CN101132832A - 炎症的治疗 - Google Patents

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CN101132832A CNA2005800391771A CN200580039177A CN101132832A CN 101132832 A CN101132832 A CN 101132832A CN A2005800391771 A CNA2005800391771 A CN A2005800391771A CN 200580039177 A CN200580039177 A CN 200580039177A CN 101132832 A CN101132832 A CN 101132832A
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P·菲什曼
S·巴-耶胡达
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Abstract

本发明涉及通过氨甲喋呤和A3腺苷受体的激动剂的组合施用进行炎性疾病的治疗性疗法。提供了包括该组合施用的治疗性疗法的方法、用于该方法的、包含两种活性剂中任一种和使用A3腺苷受体激动剂或氨甲喋呤中的任一种的药物组合物以及使用这些活性剂中的任一种制备该药物组合物的用途。

Description

炎症的治疗
发明领域
本发明涉及治疗领域且特别地涉及炎性疾病的治疗。
现有技术
下面是一系列被认为和描述本发明的领域内的技术状态相关的技术。这些参考资料的引用在本说明书中有时通过在括号内标示来自下面列表的其编号来表示。
1.Fishman P，等人Evidence for involvement of Wntsignalingpathway in IB-MECA mediated suppression of melanoma cells.Oncogene.，21：4060-4064(2002).
2.Fishman P，等到Targeting the A3 adenosine receptor forcancer therapy：inhibition of Prostate carcinoma cell growthby A3AR agonist.Anticancer Res.，23：2077-2083(2003).
3.Madi L等人A3adenosine receptor activation in melanomacells：association between receptor fate and tumor growthinhibition.J.Bio.Chem.，278：42121-42130(2003).
4.Ohana G，等人Inhibition of primary colon carcinomagrowth and liver metastasis by the A3adenosine receptor agonistIB-MECA.British J.Cancer.，89：1552-1558(2003).
5.Fishman P，等人An agonist to the A3adenosine receptorinhibits colon carcinoma growth in mice via modulation of GSK-3βand NF-κB.Oncogene，23：2465-2471(2004).
6.美国专利申请2004016709A1.
7.Szabo，C，等人Suppression of macrophage inflammatoryprotein(MIP)-1αproduction and collagen-induced arthritisby adenosine receptor agonists.British J.Pharmacology，125：379-387(1998).
8.Mabley，J.，等人The adenosine A3 receptor agonist，N6-(3-iodobenzyl)-adenosine-5′-N-methyluronamide，isprotective in two murine models of colitis.Europ.J.Pharmacology，466：323-329(2003).
9.Baharav，E.，等人The effect of adenosine and the A3adenosine receptor agonist IB-MECA on joint inflammation andautoimmune diseases models.Inter.J.MoI.Med.10(supplement1)page S104，abstract 499(2002).
10.Bahave E.等人Antiinflammatory effect of A3 Adenosinereceptor agonists in murine autoimmune arthritis models.J.Rehumatolog 32：469-476(2005)；
11.Montesinos，M.Carmen，等人Adenosine A2A or A3 receptorsare required for inhibition of inflammation by methotrexate andits analog MX-68.Arthritis&Rheumatism，48：240-247(2003).
12.Madi L，等人The A3 Adenosine Receptor is HighlyExpressed in Tumor vs.Normal Cells：Potential Target for TumorGrowth Inhibition.Clinical Cancer Research，10：4472-4479，2004.
13.Gessi，S.等人Elevated expression of A3 adenosinereceptors in human colorectal cancer is reflected in peripheralblood cells Clinical Cancer Research 10：5895-5901，2004.
14.美国专利申请，公开号20040137477A1.
15.Chan ES和Cronstein BN.″Molecular action ofmethotrexate in inflammatory diseases″Arthritis research.4：266，(2002).
16.Montesinos MC；等人Adenosine A2A or A3 receptors arerequired for inhibition of inflammation by methotrexate and itsanalog MX-68″.Arthritis&rheumatism.48：240(2003).
17.Yednock，TA.等人Me thods and compositions for treatingrheumatoid arthritis，美国专利申请公开号20050074451.
18.Yednock，TA.等人Methods and compositions for treatingrheumatoid arthritis.美国专利申请公开号20050065192.
19.Feldman M.等人Anti-TNF Antibodies and Methotrexate inthe Treatment of Autoimmune Disease.AU200051825.
20.Alison MB等人Combination therapy using a TNF bindingprotein for treating TNF-mediated diseases.美国专利申请公开号US2002119924.
