CN101061385B - 炎症的生物学标记 - Google Patents

炎症的生物学标记 Download PDF

Info

Publication number
CN101061385B
CN101061385B CN200580039176.7A CN200580039176A CN101061385B CN 101061385 B CN101061385 B CN 101061385B CN 200580039176 A CN200580039176 A CN 200580039176A CN 101061385 B CN101061385 B CN 101061385B
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression
level
disease
inflammatory
inflammation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200580039176.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101061385A (zh
Inventor
P·菲什曼
S·巴-耶胡达
L·马迪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Can Fite Biopharma Ltd
Original Assignee
Can Fite Biopharma Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Can Fite Biopharma Ltd filed Critical Can Fite Biopharma Ltd
Priority claimed from PCT/IL2005/001279 external-priority patent/WO2006059327A1/en
Publication of CN101061385A publication Critical patent/CN101061385A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101061385B publication Critical patent/CN101061385B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

通过确定来自受试者的白细胞(WBC)例如循环WBC中的A3腺苷受体(A3AR)的表达水平来测定患者的炎症状态。高水平的A3AR的表达表示受试者中的炎症状态。该测定法可用于确定受试者中的炎症的严重度和监测抗炎疗法的功效。此外，所述表达的水平可用于选择患者以接受包括A3AR激动剂的抗炎疗法。

