温下以[H2O]/[表面活性剂]＝6的摩尔比例合成的二氧化硅纳米颗粒的TEM图像：(a)35-50nm，在35±2℃下老化20小时；(b)48-62nm，在35±2℃下老化48小时；(c)37-52nm，在50±2℃下老化20小时；(d)48-70nm，在50±2℃下老化48小时；
图37显示在高温下以[H2O]/[表面活性剂]＝8的摩尔比例合成的二氧化硅纳米颗粒的TEM图像：(a)籽晶：35-68nm，在室温35±2℃下老化48小时：核心-外壳颗粒；(b)75-100nm，在35±2℃下老化20小时；(c)78-113nm，在35±2℃下老化28小时；(d)81-117nm，在35±2℃下老化48小时；(e)78-105nm，在50±2℃下老化20小时；(f)80-107nm，在50±2℃下老化28小时；(g)86-120nm，在50±2℃下老化48小时；和
图38显示在不同培育阶段时二氧化硅颗粒的TEM图像：(a)培育前(76-88nm)；(b)在加入额外的水之前于55±5℃培育1小时(82-96nm)；(c)在加入额外的水之后于55±5℃培育6小时(74-100nm)。
具体实施方式
本发明涉及无机/无机颗粒核心外壳颗粒，在一些实施方式中，涉及由陶瓷材料制成的颗粒，该颗粒具有陶瓷核心和一层或多层陶瓷覆层、或外壳。本发明适用于多种多孔的金属氧化物外壳和无孔的或多孔的(氧化物或非氧化物)核心，例如二氧化硅。
二氧化硅核心-外壳颗粒可分为下面几类：
●掺入了染料的二氧化硅颗粒
●二氧化硅包被的金属簇
●掺入了染料的核心-外壳有机硅
对于包封和从核心-外壳颗粒中释放，第一类和第三类特别令人感兴趣。本发明的颗粒与现有技术的不同在于掺杂剂可被掺入至任意一层覆层中。因此，在许多实施方式中，本发明的颗粒可被认为是多层纳米颗粒，其外壳和覆层至少之一含有一种或多种掺杂剂，该掺杂剂均匀地分布在覆层中，并能够被释放。
为了能够设计多层颗粒每个单层的成分，可能要利用改变胶团池(micelle pool)成分的能力。如在此所述，这可以通过顺序地添加表面活性剂/水和反应物前体来达到。重要的是保持乳液的成分(即，在三元相图中的相同点：表面活性剂-油-水)，能够产生具有相同的核心-外壳结构的均质多层颗粒，并不会引起具有不同成分的颗粒的产生。因此本发明提供的方法是周期性添加能促进多层颗粒产生的乳液和前体。
本说明书公开了用于经油包水微乳液(W/O)系统产生分层纳米颗粒的溶胶-凝胶方法。该纳米颗粒可以是多层的。生成的纳米颗粒可含有包封在纳米颗粒内不同位置中的一种或多种活性分子、密封剂和/或掺杂剂，它们可以可控的方式被释放。纳米颗粒可以是陶瓷纳米颗粒。它们的合成可通过顺序地加入(不同的)活性分子(掺杂剂)和(不同的)前体(或有机改性的前体)、以及新鲜的W/O乳液。通过控制加入的前体的用量可定制总粒径以及核心的直径和每层的厚度。每层的厚度可控制在大约1和50nm之间。前体可以是可水解的物种，例如可水解的硅烷。它能够水解形成反应物。前体变化的范围可以从硅醇盐(silicon alkoxide)至其他的金属醇盐或多种金属醇盐的混合物。活性分子可顺序地被释放或以分段的方式被释放(例如，释放-不释放-释放)，取决于其在多层颗粒中的位置。因此，例如，如果纳米颗粒在核心和外层中构建了可释放的物质，内层在外层与核心之间且具有不可释放的物质，则可释放物质的释放将逐步进行，释放-不释放-释放的步骤将顺序地发生。
在本发明的方法中，核心颗粒可在原位形成或作为已成形的颗粒加入。核心颗粒可以是任何物种的粉末，例如二氧化硅颗粒(如蒸气沉积二氧化硅、硅胶或硅粉)、金属氧化物颗粒(如氧化铟)、混合的金属氧化物颗粒(如掺杂了氧化铟的二氧化硅颗粒)、半导体颗粒、量子点、磁性颗粒、结晶颗粒或一些其他类型的颗粒。核心颗粒可以是球体、或立方体，或可以是三棱体、四面体、多面体(例如具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或20以上个面)、薄片或不规则的形状。核心颗粒可以是结晶的或非结晶的，或可以是部分结晶的。它可以是多孔的或无孔的。核心颗粒的直径可以在大约5和500nm之间，或大约5和450、5和400、5和300、5和200、5和100、5和50、5和20、10和500、10和400、10和200、10和100、50和500、50和400、50和200、50和100、100和500、100和400、100和200、200和500或300和500nm之间，例如直径为大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500nm，或一些其他大小的直径。非极性液体(或如果在不同步骤中使用了两种或多种液体，则每种非极性液体各自地)可以是烃，可以具有5和16个之间的碳原子，或5和12、5和8、6和12或6和10个之间的碳原子，可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳原子。它可以是直链的、支链的、环状的，可以是脂肪族的或芳香族的。它可以是烃类的混合物。或者，它可以是一些其他的非极性液体，例如卤代烷烃或卤代芳香族液体或低粘度的硅酮，例如低粘度的二甲基硅酮油或低粘度的氟硅氧烷。低粘度硅酮可以是线性硅酮或环状硅酮。硅酮的粘度可以低于大约100cS，或低于大约50、20、10、5、2或1cS，可以是大约0.5、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100cS。线性硅酮可以是三甲基甲硅烷氧基封端的硅酮。环状硅酮可以是D3、D4、D5、D6、D7或D8环硅酮或可以是这些的任意两种或多种的混合物。可使用的典型的烃是环己烷。非极性液体可以是可再循环的。催化剂可以是用于溶胶-凝胶方法的催化剂。它可以是用于缩合可缩合物种的催化剂，可以是，例如强酸(如硫酸、盐酸)、有机酸(如乙酸，三氟乙酸)、碱(例如氢氧化物如KOH、NaOH、氨水)、胺(例如，用胺官能化的ORMOSIL如APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷))、氟化物(例如，HF、NaF、KF、NH4F)、或过渡金属醇盐(例如钛醇盐、钒醇盐)。催化剂在含水液体中的浓度可以在大约0.1和5M之间，可以在大约0.1和2、0.1和1、0.1和0.5、0.5和5、1和5、3和5、0.5和2、或1和2M之间，可以是大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5M。含水液体的pH可以在大约8和14之间、或大约8和13、8和12、8和11、8和10、9和13、10和13、11和13、9和12、10和12、或11和12之间，可以是大约8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5或14。含水液体与核心颗粒的悬液的比例基于v/v可以在大约0.1和10％之间、或大约0.1和5、0.1和2、0.1和1、0.5和10、1和10、5和10、0.5和5、0.5和2、或1和2％之间，可以是大约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10％。可水解物种与含水液体的比例基于w/w、w/v、v/v或摩尔比例可以在大约0.5和10％之间，可以在大约0.5和5、0.5和2、0.5和1、1和10、5和10、或2和5％之间，基于w/w、w/v、v/v或摩尔比例可以是大约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10％。可水解的物种可以是可水解的金属物种，例如可水解的硅、铝或钛物种。可水解的物种可以是醇盐，如金属醇盐(例如，硅醇盐、钛醇盐或烷醇铝)。醇盐可以是C1-C6直链或支链醇盐或可以是这些醇盐的混合物。或者，可水解的物种可以是芳香族氧化物(aryloxide)，例如酚盐；链烷酸硅(siliconalkanoate)，例如丙酸硅；和氨基硅烷；酰胺硅烷(amidosilane)或一些其他的可水解的硅烷。金属平均每个分子可具有2和4个之间的可水解基团，平均每个分子可以具有大约2、2.5、3、3.5或4个可水解的基团。合适的可水解物种包括但不限于，三-和四-烷氧基硅烷，如四甲氧基硅烷(TMOS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、四丁氧基硅烷(TBOS)、四丙氧基硅烷(TPOS)、甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETES)、乙基三甲氧基硅烷(ETMS)、辛基三乙氧基硅烷(OTES)、辛基三甲氧基硅烷(OTMS)、十六烷基三甲氧基硅烷(HDTMS)、十六烷基三乙氧基硅烷(HDTES)、十八烷基三甲氧基硅烷(ODTMS)、十八烷基三乙氧基硅烷(ODTES)；以及聚硅酸甲酯(MPS)；聚硅酸乙酯(EPS)；聚二乙氧基硅烷(PDES)；二硅酸六甲酯；二硅酸六乙酯；或官能性三烷氧基硅烷，如甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷(PTES)、苯基三甲氧基硅烷(PTMS)、缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)、缩水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷(GLYEO)、巯基丙基三乙氧基硅烷(MPTES)、巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧烷硅烷(DATMS)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙氨基]丙基三甲氧基硅烷(TATMS)、[2-(环己烯基)乙基]三乙氧基硅烷(CHEETES)、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMS)、乙烯基三乙氧基硅烷(VTES)和上述物质的混合物。可水解物种能够水解产生可缩合的物种。可缩合物种可以是任何上述可水解物种的部分的或完全的水解产物。它可以是硅烷醇物种，每分子可具有1、2、3或4个硅烷醇基团，或每分子超过4个硅烷醇基团。它可以是每分子具有1个或多个硅烷醇基团的至少部分缩合的物质。它可以是多种硅烷醇物种的混合物。因此，核心和一层或多层覆层可各自地包括二氧化硅、聚倍半硅氧烷、氧化铝、二氧化钛或一些其他的金属氧化物。如果可水解物种是有机官能化的，则可提供同样有机官能化的可缩合物种，并且最终可产生同样有机官能化的纳米颗粒，任选地在核心和(多层)覆层中的一个或多个上选择性的有机官能化。这可为掺杂剂或其他物种提供与有机官能化的核心和/或(多层)覆层的选择性的亲和性。或者，有可能提供具有核心和包围核心的一层或多层覆层的颗粒，所述核心具有能转化为所需化合物的前体，所述覆层具有用于将前体转化为所需化合物的催化剂和/或(多种)反应物。在使用中，前体可从核心释放，并由催化剂和/或(多种)反应物转化成为所需的化合物，从而从颗粒中释放。如果所需的化合物稳定性受限制，和/或如果前体比所需的化合物更稳定，这是特别有用处的。
