CN101144822A - 一种检测啤酒大麦和麦芽中总泡沫蛋白质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测啤酒大麦和麦芽中总泡沫蛋白质的方法，采用优化的蛋白提取方法，使用较为普及而常用的考马斯亮蓝定量蛋白法(Bradford法)，能够准确直观的检测到啤酒大麦和麦芽中总泡沫蛋白质的变化情况，方法简便快速，适用性强。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种检测啤酒大麦和麦芽中泡沫蛋白质含量的方法。
背景技术
啤酒泡沫是啤酒品质优劣最直接的感官评价指标之一。丰富细腻的泡沫是啤酒的重要特征，也决定着啤酒的商品价值。啤酒泡沫的优劣受多种因素的影响，其中一个最主要的因素是啤酒中的蛋白质，那些能够促进啤酒泡沫生成并增强啤酒泡沫稳定性的蛋白质称为泡沫蛋白(foam-positive protein)。泡沫蛋白来源于啤酒大麦，具有良好的热稳定性和对蛋白水解酶的抗性，因此能够在发芽、糖化、发酵等酿造过程中“存活”下来，并进入到啤酒中，国内外很多的研究已经证明泡沫蛋白质的这些特性及其对啤酒泡沫的贡献。
发芽后的大麦种子(麦芽)是酿造啤酒的主要原料。使用不同品种、不同工艺条件下生产的麦芽酿造的啤酒，其泡沫特性存在很大差异。究其原因，主要是由于不同品种大麦的蛋白质组成不尽相同，其中泡沫蛋白的含量也存在差异。而且，在制麦过程中，随着发芽温度、pH值、通风、外源添加物种类等工艺条件的变化，也必然会影响大麦种子在发芽过程中的蛋白质含量和组成。而纵观目前国内外的制麦和啤酒酿造行业，并没有一种简单有效的方法能够从原料大麦和麦芽中判断和预测成品啤酒的泡沫特性，在实践中，改善麦芽和啤酒泡沫特性几乎完全凭借生产经验。因此迫切需要一种简单准确，行之有效的方法，能够在啤酒的上游生产步骤——制麦过程中，检测和评价啤酒大麦和麦芽中泡沫蛋白的含量和变化。
更重要的是，目前国内优质高档啤酒的酿造几乎全部使用进口大麦麦芽，国产大麦麦芽由于质量较低，始终无法在高档啤酒原料市场占有一席之地。采用本方法能够帮助制麦企业有针对性的改进工艺，改善国产大麦泡沫性较差的缺点，提高国产大麦麦芽的质量，使国产大麦芽摆脱无法酿造高档啤酒的尴尬境地，进而较大地提升其价格和市场竞争力。
发明内容
本发明采用优化的蛋白提取方法，使用较为普及而常用的考马斯亮蓝定量蛋白法(Bradford法)，能够准确检测出啤酒大麦和麦芽中总泡沫蛋白的含量。
具体操作方法如下：
第一步、总泡沫蛋白质的提取。
取粉碎后的大麦或麦芽1g(扣除水分后的绝干重量)，置于离心管中，加入4ml 4℃提取缓冲液，摇匀，置4℃提取1小时，其间每10分钟摇振一次，2800×g离心10min，将上清液收集至另一个试管中，再次向沉淀中加入3ml4℃提取缓冲液，摇匀，置4℃提取1h，2800×g离心10min，取上清液，合并两次所得上清液。提取缓冲液pH7.5，其中含有50mmol·L-1三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，10mmol·L-1氯化钠，1mmol·L-1二硫苏糖醇，乙二胺四乙酸二钠1mmol·L-1，余量为水。
第二步、杂蛋白的去除。
将前述所得上清液置于沸水浴(100℃)20min，4000×g离心10min，取上清液，即得蛋白溶液A。
第三步、考马斯亮蓝(Bradford)法标准曲线的绘制。
配制缓冲液T，pH7.5，其中含有50mmol·L-l三(羟甲基)氨基甲烷，10mmol·L-1氯化钠，余量为水。以缓冲液T为溶剂，配制1％牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(W/W，1mg/ml)，4℃保存。配制考马斯亮蓝(Bradford)贮液，其组成为：95％乙醇100ml，85％磷酸200ml，考马斯亮蓝G250 350mg，于常温下保存备用。配制考马斯亮蓝(Bradford)工作液的组成为： 贮液30ml，95％乙醇1 5ml，85％磷酸30ml，水定容至500ml，过滤不溶颗粒，保存于棕色瓶备用。分别取浓度为0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml的牛血清白蛋白溶液0.1ml于具塞试管中，并以0.1ml缓冲液T为空白对照，加入考马斯亮蓝(Bradford)工作液5ml，摇匀，静置5min，在595nm下测定各管的吸光值，每个样品作一组平行，绘制标准曲线。
第四步、考马斯亮蓝(Bradford)法测定总泡沫蛋白质含量。