Description

炎症的生物学标记
发明领域
本发明在诊断炎症和确定炎症治疗的功效，特别是因此使用与炎症状态相关的生物学标记进行之的领域。
现有技术
下面是一列被认为和描述本发明的领域内的技术状态相关的现有技术。这些参考资料的引用(Acknowledgement)在本说明书中有时通过在括号内标示来自下面列表的其编号来表示。
1.Fishman P，Madi L5 Bar-Yehuda S，Barer F，Del Valle L，Khalili K.Evidence for involvement of Wnt signaling pathwayin IB-MECA mediated suppression of melanoma cells.Oncogene.，21：4060-4064(2002).
2.Fishman P，Bar-Yehuda S5 Rath-Wolfson L5 Ardon E5 BarrerF5Ochaion A5Madi L.Targeting the A3 adenosine receptor forcancer therapy：inhibition of Prostate carcinoma cell growthby A3AR agonist.AnticancerRes.，23：2077-2083(2003).
3.Madi L5 Bar-Yehuda S，Barer F5 Ardon E5 Ochaion A5Fishman P.A3 adenosine receptor activation in melanoma cells：association between receptor fate and tumor growth inhibition.J.Bio.Chem.，278：42121-42130(2003).
4.Ohana G5 Bar-Yehuda S5 Arich A5 Madi L5 Dreznick Z5Silberman D5 Slosman G5 Volfsson-Rath L，Fishman P.Inhibitionof primary colon carcinoma growth and liver metastasis by theA3 adenosine receptor agonist IB-MECA.British J.Cancer.，89：1552-1558(2003).
5.Fishman P，Bar-Yehuda S，Ohana G，Ochaion A，EngelbergA，Barer F，Madi L.An agonist to the A3 adenosine receptorinhibits colon carcinoma growth in mice via modulation of GSK-3β and NF-B.Oncogene，23：2465-2471(2004).
6.美国专利申请2004016709 A1.
7.Szabo，C，等人Suppression of macrophage inflammatoryprotein(MIP)-1α production and collagen-induced arthritisby adenosine receptor agonists.British J.Pharmacology，125：379-387(1998).
8.Mabley，J.，等人The adenosine A3 receptor agonist，N6-(3-iodobenzyl)-adenosine-5′-N-methyluronamide，isprotective in two murine models of colitis.Europ.J.Pharmacology，466：323-329(2003).
9.Baharav，E.，等人The effect of adenosine and the A3adenosine receptor agonist IB-MECA on joint inflammation andautoimmune diseases models.Inter.J.MoI.Med.10(supplement1)page S104，abstract 499(2002).
10.PCT申请，公开号WO2005/0063246，标题为″Method forTreatment of Multiple Sclerosis″.
11.Montesinos，M.Carmen，等人Adenosine A2A or A3receptorsare required for inhibition of inflammation by methotrexate andits analog MX-68.Arthritis & Rheumatism，48：240-247(2003).
12.Madi L，Ochaion A，Rath-Wolfson L，Bar-Yehuda S，Erlanger A，Ohana G，Harish A，Merimski O，Barer F，Fishman P.The A3 Adenosine Receptor is Highly Expressed in Tumor vs.Normal Cells：Potential Target for Tumor Growth Inhibition.Clinical Cancer Research，10：4472-4479，2004.