水解的足够温度可以在大约1和70℃之间，或大约1和50、1和30、1和20、1和10、1和5、10和50、10和40、10和30、10和20、15和40、20和50、50和70、30和50、20和40、或20和30℃之间，可以是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70℃。足够的时间可以在大约6和96小时之间，或大约6和72、6和48、6和24、12和96、24和96、36和96、48和96、60和96、12和72、24和60、36和60、或36和48小时之间，可以是大约6、12、18、24、36、48、60、72、84或96小时，或可以超过96小时。核心颗粒可在大约1和70℃之间的温度下提供，或可送至大约1和70℃之间、或大约10和70℃之间、或大约1和10℃之间、或大约1和50℃之间、或大约1和20℃之间、或大约10和50℃之间、或大约10和40、10和30、10和20、20和50、50和70、30和60、30和50、20和40、或20和30℃之间，可以是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70℃。
掺杂剂可以是盐(例如，包括金属络合物离子如铜四胺配合物(copper tetramine))、染料、催化剂、生物活性物质(例如，蛋白质、多糖、酶、药物、肽等)、磁性物质、放射性示踪剂、或其他放射性核素、或一些其他类型的掺杂剂。在纳米颗粒内的不同位置可以有不同的掺杂剂(例如，核心和一层或多层覆层的每层都可包括不同的掺杂剂)。相同的掺杂剂可位于纳米颗粒内的不同位置中(例如，核心和一层或多层覆层中的一层可包括相同的掺杂剂)。该种掺杂剂或每种掺杂剂可以是可释放的或不可释放的。如果存在一种以上的掺杂剂，则至少一种掺杂剂是可释放的，且至少一种掺杂剂是不可释放的，或所有掺杂剂都是可释放的，或所有掺杂剂都是不可释放的。核心或覆层中的掺杂剂可分布在所述的核心或覆层中，并可以均匀地或不均匀地分布在所述的核心或覆层中。要理解的是当提到掺杂剂时，可包括多种掺杂剂(例如，2、3、4、5或超过5种掺杂剂)。如果核心颗粒或任意一层覆层包括多种掺杂剂，它们可以都是可释放的，或至少一种是可释放的且至少一种是不可释放的，或它们都是不可释放的。例如，覆层可包括要被同时释放的可释放掺杂剂的混合物，或可包括不可释放的掺杂剂的混合物(例如，染料或磁性掺杂剂)，从而将多种特性或复合特性(例如，如果两种不同的染料被掺入进单层覆层中时)赋予覆层，或可包括用于释放至颗粒周围环境中的可释放掺杂剂、以及不可释放的掺杂剂(例如，染料)。
如果有的话，核心颗粒中的掺杂剂可以基本上均匀地分布在核心颗粒中。覆层或任意一层覆层(如果存在一层以上的覆层)中的掺杂剂可以基本上均匀地分布在该覆层中。
在一个实例中，分层纳米颗粒可包括具有不可释放的染料(例如，红色)的核心颗粒，核心颗粒可被多孔的覆层包围，所述多孔覆层包括不同颜色(例如，绿色)的可释放染料。因此，分层纳米颗粒可采用可释放染料(例如，绿色)的颜色，或可释放的和不可释放的染料的复合颜色(例如，褐色)。当分层纳米颗粒采用了不可释放染料的颜色(例如，红色)，则警告用户如下事实：可释放的染料已经被释放了。在一个特殊的实例中，多孔的覆层除了可释放的染料以外还包括第二种可释放的掺杂剂(例如，化学反应的反应物)。当分层纳米颗粒采用了不可释放的染料的颜色时，则警告用户如下事实：需要进一步添加纳米颗粒以便保证连续释放可释放的掺杂剂。
核心颗粒可包括，例如量子点，其可作为不可释放的染料。核心颗粒可以是任何合适的颗粒，例如多孔的或无孔的颗粒。它可以是纳米颗粒。
掺杂剂可包括被固定的反应物或催化剂。例如，纳米颗粒可包括核心颗粒和包围核心颗粒的覆层。核心颗粒可包括掺杂剂(例如，药物前体)，其是要被释放至纳米颗粒环境中的化合物(例如，药物)的前体，覆层可包括用于将该掺杂剂转化为该化合物的催化剂。当纳米颗粒暴露于合适的环境时，掺杂剂会从核心颗粒通过覆层，在此它将在催化剂的影响下转化成化合物，然后从纳米颗粒中被释放。这可用于化合物的长期稳定性很有限的情况下。
覆层可包括释放率调节剂，其形式可以是不可释放的掺杂剂或覆层材料本身的形式。释放率调节剂能够调节掺入进覆层中或较靠近核心颗粒的覆层中或核心颗粒中的可释放掺杂剂的释放率。释放率调节剂能够促进或降低可释放掺杂剂的释放。例如，核心可包括具有酸性基团的可释放掺杂剂。包围核心的覆层可包括胺基，其将延缓可释放掺杂剂的释放。
核心或一层或多层覆层可包括吸附剂，其形式可以是不可释放的掺杂剂或覆层材料本身的形式。例如，核心颗粒或覆层可包括不可释放的胺掺杂剂，或核心颗粒或覆层的材料可包括胺基(例如，来自用于制备核心颗粒或覆层的氨基丙基三乙氧基硅烷)，用于吸附酸性物种。这种材料应用的实例可以是在高分子量酸类的存在下选择性地吸附低分子量的酸类。因此，具有胺基，例如来自氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷或氨基乙基氨基丙基三甲氧基-或三甲氧基-硅烷的多孔核心颗粒，其上可涂布以中性的多孔覆层，以形成根据本发明的纳米颗粒。在与包括低分子量和高分子量酸类的液体接触过程中，低分子量酸类将能够穿透覆层被吸附进核心颗粒中，而高分子量酸类则可被防止进入核心颗粒中。高分子量酸类将被核心颗粒中的胺基所隔离，因此防止了液体由于纳米颗粒与高分子量酸类之间的相互作用而发生凝聚。以此方式，低分子量酸类可被选择性地从混合物中去除，而不引起液体的凝聚。这种材料应用的另一实例是吸附高度毒性的物质。因此，例如，具有多孔核心颗粒的纳米颗粒(其胺基被中性多孔覆层包围)，可用于安全地吸附高度毒性的酸性物质。在与包括毒性酸性物质的液体接触的过程中，纳米颗粒可将毒性酸性物质从液体中吸附至氨自能化的核心颗粒中，使中性多孔覆层基本上不含有毒性酸性物质。生成的带有吸附的毒性酸性物质的纳米颗粒，使用是安全的，因为纳米颗粒的外层不含有毒性酸性物质。
更普遍的是，分层纳米颗粒可包括(在核心中和/或一层或多层覆层中)螯合和/或配合基团，其能够特异地与特殊化学物种或特殊类型的化学物种相互作用，以便选择性地吸附该化学物种或该类化学物种。螯合和/或配合基团的形式可以是不可释放的掺杂剂或覆层材料本身的形式、或两者都是。这种分层纳米颗粒可用于例如吸附毒性化合物，如重金属。因此，具有包括能够螯合铅的基团(例如，结合了EDTA的基团)的不可释放的掺杂剂的分层纳米颗粒，可用于从溶液中去除铅。
平均纳米颗粒容积密度可以是在0.075g/cm3至2.2g/cm3，或大约0.15至1.5、0.18至1.0、0.5至1.0、0.5至0.75、或0.25至0.5g/cm3的范围内，可以是大约0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1或2.2g/cm3。
纳米颗粒状物质可以是单分散的，或可以具有狭窄的粒径分布。粒径分布可以是超过50％的颗粒分布在平均粒径的10％内，或超过45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％，可以是大约10、20、30、40、50、60、70或80％的颗粒分布在平均粒径的10％内。
纳米颗粒状物质的平均颗粒直径可以在大约10和500nm之间，或大约10和100、50和500、50和300、50和100、100和500、250和500、100和300、或200和300nm之间，其平均颗粒直径可以为大约10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500nm，或可以具有更大的平均颗粒直径。纳米颗粒状物质的颗粒可包括核心和1至10层之间的覆层、或至少部分包围核心的覆层。可以是1和8层之间、1和5、1和3、2和10、5和10、2和8、或2和5层之间的覆层，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10层，或可以超过10层。核心的平均直径可以在大约5和500nm、或大约5和150、100和500、100和500、100和400、100和300、100和200、100和150、5和125、5和100、5和80、5和50、5和30、10和100、30和100、50和100、100和150、100和130、130和150、10和80、20和70、或30和70nm之间，可以是大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450或500nm。每层或覆层的平均厚度可以各自地在大约1和50nm之间、或大约1和30、1和20、1和10、5和30、5和10、10和50、10和40、10和30、10和20、20和50、30和50、40和50、20和40、或20和30nm之间，可以是大约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nm。如果存在一层以上的覆层或外壳，则它们可以具有不同的厚度或相同的厚度。核心和/或覆层可以是多孔的，且可以是微孔的、或中孔性的，其平均孔径可以在大约0.5和20nm之间、或大约0.5和10、0.5和5、0.5和4、0.5和3、0.5和2、0.5和1.7、0.5和1、1和5、2和5、3和5、4和5、5和10、7和10、10和20、5和15、5和7、1和3、或1和2nm之间，其孔径可以是大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm。因此，例如，核心和所有覆层都可以是多孔的，或核心可以是无孔的，而覆层可以是多孔的，或核心和内层可以是无孔的，而外层可以是多孔的。核心颗粒和该覆层或每层覆层可各自地具有大约0和80％之间的孔隙度，或大约0和70、0和60、0和50、0和40、0和30、0和20、0和10、2和80、10和80、30和80、50和80、10和50、30和50、20和60、或20和40％之间的孔隙度，可以具有大约0、10、20、30、40、50、60、70或80％的孔隙度。掺杂剂可占核心的大约0和100wt％之间(即，核心可以没有掺杂剂或可以是活性物质，该活性物质也可以是或不是一层或多层覆层中的掺杂剂：例如核心可包括微粉化的药物颗粒或标记物或量子点，如In2O3纳米晶体的实例)。掺杂剂可占核心的大约0和50、0和25、0和10、0和5、10和100、50和100、5和95、10和50、或25和50wt％之间，可占核心的大约0、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100wt％。掺杂剂可占包围核心的任意特定覆层的大约0和25wt％之间，或大约0和20、0和15、0和10、0和5、5和25、10和25、15和25、20和25、5和20、或10和20wt％之间，可占包围核心的任意特定覆层的大约0、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25wt％。
至少部分地分离(多个)分层纳米颗粒的步骤可包括过滤、微滤、离心、超速离心、沉降、倾析或这些方法的组合。其也可包括使悬液丧失稳定的步骤，丧失稳定可在所述的过滤、微滤、离心、超速离心或沉降之前进行。