发明背景
A3腺苷受体
A3腺苷受体，Gi蛋白相关性细胞表面受体，被认为是抗癌和抗炎症的靶。该受体在各种肿瘤细胞类型中高度表达，但在相邻的正常组织中显示较低的表达。通过特异性合成的激动剂激活该受体诱导包括Wnt和NF-kB的信号转导途径的下调，从而导致肿瘤生长的抑制(1-5)。体内研究已显示A3AR激动剂抑制结肠癌、前列腺癌和胰腺癌以及黑色素瘤和肝癌的发展。
也显示A3AR激动剂在不同的实验性自身免疫-A-模型(例如类风湿性关节炎、多发性硬化和克罗恩病)中通过改善炎症性过程发挥抗炎剂的作用(6-10)。早期提出了A2A和A3受体介导氨甲喋呤的抗炎作用(11)。
和正常细胞相比，A3腺苷受体(A3AR)的表达水平在癌细胞中被提高(12，13)。因此，已将A3AR的表达水平描述为用于癌症诊断的方法(14)。此外，也已描述A3AR的表达水平在患有结肠直肠癌的患者的外周血细胞中被提高(13)。
氨甲喋呤
氨甲喋呤(MTX)是代谢拮抗剂，其最初被开发用于恶性肿瘤的治疗剂，目前以较低的剂量用于治疗类风湿关节炎和其他自身免疫性疾病和变态反应性疾病。
尽管MTX最初作为抑制嘌呤和嘧啶的合成以治疗恶性肿瘤的抗增殖剂引进的，但现在很清楚氨甲喋呤的许多抗炎作用是由腺苷介导的(15)。在该作用机制的验证中，动物和患者中的研究都表明腺苷受体拮抗剂(其中一种是咖啡因)逆转或阻止氨甲喋呤的抗炎作用(15，16)。
已提出了包含MTX和其他药剂的联合治疗：例如，TNF介导的病症包括自身免疫性疾病的治疗中的MTX和α-4-整联蛋白的抗体或抑制剂的组合(17，18)，及MTX和抗TNF抗体或TNF结合蛋白的组合(19，20)。
发明概述
本发明基于这样发现，即与用单独的MTX或用单独的A3AR激动剂治疗相比，腺苷受体(A3AR)激动剂IB-MECA和MTX的联合治疗导致在炎症性关节炎动物模型中产生更大的抗炎效果。
因此，本发明提供了治疗患有炎性疾病的受试者的方法，其包括给受试者施用有效量的MTX和有效量的A3AR激动剂的组合物。
此外，本发明提供了治疗患有炎性疾病且用MTX进行治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的A3AR激动剂。
此外，本发明提供了治疗患有炎性疾病并用A3AR激动剂进行治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的MTX。
本发明也提供了使用A3AR激动剂制备用于治疗患有炎性疾病并用MTX进行治疗的受试者的药物组合物的用途。
本发明还提供了使用MTX制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗患有炎性疾病并用A3AR激动剂进行治疗的受试者。
本发明还提供了用于治疗患有炎性疾病并用MTX进行治疗的受治疗者的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的A3AR激动剂。
本发明还提供了用于治疗患有炎性疾病并用A3AR激动剂进行治疗的受治疗者的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的MTX。
根据本发明，所述A3AR激动剂优选地是，但不限于，N6-(3-碘苄基)-腺苷-5′-N-甲基-尿酰胺(uronamide)(IB-MECA)和2-氯-N6-(3-碘苄基)-腺苷-5′-N-甲基-尿酰胺(C1-IB-MECA)。然而，这些目前优选的A3AR激动剂绝不是排他的，也可以使用其他这样的激动剂，如下面进一步详述的。
优选的，但非排他的，根据本发明治疗的炎性疾病是自身免疫性病症，更优选地是类风湿性关节炎(RA)。如在下面进一步描述的，本发明的联合治疗事实上也可用于其他疾病，在所述疾病中需要或可能需要使用MTX或A3AR激动剂进行治疗。
附图概述
为了理解本发明和了解如何在实践中实施，现通过非限定性实施例，参照附图描述优选的实施方案，其中：
图1A-1B是实验的结果的图解表示法，该实验显示用氨甲喋呤(MTX；0.25mg/Kg，图1A中和0.25或0.75mg/Kg，图1B中)、IB-MECA(CF101)或MTX和IB-MECA的组合物或只用赋形剂(对照)处理的AIA动物中的作为时间的函数的关节炎严重度的变化。
图2A-2B是显示如通过MTT测定法所确定的IB-MECA(CF101)和MTX的联合治疗对人成纤维细胞如滑膜细胞(FLS)(图2A)或大鼠FLS(图2B)的增殖的影响的直方图。
发明详述