13.美国专利申请，公开号20040137477A1，标题为″A3AR as amarker for a dis eased state″.
14.Gessi，S.等人Elevated expression of A3 adenosinereceptors in human colorectal cancer is reflected in peripheralblood cells Clinical Cancer Research10：5895-5901，2004.
发明背景
A3腺苷受体，Gi蛋白相关性细胞表面受体，被认为是抗癌和抗炎症的靶。该受体在各种肿瘤细胞类型中高度表达，但在相邻的正常组织中表达相对较低。通过特异性合成的激动剂激活该受体诱导包括Wnt和NF-kB的下游信号转导途径的调节，从而导致肿瘤生长的抑制(1-5)。
体内研究已显示A3AR激动剂抑制结肠癌、前列腺癌和胰腺癌以及黑色素瘤和肝癌的发展。也显示A3AR激动剂在不同的实验性自身免疫模型(例如类风湿性关节炎、克罗恩病和多发性硬化(6-10))中通过改善炎症性过程发挥抗炎剂的作用。也提出了A2A和A3受体介导氨甲喋呤的抗炎作用(11)。
和正常细胞相比，A3腺苷受体(A3AR)的表达水平在癌细胞中被提高(12)。因此，已将A3AR的表达水平描述为用于癌症诊断的方法(13)。此外，也已描述A3AR的表达水平在患有结肠直肠癌的患者的外周血细胞中被提高(14)。
本发明的一般描述
本发明的目的是提供用于在受试者中确定炎症状态的方法。
本发明的另一个目的是提供用于在受试者中确定炎症状态的严重度的方法。
本发明的另一目的是提供用于确定受试者的抗炎治疗性处理的功效的方法。
本发明的再一目的是提供用于选择受试者以接受抗炎治疗性处理的方法。
本发明基于令人吃惊的发现，即和健康的受试者相比，在具有炎症状况的受试者的WBC中A3腺苷受体表达的水平增加。此外，发现在对抗炎药物治疗起反应的受试者中，其WBC中的A3腺苷受体的表达水平降低。该发现为将A3腺苷受体的表达水平用作诊断炎症状态以及下面描述的其他应用的方法铺平了道路。
在本发明的第一方面，提供了确定受试者中炎症状况的方法，该方法包括确定来自受试者的白细胞(WBC)例如循环白细胞中A3腺苷受体(A3AR)的表达水平。A3AR的高水平表达表明在受试者中存在炎症状态。
包含WBC的样品可以是全血或可以是包含WBC的血液成分。有时，可能想要使用包含WBC例如单个核细胞(MNC)的特定群体、MNC-单核细胞的亚群体或淋巴细胞或淋巴细胞的亚群体例如T细胞、B细胞或其亚群体的成分。有时也可从淋巴系统例如从淋巴结获得包含WBC的样品。
可通过确定A3AR mRNA的水平和/或A3AR蛋白的水平来确定表达的水平。因此此处所用的术语“表达水平”包括取样的细胞中的A3AR mRNA的水平和A3AR蛋白或A3AR蛋白片段的水平。
发现药物疗法可影响A3AR表达的水平。因此，过去的病史，包括治疗前或治疗期间的病史，可影响A3AR的表达水平，从而在进行本发明的方法中可能需要将其考虑进去。
在本发明的第二方面，提供了用于在受试者中确定炎症状态的严重度的方法，其包括确定受试者WBC中A3AR表达的水平；和将细胞中A3AR的表达水平与预先确定的标准的水平进行比较，所述预先确定的标准的水平使A3AR的表达水平和感染的严重度关联。所述预先确定的标准可包括，例如使结果和炎症的严重度的测量关联的成组的值，其可以是离散的数值表或连续曲线；或其可以是成组的描述符，例如关于炎症严重度的可能结果或其意义的定性列表，例如如果以颜色反应表现结果时，所述描述符可列出有关炎症严重度的可能的颜色或颜色强度结果的范围和其意义；或其可包括炎症的不同严重度或不同的炎症状态的预期测定结果的图表或图片说明；或成组的可和用于数据校准和评估的样品相伴产生的参照标准。通常可通过测定多个样品(其是来自许多炎性疾病状态中的各状态的样品)中A3AR的表达水平以获得关于表达水平和疾病状态之间的关联的统计测度来获得所述标准。疾病状态的分类可以是例如二元的：轻微炎症和严重炎症。所述分类也可包括多种不同的状态，例如，轻度、中度和严重炎症。也可通过根据表达的水平，使用数值例如对应着从轻至重的炎症的1和10之间的数字等进行分类。如将认识到的，可能存在许多类型的分类且本发明不限定于特定类型的分类。
在本发明的第三方面，提供了用于确定受试者的抗炎治疗性疗法的功效的方法，该疗法包括给受试者施用A3AR激动剂。该疗法可以是使用A3AR的单一疗法或A3AR和另一种药物例如A3AR和氨甲喋呤组合的联合疗法。该方法包括在两个或更多个连续时间点上确定来自受试者的WBC中的A3AR的表达水平，至少一个所述时间点在抗炎治疗期间，其中水平上的差异表示该药物治疗的功效。所述连续的时间点可以是例如抗炎治疗前采用的一个或多个时间点和治疗期时间的一个或多个时间点，治疗期间采用的一个或多个时间点和治疗休止期间采用的一个或多个时间点。
