CN101140282A - 水痘抗血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种水痘抗血清的制备方法，先将人二倍体细胞扩增传代，其扩增传代比例为1∶2～4，加入扩增的水痘—带状疱疹病毒液，于35～37℃培养2－5天，当人二倍体细胞出现80％以上典型病变时倒掉原维持液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞表面，加入含2％－20％豚鼠血清的培养基，液量为原液体积的1/1～1/100，破碎细胞、澄清过滤、取含水痘-带状疱疹病毒的上清液，用上述含水痘-带状疱疹病毒的上清液多次免疫豚鼠，采集上述豚鼠血，离心分离血清，除菌过滤，血清灭活，得到水痘抗血清。本发明方法比从人血制取法简单，成本低，制出的抗血清杂蛋白少、效价高，一般为1∶1024－2048。
Description
技术领域：
本发明涉及一种抗血清的制备方法，特别是水痘抗血清的制备方法。
背景技术：
水痘抗血清是检验水痘疫苗的试剂，用于鉴别水痘-带状疱疹病毒，确定水痘疫苗质量。目前，制备抗血清一般是用抗原免疫家兔来制备，但是家兔对水痘-带状疱疹病毒不敏感，不能产生高效价抗血清，因此，水痘抗血清大部分是从人血清中提取的，它的不足之处是1、含水痘抗血清的人血较少，来源受到很大限制，满足不了对水痘抗血清的需求。2、价格昂贵、成本高。3、效价低。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种来源广泛，成本低，效价高的水痘抗血清的制备方法。
本发明主要是用水痘-带状疱疹病毒作为抗原免疫豚鼠，再从豚鼠血中提取水痘抗血清，其方法如下：
一、水痘一带疱疹病毒的制备。
1人二倍体细胞扩增传代
将人二倍体细胞扩增传代，人二倍体细胞包括2BS株、MRC-5株、WI-38株、HLF-02株，KMB-17株。扩增传代的比例为：1∶2～4。扩增传代生长液为PH值7.2-7.6含10～20％小牛血清的MEM培养基(极限必须培养基)或PH值7.2-7.6的含10～20％小牛血清的199培养基；于37℃温度培养3-5天，使人二倍体细胞生长成致密单层。
2水痘-带状疱疹病毒的扩增
将人二倍体细胞MRC-5扩增传代，传代比例为1∶2，，其生长液为PH值是7.2的含10％小牛血清的MEM或199培养基，于37℃温度放置培养3天。取水痘-带状疱疹病毒，该水痘-带状疱疹病毒的来源(1)从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买的水痘疫苗毒种OKa株。(2)从水痘患者的疹内液体中分离的水痘-带状疱疹病毒。(3)从水痘患者的疹内液体中分离的水痘-带状疱疹病毒在减毒过程中得到的中间产物。将该病毒按1/20(体积比)比例加入到维持液中，维持液为PH值是7.2，含2％小牛血清的MEM或199培养基，于37℃温度放置培养3天。用显微镜观察有80％以上细胞由条状变为葡萄状发生典型病变时，倒掉原维持液，然后加入PH值为7.2的含10％小牛血清的MEM或199培养基，液量为原维持液量的1/1～1/2(体积比)。破碎细胞，澄清过滤，所得滤液即为扩增的水痘-带状疱疹病毒液。
3免疫豚鼠用水痘-带状疱疹病毒的制备
将扩增的水痘-带状疱疹病毒液加入到扩增传代的人二倍体细胞中感染细胞，其维持液为PH值7.2-7.6含1～20％小牛血清的199培养基或含1～20％小牛血清的MEM培养基，最好水痘-带状疱疹病毒液∶维持液＝1/1～1/100(体积比)，于35℃～37℃温度培养2-5天。当人二倍体细胞出现80％以上典型病变时，倒掉原维持液。用PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞面，最好冲洗量至少是一倍维持液量。向上述细胞中加入PH值7.2-7.6的含2-20％豚鼠血清的新维持液MEM培养基或199培养基，液量为原维持液量的1/1～1/100(体积比)，收获细胞培养物，破碎细胞，澄清过滤、取含水痘-带状疱疹病毒的上清液，即为进一步扩增的水痘-带状疱疹病毒液。