在下列关于用于治疗炎性疾病的治疗方法的详述中描述本发明，所述治疗法包括A3AR激动剂和MTX的组合物的施用。应当指出的是除了所述治疗方法外，本发明还包括使用活性剂(MTX和A3AR激动剂)中的每一种制备药物组合物，所述药物组合物用于给患有炎性疾病并需要通过抗炎疗法进行治疗的受试者施用，所述抗炎疗法包括使用其他活性剂；和用于治疗需要通过这些活性剂中的一种进行治疗的炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的这些活性剂中的其他活性剂和药物可接受的赋形剂。
如在本说明书和权利要求中所用的，形式“一个”、“一种“这个”，除非上下文明确地指出，包括单数和复数形式。例如，术语“一种A3AR激动剂”包括一种或多种激动剂。
此外，如此处所用的，术语“包含”意指方法或组合物包含列举的元素，但不排除其他元素。类似地，“基本上由......组成”用于定义包含列举的元素但排除可对抗炎活性具有显著影响的其他无素的方法和组合物。例如，基本上由A3AR激动剂组成的组合物将不包含或只包括可忽略量(对该组合物的抗炎作用几乎没有作用的量)的其他具有抗炎活性的活性成分。同样，基本上由此处定义的活性剂组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物、药物可接受的赋形剂例如磷酸缓冲盐溶液、赋形剂、防腐剂等。“由......组成”将表示不包含超过痕量的其他元素。由这些临界术语(transition terms)的各术语定义的实施方案在本发明的范围之内。
此外，所有数值，例如，浓度或剂量或其范围，都是和所述值相差达(+)或(-)20％，有时达10％范围内变化的近似值。要理解，即使没有总是清楚地提到，但所有数字名称之前都加有术语“大约”。也要理解的是，尽管没有总是清楚地提到，但此处描述的试剂只是示例性的且其等效物在本领域是已知的。
如在下列示例性实施方案中所描述的，本发明基于这样的发现，即使用IB-MECA(A3AR激动剂)和MTX一起治疗具有诱导的炎症性关节炎(佐剂诱导的关节炎，AIA)的动物比单独使用这些药物中的任一种产生显著更大的联合抗炎作用。
因此，根据本发明，提供了用于治疗炎性疾病的方法，该方法包括给需要所述抗炎疗法的受试者组合施用有效量的MTX和有效量的A3AR激动剂。
本发明的上下文中的组合施用是指在相同的治疗过程中给患者施用A3AR激动剂和MTX，该过程可持续数周、数月或数年。两种活性剂都给患者施用，按照其特定的服药日程施用各活性剂。通常每周一次地给患者口服或肠胃外施用MTX。可每天一次、每天两次、每天数次、隔日一次等地给患者口服或肠胃外施用A3AR激动剂。本发明的联合治疗可包括，例如，每周一次地施用MTX和每天一次或两次地施用A3AR激动剂。本发明的联合治疗是包括上述组合施用的治疗。
本发明的联合治疗可用于以前未用MTX或A3AR激动剂治疗的患者，或可用于用MTX或A3AR激动剂治疗但两者都未对现有治疗作出适当反应的患者或可用于增强治疗性反应的目的。
因此，当涉及组合施用时，本发明也涉及使用A3AR激动剂制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗患有炎性疾病并正在用MTX进行治疗的患者，或可选择地，涉及使用MTX制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗患有炎性疾病并正在用A3AR激动剂进行治疗的患者。
两种有效成分的联合治疗产生抗炎作用。此处，术语“抗炎”可用于表示通过联合治疗在减轻炎性疾病中的炎性反应上获得的疾病改善效应。可基于医生已知的各种参数确定抗炎反应。例如，当炎性疾病是关节炎时，所述参数可包括一个或多个下列参数：组织学参数、炎症的血液参数、肿胀和的程度和触痛的关节、活力参数、疼痛的减轻、许多不同的总体性能评分系统等。
因此，本发明的术语“炎性疾病”将表示活跃的或亚临床炎性疾病的任何状态，包括免疫诱导的病理状态，其特征在于具有病理后遗症的永久性炎症反应。该状态的特征可在于单核细胞的浸润、成纤维细胞和小血管的增殖、增加的结缔组织和组织破坏。
术语“炎性疾病”可包括与炎症反应和由免疫诱导的免疫系统介导的病状(例如自身免疫性病症)相关的各种病症。然而，根据优选的实施方案，术语“炎性疾病”表示这样的病症，即在该疾病中正需要使用MTX进行治疗。不限定于此，在本发明的上下文中，炎性疾病包括牛皮癣、牛皮癣性关节炎、克罗恩病、类风湿性关节炎以及其他风湿性疾病，包括多发性肌炎和全身性红斑狼疮。