丧失稳定的步骤可包括向悬液中加入失稳液体。失稳液体可以是极性的，可以与非极性液体是可混溶的。失稳液体可与水是可混溶的。它可以是，例如丙酮、乙醇、甲醇或一些其他的液体。丧失稳定的步骤可包括改变温度至例如悬液不稳定的温度。改变方法可以是加热或可以是冷却，取决于相图。
洗涤步骤可包括将(多个)分层纳米颗粒与洗涤液体(含水的或有机的)接触，并从洗涤液体中分离(多个)分层纳米颗粒。例如，洗涤的任意或所有步骤可包括将(多个)分层纳米颗粒悬浮在洗涤液体中，任选地将合并在一起的洗涤液体和(多个)分层纳米颗粒搅动，并将(多个)分层纳米颗粒从洗涤液体中分离，例如使用上述分离方法中的任意一种。或者，洗涤的任意或所有步骤可包括将洗涤液体流过和/或穿过可保留在例如滤器中的(多个)分层纳米颗粒。洗涤可以通过相分离在倾析漏斗内进行。含水的洗涤液体可以是水或含水液体，例如盐溶液。有机洗涤液体可以是溶剂，可以是极性的或非极性的溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲苯或一些其他的溶剂，且可以是多种溶剂的混合物。洗涤的步骤也可包括将悬液加热或冷却至大约10和70℃之间，或大约10和50、10和30、10和20、20和70、50和70、20和50、或30和50℃之间，可包括将悬液加热或冷却至大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70℃。加热或冷却可达到如下温度，即通过改变系统的相图防止系统形成单一的稳定相。也可通过使用溶剂混合物改变相图来防止系统形成单一的稳定相。
干燥的步骤可包括对(多个)分层纳米颗粒进行加热。加热要达到的温度低于(多种)掺杂剂(如果有的话)分解或变质的温度，可以是例如大约30和80℃之间，或大约30和60、30和40、40和80、60和80、或40和60℃之间，可以是大约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80℃。另外可选地或附加地，干燥的步骤可包括冻干，例如W01/62332(Barbé和Bartlett，“Controlled Release CeramicParticles，Compositions thereof，Processes of Preparation and Methods ofUse(可控释放的陶瓷颗粒、其组合物、制备方法和使用方法)”)中所述。干燥的步骤可附加地或另外可选地包括将气流流过和/或穿过(多个)分层纳米颗粒。气体可以是对(多个)分层纳米颗粒和其中和/或其上的任意掺杂剂呈惰性的气体，可以是例如空气、氮气、氩气、氦气、二氧化碳或这些气体的混合物，并可被干燥。干燥的步骤可附加地或另外可选地包括对(多个)分层纳米颗粒施加部分真空。部分真空可具有例如大约0.01和0.5个大气压之间的绝对压力，或大约0.01和0.1、0.01和0.05、0.1和0.5、0.25和0.5、0.05和0.1、或0.1和0.25个大气压之间的绝对压力，可以具有大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5个大气压的绝对压力。
在本发明的方法的一个实施方式中，提供包括在非极性液体中的核心颗粒的悬液的步骤包括以下的步骤：
-提供乳液，其包括分散在非极性液体中的水滴，其中水滴包括用于水解第一种可水解物种的催化剂，所述的第一种可水解物种能在水解过程中产生第一种可缩合物种；和
-向乳液中加入第一种可水解物种，这样第一种可水解物种在水滴内发生水解以在非极性液体中形成核心颗粒的悬液。
水滴的直径可以在大约5和150nm之间，或大约5和125、5和100、100和130、120和150、5和80、5和50、5和30、10和100、30和100、50和100、10和80、20和70、或30和70nm之间，直径可以是大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150nm。
提供乳液的步骤可包括以下的步骤：
-提供表面活性剂溶液，其包括表面活性剂和非极性液体、和任选的助表面活性剂；
-向表面活性剂溶液中加入水溶液，该水溶液包括用于缩合第一种可缩合物种的催化剂，也任选地包括第一种掺杂剂；
-从表面活性剂溶液和水溶液形成乳液。
表面活性剂可以是阴离子、阳离子、非离子或两性离子的表面活性剂，可以是单体的或聚合的表面活性剂。合适的表面活性剂包括壬基苯氧基聚乙氧基乙醇C9H19C6H4(OCH2CH2)nOH(NP系列)、或辛基苯氧聚乙氧基乙醇C8H17C6H4(OCH2CH2)nOH(Triton系列)，其中n为4和15之间，或4和9、或9和15、或7和12之间，可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。合适的助表面活性剂包括C5-C10的正-醇类(1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇)。表面活性剂在表面活性剂溶液中的浓度，结合合适量的水和助表面活性剂，可以足以形成稳定的微乳液，其浓度可以在大约0.05和1M之间，或大约0.05和0.5、0.05和0.2、0.05和0.1、0.1和1、0.5和1、0.1和0.5、或0.1和0.2M之间，可以是大约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1M，或可以是一些其他合适的浓度。助表面活性剂在表面活性剂溶液中的浓度可以在大约0和1M之间，或大约0.05和1、0.05和0.5、0.05和0.2、0.05和0.1、0.1和1、0.5和1、0.1和0.5、或0.1和0.2M之间，可以是大约0、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1M。助表面活性剂与表面活性剂的摩尔比例可以在大约0和10之间，或大约0和5、0和2、0和1.5、0和1、0和0.5、0和0.2、0和0.1、0.5和2、1和2、1.5和2、0.5和1.5、或0.8和1.2、0.5和10、1和10、2和10、5和10、0.5和5、或1和5之间，可以是大约0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10。在含水液体中水与表面活性剂的比例基于w/w、w/v、v/v或摩尔数可以在大约2∶1和10∶1之间、或大约2∶1和5∶1、3∶1和10∶1、4∶1和10∶1、5∶1和10∶1、3∶1和8∶1、或4∶1和6∶1之间，可以是大约2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1。
纳米颗粒的合成
图3总结了根据本发明的方法。该方法可描述如下：
1.在非极性溶剂如环己烷中，通过溶解表面活性剂和助表面活性剂，形成表面活性剂溶液。
2.通过将要被包封的活性分子(掺杂剂)(例如染料或药物)与用于溶胶-凝胶反应的催化剂(例如碱)混合，形成水溶液。
3.然后通过将如上所得到的表面活性剂溶液和水溶液混合制备稳定的微乳液。然后将醇盐前体(例如TEOS)加入至微乳液中，随后缓慢地扩散至水池中(即，乳液滴的核心)，在此被水解。
4.在金属醇盐水解和缩合至少48小时后，反应温度增加至55±5℃一小时，以确保反应完成。这个阶段会产生核心(或籽晶)颗粒。
5.然后加入更多的水溶液(可含有另一种活性分子)。混合物在55±5℃搅拌6小时，使加入的水转移至核心颗粒的表面。这是很重要的，目的是防止空胶团形成，后者是二次成核现象的来源。然后加入含有表面活性剂、助表面活性剂和非极性溶剂的表面活性剂溶液。在系统冷却至室温后，进一步加入前体(例如，TEOS)，从而通过在初始的核心颗粒周围形成覆层来使颗粒生长。在这些步骤中，合成参数如水与表面活性剂的摩尔比例、表面活性剂的浓度要保持恒定。
6.步骤4和5重复一次或多次，以在分层纳米颗粒上产生所需的覆层数目。注意通过使用这种方法，可在分层纳米颗粒的不同位置(即，覆层)中加入不同的掺杂剂。
7.在形成分层颗粒后，将极性溶剂(例如，丙酮)加入至混合物中使乳液系统丧失稳定，并通过沉降作用或离心提取颗粒。如果需要，使用更多的溶剂来去除残余的表面活性剂。
8.加入盐溶液，然后进一步用氯仿洗涤颗粒，将颗粒收集在分离漏斗内，使用W01/62332(Barbé和Bartlett，“Controlled Release CeramicParticles，Compositions thereof，Processes of Preparation and Methods ofUse(可控释放的陶瓷颗粒、其组合物、制备方法和使用方法)”)中所述的方法进行冻干。颗粒也可在悬液中进行处理。将极性溶剂(例如，丙酮)加入至混合物中使乳液系统丧失稳定，通过沉降或离心提取颗粒。如果需要，可使用更多的溶剂以进一步去除表面活性剂残渣。
控制最终粒径和粒径分布的因素包括乳液参数(例如，表面活性剂浓度、表面活性剂/水比例、前体/水比例)、金属前体的性质和数量、以及步骤4和5的循环次数。覆层的数目取决于步骤4和5重复多少次。在每个周期中活性分子(掺杂剂)的类型和浓度都可改变。每种活性分子的位置取决于其何时被引入进工艺中，每层覆层的厚度可通过加入的前体的量来控制。
与文献中报道的其他生长方法的比较
与文献中报道的试验相反，根据本发明的方法使用了籽晶生长技术，从而通过保持相同的油-水-表面活性剂(任选地具有助表面活性剂)相图来产生核心-外壳分层纳米颗粒。这可通过在每层覆层生长过程中向反应系统中加入新鲜的W/O微乳液、或新鲜的表面活性剂和非极性溶剂来完成。因此，加入第二种非极性溶剂不应该明显地改变油-水-表面活性剂相图，且第二种非极性溶剂应该与开始所使用的非极性溶剂能混溶。该方法不需要提取籽晶就可连续地进行。本发明的另一项独特的特征是，在每次加入新鲜的微乳液过程中有可能引入新的活性分子。因此，可开发一种新的方法来形成核心-外壳分层纳米颗粒，通过该方法超过一种以上的掺杂剂可被包封在核心或所选择的外壳(覆层)内。然后包封的分子可以以预定的释放次序被释放，该次序取决于其在多层结构内的位置。这种控制每层覆层中有效载荷的能力使人能设计延缓释放(空覆层+负载的核心)、以及脉冲式释放(空的和填充的覆层交替)和顺序释放(填充以不同有效载荷的多层覆层)系统。此外，不仅可控制总粒径，而且核心和每层覆层的厚度也能定制，因此有可能控制释放周期的长度。尽管没有广泛地研究在颗粒或膜中包封多种活性分子，但本发明人相信这种先进的可控释放技术可能不仅能应用于传统的可控释放系统的应用领域，如食品、化学、抗微生物剂、杀虫剂、药品和化妆品，也可应用于其他领域，如光学传感器、生物传感器、加密和信息技术。
实施例
材料
使用获得时的(as received)NP-9[壬基苯氧基聚乙氧基乙醇，C9H19C6H4(OCH2CH2)nOH，n＝9](Fluka：MW 630，HLB 13.0)(即，通过卡尔费舍尔滴定法(Karl Fisher titration)测定含有小于0.08wt.％的水)。使用获得时的来自Sigma-Aldrich的原硅酸四乙酯(TEOS)(98％)。有机溶剂(环己烷、1-戊醇、丙酮、氯仿)是ACS分光光度级(99+％)(Sigma-Aldrich)。使用的所有其他化学试剂都是A.R.级的。高纯度Milli-Q水(Millipore)用于制备所有的水溶液；其电阻率高于18.2MΩcm。所有样品在暗处保存。