二、用水痘-带状疱疹病毒作为抗原免疫豚鼠，制备水痘抗血清。1用上述含水痘-带状疱疹病毒的上清液(进一步扩增的水痘-带状疱疹病毒液)多次免疫豚鼠，或用上述含水痘-带状疱疹病毒的上清液与弗氏完全佐剂或不完全佐剂的混合物免疫豚鼠，含水痘-带状疱疹病毒上清液∶弗氏完全佐剂＝1∶0～1(体积比)含水痘-带状疱疹病毒上清液∶弗氏不完全佐剂＝1∶0～1(体积比)免疫时间分别为0，1，2周；免疫部位可以是腹腔、皮内、皮下及肌肉。
2采集上述豚鼠血，最好第5周心脏采血。将豚鼠血分别在37℃温度放置1小时，4℃温度放置2～24小时，然后离心分离血清，除菌过滤，56℃温度30分钟血清灭活，得到外观微黄、澄清、透明的水痘抗血清。
3测定上述水痘抗血清效价，测定方法见实施例1。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1本发明方法比从人血制取法简单，易于操作。
2制出的抗血清效价高，为1∶1024-2048，而外国从人血提取的抗血清效价为1∶20。
3制出的抗血清杂蛋白少：如果使用人血白蛋白或牛血清作病毒保护剂，不但产生抗水痘-带状疱疹抗体，而且还产生抗人血白蛋白或牛血清的抗体，使得抗体纯度不高。采用豚鼠血清作病毒保护剂免疫豚鼠时，只产生抗水痘-带状疱疹病毒的抗体，由于保护剂中不含人血白蛋白或牛血清，因此制备出的抗血清中不含这两种保护剂的抗体。4采用本发明制得的水痘抗血清成本低，约是从人血提取的水痘抗血清成本的1/10。
具体实施方式
例1
将人二倍体细胞MRC-5扩增传代，传代比例为1∶2，其生长液为PH值是7.2的含10％小牛血清的199培养基，于37℃温度放置培养3天。加入扩增的水痘-带状疱疹病毒液，(其扩增的方法为将人二倍体细胞MRC-5扩增传代，传代比例为1∶2，，其生长液为PH值是7.2的含10％小牛血清的MEM培养基，于37℃温度放置培养3天。取水痘-带状疱疹病毒，该水痘-带状疱疹病毒是从美国典型培养物保藏中心购买的水痘疫苗毒种OKa株。将该病毒按1/20体积比加入到维持液中，维持液为PH值是7.2，含2％小牛血清的MEM培养基，于37℃温度放置培养3天。用显微镜观察有80％以上细胞由条状变为葡萄状发生典型病变时，倒掉原维持液，然后加入PH值为7.2的含10％小牛血清的MEM培养基，液量与原维持液量的体积比为1/1。破碎细胞，澄清过滤，所得滤液即为扩增的水痘-带状疱疹病毒液。)水痘-带状疱疹病毒液按1/20(体积比)比例加入到维持液中，维持液为PH值是7.2含2％小牛血清的199培养基，于37℃温度放置培养3天。用显微镜观察有80％以上细胞由条状变为葡萄状发生典型病变时，倒掉原维持液。用一倍维持液量(体积)PH值7.4～7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞面，然后加入PH值为7.2的含5％豚鼠血清的199培养基，液量为原维持液量的1/100(体积比)。破碎细胞，澄清过滤，取含水痘-带状疱疹病毒的上清液，(即为进一步扩增的水痘-带状疱疹病毒液)。向豚鼠腹腔接种1毫升上述上清液，相隔一周、二周再分别向豚鼠腹腔接种1毫升上述上清液。于第5周心脏采全血。将豚鼠血分别在37℃温度放置1小时，4℃温度放置2小时，然后在1000转/分条件下离心20分钟，取血清，血清再经滤膜过滤除菌后，置于56℃温度30分钟进行血清灭活，得到的外观为微黄、澄清、透明的产品即为水痘抗血清。上述豚鼠水痘抗血清按以下方法进行效价测定：