关于有效成分，即A3AR激动剂和MTX，两者在本领域都是已知的。一般地，所述A3AR激动剂是能够特异性地结合腺苷A3受体(″A3R″)，从而完全或部分地激活所述受体，从而产生治疗作用(在该特定的情况下，抗炎作用)的任何化合物。因此A3AR激动剂是通过结合和激活A3AR发挥其主要作用的分子。这意味着在其施用的剂量上其基本上只结合至且只激活A3R.：在优选的实施方案中，A3AR激动剂对人A3AR具有低于1000nM、理想地低于500nM、有利地低于200nM和甚至低于100nM、通常低于50nM、优选地低于20nM、更优选地低于10nM和理想地低于5nM的结合亲和力(Ki)。Ki越低，有效地激活A3AR从而获得治疗作用的A3AR激动剂的剂量(可使用的)越低。
应当指出，一些A3AR激动剂也可和具有更低亲和力(即更高Ki)的其他受体相互作用和激活它。如果分子对A3R的亲和力比对任何其他腺苷受体的亲和力大至少3倍(即其对A3R的Ki至少低3倍)、优选地10倍、理想地20倍和最优选地至少50倍，那么其将被认为是本发明的说明书中的A3AR激动剂(即通过结合和激活A3R发挥其主要作用的分子)。
可通过许多测定法，例如结合测定法确定A3AR激动剂对人A3R的亲和力以及它对其他人腺苷受体的相对亲和力。结合测定法的实例包括提供具有受体的膜或细胞并测量A3AR激动剂取代结合的放射性激动剂的能力；使用展示各人类腺苷受体的细胞并在功能测定法中测量A3AR激动剂激活或失活(视情况而定)下调信号转导事件的能力，例如通过cAMP水平的增加或减少测量的对腺苷酸环化酶的作用；等等。很明显，如果增加A3AR激动剂的施用水平以使其血液水平达到接近其他腺苷受体的Ki的水平，那么在该施用后，除了激活A3R外还可激活这些受体。因此优选地以使获得的血液水平基本上只使A3R激活的剂量施用A3AR激动剂。
一些腺苷A3AR激动剂的特征和其制备方法详细地描述于，除了别的以外，US 5,688,774、US 5,773,423、US 5,573,772、US 5,443,836、US 6,048,865、WO 95/02604、WO 99/20284、WO 99/06053和WO97/27173，其全部在此引用作为参考。
根据本发明的一个实施方案，A3AR激动剂是落在通式(I)的范围之内的嘌呤衍生物，所述通常式(I)为：
Figure A20058003917700131
其中R1是C1-C10烷基、C1-C10羟烷基、C1-C10羧基烷基或C1-C10氰基烷基或下列通式(II)的基团：
Figure A20058003917700132
其中：
-Y是氧原子、硫原子或CH2；
-X1是氢原子、C1-C10烷基、RaRbNC(＝O)-或HORc-，其中Ra和Rb可以相同或不同且选自氢、C1-C10烷基、氨基、C1-C10卤代烷基、C1-C10氨基烷基、C1-C10BOC-氨基烷基和C3-C10环烷基或连接起来形成包含2至5个碳原子的杂环，Rc选自C1-C10烷基、氨基、C1-C10卤代烷基、C1-C10氨基烷基、C1-C10BOC-氨基烷基和C3-C10环烷基；
-X2是氢、羟基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基酰胺基或C1-C10羟烷基；
-X3和X4各独立地是氢、羟基、氨基、酰胺基、叠氮基、卤代基、烷基、烷氧基、羧基、次氮基、硝基、三氟基、芳基、烷芳基、硫基、硫酯、硫醚、-OCOPh、-OC(＝S)OPh或X3和X4都是连接至＞C＝S从而形成5元环的氧，或X2和X3形成式(III)的环：
Figure A20058003917700141
其中R’和R″独立地是C1-C10烷基；
-R2选自氢、卤素、C1-C10烷醚、氨基、酰肼、C1-C10烷氨基、C1-C10烷氧基、C1-C10硫代烷氧基、吡啶硫基(pyridylthio)、C2-C10烯基；C2-C10炔基、硫基和C1-C10烷硫基；和
-R3是R4为氢的-NR4R5基团或选自烷基、取代烷基或芳基-NH-C(Z)-(Z为O、S或NRa)的基团，且
-当R4是氢，R5选自R-和S-1-苯乙基、苄基、苯乙基或苯胺基团时，各所述基团在一个或多个位置上未被取代或被取代，取代基选自C1-C10烷基、氨基、卤素、C1-C10卤代烷基、硝基、羟基、乙酰胺基、C1-C10烷氧基和磺酸或其盐；或R5是苯并二噁烷甲基、fururyl、L-丙基丙氨酰基-氨基苄基、β-丙氨酰氨基-苄基、T-BOC-β-丙氨酰氨基苄基、苯氨基、氨甲酰基、苯氧基或C1-C10环烷基；或R5是下列式(IV)的基团：