根据本发明的一些实施方案，WBC中的A3AR表达水平可用于确定炎症的状态或严重度，例如用于确定炎症状态的存在或不存在。根据本发明的其他实施方案，A3AR的表达水平可用于炎症状态的严重度程度的定量确定。因此，此处使用的术语“确定”或“决定”包括定量和定性确定。
“炎症状态”包括活跃的或亚临床炎症的任何状态。根据本发明优选的实施方案，本发明用于在遭受疾病和自身免疫性炎性疾病的受试者中确定炎症的状态。该炎症可以是由于炎性疾病造成的，或其可以是一些其他类型的疾病或病症的副作用。炎性疾病的实例包括但不限于：炎性肠疾病、炎症细胞、炎性纤维增生、炎性胆囊疾病、炎症性乳头状增生和自身免疫性疾病。自身免疫性疾病可包括下列的任一种疾病：类风湿性关节炎、重症肌无力(MG)、先天性重症肌无力、多发性硬化(MS)、僵人综合征(Stiff-man syndrome)、热带痉挛性瘫痪、Rasmussen氏脑炎、急性运动轴索神经病、急性感觉-运动轴突性神经病、背根神经节神经炎、急性全植物神经性神经病变、臂丛神经炎、急性出血坏死性白质脑炎(Acute necrotizing hemorrhagiclekoencephalitis)、偶发性坏死性脊髓病、副肿瘤性小脑变性、格-巴二氏综合征、边缘系脑炎、眼阵挛-肌阵挛共济失调(Opsoclonus-myoclonus ataxia)、感觉神经元炎、自主神经病、脱髓鞘性神经病、AIDS-痴呆复征、图雷特(氏)综合征、Miller-Fisher综合征、阿耳茨海默(氏)病、格雷夫斯(氏)病、桥本(氏)甲状腺炎、产后甲状腺炎、局限性甲状腺炎、青少年甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退、I型(胰岛素依赖性)糖尿病、阿狄森(氏)病、垂体炎、自身免疫性尿崩、甲状旁腺功能减退、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮(Bullous phemphigoid)、妊娠性类天疱疮、疤痕性类天疤疮、疱疹样皮炎、获得性大疱性表皮松解症(epidermal bullosaacquisita)、多形性红斑、妊娠疱疹，白癜风、慢性荨麻疹、盘状狼疮、普秃/斑秃、牛皮癣、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、慢性活动性肝炎/原发性胆汁性肝硬变重叠综合征、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、伊文思综合征、肝素诱发的血小板减少症、原发性自身免疫性中性粒细胞减少症、婴儿自身免疫性(原发性)中性粒细胞减少症、骨髓移植后自身免疫性中性粒细胞减少症、获得性自身免疫性血友病(Acquired autoimmune hemophilia)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、腹部疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、涎腺炎、自身免疫性早发卵巢衰竭、精子缺乏、性腺机能减退、和精子自身抗体相关的男性不育症、自身免疫性睾丸炎、早发卵巢衰竭、自身免疫性卵巢炎、眼色素层炎、视网膜炎、交感性眼炎、Birdshot retinochoroidopathy、Vogt-Koyanagi-Harada肉芽肿性色素层炎、视网膜变性、晶体诱发性色素膜炎、视神经炎、自身免疫性感觉神经性听力丧失、梅尼尔(氏)病、自身免疫性心肌炎、先天性心脏传导阻滞(新生儿狼疮)、恰加斯(氏)病、阿霉素心脏毒素(Adriamycin cardiotoxicity)、Dressier氏心肌炎结合征、支气管哮喘、间质性纤维性肺病(Interstitialfibrosing lung disease)、急进性肾小球性肾炎、自身免疫性小管间质性肾炎、全身性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、费耳提(氏)综合征、大颗粒淋巴细胞增多(Large granular lymphocytosis)(LGL)、斯耶格伦(氏)综合征、全身性硬化症(硬皮病)、CREST综合征、混合性结缔组织病、多发性肌炎/皮肌炎、古德帕斯彻(氏)病、韦格纳(氏)肉芽肿病、丘-施二氏综合征、亨-舍二氏紫癜、微观小血管炎(Microscopic polyangiatis)、结节性动脉周围炎、黑奇特(氏)综合征、动脉粥样硬化、一过性(巨)细胞动脉炎、大动脉炎、川畸病、强直性脊椎炎、莱特(氏)病、Sneddonsdisease、自身免疫性多内分泌病、candidiasis-ectodermaldystropy、基础性冷球蛋白血症性血管炎(Essentialcryoglobulinemic vasculitis)、表皮白细胞分裂性血管炎(Cut aneous leukocytoclastic angiitis)、莱姆(氏)病、风湿热和心脏病、嗜酸细胞性筋膜炎、阵发性寒冷性血红蛋白尿、风湿性多肌病、纤维肌痛、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、M-spot和皮肤改变)、复发性多发软骨炎、自央免疫性淋巴细胞增生综合征、TINU综合征(急性小管间质性肾炎和眼色素层炎)、常见变异型免疫缺陷病、TAP(和抗原呈递相关的运载体)缺陷、欧门氏综合征(Omenn syndrome)、高IgM综合症、BTK无γ球蛋白血(症)、人免疫缺陷病毒和骨髓移植后。