将培养3天已长成单层的人二倍体细胞MRC-5株弃去生长液，接种病毒，2ml/瓶，轻摇使病毒均匀分散于人二倍体细胞表面，37℃吸附60分钟。吸附完毕后，每瓶补加维持液至15ml，维持液为PH7.2-7.6的199培养基，置37℃恒温室培养3天，于显微镜下观察，确认病变达80％，弃旧液，加入配制好的胰蛋白酶液5mL/瓶，置室温消化3分钟，弃胰蛋白酶液，加入PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)，10ml/瓶，将病变细胞轻轻吹下，并将其收集到离心杯中，补加PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)900转/分，离心10分钟。离心结束，弃上清液，加入PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)(按25ml/100ml小方瓶)，用吸管吹打分散沉淀物使之成均匀的悬液，然后用25μl微量加样器将病变细胞接种到十二孔载物片上，每孔接种病变细胞悬液20μl，于湿盒中放置30分钟。将载物片放入已于-70℃预冷1小时的丙酮中固定10分钟，再用PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次，10分钟/次，然后干燥即制备成抗原载物片，置-70℃保存备用。
用多头微量加样器吸取PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)加到酶标板中50μl/孔，然后用单头微量加样器吸取50μl血清加到酶标板中第一孔，换取样器头吸打10次，为2倍稀释，再从此孔吸取50μl 2倍稀释血清加入到酶标板第二孔中，吹打10次，为4倍稀释，如此倍比稀释至2048倍。用单头微量加样器吸取2048倍稀释的血清20ul滴加到抗原载物片第10孔上，再吸取1024倍稀释的血清20μl滴加到抗原载物片第9孔上，如此从高稀释度到低稀释度分别滴加到载物片各孔上。即第一孔为4倍稀释，第十孔为2048倍稀释。抗原载物片的第11孔滴加阴性对照血清20μl，第12孔滴加阳性对照血清20μl，然后将抗原载物片置湿盒中放37℃恒温室反应30分钟。抗原抗体反应结束后用PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次10分钟，干燥后每孔加入荧光标记抗人IgG20μl，置湿盒中放37℃恒温室30分钟。反应结束后，用PH值7.4-7.6磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次10分钟，干燥后每孔滴加甘油缓冲液1滴，覆盖盖玻片。将载物片置荧光显微镜下观察，呈现黄绿色膜性荧光为阳性，呈现非膜性浅绿色为阴性，根据荧光判定水痘抗血清的效价。经测定水痘抗血清的效价为1∶2048。
其它实施例重复例1的操作，具体数值列表如下：
| 序号 | 项目内容 | 例1 | 例2 | 例3 | 例4 | 例5 |
| 1 | 细胞名称传代倍数 | MRC-52 | 2BS3 | WI-382 | MRC-52 | KMB-174 |
| 2 | 扩增病毒的培养基 | MEM | 199 | MEM | MEM | 199 |
| 3 | 水痘-带状疱疹病毒来源 | 美国ATCC的OKa株 | 患者疹内液体 | 疹内液体减毒中间产物 | 美国ATCC的OKa株 | 美国ATCC的OKa株 |
| 4 | 病毒液是维持液的倍数(V/V) | 1 | 0.5 | 0.75 | 1 | 0.8 |
| 5 | 生长液PH值生长液时间(天) | 7.2含10％小牛血清199培养基3 | 7.3含10％小牛血清MEM培养基4 | 7.4含20％小牛血清199培养基3 | 7.5含20％小牛血清MEM培养基3 | 7.6含15％小牛血清199培养基5 |
| 6 | 加病毒量(v/v)维持液PH值含小牛血清培养基名称温度℃ | 1/207.22％19937 | 1/107.320％MEM36 | 1/407.41％19935 | 1/17.52％MEM36 | 1/1007.65％19937 |
| 时间 | 3 | 3 | 3 | 2 | 5 | |
| 7 | 细胞病变百分率冲洗液倍数 | 951 | 851 | 802 | 951.5 | 801 |