Figure A20058003917700142
或，当R4是烷基、取代烷基或芳基-NH-C(Z)-时，那么R5选自由取代的或未取代的杂芳基-NRa-C(Z)-、杂芳基-C(Z)、烷芳基-NRa-C(Z)、烷芳基-C(Z)-、芳基-NR-C(Z)-和芳基-C(Z)-；或A3AR激动剂是下列通式(V)的黄嘌呤-7-核糖甙衍生物：
Figure A20058003917700151
其中：
-X是O或S；
-R6是RaRbNC(＝O)-或HORc-，其中
-Ra和Rb可以相同或不同且选自氢、C1-C10烷基、氨基、C1-C10卤代烷基、C1-C10氨基烷基、和C3-C10环烷基，或连接起来形成包含2至5个碳原子的杂环；和
-Rc选自C1-C10烷基、氨基、C1-C10卤代烷基、C1-C10氨基烷基、C1-C10BOC-氨基烷基和C3-C10环烷基；
-R7和R8可以相同或不同且选自C1-C10烷基、C1-C10环烷基、R-或S-1-苯乙基，未取代的苄基或苯胺基团，和在一个或多个位置上被取代的苄基基团的苯基醚，其中取代基选自C1-C10烷基、氨基、卤素、C1-C10卤代烷基、硝基、羟基、乙酰胺基、C1-C10烷氧基和磺酸；
-R9选自卤素、苄基、苯基、C3-C10环烷基和C1-C10烷氧基；
或上面定义的化合物的合适的盐。
根据更优选的实施方案，A3AR激动剂是通式(VII)的核苷衍生物：
Figure A20058003917700161
其中X1、R2和R4的定义如上。
A3AR激动剂的特定组是N6-苄腺苷-5′-尿酰胺衍生物。一些优选的N6-苄腺苷-5′-尿酰胺衍生物是N6-2-(4-氨基苯基)乙基腺苷(APNEA)、N6-(4-氨基-3-碘苄基)腺苷-5′-(N-甲基尿酰胺)(AB-MECA)和1-脱氧-1-{6-[({3-碘苯基}甲基)氨基]-9H-嘌呤-9-基}-N-甲基-β-D-呋喃核糖尿酰胺(ribofuranuronamide)(IB-MECA)和2-氯-N6-(3-碘苄基)腺苷-5′-N-甲基尿酰胺(C1-IB-MECA)。
根据另一个实施方案，A3AR激动剂是N6-苄腺苷-5′-烷基尿酰胺-N1-氧化物或N6-苄腺苷-5′-N-dialy1-尿酰胺-N1氧化物。
以足以获得抗炎效果的量施用MTX和A3AR激动剂。各活性剂(MTX或A3AR激动剂)的量至少是当单独给药时提供想要的抗炎效果的量。然而，本发明的用途可涉及提供治疗组合物，该组合物可减少各活性剂的总剂量，使之比当单独使用各单种药物时可能需要的剂量低。不利效应的减少也是明显的。
如将被认识到的，各活性剂的量将依赖于被治疗的疾病、想要的治疗方案和想要的治疗剂量。作为例子，当剂量为每天1mg且想要的给药方案是每天给药一次时，药物组合物中包含的活性剂的量为1mg。当想要将该日剂量分为每天2次施用时，药物组合物中的活性剂的量将为0.5mg。
通过本领域内已知的考虑因素确定有效地获得理想作用的量。此处所用的“抗炎有效量”必须有效地获得下列抗炎作用的任一作用，包括例如，和炎症相关的不希望的症状的好转、在这些症状发生前其表现的预防、减缓炎性疾病的进展、减缓和炎性疾病相关的症状的恶化、减缓由炎性疾病的慢性阶段造成的任何不可逆的损伤、减轻严重度或治愈炎性疾病、提高存活率或提供从该病症更快速的恢复。
作为例子，当炎性疾病是类风湿性关节炎(RA，其也是由本发明治疗的优选的病症)时，可通过一个或多个下列效应展示有效量：减少关节肿胀和触痛、关节疼痛的减少、提高的活力和灵活性、关节和外围组织恶化的减缓、疾病急性发作之间的好转期时间期限的增加、急性发作的时间期限的减少、关节恶化的预防等。
要认识到，有效量依赖于多种因素，包括活性剂对其对应的受体的亲和力、其在身体内的分布特征、各种药理学参数例如体内半衰期，不想要的副作用(如果有的话)，例如被治疗的受试者的年龄和性别等。通常在具有寻找有效剂量范围、最大耐受剂量和最佳剂量的目的的临床研究中检测有效量。进行该临床研究的方式对于临床开发领域内的技术人员来说是熟知的。
有时也可基于在动物中显示有效的量来确定剂量。众所周知，通过使用本领域熟知的可能的转换公式可将给大鼠施用的Xmg/Kg的量转换成在另一种物种(特别是人)中的当量。转换公式的实例如下：
转换1：
  物种   体重(kg)   身体表面积(m2)   Km因子
  小鼠   0.2   0.0066   3.0
  大鼠   0.15   0.025   5.9