用于本发明方法的包含WBC的样品可包括组成该群体的任一已知类型的细胞。特别地，所述样品应当优选地包括单个核细胞(单核细胞和/或淋巴细胞)。有时样品可额外地或可选择地包含粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞或嗜碱性粒细胞)。
在第一实施方案中，A3AR的高水平表达用作受试者中炎症状态的指标。术语“高水平”理解为表示显著高于正常细胞中的表达水平。例如，可将WBC中A3AR表达的水平和对照水平相比，所述对照水平是健康受试者的正常WBC中的A3AR的表达水平。有时，通过检测和一个或多个参照标准相对应的来自个体的被检测样品来确定表达水平是有用的，所述参照标准是例如表示正常状态的一个参照标准和表示炎症状态的另一个参照标准；或一个表示正常状态的参照标准和两个或更多个表示不同疾病状态的参照标准。
在第二实施方案中，将确定的表达水平和标准比较。所述标准可基于前面确定的来自健康个体和来自具有炎症状态或具有不同炎症状态的个体的水平。可以例如离散数值的形式，或在测定法是比色法的情况下以具有表示健康和炎症状态的不同颜色或色调的图表的形式提供所述标准；或可以基于这些标准产生的比较曲线的形式提供。
可通过确定存在于WBC细胞中的A3AR表达的水平(如上所述，其可以是A3AR蛋白、蛋白片段的水平或mRNA水平等)来制定这些标准，所述WBC细胞获自多个被诊断(通过其他方式，例如由医生、通过组织学技术等)为阳性的、具有不同严重度水平的炎症的患者。也可通过各种常规的方法例如通过病理学技术确定用于制定所述标准的疾病的严重度。在另一个实施方案中，同时对许多健康受试者和不同炎症状态的受试者的标准进行测定，然后将在被测定的样品中确定的水平和这些标准比较。
例如，每1,000,000个细胞X1至X2之间的蛋白含量水平可确定为1级炎症的指标，每1,000,000个细胞Y1至Y2之间的更高的蛋白含量可定义为2级炎症的指标等。在制定这些标准后，才可能将获自特定个体的A3AR表达的水平和对应的标准的值进行比较，从而获得疾病严重度的评估。
可通过在治疗前、治疗期间和治疗后的不同时间点采集WBC的样品来评估受试者的抗炎治疗的功效。例如，可在治疗开始前的时间点采集第一样品和可在治疗期间的时间点采集第二样品。与第一样品相比，第二样品中A3AR表达水平的减少表示治疗是有效的。减少的程度可表示治疗功效的程度，即相关性可以是定量的。
在另一个例子中，可在治疗期间的时间点上采集第一样品和可在治疗期间在第一样品的时间点之后的时间点上采集第二样品。与第一样品相比，第二样品中A3AR表达水平的减少表示治疗是有效的。
在第三个例子中，可在治疗期间的时间点上采集第一样品和可在已中断治疗后的时间点上采集第二样品。在该情况下，与第一样品相比，第二样品中A3AR表达水平的增加表示治疗是有效的。
当然，也可进行不同的其他组合和在超过2个时间点上采集样品。
本发明也提供了用于选择遭受某种炎症疾病的受试者以接受抗炎疗法的方法，该抗炎疗法包括给受试者施用A3腺苷受体(A3AR)激动剂，该方法包括确定受试者的WBC中的A3AR的表达水平和如果所述水平高于预先确定的水平的话，选择该受试者接受所述抗炎疗法。所述预先确定的水平可以是所有受试者的某个阈值水平。所述预先确定的水平也可以是不同患者群体的许多水平，例如：不同年龄群体的水平；不同疾病状态的水平；不同病史的水平-过去药物治疗的历史(例如，发现氨甲喋呤诱导A3AR的水平增加)患病的年数等。可通过临床研究来确定所述预先确定的水平，所述研究根据可接受的反应标准例如由American College of Rheumatology制定的ACR20、ACR50和ACR70中的一个标准或任何其他可接受的有效标准寻找受体表达和药物反应之间的相关性。
适合于抗炎疗法的受试者的选择可通过确定治疗前采自所述受试者的WBC样品中的A3AR的表达水平来进行。如果确定的A3AR的水平高于预先定义的阈值则选择该受试者。
根据一个实施方案，阈值是健康受试者的WBC中A3AR表达水平的一定倍数(certain multiple)。根据另一个实施方案，基于患有所述某种炎性疾病的患者中的平均表达水平确定阈值，且其可以是所述平均值或一定倍数或其部分。根据其他实施方案，基于人患者中的临床研究确定人患者中的阈值，所述研究经设计用于确定表达水平和患者对所述治疗法的反应之间的相关性。如将被认识到的，对于不同的炎性疾病阈值可以不同。如也可被认识到的，根据其性质，该选择标准基于统计，从而表示选择的患者可对治疗产生反应的某一概率。因此，这样的选择标准，如无疑被本领域技术人员所理解的，这些选择标准可能不能完全对反应作出预测，因此由此选择的某些部分的患者也可以是对治疗不起反应的患者。
该选择方法也可用于选择参加临床研究以检测抗炎疗法的功效的候选者，所述疗法包括将A3AR激动剂单独地或和其他药物例如氨甲喋呤一起给患者施用。如本领域技术人员所认识到的，临床研究(也称为术语‘临床试验’或‘临床方案’)是在人志愿者中进行的确定新药或治疗法在人受试者中的作用机制的科学研究。干预试验确定实验性疗法或使用已知疗法的新途径在受控环境下是否安全和有效。通过临床研究，医生发现预防、检测、诊断、控制和治疗疾病的新的和更好的方法。根据本发明，基于A3AR水平选择患者的临床研究可以是I期、II期、III期、IV期或任何其他类型的临床研究。