密封剂(掺杂剂)溶液的制备：
制备铜(II)四胺配合物硝酸盐(Copper(II)tetramine nitrate)：通过向已知量的硝酸铜(II)-水合物中逐滴加入25wt.％氨水直至形成深蓝色溶液，制备铜(II)四胺配合物硝酸盐溶液。将该溶液转移至100mL体积的烧瓶中，通过加入稀释的25vol.％浓氨水(即，25wt.％NH3)将体积调整至100ml。制备的溶液含有铜16.69mg/mL，测量到其pH为11.86。
制备钴(III)六胺配合物硝酸盐(Cobalt(III)hexamine nitrate)：通过与上述铜(II)四胺配合物硝酸盐溶液的相似步骤制备钴(III)六胺配合物硝酸盐溶液，不同之处在于在用浓氨水(25wt.％NH3)溶解硝酸钴-水合物的过程中，溶液加热至沸腾20分钟使可溶性钴(III)六胺配合物形成。最终的溶液含有钴16.69mg/mL，pH为11.82。
制备联钌吡啶(Rubpy)：通过将固定量的钌配合物溶解在固定体积的稀释氨水(10vol％的浓25wt.％NH3)中，制成Rubpy浓度为2.5mg/mL的溶液，从而制成Rubpy[(三(2，2′-二吡啶基)二氯化钌(II)六水合物]溶液。
制备CuPC：通过将固定量的铜配合物溶解在固定体积的稀释氨水(10vol％的浓25wt.％NH3)中，制成CuPC浓度为5mg/mL的溶液，从而制成CuPC[铜(II)酞菁-四磺酸四钠盐]溶液。
制备FITC：通过将固定量的荧光素溶解在固定体积的稀释氨水(10vol％的浓25wt.％NH3)中制成荧光素浓度为5mg/mL的溶液，从而制成异硫氰酸荧光素溶液。
制备In-DTPA或Ga-DTPA溶液：在100mL烧杯中称取已知量的InCl3或GaCl3，加入10g Milli-Q水溶解该盐。加入固定量的二乙撑三胺五乙酸(DTPA)，这样DTPA与金属元素的摩尔比例保持在1.1∶1。当磁力搅拌混合物时，逐滴加入浓氨水(25wt.％NH3)。当所有DTPA溶解时，形成了结构式为[Me-DTPA]2-的金属-DTPA螯合物，结构如下：
Figure A20068001053700381
持续加入浓氨水直至溶液的pH超过11.50，总体积刚好至100mL以下。将溶液定量地转移至100mL体积的烧瓶中，加入水至终体积为100mL。
产生50nm二氧化硅核心的典型制备方法
在250mL螺旋盖容器中，将7.56g NP-9(12mmol)溶解在60mL环己烷中。然后加入1.304mL(12mmol)1-戊醇。将此混合物强力振荡大约1分钟制成表面活性剂溶液。然后加入含有活性分子(如染料)的1.333mol/L氨水溶液(NH4OH(pH～11.86)1.296mL(即，72mmol水)。将混合物强力搅拌大约30分钟产生微乳液系统。向此磁力搅拌的微乳液中加入0.546mL TEOS(2.4mmol)，然后在室温下(22±2℃)搅拌一段固定的时间(48-72小时)。此后加入50mL无水丙酮，从而令微乳液丧失稳定。系统进一步强力搅拌大约10分钟。二氧化硅颗粒通常会絮凝，可通过倾析而分离；如果没有观察到显著的沉淀，则将混合物在4000rpm下离心10分钟。沉淀或离心后，从有机相中分离颗粒，用50mL无水丙酮(每次)洗涤3次以去除表面活性剂。在丙酮倾析后，大约20mL NaCl水溶液与颗粒混合，并导入进倾析漏斗中。生成的悬液使用氯仿(每次50mL)进一步洗涤6次以去除残余的表面活性剂，超声处理并使用Flexi-dry-84D冷冻干燥机(FTS Systems，Inc.，Stone Ridge，NY)进行冻干。使用这种步骤，在形成的均匀地分布在NaCl基质内的纳米颗粒中产生了144mg二氧化硅。TEM显示粒径的范围是55±5nm(图4和图5-A)。使用氯化钠作为保护性基质以防止纳米颗粒聚集，二氧化硅和氯化钠之间的重量比保持在15％左右。
制备100nm、150nm和200nm二氧化硅纳米颗粒的典型试验步骤
制备例2：100nm(核心+1层外壳)：
●使用上述的步骤产生50nm籽晶；
●代替加入丙酮使微乳液丧失稳定的是将温度增加至55±5℃，并搅拌1小时；
●然后加入2.952mL 1.333mol/L NH4OH(pH～11.86)(即相当于水144mmol)，并在55±5℃下搅拌6小时，然后冷却至室温；
●加入与2.608mL 1-戊醇(24mmol)混合的15.12g NP-9(24mmol)、和120mL环己烷，并搅拌20分钟；
●向混合物中加入2.184mL TEOS(9.6mmol)；
●搅拌48-72小时；
●如上述产生50nm二氧化硅核心的典型制备方法中所述洗涤、提取和干燥颗粒；
该程序产生了720mg单分散的100nm二氧化硅纳米颗粒。相应的TEM
显微照片呈现在图5-B中。
制备例3：150nm(核心+2层外壳)：
●如上所述制备100nm颗粒；
●代替加入丙酮使微乳液丧失稳定的是将乳液分成两等分；
●取一等分，将其温度增加至55±5℃，并搅拌1小时。然后加入2.592mL 1.333mol/L NH4OH(pH～11.86)(即相当于水144mmol)，并在55±5℃下搅拌6小时；
●加入与2.608mL 1-戊醇(24mmol)混合的15.12g NP-9(24mmol)、和120mL环己烷，并搅拌20分钟；
●向混合物中加入2.184mL TEOS(9.6mmol)；
●搅拌48-72小时；
●如上述产生50nm二氧化硅核心的典型制备方法中所述洗涤、提取和干燥颗粒；
该程序产生了936mg相对单分散的150nm二氧化硅纳米颗粒。相应的TEM显微照片呈现在图5-C中。
制备例4：200nm(核心+3层外壳)：
●如上所述制备150nm颗粒；
●代替加入丙酮使微乳液丧失稳定的是将乳液分成两等分；
●取一等分加热至55±5℃，并搅拌1小时，并加入2.592mL 1.333mol/L NH4OH(pH～11.86)(即相当于水144mmol)；在55±5℃下另外搅拌6小时；
●在120mL环己烷中加入与2.608mL 1-戊醇(24mmol)混合的15.12g NP-9(24mmol)，并搅拌20分钟；
●向系统中加入2.184mL TEOS(9.6mmol)；
●搅拌48-72小时；
●如上述产生50nm二氧化硅核心的典型制备方法中所述洗涤、提取和干燥颗粒；
该程序产生了1044mg相对单分散的200nm二氧化硅纳米颗粒。相应的TEM显微照片呈现在图5-D中。
颗粒的表征
使用透射电子显微镜(JEOL 2000 FXII或JEOL 2010F)监测二氧化硅颗粒的尺寸和形态学。
为了监测残余表面活性剂的量，使用Setaram TGA 24进行TGA/DTA试验。不掺杂的样品以10℃/min的速率加热至900℃。典型的图表显示在图6中。通过DTA观察两种不同的分解反应：在大约100-200℃与水和其他挥发性组分蒸发有关的吸热反应、和在大约400℃与表面活性剂燃烧有关的放热反应。结合的表面活性剂的量计算为450℃时重量损失与250℃时重量损失的差值。在氯仿中洗涤5次以后，与二氧化硅颗粒一起的表面活性剂残余物为大约二氧化硅干重的3.0wt％。这对应于每个50nm颗粒大约1.65分子NP-9。
染料的释放率
在通过离心从水相中分离二氧化硅颗粒后，颗粒重新悬浮在20mL模拟体液(SBF，pH 7.4/25℃)中。SBF的组成可见P.Kortesuo；M.Ahola；S.Karlsson；I.Kangasniemi；A.Yli-Urpo；J.Kiesvaara，“Silica xerogel asan implantable carrier for controlled drug delivery-evaluation of drugdistribution and tissue effects after implanation(二氧化硅干凝胶作为可控药物递送的可移植载体-药物分配和移植后组织效应的评估)”，Biomater.，21，193-198(2000)。通过将悬液在3000rpm下离心半小时，使用UV-可见光光谱法测量上清液中释放的掺杂剂的浓度，从而测量释放情况。在释放研究中，样品保存在37℃水浴中，并避光。
结果和讨论
乳液参数对籽晶尺寸的影响
下面三个系统显示了水与醇盐比例对核心尺寸的影响。相应的TEM显微照片呈现在图7中。
●系统1：NP-5：0.2mol/L；环己烷50mL；催化剂：1.333mol/L NH4OH(pH～11.86)；TMOS：3mmol；[H2O]/[TMOS]＝20，[H2O]/[NP-5]＝6；老化24小时。颗粒直径：～7.6nm。
●系统2：NP-9：0.2mol/L；环己烷30mL，催化剂：1.333mol/L NH4OH(pH～11.86)；[NP-9]/[1-戊醇]＝1，TMOS：1.2mmol；[H2O]/[TMOS]＝30，[H2O]/[NP-9]＝6；老化24小时。颗粒直径：～20nm。
●系统3：Triton X-100：23.9wt.％；甲苯：71.4wt.％；水：4.7wt.％(5g)；催化剂：1.333mol/L NH4OH；TMOS：8mmol，[H2O]/[TMOS]＝34.7。颗粒直径：～25nm。
顺序添加前体的颗粒生长情况(无另外的乳液)
使用TMOS和TEOS作为硅前体进行两个试验。
●试验1：NP-9：0.2mol/L；环己烷50mL；催化剂：1.333mol/L NH4OH；[NP-9]/[1-戊醇]＝1，[H2O]/[NP-9]＝6。随着顺序加入额外的硅前体，粒径逐渐增加，生长过程见图2。结果系列地显示在图8中。
●试验2：NP-9：0.2mol/L；环己烷30mL；催化剂：1.333mol/L NH4O；[NP-9]/[1-戊醇]＝1，[H2O]/[NP-9]＝6。不使用TMOS，而是使用TEOS作为硅前体，TEM图像显示在图9中。
尽管从TEM显微照片中很清楚，TEOS提供的颗粒生长比TMOS明显更为显著，但需要考虑的是在两种情况下加入的量和初始核心的尺寸。在TMOS的情况下，初始核心为22nm，每周期加入的平均量为1.2mmol，4次添加后达到的平均直径为36。这表示每周期生长3nm或每加入1mol TMOS生长2.5nm。相反，TEOS的初始核心为50nm，经过5次添加15.6mmol的总量后，平均直径为137nm。这代表了每加入1mmol TEOS生长5.6nm。这种生长速率的差异可解释为在两种情况下存在的核(即，核心颗粒)数量的差异。如果所有硅醇盐都转变为二氧化硅，对于等量的二氧化硅来说，在TMOS合成中观察到的较小核心的数量应该大于在TEOS合成中观察到的较大核心的数量。实际上，核心颗粒总数的差异应该与其尺寸成反比，因为二氧化硅的总体积是恒定的。而且，对于加入等量的硅醇盐，如果要被包被的核心颗粒的数量大两倍，则核心-外壳尺寸的增加预期应减小大约两倍。因此，对于TMOS观察到较小的生长。
选择微乳液系统的重要性