  人类儿童   20.0   0.80   25
  成人   70.0   1.60   37
身体表面积依赖性剂量转换：大鼠(150g)对人(70Kg)是1/7的大鼠剂量。这表示在本情况下大鼠中0.001-0.4mg/Kg等同于人中大约0.14-56微克/kg；假定70Kg的平均重量，这可转换为大约0.01至大约4mg的绝对剂量。
转换II：
下列转换因子：小鼠＝3，大鼠＝67。将所述转换因子乘以动物体重以从mg/Kg转换成用于人剂量当量的mg/m2。
  物种   体重(Kg)   BSA(m2)
  人   70.00   1.710
  小鼠   0.02   0.007
  大鼠   0.15   0.025
  狗   8   0.448
根据该公式，对于人的等同于大鼠中0.001-0.4mg/kg的量为0.16-64μg/kg；即对于体重大约为70Kg的人的绝对剂量为大约0.011至4.4mg，类似于转换I中所示的范围。
转换III：
转换的另一选择是通过设定剂量以产生和在给动物施用后获得的血浆水平或AUC相同的血浆水平或AUC。
因此，基于口服施用IB-MECA后在小鼠中获得的测量值和基于临床研究中在人中获得的该测量值，得出在小鼠中IB-MECA是有效的1微克/Kg-400微克/kg的剂量相当于大约0.14-57微克/kg的人剂量，即对于70Kg个体为0.01-4mg的总剂量，其中在所述临床研究中给健康男性志愿者施用IB-MECA。
此外，基于上面的转换方法，IB-MECA和C1-IB-MECA(本发明的优选的A3AR激动剂)的优选的剂量范围低于4mg，通常在大约0.01至大约2mg(分别为大约0.14-28微克/Kg)的范围之内和理想地在大约0.1至1.5mg(分别为大约1.4-21微克/kg)的范围之内。可每天一次、二次或有时多次地施用该剂量。
如美国专利申请公开号20050101560中描述的和由Fishman等人[Fishman P.等人，Tolerability，pharmacokinetics，andconcentration-dependent hemodynamic effects of oral CF101，anA3adenosine receptor agonist，in healthy young men Int J ClinPharmacol Ther.42：534-542，2004]描述的人类研究显示，和小鼠中只有1.5小时的半衰期相比，IB-MECA的水平在人血浆中的衰减具有大约8至10小时的半衰期，在每日多次给药的情况下，为了累积效果有时需要对剂量进行修正(在前次剂量水平衰减之前施用随后的剂量，从而建立超过单一剂量中产生的血浆水平)。基于所述人试验，每日两次给药似乎是优选的给药方案。然而这并不排除其他给药方案。
此外，作为例子，MTX的有效量通常在5至25mg范围之内，每周口服或肠胃外施用一次。
根据优选的实施方案，联合治疗包括每周给受试者施用MTX，剂量在大约5至25mg的范围之内，伴随着每日一次和数次之间、优选地每日一次或两次施用A3AR激动剂，每次施用的剂量在大约1至大约1000μg/kg体重的范围之内，优选地低于400μg/kg体重和甚至低于200μg/kg体重。通常A3AR激动剂的剂量在1至100μg/kg体重的范围之内。
本发明的上下文中的“组合物”意指活性剂，一起地或分开地，和药物可接受的赋形剂以及其他添加剂的组合物。所述赋形剂有时可具有提高活性剂至靶组织的递送或渗透，提高药物的稳定性，减缓清除率，赋予缓释特性，减少不想要的副作用等的作用。赋形剂也可以是稳定制剂(例如防腐剂)、给制剂提供可食用的香料等的物质。关于赋形剂、稳定剂和佐剂的实例，参见E.W.Martin，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，MacK Pub Co(June，1990)。
可通过本领域已知的多种递送模式给受试者施用MTX和A3AR激动剂。尽管可通过口服或通过肠胃外注射施用MTX，但优选地口服施用A3AR激动剂。可基于希望的制剂形式选择赋形剂且A3AR激动剂组合物可以丸剂、胶囊剂的形式、糖浆剂、芳香粉的形式和其他各种形式存在。
以举例说明的方式描述本发明，且要理解，已使用的术语意在体现描述的单词的本质而不是限定它。很明显，根据上述教导可能产生本发明的许多改变和变化。因此要理解在所附的权利要求的范围内，可不按下文中明确描述的实施方案实施本发明。
示例性实施方案的详述
实施例1：体内研究
材料