附图概述
为了理解本发明和了解如何在实践中进行它，现在通过非限定性实施例，参照附图描述优选的实施方案，其中：
图1A-1D描述显示A3AR在炎症发生后在炎症组织和造血组织中被上调的示例性Western印迹法和对应的平均印迹强度和标准误的直方图。
图2描述显示在AIA模型中A3AR的表达水平和疾病临床评分相关的Western印迹法和对应的平均印迹强度和标准误的直方图。“0”表示未试验过的动物(无炎症的动物)而“6”、“9”和“12”涉及发炎的动物且该数字表示这些动物中的炎症评分。
图3是显示对照动物和用氨甲喋呤(MTX)、CF101(临床级IB-MECA)、MTX和CF101的组合或只用载体(对照)处理的AIA动物中的作为时间的函数的关节炎严重度的变化。
图4A-4B描述了示例性Western印迹法和相应的具有标准误的直方图，该图显示未试验过的动物、AIA动物和CF101(临床级IB-MECA)处理后的AIA动物中的淋巴结细胞(图4A)和脾(图4B)细胞中的A3AR蛋白表达水平。
图5A-5C描述了示例性Western印迹法和对应的具有标准误的直方图，该图显示用载体处理的或用CF101处理的AIA中的爪(图5A)、滑液组织(图5B)和外周血单个核细胞(图5C)中的A3AR蛋白的表达水平。
图6描述了Western印迹法和对应的直方图，该图显示了未试验过的动物、AIA动物和用MTX处理的AIA动物的淋巴节中的A3AR蛋白的表达水平。
图7描述了显示7个健康受试者和7个RA受试者中的A3AR蛋白的表达水平的Western印迹法和对应的直方图。
图8是显示用CF101处理前和处理后3个月，RA患者的外周血单个核细胞中的A3AR水平的直方图。对于各患者，按照ACR标准(由American College of Rheumatology制定的，确定治疗RA的药物的功效的标准)以百分比表示反应。
图9显示氨甲喋呤治疗前(黑色柱)和治疗后(灰色柱)以及治疗期间以任意单位测量的4个患者中PBMNC中A3AR表达的Western印迹法和对应的表达强度的直方图。
实施例
材料和方法
大鼠中佐剂诱导的关节炎(AIA)模型的诱导
从Harlan实验室(Jerusalem，Israel)获得8-12周龄的雌性Lewis大鼠。用校准化的颗粒化食物饲养大鼠并为其提供自来水。按照Can-Fite BioPharma，Petah Tikva，Israel的实验动物管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)制定的指南进行实验。在尾的基部给大鼠皮下注射100μl由不完全弗氏佐剂(IFA)和10mg/ml加热杀死的结核分支杆菌(Mt)H37Ra(Difco，Detroit，USA)组成的悬浮液。各组包含10只动物。
在接种后第14天开始用IB-MECA(10μg/kg)进行处理，通过强饲法口服施用，每天两次进行处理。在接种后第14天开始，用氨甲喋呤(MTX)(1.5mg/kg)每3天一次通过腹膜内施用处理另一组。各实验中的对照组只接受载体(以对应于药物稀释度的稀释液中的DMSO)。
如下评估临床疾病活动度评分(Clinical Disease ActivityScore)：每两天检查动物的临床关节炎。评分系统对各肢体呈现0至4分范围内变化：0-无关节炎；1-一个趾/指关节的发红或肿胀；2-超过一个趾/指关节的发红和肿胀；3-踝和跗骨-跖骨关节受累；4-全部爪发红或肿胀。通过将4个个体的腿的评分相加计算临床评分。也根据由测径器(Mitotoyo，Tokyo，Japan)测量的大鼠后爪的直径的增加来确定炎症强度。
炎症组织和造血组织的分离以及蛋白提取物的制备
a.炎症组织
在踝关节上方切开后爪。将骨组织切成碎片，在液氮中快速冷冻并在-80℃贮藏直至使用。为制备蛋白提取物，向爪组织(4ml/gr组织)中加入RIPA缓冲液(含有150mM NaCl、50mM Tris、1％NP40、0.5％脱氧胆酸盐和0.1％SDS)。用多电子将混合物在冰上匀浆并离心。
取出滑液组织，通过在37℃下强烈震荡(200rpm)下，将该组织在含有1mg/ml胶原酶IV和0.1mg/ml DNA酶的RPMI中温育30分钟来分离滑膜细胞。收集含有滑膜细胞的上清液并再提取未消化的组织。将来自两次提取的上清液混合并用PBS洗涤细胞。制备蛋白提取物。
b.造血组织
取出淋巴节，首先通过切碎该组织然后将其通过22G的针进行分解来分离细胞。取出脾脏并将其接受淋巴细胞分离剂(Nycomed AS，Oslo，Norway)以进行单个核细胞的分离。制备蛋白提取物。
来自RA患者和健康受试者的外周血单核细胞的分离
从健康受试者或RA患者抽取血液。使用Ficoll-Hypaque梯度分离单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)。从单个核细胞提取蛋白。
临床研究