在整个颗粒生长过程中选择NP-9用于产生微乳液。通常认为增加醇的浓度会引起颗粒多分散性的逐渐增加，因为微乳液的相图对醇的含量很敏感。这就限制了全部加入的醇盐前体的最大浓度，因为该前体在其水解过程中会产生醇。使用NP-9作为表面活性剂的微乳液对醇含量不太敏感，因此在颗粒生长过程中可使用较高浓度的醇盐前体。1-戊醇作为助表面活性剂的存在使反胶团更具有刚性，因此使微乳液由不稳定变化为稳定，并也能提高胶团尺寸的一致性，并随后提高固体颗粒的尺寸。另外，NP-9微乳液允许较高的[水]/[表面活性剂]数值，因此能产生较大的颗粒，同时维持微乳液的稳定性和粒径的一致性。
通过顺序添加微乳液和硅醇盐的颗粒生长情况
尽管有可能通过顺序添加醇盐前体来生长颗粒，但由于胶团核心中自由水的供应受限，在一定程度上限制了颗粒的生长。另外，在此方法中，活性分子仅能负载在颗粒的核心中。
在本发明说明书中描述的可选方法在于以额外的微乳液形式，对水提供额外的供应，以维持醇盐的水解和缩合，从而维持颗粒的生长。该方法的图示示意图见图10。一旦产生了籽晶(核心)颗粒，就向籽晶(核心颗粒)的悬液中加入新鲜的微乳液。在混合过程中，来自新鲜微乳液的刚加入的水滴与含有籽晶颗粒的亲水液滴聚结在一起，水吸附在现有核心颗粒的表面上。在加入醇盐前体后，其与吸附在颗粒表面上的水发生反应，水解，然后与颗粒表面上存在的羟基缩合。如果醇盐的浓度保持在某种水平以下，则硅前体的浓度仍然在过饱和水平以下，不形成额外的核。颗粒由典型的单体逐渐生长至核增大(nucleiaddition)。使用这种方法生长的颗粒的实例见图5。
在每个周期以微乳液的形式加入水能够在不同的阶段以不同的浓度引入活性分子。这就有可能将超过一种类型的活性分子包封在陶瓷纳米颗粒内的不同位置中。然后较外层外壳中的物种可比位于核心内或较内层外壳内的分子较早地释放。这些核心-外壳结构的一些典型TEM图像显示在图11中。不能使用EDX谱线轮廓对每个外壳进行精确成分分析，因为电子光束会损害样品，并导致颗粒内部的金属重新分布(见图12)。
使用这种合成步骤，可产生尺寸范围在50-500nm，通常为10-300nm的单分散的陶瓷颗粒。陶瓷颗粒的最终尺寸取决于：
(a)微乳液特性，包括表面活性剂、助表面活性剂、溶剂的类型、水与表面活性剂的摩尔比例、表面活性剂与助表面活性剂的摩尔比例、和水池的pH；
(b)醇盐前体的类型及其浓度；
(c)周期数；
(d)在每个周期加入的前体量；和
(e)其他溶胶-凝胶反应条件，如温度、pH等。
使用本发明的方法，可如上所述产生分层纳米颗粒以在碱的存在下(pH高于11)产生二氧化硅颗粒。选择使用适当的条件和反应物，合成条件可转变至中性、弱酸性、甚至中等程度至强酸环境，可能使用二氧化硅以外的其他陶瓷材料。
不同试验参数对颗粒多分散性的影响
添加方法的影响
图13显示了添加新鲜微乳液成分的不同方式。通过使用下列的系统(NP-93mmol、15ml环己烷、1-戊醇3mmol、0.324ml NH4OH1.33M、水18mmol、TEOS 0.6mmol，老化48h)制备籽晶。然后如下加入附加的微乳液(开始用于籽晶的体积的两倍)和TEOS：
●加入微乳液，在55℃下搅拌6小时，加入TEOS，然后老化68小时。
●首先加入表面活性剂、1-戊醇和环己烷，10分钟后加入氨水溶液。在55℃下搅拌6小时，加入TEOS，然后老化68小时。
●首先加入氨水溶液，10分钟后加入表面活性剂、1-戊醇和环己烷。在55℃下搅拌6小时，加入TEOS，然后老化68小时。
●首先加入氨水溶液，然后在55℃下搅拌6小时。然后加入表面活性剂、1-戊醇和环己烷，然后加入TEOS，将悬液老化68小时。
所有不同的方法产生的颗粒具有相同的尺寸。在之后的所有过程中，使用最后一种方法。
外壳数量的影响
为了研究尺寸对多分散性的限制，将200nm颗粒(即，核心+3层外壳)的悬液分成两等分。一个等分加热至55±5℃，同时搅拌1小时。然后加入2.592mL NH4OH 1.333mol/L(pH～11.86)(相当于水144mmol)，生成的混合物在55±5℃下搅拌6小时。然后向悬液中加入15.12g NP-9(24mmol)、2.608mL 1-戊醇(24mmol)和120mL环己烷。搅拌20分钟后，向系统中加入2.184mL TEOS(9.6mmol)，进一步搅拌48-72小时。然后如上述产生50nm二氧化硅核心的典型制备方法中所述洗涤、提取和干燥颗粒。生成的颗粒(即，核心+4层外壳)的TEM显微照片显示在图14-a中。使用相同的步骤产生了具有额外外壳(即，核心+5层外壳)的颗粒(见图14-b)。图14证明超过200nm的连续生长导致产生多分散性的颗粒。图14-a显示了双峰分布，除了目标的230nm颗粒以外，还有一些大约150nm尺寸的较小颗粒。再重复一次会导致范围从100nm至325nm的多分散的粒径分布。这种较小颗粒的逐渐出现表明，加入的微乳液与含有颗粒的液滴发生的不完全聚结导致了新的二氧化硅核的形成。更为普遍的是，纳米颗粒越大，粒径分布越宽。保持大颗粒(＞250nm)的单分散性的一种可能的方式是通过沉淀作用进行分离，从而消除了第二代(较小)纳米颗粒。
面对大颗粒连续生长的另一种实际限制因素是，需要完成整个周期的时间。一般构成三层外壳(即，200nm直径)可能需要8-10天。一种减少处理时间的方式可以是增加反应温度。或者，使用较多的可水解醇盐前体可加速颗粒的生长。
新鲜乳液/籽晶乳液体积比例的影响
试验结果(图15a和b)显示用新鲜微乳液稀释籽晶乳液并不总会形成均一的颗粒。当稀释度(新鲜乳液的体积/籽晶乳液的体积)高于3时，会产生多分散的颗粒。这表明可与现有颗粒掺合在一起的水的量不能超出一定的数值。如果加入更多的水，则会形成新的油包水反胶团，并作为形成新的二氧化硅颗粒的成核中心，导致多分散性颗粒的产生。
混合方法的影响
图16显示了用于混合含有籽晶颗粒的乳液和新鲜微乳液的方法的重要性。可使用一些不同的方法来引发新鲜乳液液滴与含有籽晶的现有液滴的聚结，从而保证单分散颗粒的产生。第一种方法是在非常高的切变速率(8000rpm)下对生成的乳液混合物进行剪切混合，以促进液滴的碰撞和聚结。第二种方法依靠通过增加混合乳液的温度，而增加液滴的碰撞速率。要注意的是，尽管理论上在室温下能达到完全的聚结，但要达到此目的所需的时间使其无法实施，如在室温下搅拌18h获得的多分散样品所证明的那样。超声处理(甚至持续很长一段时间)不能引发液滴的聚结，如在图16-b中观察到的双峰分布所证明的那样。
硅前体反应性的影响
如较前所讨论，反应性较弱的二氧化硅前体(如TEOS)产生的核心比反应性较强的前体(如TMOS)要大。当TMOS以与TEOS相同的摩尔比例加入至50nm预先形成的核心颗粒中时，获得具有75nm核心-外壳颗粒和较小的21nm次级颗粒的双峰分布(见图17)。21nm颗粒恰好对应于使用TMOS产生的核心(见图7-b)。这表明二次成核阶段的存在，该阶段是由水解的TMOS的浓度迅速达到过饱和引起的，该浓度通过二次成核作用而不是与现有核心的缩合作用而降低。相反，对于反应性较弱的TEOS，水解的单体的浓度升高更为缓慢，因此在其浓度达到过饱和并引发成核之前，它们可通过与核心表面反应而被消耗。
有机改性的二氧化硅(ORMOSIL)核心-外壳构成的纳米颗粒
在碱中进行溶胶-凝胶合成能产生中孔性的颗粒(即，大孔径：大约4nm)，通常表现是迅速和不可控制的释放其有效载荷(一般是＜2nm的有机染料或小分子药物)。为了将被包封的分子保持在陶瓷纳米颗粒内部，并避免其在洗涤步骤中泄漏，陶瓷基质可用活性基团(如-NH2、-SH、-COOH等)官能化，其将与包封的分子形成化学键。使用这种策略，已经成功地将荧光染料(异硫氰酸荧光素(FITC))包封在用胺基官能化的二氧化硅颗粒(APTES)中。然后染料的释放可通过筛分或切断活性分子-基质的相互作用而触发。
根据前面所述的试验条件合成分层纳米颗粒。ORMOSIL集成在颗粒核心或第二层外壳内部。TEOS的比例为75mol％或25mol％。在这些实验中使用的ORMOSIL前体是氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。相应的TEM图像显示在图18中，ORMOSIL核心-外壳颗粒的组成显示在表1中。
表1：ORMOSIL核心-外壳颗粒的组成
  图18的图像   核心   外壳-1   外壳-2   直径(nm)
  图像-a   TEOS(100mol.％)   48-61
  图像-b   TEOS(75mol.％)APTES(25mol.％)   43-65
  图像-c   TEOS(75mol.％)APTES(25mol.％) TEOS(100mol.％) 80-104
  图像-d   TEOS(100mol.％)   TEOS(100mol.％)   85-90
  图像-e   TEOS(75mol.％)APTES(25mol.％) TEOS(100mol.％) TEOS(100mol.％) 122-152
图像-f TEOS(100mol.％) TEOS(100mol.％)   TEOS(75mol.％)APTES(25mol.％) 150-160
核心-外壳构成的纳米颗粒，在不同的位置包封了两种活性分子
本方法的另一个优势是有可能将一种以上的掺杂剂包封在核心颗粒或任意一层外壳中。每种分子可被选择性地包封在纳米颗粒的不同位置中，其浓度也可在每个生长周期进行控制。不仅有可能通过该方法控制总尺寸，而且核心的尺寸和每层外壳的厚度都可定制，因此潜在地控制了释放周期的长度以及不同的释放速率。下面的实施例的目的是证明这种技术的通用性以及包封工艺的适应性和控制。
表2列举了在纳米颗粒的不同位置中掺杂了Cu(NH3)4 2+和Ru(bPy)3 2+的不同样品的组成。相应的TEM图像呈现在图19中，悬浮在丙酮中的颗粒的照片显示在图20中。表3列举了在纳米颗粒的不同位置中掺杂了Cu(NH3)4 2+和Co(NH3)6 3+的不同样品的组成。相应的TEM图像呈现在图21中，悬浮在丙酮中的颗粒的照片显示在图22中。表4列举了在纳米颗粒的不同位置中掺杂了CuPC2-和Ru(bPy)3 2+的不同样品的组成。图23显示了相应的冻干粉末(SiO2/NaCl重量比：15％)和悬浮在水中的颗粒。
表2：产品1的组成，Cu(NH3)4 2+和Ru(bPy)3 2+为掺杂剂
  样品   核心   外壳-1   外壳-2
  LNK-704   Cu：10.82mgSiO2：72.00mg   Ru：3.24mgSiO2：288.00mg
  LNK-705   Ru：1.62mgSiO2：72.00mg   Cu：21.63mgSiO2：288.00mg
  LNK-706   Cu：10.82mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg
  LNK-707   Ru：1.62mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg
  LNK-708   Cu：10.82mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg   Ru：6.48mgSiO2：576.00mg