取100μl前述蛋白溶液A于1 0ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝(Bradford)工作液，轻柔摇振，静置5分钟，在595nm下测定吸光值，根据第三步所得标准曲线计算其蛋白含量。
本发明中所用的水为蒸馏水、去离子水或双蒸水。本发明能够快速简便地测得啤酒大麦或麦芽中总的泡沫蛋白的含量，同时能够在发芽过程中随时监测泡沫蛋白的变化情况，为大麦和麦芽质量的评价、发芽过程的调控等提供重要的参考指标。
附图说明
图1、为牛血清白蛋白(BSA)标准曲线。
图2、各品种大麦中总泡沫蛋白在发芽过程中的含量变化。
图3、各pH条件下麦芽中的泡沫蛋白含量(μg/ml)变化。
具体实施方式
实施例一、对不同品种大麦和麦芽中泡沫蛋白含量的测定。
取四个品种的大麦在相同条件下发芽，品种分别为斯库纳(Schooner，澳洲)、盖德纳(Gairdner，加拿大)、甘啤二号(新疆)、甘啤三号(内蒙)。
发芽条件：浸麦及喷淋用水pH6.8，16℃，暗室，通风。
发芽时间：浸麦24小时，发芽96小时，共计120小时。
每24小时取样，原麦样品记为发芽0小时，共计24个样品，按品种分别记为斯库纳S0～S120、盖德纳G0～G120、甘啤二号X0～X120、甘啤三号M0～M120。
提取缓冲液pH7.5，Tris-C150mmol·L-1，NaC110mmol·L-1，DTT1mmol·L-1，EDTA·2Nalmmol·L-1，余量为水。
将上述24个样品粉碎，分别称取1g(扣除水分后的绝干重量)，置于塑料离心管中，加入4ml冰冷的(4℃)提取缓冲液，摇匀，置4℃提取1小时，其间每10分钟摇振一次。2800×g离心10min，将上清液收集至另一个试管中，再次向沉淀中加入3ml冰冷的(4℃)提取缓冲液，摇匀，置4℃提取1小时，2800×g离心10min，取上清液，合并两次所得上清液。
将前述所得上清液置于沸水浴(100℃)20min，4000×g离心10min，取上清液，得蛋白溶液A，待用。
配制缓冲液T，pH7.5，其中含有50mmol·L-1 Tris，10mmol·L-1NaCl，余量为水。以缓冲液T为溶剂，配制1％牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(W/W，1mg/ml)，4℃保存。配制Bradford贮液，其组成为：95％乙醇100ml，85％磷酸200ml，考马斯亮蓝G250350mg，于常温下保存备用。配制Bradford工作液的组成为：Bradford贮液30ml，95％乙醇15ml，85％磷酸30ml，以水定容至500ml，过滤不溶颗粒，保存于棕色瓶备用。分别取浓度为0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml的牛血清白蛋白溶液0.1ml于具塞试管中，并以0.1ml缓冲液T为空白对照，加入Bradford工作液5ml，摇匀，静置5min，在595nm下测定各管的吸光值，每个样品作一组平行，绘制出牛血清白蛋白(BSA)标准曲线(图1)。
分别取100μl前述蛋白溶液A于10ml具塞试管中，加入5ml Bradford工作液，轻柔摇振，静置5分钟，在595nm下测定吸光值，根据上述牛血清白蛋白(BSA)标准曲线计算其泡沫蛋白含量，计算结果见表1。
根据表1中各样品总泡沫蛋白质含量绘制各品种大麦中总泡沫蛋白质在发芽过程中的含量变化图(图2)。
表1不同发芽时间各品种大麦总泡沫蛋白质含量(μg/ml)
0 24h 48h 72h 96h 120h司库纳(S) 464 390 454 440 468 517甘德纳(G) 481 374 384 422 440 459甘啤二号 (X) 523 389 431 495 496480甘啤三号 (M) 375 400 378 390 410433
根据表1中各样品总泡沫蛋白质含量绘制各品种大麦中总泡沫蛋白质在发芽过程中的含量变化图(图2)。
根据表1及图2中的数据可见，从发芽全过程上看，各品种大麦种子中泡沫蛋白的含量随发芽时间的变化趋势基本一致，但是在数量上存在较明显的差异。发芽48小时后各时间段上不同样品蛋白浓度的最大值和最小值之间的差值基本在100μg/ml左右，而在原麦中的差距约为150μg/ml，含量最高的甘啤二号比含量最低的甘啤三号多出39.5％；内蒙产的甘啤三号泡沫蛋白的含量始终低于其他品种。在发芽结束的120小时，司库纳含量最高，而甘啤三号含量最低，前者(S120)比后者(M120)多出19.4％。据此可推测出甘啤三号的泡沫特性较差，事实上内蒙出产的甘啤三号正是品质较差，与实验估计相符。
大部分国产大麦的蛋白质含量高于进口大麦，而进口大麦的品质较为均一和稳定。实验数据表明，在原麦中，两种进口大麦泡沫蛋白含量较为接近，略低于甘啤二号，与实际情况相符合。
实施例二、对不同发芽工艺条件下麦芽中泡沫蛋白含量的测定。
大麦品种：盖德纳(Gairdner，加拿大)。
发芽条件：16℃，暗室，通风供氧。浸麦和喷淋用水分别为pH3.0、pH4.0、pH5.0的柠檬酸水溶液。
发芽时间：浸麦48小时，发芽96小时，共计144小时。每24h取样，共计18个样品。
提取及测定方法同实施例一，牛血清白蛋白(BSA)标准曲线同实施例一，测定结果见表2。
根据表2中各样品总泡沫蛋白质含量绘制各品种大麦中总泡沫蛋白质在发芽过程中的含量变化图(图3)。
表2不同时间各pH条件下麦芽中的总泡沫蛋白质含量(μg/ml)
| 24h | 48h | 72h | 96h | 120h | 144h | |
| pH3.0 | 519 | 481 | 518 | 548 | 550 | 619 |
| pH4.0 | 553 | 568 | 609 | 557 | 566 | 649 |
| pH5.0 | 594 | 540 | 571 | 541 | 532 | 602 |
根据表2和图3可见由上述数据可见，在不同发芽工艺条件下(pH值)，本方法能够检测到麦芽中的泡沫蛋白差异，并能够观测到发芽过程中泡沫蛋白的变化情况(图3)。总的看来，发芽用水pH值在4.0时，麦芽中总泡沫蛋白质含量较高；经过对三种pH条件下麦芽中酶活力和组织pH值的测定，发现pH4.0条件下麦芽中的酶活力较高，组织pH波动较小，麦芽质量较其他两个组(pH3.0/5.0)为好。
综上可见，本方法能够准确的测定麦芽中泡沫蛋白含量，跟踪泡沫蛋白的变化情况，评价麦芽质量，为制麦企业的生产工艺调控提供重要的参数和科学依据；帮助制麦企业有针对性的改进工艺；为成品麦芽提供重要的质量评价指标和价格依据。
Claims (4)
1.一种检测啤酒大麦或麦芽中总泡沫蛋白质含量的方法，其特征在于按以下步骤进行操作：
(1)取粉碎后的大麦或麦芽1g，置于离心管中，加入4ml 4℃提取缓冲液，摇匀，置4℃提取1h，其间每10min摇振一次，2800×g离心10min，将上清液收集至另一个试管中，再次向沉淀中加入4℃提取缓冲液3ml，摇匀，置4℃提取1h，2800×g离心10min，取上清液，合并两次所得上清液；
(2)将前述所得上清液于沸水浴放置20min，4000×g离心10min，取上清液，即得蛋白溶液A；
(3)分别取浓度为0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml的牛血清白蛋白溶液0.1ml于具塞试管中，并以0.1ml缓冲液T为空白对照，加入考马斯亮蓝(Bradford)工作液5ml，摇匀，静置5min，在595nm下测定各管的吸光值，每个样品作一组平行，绘制标准曲线；
(4)取100ul前述蛋白溶液A于10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝(Bradford)工作液，轻柔摇振，静置5min，在595nm下测定吸光值，由标准曲线计算其蛋白含量；
以上所述：
提取缓冲液为pH7.5，其中含有50mmol·L-1三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，10mmol·L-1氯化钠，1mmol·L-1二硫苏糖醇，1mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠，余量为水；
考马斯亮蓝(Bradford)工作液的组成为：考马斯亮蓝(Bradford)贮液30ml，95％乙醇15ml，85％磷酸30ml，用水定容至500ml，过滤不溶颗粒，保存于棕色瓶中；
缓冲液T为pH7.5，其中含有50mmol·L-1三(羟甲基)氨基甲烷，10mmol·L-1氯化钠，余量为水；
牛血清白蛋白标准溶液使用缓冲液T配制而成，浓度为1mg/ml；
所述考马斯亮蓝(Bradford)贮液，其组成为：95％乙醇100ml，85％磷酸200ml，考马斯亮蓝G250 350mg。
2.根据权利要求1所述的检测啤酒大麦或麦芽中总泡沫蛋白质的方法，其特征在于所取大麦或麦芽的重量为扣除水分后的绝干重量。
3.根据权利要求1所述的检测啤酒大麦或麦芽中总泡沫蛋白质的方法，其特征在于所述步骤的第一步中，提取时需要连续震荡。
4.根据权利要求1所述的检测啤酒大麦或麦芽中总泡沫蛋白质的方法，其特征在于所用的水为蒸馏水、去离子水和双蒸水。
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