由Albany Molecular Research Inc.(Albany，NY，USA)合成A3AR激动剂CF101，GMP级化合物，属类上称为1-脱氧-1-[6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-D-呋喃核糖尿酰胺(IB-MECA)。
氨甲喋呤购自Abie，Israel。
方法
从Harlan实验室(Jerusalem，Israel)获得8-12周龄的雌性Lewis大鼠。用标准化的颗粒化食物饲养大鼠并为其提供自来水。按照Can-Fite BioPharma，Petah Tikva，Israel的实验动物管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)制定的指南进行实验。在尾的基部给大鼠皮下注射100μl由不完全弗氏佐剂(IFA)和10mg/ml加热杀死的结核分支杆菌(Mt)H37Ra(Difco，Detroit，USA)组成的悬浮液。各组包含10只动物。
在接种后第14天开始用CF101(10μg/kg)进行处理，通过强饲法口服施用，每天两次进行处理。在接种后第14天开始，用氨甲喋呤(MTX)(0.25，0.75mg/kg)每3天一次通过腹膜内施用处理另一组。各实验中的对照组只接受载体(以对应于药物稀释度的稀释液中的DMSO)。
如下评估临床疾病活动度评分(Clinical Disease ActivityScore)：就临床关节炎每两天检查动物一次。评分系统对各肢体评价在0至4分范围内变化：0-无关节炎；1-一个趾/指关节的发红或肿胀；2-超过一个趾/指关节的发红和肿胀；3-踝和跗骨-跖骨关节受累；4-全部爪发红或肿胀。通过将4个个体的腿的评分相加计算临床评分。也根据由测径器(Mitotoyo，Tokyo，Japan)测量的大鼠后爪直径的增加来确定炎症强度。
结果
在免疫后大约21天，大多数经载体处理的动物逐渐发生关节炎。CF 101处理(10μg/kg，每天两次口服给药，从免疫后的第14天开始)和氨甲喋呤(MTX)处理导致疾病严重度的显著减轻，两种药物的结果非常相似，正如通过关节炎临床评分所估量的一样。疾病在第21至25天达到最高点且在这些天观察到CF101或MTX的最大效应(图1A和图1B)。使用CF101和MTX的联合治疗导致比单独地使用CF 101或MTX(图1A和图1B)获得的累加效应更大的抑制效应。
实施例2：体外研究
人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的培养
从进行穿刺术的骨关节炎(OA)患者收集人滑膜液样品。离心所述液体并移走上清液。将细胞重悬浮于含有I型胶原蛋白酶(4mg/ml)的DMEM中，进行2小时，并在37℃下强烈振荡。通过离心收获上清液中释放的细胞并将其在37℃、5％CO2的培养箱中培养在含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠和20nM HEPES缓冲液的DMEM中。过夜培养后，移走非贴壁细胞。以1∶2的比率传代贴壁细胞(FLS)，在本实验中使用传代4至10次的细胞。
使用MTT测定法检测CF101和氨甲喋呤(MTX)一起对FLS的增殖的作用。在MTX(1μM)存在的情况下在96孔微量滴定板中在生长培养基中温育细胞(5x104个/ml细胞)72小时。在最后24小时，向培养物中加入CF101(10nM)。
大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的培养
收集来自佐剂诱导的关节炎大鼠的滑液组织。将组织切碎且将其在4mg/ml的DMEM中的I型胶原蛋白酶和0.25w/v胰蛋白酶中进行消化。该混合物在37°下剧烈振摇4小时。通过离心从上清液中分离释放的细胞，并在37℃、5％CO2的培养箱中将其培养在含有15％FCS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM中。过夜培养后，移走非贴壁细胞。以1∶2的比率传代贴壁细胞(FLS)，在本实验中使用传代4至10次的细胞。
使用MTT测定法检测CF101和氨甲喋呤(MTX)组合对FLS的增殖的作用。在MTX(1μM)存在的情况下在96孔微量滴定板中，在生长培养基中温育细胞(5x104个/ml细胞)72小时。在最后24小时，向培养物中加入CF101(10nM)。
结果