  LNK-709   Ru：1.62mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg   Cu：43.26mgSiO2：576.00mg
表3：产品2的组成和颗粒粒径，Cu(NH3)4 2+和Co(NH3)6 3+为掺杂剂
  样品   核心   外壳-1   外壳-2   直径
LNK-753   Cu：10.82mgSiO2：72.00mgCu/SiO2：15wt.％ 44-50nm
LNK-754   Cu：10.82mgSiO2：72.00mgCu/SiO2：15wt.％   Co：21.63mgSiO2：288.00mgCo/SiO2：7.5wt.％ 80-90nm
LNK-755   Cu：10.82mgSiO2：72.00mgCu/SiO2：15wt.％ SiO2：288.00mg 76-88nm
LNK-756   Cu：10.82mgSiO2：72.00mgCu/SiO2：15wt.％ SiO2：288.00mg   Co：43.26mgSiO2：576.00mgCo/SiO2：7.5wt.％ 102-132nm
LNK-757   Co：10.82mgSiO2：72.00mgCo/SiO2：15wt.％ 38-60nm
LNK-758   Co：10.82mgSiO2：72.00mgCo/SiO2：15wt.％   Cu：21.63mgSiO2：288.00mgCu/SiO2：7.5wt.％ 77-88nm
LNK-759   Co：10.82mgSiO2：72.00mgCo/SiO2：15wt.％ SiO2：288.00mg 76-87nm
LNK-760   Co：10.82mgSiO2：72.00mgCo/SiO2：15wt.％ SiO2：288.00mg   Cu：43.26mgSiO2：576.00mgCu/SiO2：7.5wt.％ 104-135nm
表4：产品3的组成，CuPC2-和Ru(bPy)3 2+为掺杂剂。
  样品   核心   外壳-1   外壳-2
LNK-819   Ru：1.62mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg
LNK-820   CuPC：3.24mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg
LNK-821   Ru：1.62mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg   SiO2：576.00mg
LNK-822   Ru：1.62mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg   CuPC：12.96mgSiO2：576.00mg
LNK-823   CuPC：3.24mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg   SiO2：576.00mg
LNK-824   CuPC：3.24mgSiO2：72.00mg SiO2：288.00mg   Ru：6.48mgSiO2：576.00mg
尽管如前所述，由于电子光束损害不可能进行元素分析和探测，但通过TEM可证实一些清晰的核心外壳结构。“洋葱”形结构的存在
(见图21b、d、e、f、g)证实了将特定的掺杂剂选择性地掺杂在特定的外壳中的可能性。在掺杂剂位于纳米颗粒的不同覆层中的图20、22和23中观察到的颜色改变，进一步说明了这种技术用于光学应用的潜力。
固体核心的包封
本发明的一个附加特征是将固体颗粒包封在金属氧化物的外壳内的能力。核心可以是任意物种的粉末，如金属氧化物、半导体、量子点、磁性颗粒或晶体颗粒。
(多层)外壳可包括一种金属氧化物或超过一种的不同的金属氧化物、复合金属氧化物或含有掺杂剂的金属氧化物。在二氧化硅外壳内的晶体In2O3纳米晶体的制备和包封的实例详述如下。
In2O3纳米晶体如下进行制备：将1.017g InCl3溶解在10mL纯水中。向溶液中逐滴加入10mL NH4OH 10M，同时搅拌，形成沉淀。通过连续洗涤(每次用50mL水5-10次)去除Cl-和NH4 +离子，直至不能检测到氨水的气味。然后加入0.92mL HNO3(1M)将沉淀胶溶，且悬液在55±5℃搅拌过夜。进一步加入0.45mL HNO3 1mol/L，悬液再次在55±5℃搅拌过夜。最终的pH测定为2.284，TEM显示50nm*10nm晶体，且具有清晰的晶面。
然后使用下列的方法来包被晶体。搅拌含有6mmol NP-9、6mmol1-戊醇、30mL环己烷、0.972mL NH4OH 6.667mol/L的溶液A直至液体清亮。
搅拌含有6mmol NP-9、6mmol 1-戊醇、30mL环己烷、0.324mLIn2O3纳米晶体悬液的溶液B直至液体清亮。
将两种溶液A和B混合在一起，向混合物中加入2.4mmol TEOS。溶液老化72小时。然后向生成的悬液中加入50ml无水丙酮使微乳液丧失稳定，并回收颗粒。用丙酮洗涤颗粒数次，通过TEM进行检查(见图24)。TEM显微照片清晰地表明，在二氧化硅纳米颗粒内包封了50nm的棒状物。
在核心或外壳内包封放射性示踪剂
已经成功地完成了在二氧化硅颗粒任意选择的位置(核心或选择的外壳)中包封螯合物种，如In-DTPA和Ga-DTPA。通过EDS分析金属含量一般为二氧化硅的1-2wt％。发现颗粒粒径和粒径分布不依赖于掺杂剂的存在与否。这就证实了本发明的方法具有独立地控制颗粒粒径和内部结构的能力。
放射性示踪剂，如67Ga-DTPA，也可被很容易地掺杂在二氧化硅纳米颗粒内，从而产生能在体内可被示踪的颗粒。这种颗粒可通过下列的步骤进行制备。从ANSTO-Cyclotron获得67GaCl3(t1/2：3.261天)，活性为2GBq/mL(在0.1mol/L HCl溶液中)。该溶液被水以1∶10稀释。向pH为大约2的0.22mL 67GaCl3溶液中加入含有DTPA 3.9mg/l的0.428mL浓氨水(25wt.％NH3)。
生成的溶液可用作前面所述的方法中的水溶液，以产生活性镓在核心、在外层外壳或分布在整个颗粒中的颗粒。这些颗粒可用于生物分布研究，以使用γ计数作为检测方法来研究二氧化硅颗粒在大鼠体内的位置。这种纳米颗粒的潜在应用可预计用于放射治疗和放射成像。
从核心-外壳颗粒中的释放
如前所述，碱催化的溶胶-凝胶合成会产生中孔性的颗粒(即，大约4nm)，一般表现为迅速地和不受控制地释放其有效载荷。值得注意的例外是有机金属配合物的包封，其可在金属阳离子与二氧化硅表面之间表现一些相互作用。在这种情况下，表面与该配合物的相互作用能确保包封，并暂时地将分子锁定在二氧化硅纳米颗粒结构内。当颗粒悬浮在水相内时，二氧化硅表面与水的强亲和力能逐渐地转移与活性有机金属配合物的吸附平衡，从而将该分子释放出二氧化硅基质。在大多数情况下，该释放是通过逐渐地溶解二氧化硅基质来达到的。
为了证明顺序释放的潜力，合成两组在核心和外层外壳内有不同掺杂剂的纳米颗粒：a)样品LNK-822，CuPC在外层外壳中，Rubpy在核心中，和b)样品LNK-824，Rubpy在外层外壳中，CuPC在核心中。使用UV-可见光光谱法监测两个样品从中的释放情况。两种染料在水中的UV可见光光谱显示在图25中，两个样品(LNK 822和824)在SBF中浸析32天以后的光谱显示在图26中。CuPC的最大吸收在556nm，Rubpy则在390nm。两个峰之间的重叠很小，因此在第一次近似(approximation)中可被忽略。在1-12的pH范围(与颗粒合成的范围对应)内没有观察到最大吸收波长(对于CuPC和Rubpy)随pH迁移。当介质改变为SBF时，对于两种染料观察到了大约60nm的红移，即Rubpy从390nm至450nm，CuPC从556nm至615nm红移(见图26)。在样品LNK-824中，在大约615nm附近可见一微小的吸收，表明有微量的CuPC释放，因为在该区没有Rubpy的吸收。但由于CuPC在450nm存在有少量的吸收，因此很难对Rubpy的释放定量，尤其是这种很小的量。
两种核心外壳颗粒的相应释放曲线显示在图27中。当CuPC包封在外层外壳中时，其在10天内逐渐被释放。在此时间之后，观察几天CuPC的浓度都是恒定的，表明大多数染料都已经被释放。也有小量的Rubpy从核心释放，尽管确切的量不容易进行定量。有趣的是，LNK-822的颜色，开始是绿色的(见图23)，在从外层外壳释放CuPC后变成了桔黄色(即，Rubpy掺杂的纳米颗粒的颜色)，因此从视觉上证实了CuPC的顺序释放。另一方面，当Rubpy掺杂在外层外壳，而CuPC在核心中(LNK824)时，释放曲线显示在5天内大多数Rubpy浸出。没有观察到CuPC从核心中有可检测到的浸出。在浸出过程中，颗粒的颜色从黄色改变成绿/蓝色(仅含有CuPC的颗粒的初始颜色)。这些实验证实了这些多层颗粒在顺序释放应用中的潜在用途。
当分子与二氧化硅核心表面之间不存在强的相互作用时，陶瓷基质可用活性基团(如-NH2、-SH、-COOH等)进行官能化，其可与被包封的分子形成化学键。使用这种策略，荧光染料(异硫氰酸荧光素(FITC))被包封在用胺基官能化的二氧化硅颗粒(APTES)中。然后可以通过筛分或切断活性分子和基质的相互作用而触发释放。将小分子包封在中孔性颗粒内的另一种可能性是，将其与较大的分子，如葡聚糖或树状大分子，在包封之前结合在一起。
本发明提供了制造分层纳米颗粒的方法，该纳米颗粒具有核心-外壳结构，并含有包封在纳米颗粒不同位置(即，外壳或覆层)中的一种或多种活性分子或掺杂剂。该技术的优势包括精确控制总粒径、核心尺寸、外壳厚度、每个外壳内活性物种的浓度、以及每种被包封的掺杂剂的释放次序和释放速率的能力。
本发明人已经证明小的有机金属分子可被包封在颗粒内。这些分子包括金属络合物化合物(例如，铜四胺配合物、钴六胺配合物、铟-DTPA、镓-DTPA)、无机染料如Rubpy[(三(2，2′-二吡啶基)二氯化钌(II)六水合物]、CuPC[铜(II)酞菁-四磺酸四钠盐]、和荧光染料FITC(异硫氰酸荧光素)。甚至是络合物物体，如In2O3纳米晶体也可被包封。更重要的是，本发明人已经显示了有可能将一种以上的掺杂剂包封在纳米颗粒内不同的位置上，并具有不同的有效载荷量。通过处理参数，如加入的前体的性质和数量，可准确地控制纳米颗粒结构，即核心尺寸和覆层厚度。通过确保在每个周期加入的水都能迁移至现有颗粒的表面上，可在整个生长过程中保持颗粒的单分散性。残余的空水滴(即，不含颗粒)可用做二次成核中心。尽管通过增加前体的量、加入催化剂或使用较少的籽晶材料可加速生长动力学，但在第四个周期后会引入多分散性。籽晶乳液的极度稀释也会引起多分散纳米颗粒的产生。
尽管通过本方法产生的纳米颗粒适合用于静脉药物递送，但它们可在信息技术中用于高密度光学存储器、特定的光学传感器或生物传感器，和用于保护/表面改性纳米颗粒以避免腐蚀/氧化、烧结和聚结、表面特性的改变(表面、电荷、ζ电势、可悬浮性)等。从长期来看，该技术可用来开发包括被(多层)外壳包被的核心颗粒的纳米颗粒，该核心颗粒含有被包封的活性分子，该(多层)外壳包括有机改性的陶瓷前体，所述陶瓷前体显示-NH2、-SH、-COOH之类的官能基团，可很容易地被抗体或肽官能化而用于活性药物靶向的应用。
图28a-28f显示了根据本发明的几种不同的分层纳米颗粒的图解示意图。应该注意的是这些示意图仅显示了可以根据本发明制备的许多不同类型的纳米颗粒中的少许类型，且使用这些纳米颗粒的特定方法仅作为实例。其他类型的颗粒和使用它们的方法也是有可能的，并且在本说明书中可预料得到。因此，下面的说明仅作为实例，而不能认为是以任何方式限制本发明的范围。
参照图28a，分层纳米颗粒10包括多孔的核心颗粒15和包围核心颗粒15的多孔的覆层20，核心颗粒15包括第一种可释放的掺杂剂，覆层20包括第二种可释放的掺杂剂B。当纳米颗粒10置于合适的液体环境中时，可释放的掺杂剂B首先从纳米颗粒10中释放，然后释放可释放的掺杂剂A。掺杂剂B释放的时间周期取决于覆层20的厚度，掺杂剂A释放的时间周期取决于覆层20的厚度以及核心颗粒15的尺寸。释放速率可取决于掺杂剂的性质以及核心颗粒15和覆层20的性质和孔径。或者，如果掺杂剂A是不可释放的染料，则纳米颗粒10将显示掺杂剂A的颜色，并将释放可释放的掺杂剂B。进一步可选地，如果掺杂剂B是不可释放的染料，掺杂剂A是可释放的掺杂剂，则纳米颗粒10将显示掺杂剂B的颜色，并将释放掺杂剂A。
参照图28b，分层纳米颗粒30包括多孔的核心颗粒35和多孔的覆层40，核心颗粒35包括可释放的掺杂剂A，覆层40不包括可释放的掺杂剂。多孔覆层40包围核心颗粒35。当纳米颗粒30置于合适的液体环境中时，可释放的掺杂剂A经过一段延迟时间后从纳米颗粒10中释放。延迟的时间长度取决于多孔覆层40的厚度和孔隙度。
参照图28c，分层纳米颗粒50包括多孔的核心颗粒55、包围核心颗粒55的第一层多孔覆层60和包围第一层多孔覆层60的第二层多孔覆层65，核心颗粒55包括第一种可释放的掺杂剂A。第一层覆层60不包括可释放的掺杂剂，第二层多孔覆层65包括第二种可释放的掺杂剂B。当纳米颗粒50置于合适的液体环境中时，第二种可释放的掺杂剂B和第一种可释放的掺杂剂A顺序地释放，在掺杂剂B和A释放之间有一段延迟。延迟的时间长度取决于第一层覆层60的厚度和孔隙度。
参照图28d，分层纳米颗粒70包括多孔的核心颗粒75、包围核心颗粒75的第一层多孔覆层80和包围第一层覆层80的第二层多孔覆层85，核心颗粒75包括第一种可释放的掺杂剂A，第一层多孔覆层80包括第二种可释放的掺杂剂B，第二层多孔覆层85包括第三种可释放的掺杂剂C。当纳米颗粒70置于合适的液体环境中时，可释放的掺杂剂C首先从纳米颗粒70中释放，然后释放可释放的掺杂剂B，最后释放可释放的掺杂剂A。掺杂剂A、B和C从纳米颗粒70中释放的时间取决于覆层80和85的厚度和孔隙度以及核心颗粒75的尺寸。
参照图28e，纳米颗粒90包括多孔核心颗粒95，同心多孔覆层100、105、110和115包围核心颗粒95。核心颗粒95和同心的覆层105和115分别包括可释放的掺杂剂A、B和C，而覆层100和110不含有可释放的掺杂剂。当纳米颗粒90置于合适的液体环境中时，可释放的掺杂剂C首先从纳米颗粒70中释放，然后释放可释放的掺杂剂B，最后释放可释放的掺杂剂A。在掺杂剂C与掺杂剂B的释放之间有一段延迟，在掺杂剂B与掺杂剂A的释放之间有另外一次延迟。延迟可分别由覆层110和100的厚度和孔隙度来控制。
参照图28f，纳米颗粒120包括多孔的核心颗粒125和包围核心颗粒125的多孔覆层130，核心颗粒125包括可释放的掺杂剂A。多孔覆层130包括可释放的掺杂剂B和C。当纳米颗粒120置于合适的液体环境中时，可释放的掺杂剂B和C首先从纳米颗粒120中释放，然后释放掺杂剂A。或者，如果掺杂剂A是不可释放的染料，则纳米颗粒120将显示掺杂剂A的颜色，并将释放可释放的掺杂剂B和C。作为进一步的可选方案，如果掺杂剂B是不可释放的染料，掺杂剂A和C是可释放的掺杂剂，则纳米颗粒120将显示掺杂剂B的颜色，并将顺序地释放掺杂剂C和A。
多种染料的包封
在上述的试验中，CuPC2-和Ru(bPy)3 2+已经被包封在二氧化硅纳米颗粒中，CuPC2-在核心中，Ru(bPy)3 2+在外层外壳中，反之亦然。样品-I的核心和样品-II的外层外壳中的每种染料的量是不同的。因此，视觉上这两种样品显示不同的颜色(图23，样品LNK-822和LNK-824)。在下面的试验中，相同量的每种染料掺杂在不同的样品中，如表5中所示。在合成和冻干后，颗粒从视觉上显示相同的颜色，表明纳米颗粒的颜色取决于染料的组分及其浓度，而不是其在纳米颗粒中的位置。
表5：掺杂染料的纳米颗粒的组分
  样品   核心   外壳-1   外壳-2
  LNK-879   Ru：3.24mgSiO2：72.00mg   SiO2：288.00mg   CuPC：6.48mgSiO2：576.00mg
  LNK-880   CuPC：6.48mgSiO2：72.00mg   SiO2：288.00mg   Ru：3.24mgSiO2：576.00mg
图29显示了在37℃时每种样品在PBS(磷酸盐缓冲溶液)中的染料释放情况。被多层颗粒释放的大多数染料是包封在外层外壳中的染料，即分别是LNK879的CuPc(图29-A)和LNK880的Ru(bPy)3 2+(图29-B)。对于LNK879，在第18天和第40天之间CuPC的浓度大致保持恒定。之后大幅下降。本发明人推测其发生可能是由于CuPC的分解或CuPC与容器壁的缔合所引起的。在释放曲线的早期，CuPC的浓度增加或基本上保持恒定。本发明人推测这可能表明染料释放速率高于分解的速率。图29-A显示了核心中的染料(Ru(bPy)3 2+)在大约30天后开始释放，表明多层颗粒内容物的顺序释放确实发生了。在图29-B中，在外壳中的染料(Ru(bPy)3 2+)显示连续的释放直至64天，而同时有小量的CuPC浸出，50天后则分解。从这些结果似乎可以发现释放速率曲线是可以调整的，取决于颗粒中不同位置中的不同掺杂技的特性。图29A显示了顺序的释放，开始的两周染料最初从外壳中释放，30天后另一种染料从核心中释放。从图B中还可见CuPC(核心中的CuPC)随着时间而降解，可以解释来自外壳的染料密度的下降。图29-B没有显示顺序的释放，但钌染料从外壳逐渐释放并从核心有一个很小的突然释放。
形成ORMOSIL外壳以提高有机染料的包封作用
在前面描述的试验中，荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)在APTES之类的偶联剂的存在下，被包封在二氧化硅基质中，因为在异硫氰酸基团(-N＝C＝S)与胺基之间形成了化学键。在本试验中试图将有机染料包封在被ORMOSIL外壳包被的二氧化硅纳米颗粒内。预计这将使孔径缩小，并因此降低染料的释放速率。试验流程图显示图30中，相应的TEM图像显示在图31中。如前所述按照一般步骤进行合成。采用几种选择来对颗粒表面进行改性。每种样品的成分和最终产品的相应粒径显示在表6中。颗粒a代表仅用TEOS制成的初始核心。颗粒b是使用75％TEOS和25％APTES的前体混合物制成的核心。颗粒c是仅使用TEOS制成的核心-外壳颗粒。颗粒d和e具有ORMOSIL改性的外壳，d具有30mol.％APTES，e具有50mol.％APTES。颗粒f具有ORMOSIL核心和ORMOSIL外壳。所有颗粒都具有大致相同的粒径，但ORMOSIL改性的颗粒显示稍宽的粒径范围。
在合成和洗涤步骤过程中，在合并有机相后，通过UV/可见光吸收测量orange-II(橙色-II)的包封效率。Orange II是一种有机染料，因此与前面RuBpy和CuPC的实例明显不同，因为它是纯有机的，与二氧化硅表面没有强的相互作用。在外层外壳或是没有APTES、或是在外层外壳具有30mol％APTES的三个样品(LNK 1120、LNK1121和LNK1123)的数值平均为大约5-14wt.％，但在外层外壳具有50mol.％APTES的样品(LNK1122)的包封效率为大约45wt.％。在其他因素中，有机染料的包封效率似乎依赖于染料的性质、其量、染料与二氧化硅的重量比、ORMOSIL摩尔百分比和含ORMOSIL覆层的厚度。这表明ORMOSIL前体的有机基团可能对于在合成和洗涤过程中防止染料从二氧化硅基质中浸出具有重要的作用。而且，这种效应似乎依赖于每种ORMOSIL前体的官能基团。已发现在防止染料非常快速地浸出方面，GLYMO(环氧官能性的硅烷)比大多数ORMOSIL更有效。
表6：ORMOSIL为外壳的颗粒的成分和粒径。
样品   LNK-1120(图31-c)   LNK-1121(图31-d)   LNK-1122(图31-e)   LNK-1123(图31-f)
  核心中的Orange-II 2.592mg 2.592mg 2.592mg 2.592mg
核心前体 TEOS：2.4mmol TEOS：2.4mmol TEOS：2.4mmol   TEOS：1.80mmolAPTES：0.60mmol
  核心尺寸   50-60nm   50-60nm   50-60nm   43-65nm
外壳前体 TEOS：9.6mmol   TEOS：6.72mmolAPTES：2.88mmol   TEOS：4.8mmolAPTES：4.8mmol   TEOS：6.72mmolAPTES：2.88mmol
  粒径   95-115nm   86-126nm   80-130nm   84-122nm
  包封效率   13.1wt.％   5.0wt.％   44.8wt.％   13.9wt.％
增加粒径同时保持颗粒单分散性的其他方法
高表面活性剂浓度
已观察到当粒径超过100nm时，乳液系统变混浊，颗粒开始从水滴中沉淀出来，最后无需搅拌就形成两种物理相。有人可能会假设助表面活性剂丧失了其功能，较高浓度的表面活性剂会将颗粒保持在悬液中。图32显示了使用多种表面活性剂条件产生的二氧化硅颗粒的TEM图像。使用典型的合成步骤，采用0.2mol/L NP-9和0.2mol/L 1-戊醇，[水]/[NP-9]的摩尔比例为6，产生了初始籽晶(核心-外壳颗粒，直径在74和86nm之间，显示在图32a和b中)。
从上面产生的籽晶形成核心+2层覆层和核心+3层覆层的颗粒。不添加额外的助表面活性剂(1-戊醇)，表面活性剂浓度增加至0.4mol/L(则[水]/[NP-9]摩尔比例＝3)、和0.6mol/L([水]/[NP-9]摩尔比例＝2)。图32c和e显示了加入无额外的助表面活性剂的第一层外壳，产生了单分散的颗粒。然而，由于另一层的生长(图32d和f)，产生了直径在20nm左右的较小颗粒。这些结果表明助表面活性剂的存在对于单分散颗粒的形成是非常关键的，即使颗粒大于大约100nm并开始沉淀时。
当表面活性剂和助表面活性剂都从0.2mol/L增加至0.4mol/L时，具有两层或三层外壳的颗粒保持狭窄的粒径分布(图32g和h)，但与用0.2mol/L表面活性剂合成的颗粒相比没有显著较大地生长。
两种生长工艺的组合
如上所述，随着在乳液中加入的硅前体越来越多，粒径逐渐增加(图2)。然而，仅加入醇盐(没有额外的水)导致产生的颗粒具有含活性掺杂剂的核心，该核心被空壳所包围。而且，在加入一定量的醇盐后，水池中的所有水被消耗，不可能进一步生长。在微乳液中这种情况进一步恶化，因为在水池中仅存在很小百分比的水是自由的，并能够参与醇盐的缩合反应。大多数水与胶团壁结合作为溶剂化水，用于表面活性剂极性头端。
在实施本发明的一种形式中，加入更多的乳液，通过在较高温度下(大约55℃)培育几小时将额外的水转移至现有颗粒的表面上(图3)。然而，在几个生长周期后，二氧化硅颗粒变成多分散的。这可从如下的事实来进行解释：在每次培育过程中，水不仅分布在现有颗粒的表面上，而且也形成新的空水滴。要考虑的另一个因素是，随着粒径的增加，乳液系统不再是均一的和热动力学稳定的，颗粒能够发生沉降。因此，应该将培育工艺的次数控制至最小，以保持单分散性、或尽可能窄的多分散性。
图33说明了通过将上述的两种生长技术(即，多次添加TEOS，期间伴有添加乳液组分)组合产生分层颗粒的方法。在每个培养周期中，硅前体加入两次而不是典型方法中的一次。图34显示了在每个生长期的颗粒的TEM图像，对于整个工艺，水与表面活性剂的摩尔比例为6。初始的籽晶为大约55nm。在3个培育周期后，初始籽晶包被了7层覆层，颗粒直径的范围是大约200-240nm。这样，水与硅醇盐的摩尔比例稍高于4。这种新方法的结果显示，使用较少次数的培育步骤粒径可增加至200nm以上。
有人可能会争辩说对于全部生长步骤来说，应该使用较高的水与表面活性剂摩尔比例，由此为系统提供更多的水。图35显示了生长工艺中水与表面活性剂摩尔比例为9而合成的颗粒的TEM图像。与[水]/[表面活性剂]＝6的系统相比，[水]/[表面活性剂]＝9的系统的初始籽晶并非更大。然而，在相同的生长步骤下，后者粒径的增加更快一些。对于核心+3层覆层颗粒，尺寸增加至大约158-172nm，但随后添加产生小颗粒，表明使用这种水与表面活性剂的高比例，单分散的颗粒不会生长得更好。
在高温下的合成
如前面所提到的，可能需要几天来产生分层纳米颗粒。为了尝试缩短反应时间，在较高温度下进行试验。图36显示了在35℃或50℃时合成的纳米颗粒的TEM图像。在35℃老化20小时产生了35-50nm颗粒。当在相同的温度下使用48小时的老化时间时，粒径增加至大约48-62nm。在50℃下，由于老化时间从20小时增加至48小时，粒径从37-52nm增加至48-70nm。比较而言，在室温下，老化48小时纳米颗粒的尺寸范围在50-60nm左右(图34-a)。这些结果表明粒径随着时间而增加，但很大程度上不依赖于反应温度。高温反应不能使溶胶-凝胶反应迅速完成，但产生的颗粒具有较宽的粒径分布。
图37显示了在较高反应温度下使用水与表面活性剂摩尔比例为8所产生的核心-外壳颗粒。由于反应时间从20小时增加至48小时，不管反应温度(35或50℃)是多少，平均粒径都增加大约10-15nm。
培育对粒径的作用
如前面所提到，为了产生分层纳米颗粒，在室温下制造籽晶，然后在55±5℃下培育一小时以确保大多数TEOS完全反应掉。然后将新的乳液组分加入至悬液中，然后在55±5℃下将混合物培育6小时使所有刚加入的水都被吸附在现有颗粒的表面上。图38显示了在不同培育阶段时的二氧化硅粒径。在孵育前，颗粒的粒径范围大约是76-88nm。在55±5℃下培育一小时后，粒径稍微增加至大约82-96nm。然而，在加入额外的水，然后将系统在55±5℃下培育6小时后，平均粒径很难改变，显示稍微宽一些的粒径分布。对于较长的培育时间没有观察到粒径增加，表明在1小时后几乎所有的硅醇盐都已经反应了。

Claims (34)

1.一种形成分层纳米颗粒的方法，包括：
-提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的核心颗粒；
-将第二种液体加入至悬液中，所述的第二种液体与第一种液体不混溶；和
-向包括第二种液体的悬液中加入反应物、或反应物的前体；由此，如果将反应物加入至包括第二种液体的悬液中，则所述反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，如果将反应物的前体加入至包括第二种液体的悬液中，则所述前体转变为反应物，由此形成的反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，从而形成分层纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第一种液体是非极性液体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的悬液包括第一种表面活性剂，并且其中所述的方法包括在加入反应物、或反应物的前体的步骤之前加入第二种非极性液体和第二种表面活性剂的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的第二种非极性液体与第一种液体相同。
5.根据权利要求3所述的方法，其中加入第二种非极性液体和第二种表面活性剂，这样使第一种液体加第二种非极性液体与第一种表面活性剂加第二种表面活性剂的比例基于v/v、v/w、w/w、v/mol或w/mol保持不变。
6.根据权利要求1所述的方法，其中提供在液体中的核心颗粒的步骤包括在第一种液体中形成核心颗粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核心颗粒具有基本上均匀地分布在其中的核心掺杂剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第二种液体包括覆层掺杂剂，这样覆层包括覆层掺杂剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的覆层掺杂剂是可释放的物质。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述的反应物的反应使覆层掺杂剂基本上均匀地分布在覆层中。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核心颗粒是纳米颗粒或亚微型颗粒。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核心颗粒和覆层中至少之一是多孔的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述的加入第二种液体和加入反应物或前体的步骤被重复一次或多次，从而形成多层覆层。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第二种液体是含水的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中如果将前体加入至悬液中，则所述的前体能够与第二种液体反应以形成所述的反应物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的反应物包括可缩合的物种、可交联的物种或可聚合的物种。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述的前体是可水解的物种，且所述的第二种液体是含水的，由此所述的前体能够发生水解而形成所述的反应物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述的前体是可水解的硅烷。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述的前体是可水解的物种，且所述的第二种液体是含水的液体，且所述的方法包括以下步骤：
-在含水液体中将可水解的物种水解而形成可缩合的物种；和
-在含水液体中将可缩合的物种缩合而形成覆层。
20.根据权利要求19所述的方法，其中水解可水解物种的步骤包括将悬液在足够的温度下保持足够的时间以水解可水解物种。
21.根据权利要求1所述的方法，另外包括下列步骤中的一个或多个：
-从第一种液体中至少部分分离分层纳米颗粒；
-用含水液体洗涤分层纳米颗粒；
-用有机液体洗涤分层纳米颗粒；
-将分层纳米颗粒干燥或冻干。
22.根据权利要求1所述的方法，其中提供悬液的步骤包括：
-提供乳液，所述乳液包括分散在第一种液体中的含水液滴，所述乳液另外包括表面活性剂，其中所述的液滴包括用于在水解过程中缩合可缩合物种的催化剂；和
-向乳液中加入可水解物种，所述的可水解物种能够在含水液滴中水解而形成可缩合物种，由此可缩合物种在催化剂的存在下发生缩合，以形成在第一种液体中的核心颗粒的悬液。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的乳液是微乳液。
24.一种分层纳米颗粒，其包括多孔的核心颗粒和至少部分包围所述核心颗粒的一层或多层覆层，其中纳米颗粒中选自核心和一层或多层覆层的至少一个区域包括基本上均匀地分布在其中的掺杂剂。
25.根据权利要求24所述的分层纳米颗粒，包括：
-多孔核心颗粒，所述的核心颗粒包括核心掺杂剂；和
-包括覆层掺杂剂的多孔覆层，所述的多孔覆层至少部分地包围所述的核心颗粒。
26.根据权利要求25所述的分层纳米颗粒，其中核心掺杂剂和覆层掺杂剂中至少之一可从分层纳米颗粒中释放。
27.根据权利要求26所述的分层纳米颗粒，其中所述的纳米颗粒能够顺序地释放覆层可释放掺杂剂和核心可释放掺杂剂。
28.一种分层纳米颗粒，其通过包括下面步骤的方法制成：
-提供悬液，所述悬液包括在第一种液体中的核心颗粒；
-将第二种液体加入至悬液中，所述的第二种液体与第一种液体不混溶；和
-向包括第二种液体的悬液中加入反应物、或反应物的前体；由此，如果将反应物加入至包括第二种液体的悬液中，则所述反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，如果将反应物的前体加入至包括第二种液体的悬液中，则所述前体转变为反应物，由此形成的反应物发生反应而在核心颗粒上形成覆层，以形成分层纳米颗粒。
29.一种纳米颗粒状物质，其包括多个分层纳米颗粒，每个分层纳米颗粒都包括多孔的核心颗粒和至少部分包围所述核心颗粒的一层或多层覆层，所述的物质具有狭窄的粒径分布。
30.根据权利要求29所述的纳米颗粒状物质，其中纳米颗粒中选自核心和一层或多层覆层的至少一个区域包括基本上均匀地分布在其中的掺杂剂。
31.一种将可释放物质递送至流体的方法，其包括将分层纳米颗粒与流体接触，所述的分层纳米颗粒包括多孔的核心颗粒和至少部分包围所述核心颗粒的一层或多层覆层，其中所述的分层纳米颗粒具有可释放物质，所述的可释放物质基本上均匀地分布在至少一层覆层或核心颗粒中，且所述的流体能够至少部分地从分层纳米颗粒释放可释放物质。
32.一种将药物给予患者的方法，所述的方法包括将分层纳米颗粒递送给患者，所述的分层纳米颗粒包括多孔的核心颗粒和至少部分包围所述核心颗粒的一层或多层覆层，所述的分层纳米颗粒具有基本上均匀地分布在至少一层覆层或核心颗粒中的药物。
33.包括多孔的核心颗粒和至少部分包围所述核心颗粒的一层或多层覆层的分层纳米颗粒在对患者给药中的应用，所述的分层纳米颗粒具有基本上均匀地分布在至少一层覆层或核心颗粒中的药物。
34.包括多孔的核心颗粒和至少部分包围所述核心颗粒的一层或多层覆层的分层纳米颗粒，在选择性吸附混合物中的至少一种组分中的应用。
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