| 8 | 培养基PH值含豚鼠血清％培养基名称培养基用量 | 7.251991ml | 7.32MEM5ml | 7.44199100ml | 7.510MEM2ml | 7.62019920ml |
| 9 | 免疫豚鼠部位 | 腹 | 肌肉 | 皮下 | 腹 | 腹 |
| 10 | 弗氏完全佐剂比例 | 0.5 | 1 | |||
| 11 | 弗氏不完全佐剂比例 | 0.5 | 1 | |||
| 12 | 血清效价 | 1∶2048 | 1∶512 | 1∶256 | 1∶1024 | 1∶256 |
Claims (4)
1.一种水痘抗血清的制备方法，其特征在于：
1).将人二倍体细胞扩增传代，其扩增传代比例为1∶2～4，生长液为PH值7.2～7.6的含10～20％小牛血清的MEM培养基或PH值7.2～7.6的含10～20％小牛血清的199培养基，于37℃培养3-5天，
2)扩增水痘-带状疱疹病毒，
3).将扩增的水痘-带状疱疹病毒液加入到步骤1)的产物中，维持液为PH值7.2-7.6的含1～20％199培养基或含1～20％小牛血清的MEM培养基，于35～37℃培养2-5天，
4).当人二倍体细胞出现80％以上典型病变时倒掉原维持液，用PH值7.4～7.6磷酸盐缓冲液冲洗细胞表面，
5).向上述细胞中加入含2％-20％豚鼠血清的PH值为7.2～7.6的MEM培养基或199培养基，液量为原液体积的1/1～1/100，破碎细胞、澄清过滤、取含水痘-带状疱疹病毒的上清液，
6).用上述含水痘-带状疱疹病毒的上清液多次免疫豚鼠，
7).采集上述豚鼠血，离心分离血清，除菌过滤，血清灭活，得到水痘抗血清，
8).测定上述水痘抗血清效价。
2.根据权利要求1所述的水痘抗血清的制备方法，其特征在于：将人二倍体细胞MRC-5扩增传代，传代比例为1∶2，其生长液为PH值是7.2的含10％小牛血清的MEM或199培养基，于37℃温度放置培养3天，取水痘-带状疱疹病毒，按1/20(体积比)比例加入到维持液中，维持液为PH值是7.2，含2％小牛血清的MEM或199培养基，于37℃温度放置培养3天，用显微镜观察有80％以上细胞由条状变为葡萄状发生典型病变时，倒掉原维持液，然后加入PH值为7.2的含10％小牛血清的MEM或199培养基，液量为原维持液量的1/1～1/2(体积比)，破碎细胞，澄清过滤，所得滤液即为扩增的水痘-带状疱疹病毒液。
3.根据权利要求1或2所述的水痘抗血清的制备方法，其特征在于：用含水痘-带状疱疹病毒的上清液与弗氏完全佐剂的混合物多次免疫豚鼠，并且含水痘-带状疱疹病毒的上清液与弗氏完全佐剂的体积比为1∶0～1。
4.根据权利要求1或2所述的水痘抗血清的制备方法，其特征在于：用含水痘-带状疱疹病毒的上清液与弗氏不完全佐剂的混合物多次免疫豚鼠，并且含水痘-带状疱疹病毒的上清液与弗氏不完全佐剂的体积比为1∶0～1。
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| CNA2007100125276A CN101140282A (zh) | 2007-08-22 | 2007-08-22 | 水痘抗血清的制备方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115227811A (zh) * | 2022-08-26 | 2022-10-25 | 上海荣盛生物药业股份有限公司 | 一种水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法 |
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2007
- 2007-08-22 CN CNA2007100125276A patent/CN101140282A/zh active Pending
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