图2A和2B分别显示通过MTT测定法所估量的单独的MTX、单独的CF101或使用MTX和CF101的联合治疗对人或大鼠FLS的增殖的作用。如图所示，联合治疗的抑制作用大于由单独的各个治疗获得的作用。

Claims (36)

1.治疗患有炎性疾病的受试者的方法，其包括给受试者施用有效量的氨甲喋呤(MTX)和有效量的A3腺苷受体的激动剂(A3AR激动剂)的组合物。
2.权利要求1的方法，其中每周给受试者施用MTX一次。
3.权利要求1或2的方法，其中每天一次至多次地给所述受试者施用A3AR激动剂。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中给所述受试者口服施用A3AR激动剂。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述A3AR激动剂是IB-MECA或C1-IB-MECA。
6.权利要求3至6中任一项的方法，其中所述A3AR激动剂的日剂量低于4mg。
7.权利要求6的方法，其中所述A3AR激动剂的日剂量在大约0.01至大约2mg的范围之内。
8.权利要求7的方法，其中所述A3AR激动剂的日剂量在大约0.1至大约1.5mg的范围之内。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫性病症。
10.权利要求10的方法，其中所述自身免疫性病症是类风湿性关节炎。
11.权利要求10的方法，其中所述A3AR激动剂是IB-MECA。
12.治疗患有炎性疾病且用MTX进行治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的A3AR激动剂。
13.治疗患有炎性疾病且用A3AR激动剂进行治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的MTX。
14.权利要求12或13的方法，其中每日一次至数次地给所述受试者施用A3AR激动剂。
15.权利要求12至14中任一项的方法，其中给所述受试者口服施用A3AR激动剂。
16.权利要求12至15中任一项的方法，其中所述A3AR激动剂是IB-MECA或C1-IB-MECA。
17.权利要求12至16中任一项的方法，其中所述A3AR激动剂的日剂量低于4mg。
18.权利要求17的方法，其中所述A3AR激动剂的日剂量在大约0.01至大约2mg的范围之内。
19.权利要求18的方法，其中所述A3AR激动剂的日剂量在大约0.1至大约1.5mg的范围之内。
20.权利要求12至19中任一项的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫性病症。
21.权利要求20的方法，其中所述自身免疫性病症是类风湿性关节炎。
22.A3AR激动剂用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗患有炎性疾病且用MTX进行治疗的受试者。
23.使用MTX制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗患有炎性疾病且用A3AR激动剂进行治疗的受试者。
24.权利要求22或33的用途，其中所述炎性疾病是自身免疫性病症。
25.权利要求14的用途，其中所述自身免疫性病症是类风湿性关节炎。
26.用于治疗使用MTX进行治疗的炎性疾病的药物组合物，其包含有效量的A3AR激动剂。
27.权利要求26的药物组合物，其包含用于口服递送所述A3AR激动剂的生理可接受的赋形剂。
28.权利要求26或27的药物组合物，其中所述A3AR激动剂是IB-MECA或C1-IB-MECA。
29.权利要求28的药物组合物，其包含低于4mg的所述A3AR激动剂。
30.权利要求28的药物组合物，其包含低于4mg的所述A3AR激动剂。
31.权利要求28的药物组合物，其包含大约0.01至大约2mg之间的所述A3AR激动剂。
32.权利要求28的药物组合物，其包含大约0.1至大约1.5mg之间的所述A3AR激动剂。
33.用于治疗患有炎性疾病且用MTX进行治疗的患者的药物组合物，其包含有效量的A3AR激动剂。
34.权利要求26至33中任一项的药物组合物，其中所述炎性疾病是自身免疫性病症。
35.权利要求34的药物组合物，其中所述自身免疫病症是类风湿关节炎。
36.权利要求35的药物组合物，其中所述A3AR激动剂是IB-MECA。
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