从参加由Can-Fite BioPharma资助的临床研究的RA患者抽取血液，在所述研究中估量CF101(临床级IB-MECA)对关节炎患者的作用。患者随机地接受0.1、1.0或4.0mg CF101，每天两次。在两个时间点抽取血液：(a)在前次治疗后4至6周的清除期后和在CF101治疗开始前-这期间被当作基线水平；(b)在用CF101治疗后3个月。如上所述分离外周血单个核细胞和提取蛋白。此外，记录C反应性蛋白(CRP)值、触痛(tender)和肿胀的关节的数目、医生的整体评价、患者自身的评价、疼痛评分和残疾评分并计算各患者的ACR评分(ACR是根据由American College of Rheumatology制定的标准，基于上述测量计算的，用于评价药物治疗RA的功效的评分；ACR20、ACR50和ACR70分别表示该评分的20％、50％和70％的提高)。
通过Western印迹法(WB)进行的A3AR蛋白表达水平的分析
按照下列方案进行滑液、爪、脾和淋巴结的Western印迹分析(WB)。用冰冻的PBS漂洗样品并将样品转移至冰冻的裂解缓冲液(TNN缓冲液、50mM Tris缓冲液pH＝7.5、150mM NaCl、NP40)。通过在7500xg下离心10分钟去除细胞碎片。使用Bio-Rad蛋白测定染色剂确定蛋白浓度。使用12％的聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离等量的样品(50μg)。然后将分解的蛋白电转染至硝酸纤维素膜(Schleicher &Schuell，Keene，NH，USA)上。用1％BSA封闭膜，然后用第一抗A3AR的抗体(稀释度1：1000)在4℃下温育24小时。然后洗涤印迹并在室温下用第二抗体温育1小时。使用BCIP/NBT彩色显影试剂盒(Promega，Madison，W1，USA)记录条带。
结果
A3AR在炎症和造血组织中被上调
通过WB分析确定A3AR在AIA模型中的表达水平。为此，获得来自发炎组织(爪)或来自外周造血组织(外周血单核细胞、淋巴节和脾)的蛋白提取物并如材料和方法中所述进行分析。图1A-1D显示了WB分析结果，该结果也示于提供平均结果和标准差的对应的直方图中。如所显示的，A3AR在发炎组织(图1A)以及外周造血组织(图1B-1D)中被上调。
A3AR在AIA模型中的表达水平也和疾病临床评分(图2)相关，这为炎症和A3AR表达之间的关联提供了进一步的证据。
CF101抑制AIA的发展
在免疫后大约21天，大多数经载体处理的动物逐渐发生关节炎。CF101处理(10μg/kg，每天两次口服给药，从免疫后的第14天开始)和氨甲喋呤(MTX)处理导致疾病严重度的显著减少，两种药物的结果非常相似，如由关节炎临床评分所估量的。疾病在第21至28天达到最高点且在这些天观察到CF101或MTX的最大效应(图3)。
A3AR在AIA大鼠的炎症组织和外周造血组织中高度表达
在健康爪和滑液组织中检测到低A3AR表达水平。在来源于AIA大鼠的炎症组织中，注意到A3AR蛋白表达水平的显著增加(图4A-4B)。在IB-MECA处理后，A3AR水平即刻下调(图4A-4B)。在外周造血组织中注意到相似的模式，即在来源于未试验过的动物的脾和淋巴节(LN)中注意到低A3AR表达水平，来自AIA的组织中的高表达水平和IB-MECA处理的大鼠组织中的低表达水平(图5A-5C)。在来自用MTX处理的AIA大鼠的LN中观察到相似的A3AR表达谱(图6)。
在来源于RA的MNC中发现高A3AR表达对健康受试者中的低表达
在来自健康受试者的MNC中发现低A3AR表达水平，而在来源于RA患者的MNC中检测到高表达(图7)。
A3AR表达和临床功效参数之间的相关性
从17个参加临床研究的RA患者抽取血液，所述临床研究检测CF101对这些患者中的疾病表现的影响。在前次治疗的清除期之后，和然后在3个月的治疗之后抽取血液，分离外周血单个核细胞(PBMNC)并确定这些细胞中的A3AR的水平。如可在图8中所见到的，这17个患者中有5个是非应答者，即这些患者甚至未获得ACR20的反应，而其他13个患者是应答者，因为其具有至少ACR20的反应(如可在图8中看到的，应答者中有3个具有ACR70的反应，5个获得ACR50的反应，另外4个只获得ACR20的反应)。
如可在图8中进一步看到的，所有ACR50和ACR70应答者均具有起始的高水平A3AR，在3个月的治疗后，该高水平降低，而在非应答者中A3AR水平基本上没有改变。由“*″”标记的患者(患者号1517)，尽管没有ACR反应(根据CRP水平(用于计算ACR评分的参数中的一个参数-参见下面)的变化低于0％的事实)，但在其他参数特别是肿胀和关节触痛的数目上具有非常显著的改善。
这些数据清楚地证明使用A3AR水平以预测患者对抗炎药物疗法(特别是利用A3AR激动剂作为疾病修饰性药物的该疗法)的反应的能力。
经氨甲喋呤治疗的RA患者中A3AR表达水平的上调
在使用氨甲喋呤的疗法开始之前和之后从4个RA患者采集血液样品。分离PBMNC并如上所述测定A3AR的水平。显示于图9中的结果证明使用氨甲喋呤的疗法诱导了A3AR水平的增加。
这些数据显示过去的病史，特别是过去的药物疗法，可影响PBMNC中的A3AR水平，因此为了进行本发明的方法可能需要考虑该病史。

Claims (1)

1.用于确定A3腺苷受体A3AR的mRNA的水平的试剂在制备用于选择遭受某种炎性疾病的受试者以接受采用A3AR激动剂的抗炎治疗性处理的诊断试剂中的用途，所述诊断试剂用于确定该受试者的外周血单个核细胞PBMNC中的A3AR的mRNA的表达水平，且如果所述水平高于预先确定的水平则选择该受试者接受所述抗炎治疗性处理，其中所述A3AR激动剂为IB-MECA，所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
CN200580039176.7A 2004-12-02 2005-11-30 炎症的生物学标记 Active CN101061385B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63219804P 2004-12-02 2004-12-02
US60/632,198 2004-12-02
US65771805P 2005-03-03 2005-03-03
US60/657,718 2005-03-03
PCT/IL2005/001279 WO2006059327A1 (en) 2004-12-02 2005-11-30 A biological marker for inflammation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101061385A CN101061385A (zh) 2007-10-24
CN101061385B true CN101061385B (zh) 2013-03-20

Family

ID=38866667

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800391771A Pending CN101132832A (zh) 2004-12-02 2005-11-30 炎症的治疗
CN200580039176.7A Active CN101061385B (zh) 2004-12-02 2005-11-30 炎症的生物学标记

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800391771A Pending CN101132832A (zh) 2004-12-02 2005-11-30 炎症的治疗

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN101132832A (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL254535A0 (en) * 2017-09-17 2017-11-30 Can Fite Biopharma Ltd Adenosine a3 receptor ligand for use in the management of cytokine release syndrome

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARALDI P G ET AL.A3 ADENOSINE RECEPTOR LIGANDS: HISTORY AND PERSPECTIVES.《MEDICINAL RESEARCH REVIEWS》.2000,第20卷(第2期),103-128. *
KOHNO Y ET AL.ACTIVATION OF A3 ADENOSINE RECEPTORS ON HUMAN EOSINOPHILS ELEVATES INTRACELLULAR CALCIUM.《BLOOD》.1996,第88卷(第9期),3569-3574. *
WALKER BA ET AL.Adenosine A3 receptor expression and function in eosinophils.《AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY CELL AND MOLECULAR BIOLOGY》.1997,第16卷(第5期),531-537. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101132832A (zh) 2008-02-27
CN101061385A (zh) 2007-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Punga et al. Epidemiology, diagnostics, and biomarkers of autoimmune neuromuscular junction disorders
Ellis et al. Epilepsy genetics: clinical impacts and biological insights
US8541182B2 (en) Biological marker for inflammation
Zhao et al. Promoter methylation of serotonin transporter gene is associated with obesity measures: a monozygotic twin study
Harrison et al. The influence of HLA–DRB1 alleles and rheumatoid factor on disease outcome in an inception cohort of patients with early inflammatory arthritis
Wesselhoeft et al. Dimensions and subtypes of oppositionality and their relation to comorbidity and psychosocial characteristics
JP6864089B2 (ja) 進行性胃癌患者の手術後の予後または抗癌剤適合性予測システム
AU2016330780A1 (en) Immunorepertoire normality assessment method and its use
CN108034708B (zh) 通过多个mRNA的表达量确定雷公藤多苷片治疗类风湿性关节炎的个体有效性的系统
CN105483218A (zh) 检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用
WO2017120285A1 (en) METHODS OF USING miRNA FROM BODILY FLUIDS FOR DIAGNOSIS AND MONITORING OF NEURODEVELOPMENTAL DISORDERS
CN109136358A (zh) 鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及miRNA在其中的应用
CN101061385B (zh) 炎症的生物学标记
CN101627128A (zh) 膀胱癌生物标记及其用途
Yang et al. The emerging genetic diversity of hereditary spastic paraplegia in Korean patients
Kim et al. Threshold of somatic mosaicism disrupting the brain function
Yang et al. Four mutations identified in Chinese families with autosomal dominant congenital cataracts by next-generation sequencing
Becue et al. Screening for an underlying tubulopathy in children with growth failure, simply maths?
CN109355378B (zh) 标志物clptm1在癫痫诊断和治疗中的应用
Kong The Complexities and Art of Interpreting Biomarkers and Response to Immune Checkpoint Inhibitors
Kageyama et al. Evaluation of the SNP rs2367563 genotyping test as an adjunctive detection tool for dental metal hypersensitivity
Seğmen et al. Investigation of the D188V mutation in the SCN1A gene in patients with idiopathic generalized epilepsy
Kalniņa Clinical Variability of Charcot-Marie-Tooth Disease and its Association with Neurofilament and Genetic Type of Disease. Summary of the Doctoral Thesis
Yoshida et al. M172. POLYGENIC RISK SCORES ANALYSES IN ANTIPSYCHOTIC-INDUCED WEIGHT GAIN
He et al. The Impact Of The Serotonin Transporter Gene Promoter DNA Methylation And Parenting Styles On Anorexia Nervosa

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant