CN101128216A - 输送载体、生物活性物质和病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组合物和方法，用于将生物活性剂安全地输送给动物。优选地，生物活性剂是疫苗，更优选地，生物活性剂是病毒。

Description

输送载体、生物活性物质和病毒疫苗

发明背景

[001]本发明涉及新型的的病毒疫苗，以流行性感冒病毒疫苗为例，但不仅仅限定于流行性感冒病毒疫苗。本发明进一步涉及新型的组合物和新型的方法，用以将生物活性物质安全的输送给动物，优选地为脊椎动物；如果所述生物活性物质以气溶胶或游离的形式被输送给脊椎动物，其可对脊椎动物产生不利作用。

[002]甲型流行性感冒病毒(A型流感病毒(Influenza Avirus))引起普通的流感；并且在美国，是死亡率中的主要病毒性原因(Yewdell et al.，2002，Curr.Opin.Microbiol.5：414)。这很大程度上是由于如此的事实——对比于健康的人，免疫受损的个体易于受流感的更严重和更致命的流感情况的影响。流行性感冒病毒是一种属于正粘病毒科家族的RNA病毒。该病毒基因组包括八个单链RNA片段，其编码下述蛋白质：被称为血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的两种表面糖蛋白、M2离子通道蛋白、M1基质蛋白、与病毒RNA相关的核蛋白和三种RNA聚合酶(PA、PB1和PB2)(Horimoto et al.，2005，Nat.Rev.Microbiol.3：591-600)。由于RNA基因组的易错本性，流行性感冒病毒在两个主要的表面蛋白——HA和NA中，累积突变。基于在甲型流行性感冒病毒组内的HA或NA中存在的抗原性差异，已经鉴别了16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型。二级水平的遗传学多样性的存在是由于RNA片段在被感染的宿主中进行重配的能力，因此产生了包含人和动物起源的RNA片段的病毒(Zhou et al.，1999，J.Virol.73：8851-8856)。

[003]作为流行性感冒病毒抗原易变性的结果，病毒包膜蛋白、血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的组成总是处于变化中。这种易变性导致产生新出现的病毒毒株，这种病毒毒株通常对于动物物种内部或动物物种之间的传播具有增强的功效。更重要地，因为在易受感染的人群中，对新毒株只有很少或没有免疫性，所以病毒的新毒株的产生导致了大流行(Enserink，2004，Science 306：392)。由于这个原因，1918-1919“西班牙流感”是曾经最致命的大流行病，其曾经使全世界估计1亿人死亡。

[004]近来，对于物种之间的流行性感冒病毒的传播的关注已经持续上升。被发现的在人群中传播的流行性感冒病毒毒株主要表达HA的1亚型、2亚型或3亚型和NA的1亚型或2亚型。H1N1病毒引起了在1918年的流行性感冒病毒的大流行(西班牙流感)。在整个世纪里，在这次破坏性巨大的大流行性感染之后，接下来的是其它的流感流行病，例如在1957年的亚洲流感(H2N2)和在1968年的香港流感(H3N2)。H1N1和H3N2病毒的遗传学变异体继续感染人类，并且每年引起流行性病。甲型流行性感冒病毒的HA和NA的其它亚型被保存在水禽中。因此，通过重配过程(the process of reassortment)，新的HA亚型可能会从鸟类的贮存库中引入人群，结果是引起流行性感染。鸟类的流行性感冒病毒在人类中的无效复制被认为是流行性感染出现的一个主要障碍。

[005]先前认为人和鸟类的流行性感冒病毒仅仅能在猪中重配，因为猪是唯一可能会被这两种亚型的病毒均感染的物种。但是，在1997年，鉴定了第一个直接从鸟类向人传播的病例。这种病毒感染了18个人，并且使他们中的6个人死亡(Enserink，2004，Science 306：392；Kaiser，2004，Science 306：394)。从1997年起，在人群中，鸟类流感的三种毒株已经又有了6次发作，并且H5N1毒株作为最普通和致命的毒株已经出现(Kaiser，2004，Science 306：394)。这种跨越物种的传播造成了此种危险，即流行性流感毒株突然出现、而人群却没有被任何目前可获得的疫苗保护。

[006]由于对新的流行性感冒病毒大流行病可能性越来越多的担心，已经加强了努力以发现流行性感冒病毒疫苗，其能保护人抵抗一种以上的病毒毒株。这些努力也涉及发现通过阻断病毒的复制而具有治疗流行性感冒病毒感染之效果的治疗分子(Cox et al.2004，Scand.J.Immunol；Kaiser，2004，Science 306：395)。这一研究已经定位于开发：基于DNA的疫苗、RNA干扰分子——其作用为保护人抵抗流行性感冒病毒毒株、和对抗流行性感冒病毒的新的抗病毒药物(Kaiser，2004，Science 306：395；Epstein et al.，2002，Emerg.Infect.Dis.8：796；Tompkins et al.，P2004，PNAS，101：8682；Tumpey et al.，2004，PNAS 101：3166)。

[007]目前，在美国，有两种商业上可获得的用于人使用的流行性感冒疫苗。一种是灭活病毒疫苗，其以肌肉注射方式进行给药；另外一种是减毒疫苗，其以鼻喷雾方式进行给药。这两种疫苗诱导出抗流行性感冒病毒的抗体，该抗体能中和同一种病毒的随后感染。但是，新出现的表达变异的抗原表位的病毒菌株不可被存在的抗体识别。因此，每年必须制备不同的疫苗并且进行施用。

[008]抗病毒药物也是可行的，其通过干扰病毒生命周期的不同步骤产生影响。通过受体介导的胞吞作用，病毒进入宿主细胞。在内体里，低pH激发病毒和内体膜的融合，而且M2离子通道容许H⁺的流入，这导致了将病毒基因释放入细胞质。两种抗病毒药物——金刚烷胺(amantidine)和金刚乙胺(rimantidine)--阻断了M2离子通道，因此阻止了病毒脱壳和将RNA释放入细胞质。第二类的抗病毒药物作用在NA上，干扰病毒包装和新的感染性颗粒从细胞出芽。NA通过除去在细胞表面的包含唾液酸的受体而发挥作用，这样新产生病毒颗粒不能和其它病毒颗粒聚集，或者也不能保持粘附于受感染细胞的表面。因此，NA抑制剂，例如奥斯他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)，引起了病毒粒子保持粘附于受感染细胞的细胞膜上，阻止它们粘附于其它细胞和因此对其它细胞的感染。尽管存在对M2和NA阻断剂具有自然抗性的毒株，如果流行性传染发生，这些药物仍然可提供一种方法，以抑制病毒传播(Monto and Arden，1992，Clin.Infect.Dis.15：362-367；Kiso et al.，2004，Lancet 364：759-765)。

[009]鉴于当心——下次流行可能由具有先前没有感染过人的HA亚型的病毒所引起，现在正在测试用于疫苗开发的新技术。例如，反向遗传学正被用于将候选毒株的HA和NA基因克隆到质粒中。然后，用这些质粒和原供体毒株的其它六种基因一起转染细胞。因此，通过反向遗传学产生的病毒粒子把相关抗原分子HA和NA的表达和供体菌株的特性(高产率、寒冷适应性、减毒株)组合起来。反向遗传学相当大的减少了获得候选疫苗所需要的时间的量(Webby et al.，2004，Lancet 363：1099-1103)。但是，如果大流行发生，致病病毒可在1个月内影响美国(Enserink，2004，Science 306：392-394)。因此，使用这种策略开发有效的疫苗所需要的时间不可能是充足的。和反向遗传学相关的其它缺陷是如下困难，其关系到用八个或更多的质粒同时转染细胞和批准用于疫苗生产的有限数量的细胞系。

[010]另一个抗病毒的方法是使用短干扰RNA(short interfering RNAs(siRNA))，作用于流行性感冒病毒基因的保守区。siRNA是RNA双链体，其在长度上为21个到26个核苷酸，并且其能诱导同源性mRNA的序列特异性降解。对核蛋白或酸性聚合酶特异性的siRNA的静脉内输送，表明保护了鼠免于已知可感染鼠的流行性病毒毒株或高度致病的鸟类毒株例如H5和H7亚型的致命攻击(Tompkins et al.，2004，PNAS 101：8682-8686)。尽管siRNA干扰了流行性病毒的生命周期，但是当这种技术去适应人的时候，产生了主要的困难。重要的是该siRNA序列不能与任何的人基因序列互补；并且为了阻断病毒基因的活性，在所有感染的细胞中，siRNA必须以足够的水平表达。总的说来，该新的抗病毒技术可具有长远的希望，去发展新的流行性病毒疫苗或治疗方法。但是，使用这些技术，不能解决当前的在非常短的时期内生产好几百万剂量的疫苗的要求。

[011]从1997年开始，又有了三次高度致病的鸟类病毒H5N1(高度致病的禽病毒H5N1，highly pathogenic avian virus H5N1))在人群中爆发：香港2003、越南2004和泰国2004(Kaiser，2004，Science 306：394-397)。针对这种流行性病毒亚型的疫苗正在被生产并被检验功效和安全性。已经报道，该疫苗可保护人抵抗H5N1菌株；但是诱导保护所需要的剂量(90μg的纯化杀灭病毒或抗原)是被用于普通季节性流行性感冒病毒疫苗情形中的剂量的两倍。另外，对于一个人来说，H5N1疫苗不得不以四周为间隔给予两次(Enserink，2004，Science 309：996)。为了提高抗H5N1疫苗的功效，并且为了能给予更低剂量的抗原，已经提出了不同的策略，例如使用佐剂或改变病毒传送途径(Schwartz and Gellin，2005，J.Infect.Dis.191：1207-1209)。

[012]正如所提到的，目前可行的针对流行性病毒菌株的疫苗包括：以肌肉注射方式给药的无活性的(被灭活的)疫苗和以鼻喷雾方式给药的减毒活疫苗。这两种疫苗都导致了抗病毒或病毒中和抗体的产生(Cox et al.，2004，Scand.J.Immunol.59：1)。新出现的表达变异的抗原表位的病毒菌株不可被存在的抗体识别。因此，当这是选择的疫苗策略的时候，必须发展新的疫苗并且每年给人施用(Cox et al.，2004，Scand.J.Immunol.59：1；Kaiser，2004，Science 306：395)。如果鉴别了流行性感冒病毒的流行性毒株，预期至少需要6个月以发展有效对抗新毒株的无活性的疫苗(Kaiser，2004，Science 306：394；Kaiser，2004，Science 306：395)。为了发展保护人免于流行性流感病毒毒株的疫苗，所述疫苗必须不仅仅能诱导出对抗病毒的抗体反应，而且最佳地，疫苗应该诱导CD8+T细胞反应，CD8+T细胞反应展示了对抗几种流行性菌株的广谱特异性。虽然这样的疫苗不可能预防任意一种流行性病毒菌株的实际感染，但是它可以缓解疾病的严重性，因此减低了感染以后的发病率和死亡率。

[013]对于发展和成功使用任意生物活性物质或疫苗的一个关键问题是，是否其在人和动物中使用是安全的。安全性的评估必须在两个水平进行。一方面，生物活性物质或疫苗对被施用的动物必须是没有毒性的。另一方面，处理生物活性物质或疫苗的人员，例如那些施用生物活性物质或疫苗的人员、生物活性物质或疫苗的接收人员和那些在施用期间可能存在的人员，不能对生物活性物质或其中包含的病毒所引起的任何不利作用冒险。如果生物活性物质是毒素，或者疫苗包含有活病毒，后面的情况是特别重要。从本文提供的公开内容中，明显的是，通过在介质中包封生物活性物质或病毒可以解决这个问题，所述介质可预防通过气溶胶化作用的病毒扩散。考虑到这一点，本文现在回顾不同组合物的现有技术公开内容。

[014]生物相容性凝胶已被广泛研究并用于药物输送、细胞因子输送(Liu etal.，2003，Cancer Chemother.Pharmacol.51：53-57)、基因治疗(Schek et al.，2004，Molecular Therapy 9：130-138)和组织工程(Tsang and Bhatia，2004，Adv.Drug Deliv.Res.56：1635-1647)。大量生物相容性聚合物已被用于活体内。为了回应世界卫生组织(the World Health Organization)对于单步免疫(single-step immunization)(Aguado，1993，Vaccine 11：596-597)的号召，多数近来对疫苗包囊化(vaccineencapsulation)的研究已经强调了使用脉冲型或持续型释放制剂的优点。可释放抗原的聚合微胶囊已经表明，在哺乳动物中，在超过6个月的时期内，可诱导增强的免疫应答(Pries and Langer 1979，J.Immunol.Methods 28：193-197)。这些制剂导致的免疫增强(immunopotentiation)被认为通过类似于铝盐佐剂的贮存效应(depoteffect)所产生，或者通过将抗原直接输送到抗原呈递细胞所产生。

[015]通常，水凝胶被定义为胶态凝胶，在其中，水是分散介质。它们由多种不同连结(a variety of different bonds)交联而成的聚合物组成，这些连结可以是化学的或者物理的，例如离子或疏水相互作用，或者通过氢键。藻酸盐是自然发生的从褐藻提取的线性多糖。它由1-4连接的α-L-古洛糖醛酸残基和β-D-甘露糖醛酸残基组成。不同来源的藻酸盐具有不同古洛糖醛酸含量，并且这又影响了藻酸盐的性质。藻酸盐能通过与二价阳离子，例如Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺和类似物，反应形成水凝胶；但不能与Mg²⁺反应形成水凝胶。三价阳离子，例如Al³⁺和Fe³⁺，也能被用于从藻酸盐形成水凝胶。制备这些水凝胶的一般方法涉及：把藻酸钠溶液滴加到包含交联必需的阳离子的溶液中。包裹在藻酸盐中的脂质体已被研究用于蛋白输送(Wheatley et al.，1991，J.Applied Polymer Science 43：2123-2135；Dhoot andWheately 2003，J.Pharmaceut.Sciences 92：679-689；U.S.Patent No.4,921,757)；并且，几种不同的细胞系，包括胰岛细胞(Lim and Sun，1980，Science 210：908-910)和基因工程成纤维细胞(Tobias et al.，2001，J.Neurotrauma 18：287-301；Cheng et al.，1998，Human Gene Therapy 9：1995-2003)，已经被包裹在藻酸盐中以进行医疗应用。近些年来，藻酸盐已被研究，用于在组织工程(Kuo and Ma，2001，Biomaterials22：511-521)中用作支架结构。带有共价连接的肽的藻酸盐水凝胶，作为合成的胞外材料(Suzuki et al.，2000，J.Bionied.Materials Res.50：405-409；Rowley et al.，1999，Biomaterials 20：45-53)和作为组织膨胀剂(Loebsack et al.，2001，J.Biomed.MaterialsRes.57：575-581)，已经被研究。已经报道离子化交联的藻酸盐随着时间逝去在体外失去了机械特性，大概是由于交联的离子外流进入周围的介质(Shiochet et al.，1996，Biotechnology and Bioengineering 50：374-381)。用于藻酸盐的离子致凝胶化作用(ionotropic gelation)的方法包括，例如在下列参考文献中描述的那些方法：Wheatley et al.(1991，J.Appl.Pol.Sci.44：2123)；Dhoot and Wheatley(2003，J.Pharm.Sci.92：679)；和Dhoot et al(2004，J.Biomed.Mater Res.71 A：191)。

[016]可从透明质酸(hyaluronic acid)——其也被称为透明质酸(hyaluron)，是一种通常在身体中发现的聚合物——形成相似的水凝胶。透明质酸是D-古洛糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺形成的带负电的一种线形聚合物，当这些化合物暴露于多价阳离子的时候(Balazs and Laurent，1998，In：The Chemistry，Biology and MedicalApplications of Hyaluronan and Its Derivatives，325-336；Chen and Abatangelo，1999，Wound Repair Regen.7：79-89)，形成该聚合物。已知透明质酸是高度生物相容的，这一点通过其经常应用于关节修复而被证明(Lim et al.，2000，J.Controlled Release66：281-292；Prestwich et al.，1998，J.Controlled Release 53：93-103)。因为这种化合物在生理pH下快速地溶解(Campoccia et al.，1998，Biomaterials 19：2101-2127)，所以很少有关于它用于药物输送的研究。

[017]使用胶原蛋白基质的药物输送赢得了其重要性，主要归功于当与天然生物聚合物例如白蛋白比较时，其固有的生物降解性、弱抗原性(Maeda et al.，1999，J.Controlled Release 62：313-324)和出众的生物相容性。胶原蛋白基质已被用作用于基因治疗的载体(Cohen-Sacks et al.，2004，J.Controlled Release 95：309-320)，控制蛋白(Fijioka et al.，1995，J.Controlled Release 33：307-315)、抗体(Fleming andSaltzman，2001，J.Controlled Release 70：29-36)和抗生素(Verbukh et al.，1993，Collagen Shields Impregnated With Gentamicin-Dexamethasone As A Potential DrugDelivery Device，Elsevier Science Publishers)的释放，以及把生长因子例如转化生长因子-beta 2(TGF-β2)(Schroeder-Tefft et al.，1997，J.Controlled Release49：291-298)输送到哺乳动物。已经使用胶原蛋白基质，把编码血小板衍生的生长因子B(adenoviral vector encoding platelet-derived growth factor-B(AdPDGF-B))的腺病毒载体输送到哺乳动物(Chandler et al.，2000，Molecular Therapy 2：153-160)，也发现在活体内和体外伤口愈合中，胶原蛋白基质增加了编码的转基因的表达。Gu等(2004，Molecular Therapy 9：699-711)指出：在胶原蛋白基质中输送的编码血小板衍生的生长因子B的腺病毒诱导了针对该腺病毒的抗体反应。没有记录到T细胞反应。为了把基因输送到动物，其他人也公开了包含腺病毒的胶原蛋白凝胶(Schek et al.，2004，MoI.Ther.9：130)。但是，这些凝胶没有被用于疫苗配制中，以便在动物体内针对特定目的诱导保护性免疫应答。而是在这些研究中，期望缺乏对病毒的免疫应答，因为预期应答的存在会导致动物排斥病毒，因此，基因输送的希望效应将被抵消。为了实现药物的受控释放，必须交联胶原蛋白纤维以形成基质。分离的胶原蛋白纤维，或者可通过使用共价交联剂(甲醛、戊二醛、1，6-己二异氰酸酯(hexamethylenediisocyanate)、聚环氧化合物(polyepoxy compounds)、碳二亚胺)，与三价阳离子如铬(Chvapil et al.，1973，Int.Rev.Connective Tissue Res.6：1-61)或铝(Gervais-Lugan et al.，1991，J.Biomed.Materials res.25：1339-1346)形成离子键进行交联；或者通过使用物理处理(干热、暴露于紫外线、γ辐射或pH改变)(Khor，1997，Biomaterials 18：95-105)进行交联。

[018]明胶是很少的几种能在疫苗中被成功地用作稳定剂的材料之一(Sarkaret al.，2003，Vaccine 21：4728-4735；de Souza Lopes et al.，1988，J.Biologic.Standardization 16：71-76)。明胶的可生物降解的纳米颗粒已被用于输送治疗肺病的药物(Brzoska et al.，2004，Biochem.Biophys.Res.Comm.318：562-570)，通过使特定的抗体与明胶纳米颗粒表面偶联用以输送给目标T细胞(Dinauer et al.，2005，Biomaterials 26：5898-5906；Balthasar et al.，2005，Biomaterials 26：2723-2732)；以及用在光动力学疗法的制剂中(Zhao et al.，2004，Biochim.Biophys.Acta1670-113-120)。明胶水凝胶因为其带正电的特性和其可生物降解性，所以作为一种新的基因输送系统(Kasahara et al.，2003，J.Amer.Coll.Cardiol.41：1056-1062)而被测试。明胶的带正电的结构能包装带负电的核酸、蛋白质和药物。当明胶凝胶逐步降解的时候，这些明胶结合的生物分子被释放出来。进一步，已阐明：当加入明胶和蔗糖的时候，可以通过冻干来保留逆转录病毒的感染性(Levy andFieldsteel，1982，J.Virol.Meth.5：165-171)。

[019]Borek等推测到：可能的是，通过用合成的抗原免疫动物，而引起能与同种动物物种的蛋白质进行交叉反应的抗体的形成(Borek et al.，1969，Biochim.Biophys.Acta 188：314-323)。全世界就已经报道了几个在初始暴露于抗原之后导致的过敏性休克的实例(Ring and Messmer，1977，Lancet 1：466-469；Van Asperen et al.，1981，The Med.J.Australia 2：330-331；Aukrust et al.，1980，Allergy 35：581-587)。一个进行过麻疹、流行性腮腺炎、风疹(MMR)疫苗接种的17岁少年的反应，被归因于针对疫苗的明胶成分的IgE抗体的诱发(Keslo et al.，1993，J.Allergy andClinical Immunol.91：867-872)。有其它的报道引证了明胶和过敏性反应之间的联系，这里明胶作为疫苗的热稳定剂成分(Sakaguchi et al.，1996，J.Allergy and ClinicalImmunol.98：1058-1061；Sakaguchi et al.，1995，J.Allergy and Clinical Immunol.96：563-656；Kumagai et al.，1997，J.Allergy and Clinical Immunol.100：130-134；Sakaguchi and Inouye，1998，Vaccine 16：68-69；Nakayama et al.，1999，J.Allergy andClinical Immunol.103：321-325；Sakaguchi et al.，1999，Immunology 96：286-290)。通过当改变明胶的配方(Nakayama and Aizawa，2000，J.Allergy and Clinical Immunol.106：591-592)或当从疫苗完全除去明胶时(Kuno-Sakai and Kimura，2003，Biologicals 31：245-249)，在过敏性反应上的明显减少的观察结果，进一步支持了这些报道。多数报道的过敏性反应的病例源自日本，而不是美国(Pool et al.，2002，Pediatrics 110：71)。这提示对明胶基疫苗的过敏性是由明胶过敏反应和HLA-DR9(Kumagai et al.，2001，Vaccine 19：3273-3276)之间强烈的关联引起的，其是对亚洲人群特有的(Nakayama and Kumagai，2004，Pediatrics 113：170-171)。Pool等(2002，Pediatrics 110：71)也建议在日本把少量水解的明胶加入到白喉-破伤风一非细胞性百日咳(DTaP)疫苗可能促进了一些孩子对明胶的敏化，导致对后来MMR疫苗接种的过敏性反应的危险增加(Nakayama et al.，1999，J.Allergy and ClinicalImmunol.103：321-325)。在美国，发现被使用在疫苗制造中的明胶是完全水解的。

[020]更多的研究涉及到使用单壁纳米管(single walled nanotubes(SWNT))来传递多种大分子进入哺乳动物细胞。例如已经使用这种系统，它们连接有小肽(Pantarotto et al.，2004，Chemical Communications(Cambridge，UK：16-17))、核酸(Lu et al.，2004，Nano Lett.4：2473-2477)和蛋白质，例如链霉亲和素(ShiKam etal.，2004，J.Amer.Chem.Soc.126：6850-6851)。近来，Shikam等凭借使用叶酸部分对SWNT的功能化作用，探究了对癌症细胞的破坏(ShiKam et al.，2005，PNAS102：11600-11605)。这导致了SWNTs内化进入带有叶酸受体肿瘤标志标记的细胞的内部。通过使用近红外光辐射细胞，实现了肿瘤细胞死亡。Naguib等阐明了：仅仅通过改变后合成处理，可适应性改变碳纳米纤维结构的表面，以具有多种生物医学的应用(Naguib et al.，2005，Nanotechnology：567-571)。在他们的针对蛋白质在碳纳米管上吸附的研究工作中，Salvador-Morales等(2006、MoI.Immunol.43-193-201)报道了相似的结果。最重要的是，为了增强病毒特异性中和抗体对肽的应答，Pantarotto等已经阐明了碳纳米管的功能化(2003，Chem.Biol.10：961-966)。使用这些技术，要被输送的化合物是与纳米管的外部相联系，另外，纳米管的大小影响化合物的输送。

[021]尽管疫苗的技术和抗病毒的技术都普遍进步了，但是在本领域对于病毒疫苗，特别是流行性感冒病毒疫苗——其是安全的并能迅速、轻而易举地制造——仍保持期盼已久的期望。这些疫苗必须能够诱发完全的体液和细胞的免疫应答，这样，经过接种疫苗的动物和人完全被保护，以免于恶性的病毒毒株的随后攻击。本发明满足这个需求。进一步，给予动物潜在致命的生物活性药剂例如活病毒时，如果该药剂变成气雾化或者溢出，其可能会对那块区域中的其它的动物产生不利作用。本发明通过提供组合物和安全给予如此药剂的方法，解决了这个问题。

发明简述

[022]本发明包括疫苗，该疫苗包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的病毒，其中，在采用不会在动物体内引起疾病的途径，将病毒施用给动物之后，所述病毒在动物体内诱导免疫保护的CD8+T细胞和/或抗体应答。

[023]发明进一步包括疫苗，该疫苗包含CD8+T细胞免疫保护量的病毒，其中，在采用不会在动物体内引起疾病的途径把病毒施用给动物之后，所述病毒在动物体内诱导免疫保护性的CD8+T细胞应答。

[024]在一些方面，病毒是活病毒、减毒病毒或死病毒。

[025]在其它一些方面，病毒是呼吸道病毒。在其它一些方面，病毒选自正黏病毒、副黏病毒、冠状病毒属、微小RNA病毒(a picornavirus)、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒(adenovirus)、细小病毒和腺体病毒(adenovirus)、杯状病毒、星状病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)、沙粒病毒、黄病毒、线状病毒、汉坦病毒属、甲病毒属、反转录病毒和慢病毒。

[026]优选地，病毒为正黏病毒，更优选地为流行性感冒病毒，甚至更优选地，病毒为甲型流行性感冒病毒(influenza virus type A)。当病毒为甲型流行性感冒病毒的时候，病毒具有选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的血凝素抗原(hemagglutinin antigen(HA))和选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的神经氨酸酶抗原(neuraminidaseantigen(NA))。甚至更优选地，甲型流行性感冒病毒具有选自H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H2N2、H1N1、H1N2和H3N2的HA∶NA的抗原谱(HA∶NAantigentic profile)。

[027]在一些实施方式中，疫苗包括低剂量的甲型流行性感冒病毒。优选地，低剂量的甲型流行性感冒病毒为0.001到5000血细胞凝集单位(Hamagglutinationunits(HAU))的病毒，更优选地，为0.005到500HAU的病毒，以及更优选地，0.01到100HAU的病毒。

[028]在一些实施方式中，动物为脊椎动物，优选地为哺乳动物以及更优选地为人。

[029]本发明的疫苗可包括两种或两种以上选自活病毒、减毒病毒和死病毒成分的病毒的联合。

[030]在优选的实施方式中，给药的途径是非自然的途径，以及更优选地选自皮下的、皮内的、肌肉的、粘膜的和口的途径。

[031]本发明也包括：包含本发明疫苗的试剂盒。

[032]本发明进一步涉及包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的病毒的疫苗，其中，在通过采用不会在动物体内引起疾病的途径把病毒施用给动物之后，所述病毒在动物体内诱导免疫保护性的CD8+T细胞和/或抗体应答，并且进一步地，其中所述病毒与包囊载体(或者包裹载体，encapsulation vehicle)相结合。

[033]另外，本发明涉及包含CD8+T细胞免疫保护量的病毒的疫苗，在采用不会在动物体内引起疾病的途径把病毒施用给动物之后，其中所述病毒在动物体内诱导免疫保护性的CD8+T细胞应答，进一步地，其中所述病毒与包囊载体相结合。

[034]在一个优选的实施方式中，病毒被包封在包囊载体内，病毒在被包入包囊载体之前，也可以与纳米管、脂质体或蛋白质相结合。在其它实施方式中，包囊载体包含一种或几种成员，选自凝胶、液体或粉末。优选地，包囊载体被负载在纳米管中。

[035]在某些实施方式中，包囊载体包括聚合物，更优选地，当把包囊载体施用给动物时，其是无毒的。优选地，聚合物与病毒相连接，因此延迟了把病毒释放到周围环境中。

[036]在优选的实施方式中，聚合物是凝胶，并且可以包含胶原蛋白。聚合物也可以是水凝胶，以及也可优选地选自藻酸盐、明胶、壳聚糖和透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。

[037]在另外的优选实施方式中，凝胶包含藻酸盐、明胶、壳聚糖和透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素的一种或多种的组合。

[038]优选地，凝胶为交联的，另外，凝胶可进一步包括添加剂。在一个优选的实施方式中，添加剂为聚乙二醇(polyethylene glycol)。

[039]在另外的实施方式中，包囊载体包含微胶囊或纳米胶囊，或者纳米管。优选地，纳米管具有500纳米或以下的直径。

[040]仍在另外的实施方式中，包装胶囊包括溶液、粉末或凝胶中的一种或多种的组合。

[041]优选地，包囊载体优选地包括如本文其它地方所描述的病毒。

[042]本发明也包括用于把疫苗输送到动物的装置，该装置包括(a)CD8+T细胞免疫保护和/或抗体量的病毒，其中在通过非自然途径把病毒施用给动物之后，所述病毒在动物体内诱导免疫保护性的CD8+T细胞和/或抗体应答，(b)用于把疫苗输送到动物的输送器具。

[043]进一步包括用于把疫苗输送到动物的装置，该装置包括(a)CD8+T细胞免疫保护量的病毒，其中在通过非自然途径把病毒施用给动物之后，所述病毒在动物体内诱导免疫保护的CD8+T细胞应答，(b)用于把疫苗输送到动物的输送器具。

[044]在一个实施方式中，输送器具包含空心管，优选地，空心管具有锥形末端。在一些实施方式中，输送器具包括针。在另外一些实施方式中，任选地，空心管被连接到冲压器械上，其中优选地，冲压器械(plunging device)为注射器、基因枪、导管、胶布(贴剂)、吸入器或黏膜施用器。

[045]优选地，装置包括包囊载体和如本文其它地方描述的病毒。优选地，病毒被包在包囊载体内，更优选地，病毒在被包入到包囊载体之前，与纳米管、脂质体或蛋白相结合。

[046]本发明中进一步包括制造包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的病毒的疫苗的方法。本方法包括将CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的病毒与包囊载体相结合，因此制造疫苗。

[047]也包括制造包含CD8+T细胞免疫保护量的病毒的疫苗的方法，这里，本方法包括把免疫保护量的病毒与包囊载体相结合，因此制造疫苗。

[048]本发明也包括在动物体内诱导出CD8+T细胞免疫保护性应答和/或抗体免疫应答的方法。本方法包括把包含CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答。

[049]另外，也包括在动物体内诱导出CD8+T细胞免疫应答的方法。本方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞免疫应答。

[050]在这些和另外的方法中，优选地，动物为哺乳动物，更优选地，哺乳动物为人。

[051]在本发明中也包括了保护动物免于病毒引起的感染的方法。其包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，因此保护动物免于感染。

[052]另外，也提供了保护动物免于病毒引起的感染的方法，这里，本方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞体免疫应答，因此保护动物免于感染。

[053]也包括了预防在动物体内的病毒感染的方法，这里，本方法包括把包含CD8+T细胞的免疫保护和/或抗体的免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，从而预防在动物体内的病毒感染。

[054]另外，也提供了预防在动物体内病毒感染的方法。本方法包括把包含CD8+T细胞的免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞的免疫应答，从而预防在动物体内的病毒感染。

[055]进一步包括了在动物体内治疗病毒感染的方法。本方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞和/或抗体的免疫应答，从而治疗动物。

[056]也包括的是在动物体内治疗病毒感染的方法，这里，本方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗施用给动物，因此在动物体内诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，因此治疗动物。

[057]本发明包括一种组合物，该组合物包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的生物活性制剂，在采用不会在动物体内引起疾病的途径把生物活性制剂施用给动物之后，其中所述生物活性制剂在动物体内诱导免疫保护的CD8+T细胞和/或抗体应答。

[058]本发明也包括组合物，该组合物包含CD8+T细胞免疫保护量的生物活性制剂，在通过不会在动物体内引起疾病的途径把生物活性制剂施用给动物之后，其中所述生物活性制剂在动物体内诱导免疫保护的CD8+T细胞应答。

[059]在优选的实施方式中，该途径是非自然的途径，以及可选自皮下的、皮内的、肌肉的、粘膜的和口的途径。生物活性制剂被包在包囊载体内，并且优选地，生物活性制剂在被包入包囊载体之前，也可与纳米管、脂质体或蛋白质相结合。包囊载体包含选自凝胶、液体或粉末中的至少一种成员，优选地，包囊载体被负载在到纳米管上。包囊载体也可包括聚合物，并且优选地，当把包囊载体施用给动物时，其是无毒的。聚合物可与生物活性制剂相连接，因此延迟了把生物活性制剂释放到周围环境中。优选地，聚合物为凝胶，而且也优选地，生物活性制剂选自微生物和蛋白质。

[060]也包括了当把生物活性制剂施用给动物时，增强安全性的方法。本方法包括了把包含CD8+T细胞免疫保护量和/或抗体免疫保护量的生物活性制剂的组合物施用给动物，在用不会在动物体内引起疾病的途径把生物活性制剂施用给动物之后，其中所述生物活性制剂在动物体内诱导免疫保护的CD8+T细胞和/或抗体应答，并且进一步其中所述生物活性制剂被包在包囊载体内。

[061]进一步包括当把生物活性制剂施用给动物时，增强安全性的方法。本方法包括了把包含CD8+T细胞免疫保护量的生物活性制剂的组合物施用给动物，在用不会在动物体内引起疾病的途径把生物活性制剂施用给动物之后，其中所述生物活性制剂在动物体内诱导免疫保护的CD8+T细胞应答，并且进一步地，其中所述生物活性制剂被包在包囊载体内。

[062]在优选的实施方式中，生物活性制剂选自微生物和蛋白质。

[063]另外，本发明也包括了一种组合物，其包含生物学有效量的生物活性制剂，在采用不会在动物体内引起疾病的途径把生物活性制剂施用给动物之后，其中所述生物活性制剂在动物体内诱导期望的应答，同时减低了在动物体内的风险。

[064]进一步包括当把生物活性制剂施用给动物时，增强安全性的方法。本方法包括把包含一定量的生物活性制剂的组合物施用给动物，该生物活性制剂在动物体内诱导期望应答同时减低危险，其中生物活性制剂的给药途径不会在动物体内引起疾病，并且，进一步，其中生物活性制剂被包在包囊载体中，因此当施用生物活性制剂时，增强了安全性。

附图简述

[065]当与附加的图一起阅读的时候，前述的概要以及下面的关于本发明的详细描述将会更好地被理解。以图解阐明本发明为目标，附图表明哪些实施方式是目前优选的。但是，应该理解：本发明并不仅仅限定于所显示的明确配制和仪器设备。在附图中：

[066]图1是柱状图，其描述了在C57B1/6J鼠中流行感冒病毒的四种不同的施用途径对二次病毒特异性CD8+T细胞应答的影响。用100个血细胞凝集单位(HAU)的PR8流行性感冒病毒，通过腹膜内(IP)注射途径、肌肉内(IM)注射途径、皮内(ID)注射途径或皮下(SubQ)注射途径，激发小鼠。在用X31甲型流行性感冒病毒再次攻击的七天后，收获组织；在肺组织的制备物中，使用负载有免疫显性的甲型流行性感冒病毒核蛋白NP_366-374(ASNENMETM(SEQ IDNO：1))的MHCI类四聚体，评估病毒特异性CD8⁺T细胞的存在。

[067]图2——包括图2A和2B——提供了在鼠中剂量响应研究的结果。在这项研究中，在采用通过IP或ID注射途径施用的多种不同剂量的PR8流行性感冒病毒刺激的C57B1/6J鼠中，评估二次病毒特异性CD8⁺T细胞应答。在用X31甲型流行性感冒病毒在鼻内再次攻击的七天后，收获组织。在肺组织的肺制备物中，使用免疫显性的甲型流行性感冒病毒核蛋白NP_366-374(ASNENMETM(SEQ IDNO：1))负载的MHC I类四聚体或IFN_γ细胞内染色剂，检测病毒特异性CD8⁺T细胞。图2A描绘了病毒特异性CD8⁺T细胞的代表性FACS图。图2B描绘了病毒特异性CD8⁺T细胞和产生IFN_γ的CD8+T细胞的剂量响应曲线。点是平均值+/-SEM；对于每组而言，有3只动物(^*p＜0.05)。

[068]图3——包括图3A和3B——是一连串描述病毒特异性CD8+T细胞对通过IP、SQ或ID输送的1HAU活流行性感冒病毒应答的图。在用1HAU的PR8流行性感冒病毒通过不同感染途径：IM、SQ或ID激发的C57B1/6J鼠中，二次病毒特异性CD8+T细胞应答。在用X31甲型流行性感冒病毒在鼻内再次攻击后的第七天收获肺，使用采用衍生自病毒核蛋白：NP_366-374(ASNENMETM(SEQ IDNO：1))的免疫显性的肽表位负载的MHCI类四聚体型的复合物，检测病毒特异性CD8+T细胞。在三个免疫情况的每一个中，计算NP₃₆₆特异性的CD8+T细胞占全部CD8+T细胞的百分数(A)和全部NP₃₆₆特异性的CD8+T细胞的数量(B)。水平线描述了平均值。

[069]图4是一幅图，描述了SQ施用的活体流行性感冒疫苗安全性。用100HAU的活的PR8流行性感冒病毒，SQ免疫野生型C57B1/6J(白色菱形)或免疫缺陷的Rag-/-γc-/-鼠(白色圆圈)。作为对照，用1HAU的PR8流行性感冒病毒IN感染(注射感染)一组C57B1/6J鼠(黑色菱形)。在接下来的17天里，记录鼠的重量(体重)，并且绘制出重量损失的百分比对感染之后天数的图。

[070]图5是描述了如此事实的图，即皮下施用的甲型流行性感冒病毒是安全的，并且不会引起疾病。低剂量(0.1HAU)的PR8(黑色方块)或伦敦毒株(黑色三角)的流行性感冒病毒，鼻内施用给野生型C57BL/6鼠。用高剂量(10HAU)的PR8(空心菱形)或伦敦毒株(黑色圆圈)皮下注射免疫缺陷型Rag-/-γc-/-鼠。在接种后的30天里，监测鼠的重量。表示出接种后的平均重量损失。在重量损失30％

时，使濒临死亡的鼠接受安乐死。对于所有的组，n＝5。

[071]图6——包括图6A、6B和6C——是一连串的流式细胞计量图，其描述了明胶凝胶中活病毒经SQ施用而有效地刺激鼠中CD8+T细胞应答的事实。将未处理的鼠或者用明胶单独、明胶和病毒一起(10HAU)或病毒单独(10HAU)免疫30天的鼠，在用X31流行性感冒病毒鼻内再次攻击后的第7天，分析它们的肺(图6A)和脾(图6B)。用抗CD8抗体和MHCI类/NP_366-374四聚体型的复合体对单细胞悬液染色，并且用流式细胞计量术进行分析。在全部淋巴细胞中的CD8+T细胞的百分比被表示在门形框外，然而在全部CD8+T细胞中的NP₃₆₆特异性CD8+T细胞的百分比被表示在方框内。(图6C)在体外，用NP_366-374肽刺激从指示鼠中得到的脾细胞6个小时。通过用抗IFN_γ抗体的细胞内染色和通过流式细胞计量术分析，评估由CD8+T细胞产生IFN_γ(IFN_γ ⁺CD8+T细胞的百分数表示在所述象限中)。

[072]图7——包括图7a、图7b、图7c和图7d——是一连串电子显微照片的图，其描述具有不同孔尺寸的胶原蛋白聚合物，该不同孔尺寸的胶原蛋白聚合物是通过改变聚合物浓度和交联剂含量而产生的。在注射针头内部制造的包含下述成分的冻干胶原蛋白凝胶的SEM显微照片：6mg/ml的胶原蛋白(图7a)；10mg/ml的胶原蛋白(图7b)；包含10mg/ml的胶原蛋白的胶原蛋白凝胶(湿式ESEM)(图7c)；和冻干的比例为1∶4的胶原蛋白：PEG的水凝胶(图7d)。

[073]图8——包含图8A和8B——是描述聚合物性质和Ca²⁺浓度(即载体性质)对排出时间之影响的图(图8A)和表(图8B)。

[074]图9——包括图9a和图9b——是一连串描述了如此事实的图，即聚合物性质控制纳米颗粒释放速率。从低粘度(图9a)和高粘度(图9b)的藻酸盐聚合物释放QDot(20nm大小)。低粘度聚合物迅速释放QDots，然而高粘度聚合物却以相比较而言低得多的速率释放QDots。

[075]图10是描述了如此事实的图，即在藻酸盐凝胶中输送的活体PR8病毒有效地刺激了鼠中的CD8+T细胞应答。在用活病毒皮下接种、然后用恶性病毒攻击的动物中，诱导出大量的肺部NP₃₆₆特异性CD8+T细胞。从未操作的鼠，或者从用PR8活病毒单独、藻酸盐单独或包在藻酸盐中的RP8活病毒皮下接种的鼠中得到的肺，是在用X31病毒再次攻击后的第7天予以分析的。用抗CD8抗体和MHCI类/NP_366-374肽对单细胞悬液染色，并且用流式细胞术进行分析。显示的数值代表了从每组两只鼠中所获得的平均数值。

[076]图11是描述了如此事实的图，即在藻酸盐凝胶中输送的活体PR8病毒有效地刺激了流行性感冒病毒特异性抗体的产生。用PR8病毒单独或被包在藻酸盐凝胶中的PR8病毒免疫C57BL/6鼠，C57BL/6鼠的血清中存在抗PR8抗体，这是通过ELISA、使用PR8病毒作为捕获抗原进行检测的。1/270的初始血清稀释物，进一步稀释在三倍连续稀释液中，并加入到结合于平板的PR8病毒中。没有被感染的动物表现出：对PR8病毒没有抗体应答。

[077]图12是描述了如此事实的图，即用包在藻酸盐凝胶中的活病毒接种鼠，在这些动物血清中诱导出中和性抗体。连续稀释(1/2连续稀释)从用包囊在藻酸盐中的活病毒感染的鼠中所得到的血清，并用2HAU的PR8病毒，检测该血清抑制鸡的红细胞的血细胞凝集能力。从没有用病毒接种的动物中得到的血清，不抑制血细胞凝集。

[078]图13是一个图像，是通过在670℃被乙烯高温分解辅助的模板合成的碳纳米管的扫描电子显微图。模板的孔的直径决定了纳米管的直径，在本实例中，纳米管的直径为250nm。纳米管管壁的厚度为大约20纳米。

[079]图14是用化学气相沉积法合成碳纳米管的示意性的图解说明图。

[080]图15——包括图15a和15b——是一连串显微照片的共聚焦图像，其描述了可用包含QDots的藻酸盐凝胶负载碳纳米管的事实。用藻酸钠和量子点(quantum dots)填充的碳纳米管的共聚焦图被显示出。把包含50nm的QDots的藻酸盐与纳米管混合，然后经历负载过程。在纳米管内部荧光的存在是负载的证明。箭头指向单独的纳米管。

[081]图16——包括图16a和16b——是一连串被在负载入纳米管的藻酸盐凝胶中的QDots的图像。包含藻酸钠和QDots的碳纳米管的SEM图被显示。在管的内部，可清楚地看出凝胶和QDots。在两张图上的比例标尺，都为2μm。

[082]图17—包括图17a和17b——是一连串与QDots混合但是并没有负载的纳米管的共聚焦图像。纳米管与包含50nm的QDots藻酸盐凝胶混合，但是没有经历负载过程。QDots的荧光明显在背景里，但是并不在管子中。箭头指向单独的管。

[083]图18——包括图18a和18b——是一连串描述可用超声处理(sonnication)打碎的纳米管的SEM图像。图18a——在进行超声处理前：图18b——在1.36MHz、30秒的超声处理后(放大10,000倍)。在超声处理前，管子10-20μm长。超声处理后，管子小于1微米(＜1μm)长。

发明详述

[084]本发明涉及组合物的发现和在新型的疫苗策略中使用该组合物以保护动物，优选的是脊椎动物，优选的是哺乳动物，更优选的是人，免于流行性感冒病毒的感染。但是，本发明不应该被理解为仅限定于保护动物免于流行性感冒病毒感染的疫苗策略，而应该被理解为包括任何生物活性制剂的施用，如果该生物活性制剂通过某些途径被施用可以气雾化或者以另外方式形成暴露给其它脊椎动物并给其它脊椎动物呈现出造成伤害的风险。本发明进一步包括赋予保护而免于其它病毒感染的疫苗策略，这些病毒感染包括，但不限定于，其它经动物的呼吸道和胃肠道感染或进入宿主的RNA病毒，甚至在一些情形中，包括经动物的呼吸道和胃肠道感染或进入宿主的DNA病毒。这是因为，如在本文其它地方更充分描述的，本发明的疫苗策略涉及如此的一个发现，即：通过与当前使用的常规接种途径，或者与病毒进入动物的自然途径不同的施用途径，将低剂量的活病毒单独或与新型的制剂或输送载体结合起来施用给脊椎动物，诱导了包括CD4+和CD8+T细胞和/或抗体的有效力的免疫应答，这对于有效保护动物免于感染性病毒的后续攻击是十分重要的。例如，已知用不同于自然感染途径的一个路径将流行性感冒病毒施用给动物，一般不会在动物内引起疾病。然而，通过将当前灭活的流行性感冒疫苗(死流行性感冒疫苗(killed influenza vaccines))肌肉内施用给动物仅仅诱导出体液的免疫应答，和仅仅微弱的T细胞的免疫应答或没有T细胞的免疫应答。鼻内施用(即自然途径)的减毒流行性感冒病毒疫苗仅诱导出弱的CD8+T细胞免疫应答。因此，当前疫苗保护了目标群体(target population)的大约仅仅30％。本发明包括如下发现：低剂量活体流行性感冒病毒疫苗皮下或皮内施用，诱导了有效力的CD8+T细胞的应答，并且因此是优于当前疫苗的。换句话说，本发明包括把生物活性剂施用给脊椎动物，是经由不同于生物活性剂进入该动物的自然途径的一个路径进行施用，在那里，在动物内诱导出保护性免疫应答，然后保护动物免于后来的生物活性剂攻击所致的疾病。本发明进一步包括了在材料中包囊生物活性剂，该包囊作用充分减低了该材料气雾化或产生其它的暴露风险，因此致使生物活性剂的施用比缺乏这些材料的情况更安全。在研读了本文提供的公开内容之后，将更容易明白本发明的这些和其它的方面。

定义：

[085]如在本文中使用的，下列每一个术语具有在本部分中与其相关的意思。

[086]本文使用的冠词“一(a)”和“一个或一种(an)”被参考意指为该冠词的语法目标物的一个或者意指该冠词的语法目标物的多于一个(即，意指至少一个)。作为实例方式，“一种元素(an element)”表示一种元素或多于一种元素。

[087]如在本文中使用的，“缓解”(alleviate)疾病(disease)、病症(disorder)或状况(condition)表示减低疾病、病症或状况的一种或多种症状的严重性。

[088]如在本文中使用的，“治疗”(treat)表示减低动物，优选脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人所经历的疾病症状发生的频率。

[089]如在本文中使用的术语“施用器”(applicator)，表示任意器具，其包括但不限定于针、导管、皮下注射器、基因枪、贴剂、纳米管、黏膜施用器或其任意组合，用于把本发明的组合物施用给脊椎动物。

[090]如在本文中使用的术语“生物活性剂”(bioactive agent)表示当施用给脊椎动物时，能对脊椎动物产生影响的任何制剂。当该制剂施用给脊椎动物时，产生的影响对脊椎动物可以是有益的或有害的。生物活性剂的实例包括，但不限定于活病毒、减毒病毒或死病毒、失活病毒、活体微生物、减毒或死微生物、肽、蛋白质、核酸、或者小的有机或无机化学品，它们能被作为疫苗、免疫原、药物或其它治疗剂施用给脊椎动物，优选人。

[091]如在本文中使用的，“有效量”(effective amount)的生物活性剂，例如疫苗或其它组合物，表示诱导出期望应答的任何量。在疫苗的情形中，这个术语表示：当生物活性剂被施用给脊椎动物时，在脊椎动物中，诱导出针对生物活性剂中的抗原的CD8+T细胞和/或抗体免疫应答的生物活性剂的任意量。

[092]如在本文中使用的，“CD8+T细胞和/或抗体的免疫保护量的生物活性剂”(CD8+T cell and/or antibody immunoprotective amount of bioactive agent)表示当生物活性剂被施用给脊椎动物时，诱导出针对生物活性剂的CD8+T细胞应答和/或抗体应答的生物活性剂的量，因此，当用生物活性剂通过在普通情况下对脊椎动物有不利作用的途径攻击脊椎动物时，脊椎动物比另外一个受相似攻击的同种脊椎动物——但是该动物没有被施用CD8+T细胞和/或抗体的免疫保护量的生物活性剂——表现了较少或较不严重的由生物活性剂攻击所引起疾病的症状。

[093]如在本文中使用的，“CD8+T细胞的免疫保护量的生物活性剂”(CD8+T cell immunoprotective amount of bioactive agent)表示当生物活性剂被施用给脊椎动物时，诱导出针对生物活性剂的CD8+T细胞应答的生物活性剂的量，因此，当用生物活性剂通过在普通情况下对脊椎动物有不利作用的途径攻击脊椎动物时，脊椎动物比另外一个受相似攻击的同种脊椎动物——但是该动物没有被施用过CD8+T细胞的免疫保护量的生物活性剂——表现了较少或较不严重的由生物活性剂攻击所引起之疾病的病症。

[094]如在本文中使用的，术语“基因”(gene)和“重组基因”(recombinantgene)涉及包括编码多肽的至少一个可读框的核酸分子。

[095]如在本文中使用的，“说明书材料”(instructional material)包括出版物、录音带、图表或其它的表达媒体，其可用于交流试剂盒中的本发明的生物活性剂、疫苗或其它组合物的有效性，用来实现本文中正式描述的多种疾病或病症的缓解。任选地或可选地，说明书材料可描述一种或多种在脊椎动物的细胞或组织中缓解疾病或病症的方法。本发明的试剂盒的说明书材料可以被，例如粘贴在包含本发明的生物活性剂、疫苗或其它组合物的容器上，或者与包含生物活性剂、疫苗或组合物的容器一起运送。可选地，说明书材料也可与包含本发明的容器分开运送，接受者协同使用说明书材料和化合物。

[096]如在本文中使用的术语“特异性结合”(specifically binds)表示化合物，例如蛋白质、核酸、抗体和类似物，其识别和结合特定的分子，但是基本上不会识别或者结合样品中的其它的分子。

[097]如在本文中所使用，术语“转基因”(transgene)表示外源核酸序列，该外源核酸被转基因的细胞或哺乳动物编码。

[098]如在本文中使用的涉及病毒的术语“活的”(live)，指病毒能在宿主细胞中感染和复制，也能在动物中引起疾病。

[099]这和如在本文中使用的涉及病毒的术语“减毒”(attenuated)形成对比，其表示能感染宿主细胞，但是在动物中明显地减小或者没有能力引起疾病的病毒。

[100]如在本文中使用的涉及病毒的术语“灭活或死”(killed)病毒，是不能在宿主细胞中感染和复制的病毒，并且也很大程度上在动物中不能引起疾病的病毒。

[101]如在本文中使用的术语“疫苗”(vaccine)是指抗原，即生物活性剂，优选地为病毒或其它微生物或者蛋白质，其能在疫苗施用的脊椎动物中诱导出免疫应答。优选地，免疫应答作为免于相同或相似的生物活性剂后来的攻击，给脊椎动物带来有益和保护性效应。更优选地，免疫应答预防了在生物活性剂随后攻击时，与生物活性剂相关疾病的至少一个症状的发作或者改善了与生物活性剂相关疾病的至少一个症状，或者减少了与生物活性剂相关的疾病的至少一个症状的严重性。甚至更优选地，免疫应答预防了与生物活性剂后来攻击相关的疾病的一个以上症状的发作或者改善了与生物活性剂后来攻击相关的疾病的一个以上症状。

[102]术语“不引起疾病的方法或途径”(method or route that does not causedisease)是指将生物活性剂用如此一种方式施用，该方式以一种路线给予该剂到生物体，该路线不同于该剂自然危害、毒化或感染生物体的机制或进入位点。作为非限制性的实例，流行性感冒病毒在自然感染人期间的进入位点是以未包囊的病毒直接地通过呼吸道。在本上下文中，“不引起疾病的方法或途径”是病毒的注射，优选地为皮下或皮内注射，其中病毒被包在包囊组合物中。

[103]如在本文中使用的术语“非自然途径”(non-natural route)是指动物的身体上的病毒进入位点；对于该病毒，该位点不是病毒自然感染该动物期间的进入位点。作为举例方式，在自然感染人期间的流行性感冒病毒的进入位点是呼吸道。皮下或皮内进入途径，因此是流行性感冒病毒进入的非自然途径。

[104]“感染的自然途经”(natural route of ninfection)是指在病毒的自然扩散中，病毒通过其感染动物的途径。

[105]“生物活性剂的自然进入途径”(natural route of entry of bioactive agent)指如下途径，通过其，动物对生物活性剂的暴露将通常引起与之相关的疾病的症状。

[106]术语，病毒的“低剂量”(low dose)，是指在病毒被施用的脊椎动物中，足够引发出保护性的CD8+T细胞和/或抗体应答的病毒量。熟练的实施者将会知道：在每种情况下欲被施用的病毒的精确量，并且该量将根据多种因素中的一种或几种而改变，这些因素包括但不限定于所使用的具体病毒的毒力、被施用病毒的动物的年龄和综合健康情况、病毒的制剂和甚至在病毒施用中所使用的装置。在流行性感冒的情况中，低剂量可在大约0.0001个血细胞凝集单位(HAU)到大约5000个HAU的范围内变化。优选地，低剂量可在大约0.0005个到大约500个HAU的范围内变化，更优选地为大约0.001个到大约100个HAU，并且甚至更优选地为大约0.05个到大约10个HAU，以及其间的任意和所有的全部或部分整数。

[107]如在本文中使用的术语“呼吸道病毒”(respiratory virus)是指在动物中，在感染动物时，主要使用呼吸道作为进入位点，和/或主要靶向呼吸道并且引起呼吸疾病的病毒。

[108]如在本文中使用的术语“肠病毒”(enteric virus)是指在脊椎动物中，在感染脊椎动物之时，使用胃肠道作为进入位点，和/或主要靶向胃肠道并且引起胃肠疾病的病毒。

[109]“皮下”(subcutaneous)涉及位于皮肤的真皮层和下面的肌肉组织之间的脂肪组织区域。

[110]“皮内”(intradermal)涉及位于表皮层和下面的皮下脂肪层之间的真皮层。对比于皮下位点，皮内位点包括大量的抗原呈递细胞，并且提供进入淋巴的更快释放。这可以导致皮内和皮下注射位点之间，在免疫应答的类型和程度、抗原/生物活性剂清除以及所需要的剂量上的差异。

[111]如在本文中使用的，术语“疫苗单位”(vaccine unit)或“疫苗的单位”(unit of vaccine)，是指疫苗量，当其被施用给脊椎动物时，在脊椎动物中发动保护性免疫应答的引发过程。疫苗单位可在脊椎动物中发动完全保护性应答的引发，或者可以发动不完全的应答，在这种情况下，为了完全应答，需要额外的疫苗单位。

[112]如在本文中使用的，术语“包囊载体”(encapsulation vehicle)指用于把生物活性制剂、疫苗或其它组合物施用到脊椎动物的成分，其中该成分涂敷、环绕、包围或者以其它方式与该制剂相连系，以致这些制剂包括来自以非包囊状态存在的另外的材料。

[113]术语“生物相容性聚合物”(biocompatible polymer)，是指当被施用给动物时不会诱导对动物一般有害的反应的聚合物。本文中使用该术语，其同义于术语“无毒性的”(non-toxic)。

[114]如在本文中使用的，术语“微胶囊”(microcapsule)指包围或以其它方式与生物活性制剂相关联的载体，并且该载体在制剂和环境之间提供了屏障。微胶囊的尺寸是大约1微米到几百微米的级别，以及是其间的任意和所有的全部或部分整数。微胶囊的形状可以变化，包括但不限定于球形的、椭圆体的和多边形的形式。微胶囊的形式可以变化，从在整个基质中被均匀分开——通常被称为微球体——以至被限制在一个部分中，例如用生物活性制剂填充的空心微胶囊的情形。

[115]如在本文中使用的，术语“纳米胶囊”(nanocapsule)是指微胶囊样的结构，这里，尺寸为在大约1纳米到1微米的范围内，以及其间的任意和所有的全部或部分整数。

[116]如在本文中使用的，术语“纳米管”(nanotube)指具有长度与宽度的比率大于1的结构，具有任意形状(环形、椭圆形、矩形、多边形或其它)的横截面，其中一个尺寸是100nm或更小的量级，但是测量结果可以达到1微米，以及其间的任意和所有的全部或部分整数。

[117]如在本文中使用的，术语“输送工具”(delivery device)是指可至少穿透脊椎动物之皮肤的最外层、并且把生物活性剂输送到脊椎动物的内部组织的工具。可选地，输送工具可把生物活性剂输送到脊椎动物内的粘膜组织。输送工具的非限制性实例为针、注射器、导管、基因枪、纳米管、贴剂、黏膜施用器和类似物。

[118]如在本文中使用，“安全输送载体或工具”(safe delivery vehicle ordevice)是用于把有潜在危险的生物活性剂输送到脊椎动物的工具，在这种情形中，如果脊椎动物暴露于不安全形式的生物活性剂，其通常为气溶胶或自由粉末的形式，生物活性剂将对脊椎动物具有不利作用。

说明：

I.病毒和其它的生物活性剂：

[119]本发明基于如此一个发现，即在鼠内，活的流行性感冒病毒的低剂量皮下或皮内施用诱导了鼠有效的CD4+和CD8+T细胞应答和抗体应答，该应答保护鼠免于后来鼻内施用的感染性流行性感冒病毒的攻击。本发明进一步基于如此的一个发现，即如果生物活性剂被包囊在阻止生物活性剂气雾化的材料里，与生物活性剂施用相关的风险可被最小化，其中所述生物活性剂有潜能形成危险的气溶胶。

[120]本发明不应该被理解为仅限定于直接针对感冒病毒的疫苗之使用，而应该被理解为包括发展对抗其它病毒的疫苗，特别是对抗呼吸道病毒或者肠病毒的疫苗。另外，本分明应该被理解为包括将生物活性制剂施用给脊椎动物，这里，该制剂在气溶胶或粉末形式下是有潜在的危害性。进一步，本发明应该被理解为包括不仅仅针对病毒的疫苗，而且包括针对其它微生物的疫苗，该微生物包括但不限于细菌。本发明应该进一步被理解为包括疫苗施用，这些疫苗针对其它分子、化合物或结构，其组成包括但不限定于蛋白质或者脂类。

[121]如本文其它地方更详细的描述，本发明包括如此疫苗，其能诱导保护性的CD4+T细胞应答、或者保护性的CD8+T细胞应答、或者对抗一种给定的生物活性剂的抗体应答、或者各种应答的两种或多种的组合。

[122]本发明的疫苗中包括的其它病毒是那些相似地依靠T细胞应答，即CD4+和/或CD8+T细胞应答，和/或抗体应答，以这样进行保护的病毒。这些病毒包括，但不限定于RNA病毒、引起呼吸道感染的RNA病毒、以及在一些情况下是DNA病毒。这些病毒的非限制性实例包括：正黏病毒、副黏病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒属、麻疹病毒、腺病毒、肠道病毒(包括但不限定于，小RNA病毒例如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、细小病毒、轮状病毒、杯状病毒、星状病毒、诺沃克样病毒、诺沃克病毒、虫媒病毒和沙粒病毒，例如黄病毒、线状病毒、汉坦病毒属、甲病毒属、逆转录病毒或慢病毒以及类似病毒。

[123]因此应该注意到，尽管流行性感冒病毒在整个本公开内容中作为实例，本发明必须被理解为包括这些另外的病毒和其它微生物，作为本公开内容的完整部分，也包括其它有潜在危害的生物活性剂。一旦被本发明武装，那么开发另外的病毒组合物和疫苗则是切实在技术人员的技能范围之内，这些另外的病毒组合物和疫苗具有可以诱导保护性的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞免疫应答，和/或抗体应答的性能，这在一旦后来被感染性病毒攻击时有益于接受过免疫的个体。这也进一步确实在技术人员的技能之内，即开发另外载体/制剂组合物，帮助把制剂安全的施用到动物或人。

[124]基于上述，本公开内容主要聚焦于流行性感冒病毒是仅仅为了清楚的目的，应该被理解为可以普遍性应用到其它生物活性剂、微生物和病毒，它们的致病机理、复制和/或感染性疾病的周期是已知的，并且遵循本文公开了的一般方法程序，结合本领域的那些方法程序，能被操作以产生有效的疫苗。对于这些方法程序的综述，参见Fields Virology，根据Bemard Fields，Editor，DavidKnipeLippincott Williams & Wilkins；3nd edition(1996)。

[125]在本领域中，有大量的信息教授各种各样病毒在多种不同细胞或其它系统中的生长和评估，例如在流行性感冒病毒的情形中，鸡蛋被用来产生病毒，进行疫苗生产。每一种病毒具有具自己的系统，因此产生了大量的系统，这些系统是众所周知的，而且是技术人员很容易获得的。当产生巨大数量的活病毒用于疫苗时，所产生的病毒必需能够感染宿主细胞并且在其中复制。进一步，在活病毒疫苗的情形中，使用技术人员很容易获得的方法学，可以评估：当经自然途径感染时，病毒在感染的宿主中引起疾病的能力。本发明的活病毒疫苗中使用的候选者是此类病毒，它们能够被复制、分离、具有感染细胞的能力，并当采用感染的自然途径时，能引起动物患病。本发明的减毒疫苗中使用的候选者是此类病毒：是能被复制和分离的病毒，可作为减毒病毒——其能感染细胞，但是当采用感染的自然途径时，不会引起动物明显患病。能够被复制、被分离，然后被杀死的病毒，以致它们不能感染细胞，并且当采用感染的自然途径时，它们不会引起动物患病，这样的病毒是本发明的死病毒疫苗中所使用的候选病毒。最后，作为野生型，减毒或灭活的生物和病毒，经由自然途径进入以后，可以引起疾病的其它微生物，是本发明的疫苗中使用的候选者。

[126]当病毒被使用在疫苗中，典型地，把病毒施用给动物，优选为哺乳动物，以及更优选为人。然而，本发明应该被理解为：包括将病毒、其它微生物或生物活性制剂施用给多种多样的动物，包括但不限定于猫、狗、马、母牛、牛、绵羊、山羊，鸟类例如鸡、鸭、鹅，以及鱼。

[127]目前，两种流行性感冒病毒疫苗在全球使用。这些是(i)灭活病毒的肌肉内注射，(ii)减毒病毒的鼻内施用。任一疫苗的施用诱导了对抗病毒的强抗体应答，其是保护性的，抵抗后来的病毒感染。

[128]有几条和任一疫苗相关的缺点，本文现在评述这些缺点。(a)诱导的抗体应答中和抗体应答本身，不能提供充足的保护以免于病毒后来感染。直接针对病毒的保护性CD8+T细胞应答也是需要的。在健康的具有对抗病毒的抗体的个体中，当用流行的感染毒株感染时，也可诱导这样的CD8+T细胞应答，但是不可能在免疫受损的个体或非常小的和非常老的个体中诱导这种应答。(b)在疫苗施用后，所诱导的抗体应答是对作为免疫原使用的病毒毒株高度特异性的。因此，为了使群体免疫，必须每年鉴定、制备和施用新的疫苗。如果在疫苗中使用的病毒毒株证明与在特定年份里流行的感染毒株是不同的毒株，那么流行性感冒病毒感染的发病率和死亡率将上升，原因在于该群体的大多数没有被保护而免于流行的毒株。(c)，需要的有效诱导对抗任何一个给定的年份里之流行性感冒病毒的保护性抗体应答的病毒数量是巨大的，生产是复杂的并且是非常频繁的，在需要充分免疫群体的相当大部分的时候，不能产生足够的疫苗。

[129]本发明的疫苗包括低剂量的活体感染性病毒，其通过皮内或皮下途径被施用给脊椎动物。皮下涉及位于皮肤真皮层和下面的肌肉组织之间的脂肪组织区域。皮内涉及位于表皮层和下面皮下脂肪层之间的真皮层。与皮下位点相比较，皮内位点包括巨大数目的抗原呈递细胞，并且提供更快释放至淋巴管。这可导致皮内和皮下注射位点之间，在免疫应答的类型和数量上、抗原/生物活性制清除和所需要的剂量上的差异。一旦阅读本公开内容，这将是十分明显的，即，使用本发明的疫苗比那些目前使用的疫苗具有几条优势。第一，本发明的疫苗给所有接受者提供保护性免疫应答，因为本发明的疫苗在接受者体内除了诱导了抗体应答，还诱导了CD4+和CD8+T细胞应答——这对于免于后来的病毒感染的更完整保护是非常重要的事情。第二，疫苗对于个体病毒毒株的特异性更不严格，因为被本发明疫苗所诱导的保护性CD4+和CD8+T细胞应答对于每个个体病毒血清型具有更低的特异性，鉴于流行性感冒病毒毒株的许多内部片段/基因共享抗原性T细胞表位。第三，低剂量的病毒是足够的，因此减小了与产生大量特定病毒相关联的困难。一旦流行的感染性毒株被分离，大量的疫苗可被迅速生产，因此可使易感人群的大部分，比现在可能的，更迅速地被免疫。第四，活病毒的单一注射激发出可被另外的免疫过程进一步强化的免疫应答。当前疫苗需要多次接种疫苗，以激发出保护性免疫应答。

[130]在本发明中用作疫苗的病毒，优选“活”病毒。然而，减毒病毒和死病毒，或者这些病毒的任意或全部的组合，或者诱导出CD8+细胞和/或抗体应答的任何生物活性剂，也是本发明所考虑包含的。在流行性感冒病毒的情形中，尽管已知的、或仍然处于未知的其它流行性感冒病毒也被包括在本发明中，但是被使用在疫苗中的病毒的类型优选地为甲型流行性感冒病毒。正如在本文其它地方讨论的，目前存在大量不同血清型的甲型流行性感冒病毒(influenza virus type A)，它们在人和其它动物中引起疾病和诱导免疫性的能力，很大程度上，被病毒的被膜中的HA和NA抗原之类型所决定。本发明应该被理解为包括具有病毒被膜中HA和NA抗原任意和全部组合的任意和全部病毒，而不管是否这些病毒毒株是在宿主的自然感染过程中产生的，是否通过不同物种感染的结果导致的HA和NA抗原的重排所产生的，或者通过重组手段所产生的，其中病毒的抗原组成或者是特别地设计的或者是通过随机重组所产生，只要这些是使用普通的分子生物学技术是可能的。优选地，在本发明中可用的流行性感冒病毒是在脊椎动物中能诱导出广谱CD8+T细胞和/或抗体应答的流行性感冒病毒。更优选地，病毒包括，但不限定于：流行性感冒病毒的那些潜在广泛流行的毒株(例如H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3或H7N7)、过去广泛流行的毒株(例如H2N2或H1N1)、或非广泛流行的病毒(例如H1N1、H1N2或H3N2)。

[131]如在本文其它地方谈到的，本发明不应该被理解为仅仅限定于活病毒作为疫苗的用途。减毒病毒，以及灭活病毒，或者减毒病毒、灭活病毒和活病毒的组合，也是预期可用的并且被本发明所包括的。其它的活体、灭活或减毒微生物也是预期可用的，并且被本发明所包括的。基于本文提供的公开内容，实施者可理解：在一个疫苗中不同形式的病毒的组合，在某些情况中，可在动物中同时加强体液和细胞免疫应答，该应答就针对广谱病毒血清型的保护而言是必须的。

施用的途径和频率：

[132]在本发明中，已经发现疫苗的施用途径对疫苗在动物中所诱导的保护性免疫应答的程度起作用。一旦仔细阅读了在实施例部分中提供的数据，这将是十分明显的，即在通过皮下或皮内途径被施以病毒的动物中，可得到免于后来的流行性感冒病毒攻击的更大程度上的保护性免疫力。因此，本发明的疫苗不能被理解为仅仅限定于这两种途径中的任意一种，流行性感冒病毒的皮下或皮内施用是优选的途径，并且也是非流行性感冒病毒或其它微生物或其它生物活性制剂的优选途径。然而，本发明也包括其它的施用途径，特别是优选非自然的途径。作为非限制性实例，肌肉内的、鞘内的、腹膜内的、鼻内的、直肠的、口的、肠胃外的、局部的、肺的、颊的、黏膜的和其它的施用途径，也包括在本发明中，用以把本发明的疫苗施用给动物，特别是如果在疫苗中包含的病毒不是流行性感冒病毒。根据需要对其免疫的致病病毒的类型和要被保护的身体部位，如果需要，可以结合或调整施用途径。

[133]为了评估任意特定病毒当用作疫苗时的最佳施用途径，可以遵循实验细节部分描述的方案，当然承认这些方案仅仅作为实例而被提供，并且它们不应该被理解为对本发明具有任何限制影响，该发明是本文描述的和要求保护的。这些实验确立了：活病毒的皮下和皮内疫苗接种诱导出非常有效力的直接针对流行性感冒病毒的免疫应答，甚至在非常低的病毒剂量下，而没有疾病的任何临床迹象的征兆。因此，这些实验确定：活病毒的皮下或皮内施用途径是免于流行性感冒病毒潜在广泛流行的有用的疫苗策略。

[134]病毒疫苗的剂量或者有效量可依赖下列因素，例如条件，选择的病毒，动物的年龄、重量和健康程度，并且病毒疫苗的剂量和有效量也可在动物宿主之间变化。施用给个体的本发明病毒的适当滴度，是这样的一个滴度，其能诱导对抗病毒的保护性免疫应答，包括抗体和T细胞应答。在把疫苗施用给个体之后，使用确定免疫效应细胞活性的测定法，来确定有效的滴度；或者通过使用众所周知的体内诊断测定法，监控治疗的有效性，来确定有效的滴度。

[135]疫苗被施用给动物，按照每天几次的频率，或者其可以以更低频率被施用，例如每日一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至更低的频率，例如每几个月一次，或甚至每年一次，或更低。理想地，疫苗施用给动物一次，或者至多两次。对于技能熟练的人员，剂量的频率是十分明显的，并且剂量的频率依赖于许多因素，例如，但不限定于，被免疫所对抗的疾病的类型和严重性，动物的类型和年龄，等等。

[136]病毒疫苗的免疫原性，也就是在动物中抗病毒抗体和CD8+T细胞应答的产生——其赋予保护动物免于致病病毒毒株的致死攻击——按照本文在实验实例部分所描述的进行确定。简言之，把疫苗施用给一群动物。在选择时段后，监控这群中某些动物的抗体以及CD4+和CD8+T细胞应答。用致病病毒攻击这群中的其它动物，并且监控病毒性疾病的任意症状的发展。通过对比在疫苗施用的动物中得到的结果和没有疫苗施用的对照动物中的结果，评估通过疫苗对动物产生的免疫应答和通过疫苗对动物赋予的后来被用病毒致病毒株进行攻击时的保护性效应。

III制剂：

[137]生物活性剂，例如，根据本文描述的方法学所制造的疫苗，可以以本文所描述的多种不同方式进行配制。

[138]生物活性剂的基本配制方法包括：将生物活性剂组合在药物载体中，这些药物载体，例如但不限定于化学成分，其可与生物活性剂相组合；以及，在组合以后，其可被用以把生物活性剂施用给动物。药物组合物也可包括任意生理学上可接受的酯或盐，其与药物组合物的任意其它成分具有生物相容性，并且其对欲被施用该组合物的动物是无害的。通过在药理学领域任意已知的或以后发展的方法，可制备本文描述的药物组合物的制剂。普遍来说，这些制备型方法包括使活性成分与载体、或一种或多种其它辅助成分相关联的步骤，然后，如果必要或期望，成形或包装产品成为期望的单一剂量单位或多剂量单位。

[139]在这些配方中，其它物质可被包括进来，用作与配方的成分形成共聚物、混合物或掺杂物，因此改变了配方的物理特性，并且进一步调整了包囊/释放的形式。这些制剂可包括如此物质，例如趋化因子，其吸引和保持抗原呈递细胞例如树突细胞，或者改变了抗原呈递细胞的行为，例如Toll样受体(Toll-like receptor(TLR))激动剂或拮抗剂。

[140]尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合凭处方施用给人的药物组合物，但是技术人员可明白这些组合物普遍适用于施用给各种动物。修饰适用于施用给人的药物组合物，以致制成适合施用给各种各样动物的组合物是很好理解的，并且普通的技术熟练的兽医药理学家可设计并实施这种修饰，即便需要实验，也是非常普通的实验过程。预期施用本发明的药物组合物的对象包括，但不限于人类和其它灵长类动物、哺乳动物——包括商业相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和狗，和其它脊椎动物，例如鸟类。

[141]本发明的药物组合物，可作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量，被大量制备、包装或出售。如本文所使用的，“单位剂量”是包含一个预先确定量生物活性剂的不连续量的药物组合物。生物活性剂的量，一般等于被施用给动物的生物活性剂的剂量，或者该剂量适宜的部分，例如诸如该剂量的二分之一或三分之一。

[142]作为本文公开的本发明的药物组合物被包括的某些制剂被设计，以便施用的生物活性剂被迅速地释放到周围的组织中，或者其随着时间缓慢释放。另外，本文公开的许多制剂具有另外的优点，其在一个温度保持生物活性剂，而在另一个温度释放生物活性剂。例如，包含在凝胶中的生物活性剂，在温度低于体温时，将被保持在凝胶中，但是当在体温下时，生物活性剂将被释放到周围组织中。进一步，本发明的生物活性剂可作为多剂量中的单一剂量被规划施用。本领域的技术人员基于施用的生物活性剂，可确定释放曲线和/或单一剂量对多剂量策略。进一步，可通过突然使包含生物活性剂的材料破裂释放生物活性剂，和/或通过改变条件——通过施加超声波、光或热的形式的能量，或产生pH改变——来调节释放。

[143]在下面描述的制剂之前，可任选地使用技能熟练的病毒学家众所周知的以及例如在Field Virology(见上文)描述的低压冻干技术，冷冻干燥或低压冻干生物活性剂、活病毒、减毒病毒或灭活病毒。

[144]生物活性剂的施用，例如施用给动物和人的活病毒疫苗，由于在注射过程中的病毒气溶胶化的潜在能力，潜在地引起对紧邻区域中的人员的健康威胁。为了解决这个问题，本发明包括新的输送制剂和仪器，其被设计用来处理有危害的生物活性剂的安全性问题，例如活病毒疫苗接种。另外，该制剂和输送仪器提供了可选的用于把生物活性剂释放到动物组织中的策略。例如，可使用持续释放剂型，或者可施用将生物活性剂直接释放到组织中的剂型。

[145]本文提供的为包囊载体，其包括用于包囊生物活性剂——例如活病毒——的非毒性的天然或合成的聚合物。优选地，这些聚合物有效的用于与微胶囊、纳米胶囊或纳米管结合的活病毒的微囊化作用或纳米囊化作用。更优选地，这些聚合物具有附加的特性，当其与生物活性制剂结合时，避免了生物活性制剂的气雾化，因此当被施用给动物时增强了活病毒疫苗的安全性。

[146]包囊载体包括但不限于：天然的和合成的聚合物，例如藻酸盐、透明质酸、黄原胶、吉兰糖胶、胶原蛋白、壳聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白、Matrigel^TM、Vitrogen^TM、聚甲基丙烯酸甲酯、聚[1-乙烯基-2-吡咯烷酮-共-(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)]、聚乙烯醇、聚(乙烯醇)(PVA)、聚环氧乙烷、丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸甘油酯、丙烯酸系共聚物(例如，TRISACRYL)；多糖，例如葡聚糖和其它粘度加强聚合物例，如羧甲基纤维素；聚乙二醇、聚乳酸及其共聚物。只要上述大分子的低聚组合物提供了充足的粘弹性质以抑制气雾化的形成，则其被包括在内。

[147]进一步，生物活性制剂本身可在被包入载体之前，被包含在本领域技术人员已知的任意微胶囊或纳米胶囊的形式中。这些容器包括但不限于脂质体、聚合微胶囊例如由多羟基酸组成的那些聚合微胶囊、水凝胶胶囊，或者微米管和纳米管。可选地，包含在凝胶中的生物活性物质可被装填到微胶囊、纳米胶囊或纳米管中。

[148]在一个实施方式中，把活病毒颗粒与包裹载体相混合，产生足够小可通过注射针头注射的包裹了病毒的胶囊。依靠使用的聚合物、病毒和施用途径，可最优化胶囊大小和胶囊内病毒的数量。

[149]在可选的实施方式中，在单剂量针或其它注射仪器中生成包含成为胶体的包裹载体和活病毒的圆柱体。这个过程在本文中被称为原位胶凝(或者原位凝胶化(in-situ gelation))。原位胶凝的方法提供了准备使用单位(即刻使用单位(ready-to-use unit)，其可皮下或皮内注射包裹有病毒的非常小的圆柱体。在该实施方式中，基于选定的疫苗输送途径，设计包裹载体，以便达到期望的凝胶强度，以致其在室温下保持固态可注射的凝胶，但是在体温下，或以预先编程的释放谱(release profile)释放包裹的病毒。根据使用的聚合物的种类、病毒和施用途径，可最优化针的大小、初始凝胶的浓度、移去圆柱体的手段和其中包含的病毒数量。

[150]为了达到期望的气溶胶化抑制性能、适当的粘弹性质和释放动力学，温度和pH是其它可能可以被改变的因素。而且，通过突然使该容器破裂释放生物活性剂，和/或通过改变条件——通过运用超声波、光或热形式的能量或产生pH改变——来调节释放，可控制由凝胶和微胶囊、纳米胶囊或纳米管组成的包裹载体释放生物活性剂。

[151]用于包裹活病毒的典型聚合物将在下面进行更详细的描述，且该聚合物包括但不限于藻酸盐、透明质酸、纤维素、葡聚糖和胶原蛋白基质。

[152]设计产生用于其它应用的包裹聚合物的方法学可适用于本发明，倘若当输送的病毒为活病毒时，在被包裹的状态下病毒不允许基本上失活和/或失去免疫原性。相似的限制运用到生物活性制剂，其中包裹作用必须保留期望的活性。

[153]术语“基本上失活”(substantially inactivated)是指病毒必须至少保持一些感染性，因此可感染和在宿主细胞中可复制。

[154]技术人员可理解本文描述的包裹载体不但可用于活病毒疫苗策略，而且也可用于把任意生物活性剂安全输送到对象。

[155]现在描述非限制性的包裹载体的实例。在本文其它地方的实验实施例部分，对产生包裹载体有益的实验条件和其在疫苗中的使用进行了充分的描述。本发明中有用的包裹载体，通过在施用期间抑制病毒的气雾化赋予了生物活性制剂一定的安全性。进一步，包裹载体有助于生物活性制剂之立刻或持续释放剂型的产生。另外，在施用以前，病毒可安全地储存在包裹载体中，不管生物活性制剂/包裹载体组合物是否在施用前预先填充到输送仪器里。

[156]本发明包括明胶聚合物作为用于本发明病毒疫苗的包裹载体的用途。在本发明的疫苗中可用的明胶浓度为在明胶比水大约0.05％到大约25％(w/w)的范围内变化，以及其间任意和所有的全部或部分整数。把病毒和各种浓度的明胶相混合，把所产生的溶液负载到输送仪器，例如但不限于针或注射器。先于负载期间或在负载之后，遵循本领域已知的步骤诱导明胶的凝胶化。在本发明中使用明胶的优点是如此事实，在没有任何附加的化学试剂下，明胶的交联可发生，因为作为交联剂，交联过程只要通过温度就可发生。

[157]把病毒明胶混合物接种到动物，并且按照本文其它地方更充分描述的，评估对免疫反应的影响。优选地，明胶被低压冻干，为了对其灭菌，明胶被用γ射线辐射或其它的灭菌方法。可改变被使用的明胶的浓度，这一点依赖于在施用给动物以后，所期望的病毒从凝胶释放的速率；并且，一旦知晓本发明，对技术人员来说，欲被使用的明胶浓度是明显的。

[158]任选地，共聚物、聚合物混合物或掺杂物，例如，但不限于聚乙二醇(polyethylene glycol(PEG))，可与明胶共同使用。PEG的作用是减低从明胶的水损失。在大约500到大约50,000的范围内变化PEG大小在发明中是可用的，以及其间任意和所有的全部或部分整数，优选的分子量为大约100、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000和10,000的PEG。在明胶病毒混合物中，PEG可被以大约为0.1-20％w/w的PEG/明胶被包括，尽管这个范围可根据许多因素而变化，这些因素包括但不限于明胶的强度、疫苗中使用的病毒、递送途径和类似条件。因此0.1-20％w/w的PEG/明胶的范围应该被理解为包括其间任意的全部或部分整数。

[159]包含胶原蛋白凝胶的包裹载体也可被用于本发明。按照本文其它地方描述的，可合成和表征胶原蛋白凝胶。在用于疫苗生产的凝胶中可用的胶原蛋白的浓度，可在大约0.5到大约50mg/ml胶原蛋白溶液中以及其间任意和所有的全部或部分整数内变化。使用技能熟练的技术人员众所周知的技术可实现胶原蛋白的交联，胶原蛋白的交联在本文其它地方被更充分地描述。

[160]把病毒胶原蛋白混合物接种到动物，并且按照本文其它地方更充分描述的，评估对免疫反应的影响。优选地，胶原蛋白被低压冻干，并且为了对其灭菌，可用γ射线辐射胶原蛋白。可改变被使用的胶原蛋白的浓度，这依赖于在施用给动物以后所期望的病毒从凝胶释放的速率，并且一旦知晓本发明，对技能熟练的人员来说，被使用的胶原蛋白的浓度是十分明显的。

[161]任选地，共聚物、聚合物混合物或掺杂物，例如但不限于聚乙二醇(PEG)，可与胶原蛋白共同使用。在大小为大约500到大约50,000的范围内变化的和其间任意和所有的全部或部分整数的PEG在发明中是可用的，优选的分子量为大约100、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000和10,000的PEG。在胶原蛋白病毒混合物中，在大约为0.1-20％w/w的PEG/胶原蛋白下，PEG可被包括进来，尽管这个范围可根据许多因素而变化，这些因素包括但不限于胶原蛋白的强度、疫苗中使用的病毒、传送途径和类似条件。因此0.1-20％w/w的PEG/明胶的范围，应该被理解为包括其间任意的全部或部分整数。

[162]本发明的包裹载体也可包括藻酸盐。根据其分子量，变化粘度的藻酸盐是可获得的。也可通过改变藻酸盐的浓度和类型，生产不同粘度的溶液。通过改变本文实验部分描述的离子交联剂的浓度和类型，可产生各种强度的交联凝胶。不同类型的藻酸盐也包括那些在聚合物主链里具有不同古洛糖醛酸：甘露糖醛酸比率的组合物。评估用于本发明的最优化的藻酸盐组合物的方法在本文实验实施例部分被提到。

[163]典型地，藻酸盐浓度在大约0.1％到大约20％的藻酸盐，以及其间任意的全部或部分整数的范围内变化。根据使用的藻酸盐的类型，优选浓度包括大约0.5％、1％或1.5％或2％或直到20％的藻酸盐。藻酸盐可与其它的聚合物——例如壳聚糖——相结合以产生具有期望特性的凝胶。其也可与聚阳离子相互作用，例如聚L-赖氨酸。修饰的藻酸盐也可用，例如PEG-藻酸盐。

[164]如本文其它地方讨论的，优选的疫苗是这样的疫苗，载体包含凝胶、溶液或粉末，负载入微胶囊、纳米胶囊或纳米管。因此，本发明包括一到几百微米级别尺寸大小的微胶囊的合成和负载，优选的大小为10-100微米。本发明也包括一维是在从1纳米以下直到一微米的纳米胶囊的合成和负载，优选的大小为100纳米到1微米。本发明也包括纳米管的合成和负载，其中纳米管具有直径为大约1纳米到1000纳米的范围，优选地，为20到500nm，以及其间任意和所有的全部或部分整数。直径超过200nm的纳米管有助于如此结构的产生，其可保持和释放流行性感冒病毒大小的颗粒。用于本发明的优选的纳米管是多壁纳米管(multi-wallnanotube(MWNT))。使用技能熟练的技术人员可获得的技术，和例如Miller等(Miller et al.，2001，J.Amer.Chem.Soc.123：12335-12342)公开的技术，可合成纳米管。

[165]负载到本发明的纳米管中的病毒不应该有一点扩散出管腔。优选地，用比水粘度更高的液体负载纳米管。进一步，可用包裹在凝胶或包含在粘性或半粘性溶液中以及本文其它地方描述的，例如在明胶、胶原蛋白、藻酸盐或其它凝胶中的病毒负载纳米管，这些凝胶可在体温下把病毒释放到周围组织，因此给本发明的疫苗赋予了附加的安全性和其它优点。可用粉末，例如，但不限于冷冻于燥的生物活性剂，负载纳米管。使用本发明描述的任意仪器，或使用其它可产生期望的保持输送安全性效应的仪器，内部负载有生物活性剂包裹凝胶的纳米管可被安全施用。可选地，用生物活性剂负载的纳米管可被包裹入凝胶，然后使用下面更充分描述的各种各样装置输送。

IV装置：

[166]本发明包括使用多种装置存储和施用生物活性剂给动物，优选地为哺乳动物，更优选地为人。这些装置包括，但不限定于，针、注射器、导管、基因枪、贴剂、纳米管、贴剂、黏膜施用器和类似物，用期望的生物活性制剂剂型将它们预先负载，也就是在把相同的生物活性制剂施用给动物之前，或者在把活性生物制剂施用给动物之时，用生物活性制剂疫苗将它们负载。

[167]本发明包括任意和所有的如此装置的使用，该装置包括目前已知的或将被发现的，它们施行穿透动物组织以及把制剂输送到动物内在组织的功能。因此，本发明包括任意和所有的单个或多个针、注射器、针头注射器联合体、基因枪和类似物。

[168]可用生物活性制剂单独或如本文所述被包裹的生物活性制剂，负载这些装置中的每一种。这些装置的负载可在把制剂施用给动物之前立即进行，或者这些装置的负载可能在别的地方进行，然后储存此装置直到运输和使用。

[169]如本文其它地方描述的，优选的疫苗为负载到纳米管内的疫苗。因此本发明包括碳纳米管的合成和负载，其中纳米管的直径范围为大约50nm到250nm，以及其间任意和所有的全部或部分整数。较大直径的纳米管有助于如此结构的产生，其可保持和释放流行性感冒病毒大小的颗粒。用于本发明中的优选的纳米管为多壁纳米管(NWNT)。使用技能熟练的技术人员可获得的技术和例如Miller等(Miller et al.，2001，J.Amer.Chem.Soc.123：12335-12342)公开的技术，可合成纳米管。负载到本发明的纳米管中的病毒不应该有一点可感知地扩散出管子的腔。优选地，用比水粘度更高的液体负载纳米管。进一步，可用包裹在水凝胶中以及本文其它地方描述的，例如在明胶、胶原蛋白、藻酸盐或其它水凝胶中的病毒负载纳米管，这些水凝胶可在体温下把病毒释放到周围组织，因此给本发明的疫苗赋予了附加的安全性和其它优点。

V方法：

[170]另外，本发明包括了在脊椎动物，优选人中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答的方法。该方法包括把包含CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗施用给脊椎动物，因此在脊椎动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答。被施用给脊椎动物的病毒为呼吸道病毒，并且优选为甲型流行性感冒病毒。施用途径为任意途径，当病毒为甲型流行性感冒病毒时，优选的施用途径为皮下或皮内。使用本文其它地方描述的任一装置，病毒可以如本文所定义的术语药物上可接受的组合物的形式施用，或者以任意的胶囊剂型施用。根据在本文实验实施例中公开的方法，确定是否在脊椎动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体应答。

[171]本发明也包括的是保护脊椎动物免于病毒感染的方法。该方法包括把包含CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗施用给脊椎动物，因此在脊椎动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，进而保护脊椎动物免于感染。被施用给脊椎动物的病毒为呼吸道病毒，并且优选为甲型流行性感冒病毒。施用途径为任意途径，当病毒为甲型流行性感冒病毒时，优选的施用途径为皮下或皮内。使用本文其它地方描述的任一装置，病毒可以如本文所定义的术语制药学上可接受的组合物形式施用，或者以任意的胶囊剂型施用。保护脊椎动物免于后来的病毒感染被描述在本文其它地方。

[172]进一步包括的是在脊椎动物中预防病毒感染的方法。该方法包括把包含CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗施用给脊椎动物，因此在脊椎动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，进而在脊椎动物预防了病毒感染。被施用给脊椎动物的病毒为呼吸道病毒，并且优选为甲型流行性感冒病毒。施用途径为任意途径，当病毒为甲型流行性感冒病毒时，优选的施用途径为皮下或皮内。使用本文其它地方描述的任一装置，病毒可以如本文所定义的术语药学上可接受的组合物形式施用，或者以任意的胶囊剂型施用。

[173]另外，包括了在脊椎动物中治疗病毒感染的方法。该方法包括把包含CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量的病毒的疫苗施用给脊椎动物，因此在脊椎动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，进而治疗脊椎动物的感染。被施用给脊椎动物的病毒为呼吸道病毒，并且优选为甲型流行性感冒病毒。施用途径为任意途径，当病毒为甲型流行性感冒病毒时，优选的施用途径为皮下或皮内。使用本文其它地方描述的任一仪器，病毒可以如本文所定义的术语药学上可接受的组合物的形式施用，或者以任意的胶囊剂型施用。本发明的这种方法特别适用于大流行性疾病事件，特别是在人群中。为了治疗人并且预防更严重的疾病，疫苗可在症状发作时施用给人。

[174]本发明也包括了当把生物活性制剂施用给动物时，提高安全性的方法。该方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的生物活性制剂的组合物施用给动物，其中，生物活性制剂通过在动物内不会引起疾病的途径施用后，生物活性制剂在动物中诱导了免疫保护的CD8+T细胞和/或抗体应答，进一步，其中生物活性制剂被包裹在包裹载体中。

[175]也包括了当把生物活性制剂施用给动物时，增加安全性的方法，这里，该方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量生物活性制剂的组合物施用给脊椎动物。在把生物活性制剂通过在动物内不会引起疾病的途径施用后，生物活性制剂在动物中诱导了免疫保护性的CD8+T细胞应答。

[176]在这些方法中的每一个中，生物活性制剂被包裹在包裹载体中，并且生物活性制剂选自微生物和蛋白质。

[177]也包括了当把生物活性制剂施用给动物时，增加安全性的方法。该方法包括把包含一定量的生物活性制剂的组合物施用给动物，该生物活性制剂在动物内诱导了期望的应答，同时减少了危险。生物活性制剂的施用途径是在动物内不引起疾病的途径，并且进一步生物活性制剂被包裹在包裹载体中，因此当施用生物活性制剂时，增强了安全性。

[178]本发明的每一个方法可以在任何动物上施行，优选在人上施行，包括非常老的、非常小的和任何其他免疫受损的人，以及健康的人群。

VI其它组合物：

[179]本发明进一步包括包含生物学上有效量的生物活性剂的组合物，其中，生物活性剂通过在动物内不会引起疾病的途径施用后，生物活性剂在动物中诱导了期望的应答，同时减少了动物中的危险。优选地，途经是非自然的途径，更优选地，途经选自皮下、皮内、肌肉内、粘膜和口。

[180]组合物中的生物活性剂可包裹在包裹载体中，其也可在被包裹入包裹载体之前，与纳米管、脂质体或蛋白质相结合。包裹载体为选自凝胶、液体或粉末中的至少一个成员，并且其也可被负载到微胶囊、纳米胶囊或纳米管中。包裹载体可包含聚合物，优选地，该聚合物在施用给动物时是没有毒性的。优选地，聚合物与生物活性物质相缔合，因此延迟了把生物活性制剂释放到周围环境。更优选地，聚合物是凝胶。优选地，生物活性制剂选自微生物和蛋白质。

VII试剂盒：

[181]本发明包括多种包含本发明生物活性制剂和疫苗的试剂盒。在本发明的试剂盒中也包括的是说明书材料，其描述了本发明的方法中的疫苗的使用。尽管典型的试剂盒在下面进行了描述，但是根据本公开内容，其它可用的试剂盒的内容对技能熟练的技术人员来说是十分明显的。这些试剂盒中的每一个被包括在本发明内。

[182]本发明包括了在下列方法中使用的试剂盒：在脊椎动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答；用于保护脊椎动物免于病毒的感染；用于预防脊椎动物中的病毒感染；以及用来在脊椎动物中治疗病毒感染。

[183]本发明的试剂盒包括：装置，其可用准备施用给动物的生物活性制剂预先负载；和，用于其使用的说明书材料。可选地，试剂盒包含装置、可以是冷冻干燥的或可以不是冷冻干燥的生物活性剂的制备物、悬浮生物活性剂的溶液和说明书材料，该说明书材料用于组合该装置、生物活性剂和溶液，并且进一步包括关于把相同的生物活性剂施用给脊椎动物，优选施用给人的说明书。生物活性剂可悬浮于药学上可接受的载体中，任选地，包括胶囊剂型。预先负载的装置可以是针头、注射器、针头注射器的组合体、或纳米管、或前述的任意组合。

实施例

[184]通过参考下面的实验实施例，进一步详细描述了本发明。提供这些实施例仅仅作为示例性说明的目的，并不拟被限定于此，除非另外特殊说明。因此，本发明绝不应该理解为仅仅限定于下述实例，而应该理解为包括任意和所有变化，该变化明显的是作为本文提供的教导的结果。

[185]在本发明中有用的实验方法在下面首先予以描述。

动物、抗体和流行件感冒病毒感染

[186]在IACUC同意下，进行了动物研究。无特定病原体的8-12周大的C57BL/6J(B6)野生型鼠可从Jackson Laboratories(Cincinnati，OH)获得。C57Bl/10SgSnAiRag^-/-γc^-/-(以后表示为Rag-/-γc-/-)和C57B1/10雌鼠可从Taconic(Germantiwn，NY)获得。所有鼠被养在Drexel University的Drexel UniversityCollege of Medicine的AAALAC认证的屏障设备里。作为常规，每组中包括9只动物。在本实验中，使用甲型流感/Puerto Rico/8/34(PR8)病毒毒株(H1N1)和A/Aichi/2/68与A/Puerto Rico/8/34的X31重组毒株(H3N2)。这些病毒毒株表达不同的表面血凝素(H)蛋白质和神经氨酸酶(N)蛋白质，因此对这些病毒的抗体应答并不彼此交叉反应，这在动物被再次攻击的实验中是重要的。在不同的毒株之间，这些病毒的六个内部基因是相似的，因此允许在再次攻击实验中评估CTL应答。通常地，用12个血细胞凝集单位(HAU)的病毒毒株X31经鼻内感染鼠。在再次应答的情况下，用PR8毒株(1000HAU)经过IP注射鼠，然后用12HAU的X31毒株经鼻内再次攻击鼠。使用A/Equine/London/1416/73病毒(H7N7)施行安全性和再次攻击的研究，这种病毒在鼠中具有高度致病性。肺和脾单核细胞的制备、NP₃₆₆特异性CD8+T细胞的表型分析、细胞质内细胞因子染色、流式细胞计量测量、细胞毒性测试、抗病毒抗体滴度分析和肺部病毒滴度分析，按照先前描述(Halstead et al，2002，Nat.Immunol.3：536-541)施行。

肺、脾单核细胞的制备

[187]在1mg/ml的胶原酶A(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)和40U/ml的DNAse(Sigma，St Louis，Mo)中，在37℃下，消化肺90分钟，所形成的组织通过100μm的尼龙网，然后被洗涤。使用Comingware Glass组织破裂器(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，把脾搅匀成单细胞悬液。然后使用Hystopaque1083(Sigma，St Louis，Mo)，通过密度梯度离心，从肺和脾的悬液中分离获得淋巴细胞。

NP₃₆₆特异性CD8+T细胞的表型分析和测量

[188]用APC标记的NP₃₆₆四聚体对细胞染色。也使用FITC-、Cy5PE-和PE-偶联的针对表面标记的抗体的组合，在冰上共染色细胞30分钟，即抗CD3-PE(Becton Diekinson，San Jose，CA)、抗CD8-FITC(eBioscience，San Diego，CA)和抗CD4-CyChrome(Cy5PE)(eBioscience)。在洗涤和在多聚甲醛中固定之后，使用FACS Calibur(BD Biosciences)和FlowJo软件(Treestar，San Carlos，CA)通过流式细胞计量术分析2×10⁵个细胞。在一些情况下，使用3-激光器FACSAria高速细胞分选仪(BD Biosciences)，施行针对NP₃₆₆特异性CD8+T细胞的多达10种颜色的分析。

生物素化的H-2D^b/β2m/肽复合体

[189]按照(Airman et al.，1996，Science 274：94-96)描述的，生产生物素化的H-2D^b/β2m/肽复合体。把H-2D^b限制性甲型流行性感冒核蛋白NP(366-374)优势免疫表位(ASNENMETM(SEQ ID NO：1))(Townsend et al.，1986，Cell44：959-968)复合入H-2D^b，以产生这些研究中使用的NP₃₆₆四聚体。

细胞毒性分析

[190]通过用1μg/ml的甲型流行性感冒肽NPP_366-374、NS2_114-121、Ml_128-135和PA_224-233在37℃下温育6小时，用肽负载EL-4细胞(ATCC)。温育之后，洗涤细胞并用Na₂ ⁵¹CrO₄(NEN，Boston，MA)在37℃下标记细胞75分钟，然后再次洗涤细胞。然后，这些EL4细胞以10⁴(100μl)/孔，被加入到96孔圆底微量滴定板(Falcon，Becton-Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ)。然后以100∶1、50∶1、25∶1和10∶1的比率铺板效应细胞和靶细胞，然后在37℃下温育6小时。然后平板被离心，并且30μl的上清液被转移到96孔LumaPlates(Packard，Meriden，CT)；并且在TopCount微量培养板闪烁计数器(Packard)中计数。可使用下列公式确定比细胞毒性：

比裂解％＝(实验CPM-自发CPM)/(最大CPM-自发CPM)×100

通过使用5％的Triton X-100(Sigma，St Louis，MO)裂解靶细胞，确定最大⁵¹Cr的释放。使用单独温育在培养基中的靶细胞，确定自发⁵¹Cr的释放。

胞浆内细胞因子染色

[191]为了进行胞浆内细胞因子染色，用10μg/ml的NPP_366-374、NS2_114-121、Ml_128-135和PA_224-233肽、抗CD3抗体或PMA(25ng/ml)+离子霉素(1μg/ml)，在存在2.5μM莫能霉素(Monensin)情况下，刺激10⁶/ml/孔的肺淋巴细胞、脾单核细胞、或纯化的CD8+T细胞5小时；然后用4％的多聚甲醛，在4℃下，固定10分钟。洗涤细胞两次，并且用0.1％的皂苷(Saponin)，在4℃下，透化处理10分钟。然后洗涤细胞，并且用抗IFNγ抗体(eBioscience)在4℃下培养30分钟。洗涤细胞，并在1％多聚甲醛中固定，然后在FACS Calibur(BD Biosciences)上收集2×10⁵个结果，并且用FlowJo软件进行分析。

流行性感冒病毒滴度分析

[192]搅匀肺，并且在1500xg离心匀浆15分钟后收集病毒上清液，将上清液冷冻于-80℃直到后来分析。病毒上清液的稀释液被加入到3×10⁴个Madin Darby犬肾(MDCK)细胞/孔的96孔U底平板。在37℃下，感染MDCKs 24小时以后，从每个培养孔(MDCK是粘附细胞)中吸出培养基，并加入无血清的培养基。四天后确定病毒滴度，是通过使用已知病毒浓度的标准曲线和TCID的Reed-Munch法计算，通过确定上清液不再凝聚鸡红血球细胞时的稀释度进行确定。第二种可用于测量病毒滴度的方法，为按照先前描述的(Ward et al.，2004，J.Clin.Virol.29：179-188)利用实时PCR。

强免疫反应的鉴定

[193]用来鉴定一旦把疫苗施用给鼠的强免疫反应的具体标准为：当使用流行性感冒病毒进行鼻内再次攻击时，应该在再次攻击的第七天观察到肺中的全部CD8+T细胞中有20％以上NP₃₆₆特异性CD8+T细胞的诱导，或者观察到NP₃₆₆特异性CD8+T细胞在1×10⁶个以上，和/或血清中和抗体的效价在1/500以上(在血细胞凝集抑制试验中)。先前没有被免疫的自然鼠通常在感染的第七天，在肺中表现3％以下的NP₃₆₆特异性CD8+T细胞和在10⁵个以下的NP₃₆₆特异性CD8+T细胞。

统计分析

[194]使用Mann-Whitney U检验、用于成对数据的Wilconxon的符号秩检验、学生t检验和使用JMP统计指导(SAS Institute Inc.，Cary，NC)的Spearman’s rho相关性，来分析数据。

安全性

[195]任何疫苗的安全性可在野生型动物和Rag-/-γc-/-动物中进行检验。通过检测动物总体外观、重量减轻以及通过评估肺和其它组织的病理学，来评价安全性。使用实时PCR，评估从肺、脾、肝和脑获得的病毒载量。使用PR8和A/Equine/London/1416/73 H7N7病毒(伦敦毒株)，在SQ或ID施用活病毒后，可进行这些研究。每组中包括9个动物。高度致病性的A/Equine/London/1416/73病毒的使用——当鼻内施用后，其可引起全身性和脑部感染(Kawaoka，1991，J.Virol.65：3891-3894；Christensen et al.，2000，5 J.Virol.74：11690-11696)——提供了用于评估SQ和ID施用病毒的一个非常严谨的检验。每天观察动物并给动物称重，长达30天。用1、0.1、0.01和0.001 HAU的病毒经ID或SQ使动物免疫，动物被观察30天。动物被评估临床体征和重量损失。通过视觉检查，动物每天被监控两次。动物被每日称重。当满足下列标准时，动物被移走：1)对外部刺激没有应答，2)平卧超过1小时，3)费力的呼吸，4)持续的振颤，5)动物持续的蜷曲身体。记录所有的观测结果。移去的动物在生存分析中被算为非生存的。死亡不是这些研究的终点。动物被观察30天。当疫苗没有诱导动物产生超过5％的重量损失时——其在这种测量的实验误差范围内，并导致90％的动物存活——疫苗被认为是安全的。

病毒感染和施用途径

[196]为了研究活病毒免疫接种，研究了施用途径对抗病毒CD8+T细胞应答的影响。用甲型流行性感冒病毒的PR8毒株，通过腹膜内(intraperitoneally(IP))、肌肉内(intramuscularly(IM))、皮内(intradermally(ID))或皮下(subcutaneously(SQ))免疫八周大的鼠，并且用流行性感冒病毒的X31毒株在30-45天后经鼻内再次攻击鼠。在再次应答的顶峰(第七天)，鼠被处死，并且检测流行性感冒病毒核蛋白(NP₃₆₆)病毒特异性CD8+T细胞应答。图1描述了通过ID和SQ途径的病毒施用，在肺部导致了比用IM和IP途径施用病毒更强的病毒特异性CD8+T细胞应答。图1中表示的数为平均值±SE，ID和SQ途径分别为5.04±1.17×10⁶和5.71±0.79×10⁶病毒特异性CD8+T细胞，相对地，IP和IM途径分别为3.65±1.21×10⁶和3.41±0.18×10⁶病毒特异性CD8+T细胞。这些结果表明活病毒的免疫途径影响了总的抗病毒CD8+T细胞应答的程度，并且ID途径诱导了最有效应答。最重要的是，观察到：使用ID或SD途径把活流行性感冒病毒施用给鼠，不会在动物内导致临床疾病。接下来，施行剂量反应研究，以确定在免疫应答中观察到的差异在更低剂量的病毒中是否明显。使用渐减的病毒浓度，鼠被通过IP或ID注射施用活的流行性感冒病毒。然后，检测对流行性感冒病毒第二次的再攻击产生的病毒特异性应答。描述了在IP和ID启动的鼠的肺部中，肺病毒特异性CD8+T细胞(NPP+CD8+)的代表性的FACS图，该图被表示在图2中。通过测量MHCI类四聚体(在高剂量为3.65±1.21×10⁶个细胞，在低剂量仅为0.35±0.11×10⁶个细胞)和产生NP₃₆₆肽特异性INFγ的CD8+T细胞(在高剂量为2.81±0.1×10⁶个细胞，在低剂量为0.18±0.05×10⁶个细胞)，(发现)减少被IP施用给鼠的活流行性感冒病毒的剂量导致在肺中的病毒特异性CD8+T细胞数量的下降。减少被ID施用的活流行性感冒病毒的剂量导致了抗病毒CD8+T细胞应答的增加(在高剂量为5.01±1.18×10⁶个细胞，相对的，在低剂量为7.2±0.46×10⁶个细胞，病毒特异性CD8+T细胞；在高剂量为4.06±0.79×10⁶个细胞，相对的，在低剂量为4.83±0.24×10⁶个细胞，INFγ产生CD8+T细胞)。因此，IP施用低剂量的活流行性感冒病毒，诱导了弱的病毒特异性CD8+T细胞应答，但是ID施用同样的剂量，又诱导出非常强的病毒特异性CD8+T细胞应答。这些结果表示：对比于活流行性感冒病毒的IP施用，ID施用增加了诱导病毒特异性CD8+T细胞应答的效率，并且这些结果表明：当使用ID或SQ途径时，非常低剂量的活病毒可诱导出非常有效的应答。

[197]为了进一步对比ID和SQ免疫接种，用低剂量(1HAU)的活甲型流行性感冒病毒毒株PR8(HlN1)，通过腹膜内(IP)、皮下(SQ)或皮内(ID)使八周大的C57B1/6J鼠接受免疫，并且用流行性感冒病毒杂合亚型X31(H3N2)在45天后经鼻内再次攻击鼠。在再次攻击以后，在再次应答的顶峰(在再次攻击后第七天)，鼠被处死。使用由跨越366-374位氨基酸(ASNENMETM(SEQ ID NO1))的肽(NP₃₆₆)负载的MHC I类四聚体，评估NP₃₆₆特异性CD8+T细胞应答，该肽与从NP获得的优势免疫表位相符合(Flynn et al.，1998，Immunity 8：683-691)。基于回收的NP特异性CD8+T细胞的百分比和总数目(图3A)，当对比于通过IP途径使鼠免疫时，ID和SQ施用途径，在被再次攻击的鼠的肺中，导致了较强的免疫应答。从SQ(n+6)或者ID(n+6)免疫的鼠的肺部，分别回收NP₃₆₆特异性CD8+T细胞，浓度为3.76±3.7×10⁶和5.8±4.3×10⁶个细胞。相反，从IP免疫的鼠中(n＝5)(图3B)，仅回收了1.9±1.6×10⁶个NP特异性CD8+T细胞。这些结果表明低剂量的活病毒诱导出强CD8 T细胞应答，特别是当通过ID或SQ输送时。记住在人体中的SQ免疫接种更容易施行，已经决定这种输送途径将被用来进行疫苗功效和安全性的最初检验。

[198]为了检验活病毒的SQ施用是否在宿主动物中诱导了疾病，野生型C57Bl/BJ鼠，和缺乏T、B、NK细胞的鼠(品系C57Bl/10SgSnAiRag^-/-γc^-/-，此后表示为Rag-/-γc-/-)被免疫。后一种鼠对病毒，不能进行NK介导应答或适应性免疫应答。在皮下施用1HAU的活PR8病毒之后，在30天的时期内，Rag-/-γc-/-和C57Bl/6J鼠都没有表现感染的任何迹象，另外，没有任何一组鼠损失重量，重量损失象征活动性病毒感染。为了检验100HAU活PR8病毒的剂量在Rag-/-γc-/-或C57Bl/6J鼠中能否诱导疾病，用100HAU PR8流行性感冒病毒使五只Rag-/-γc-/-鼠和五只C57Bl/6J鼠免疫，并且在连续17天内记录它们的体重。比常规免疫接种建议的病毒剂量高100倍的病毒剂量的SQ注射也是安全的，并且在C57Bl/6J或Rag-/-γc-/-鼠中没有诱导体重损失(图4)。然而，用1HAU PR8流行性感冒病毒鼻内(IN)感染C57Bl/6J，诱导了感染并且诱导了C57Bl/6J鼠(n＝5)愈来愈严重的重量损失，在感染后，重量损失在第6天开始，顶峰在第10天，这些正如所预期的。从鼻内感染后的第11天开始，C57BL/6J鼠开始恢复(图4)。

[199]迄今为止的数据进一步表明：用于把活病毒施用给哺乳动物的SQ途径不会在野生型或免疫缺陷鼠中引起活动性病毒感染或系统性疾病。因此，这种施用途径被认为是安全的。不希望被原理所限制，这些发现支持了如此研究，这些研究暗示在用流行性感冒病毒系统感染期间，控制点是呼吸感染后的病毒血症的水平(Lu et al.，J.Virol.73：5903-5911)。这些数据也支持了这样的假设，经一个可选、非自然的途径施用活病毒不会导致明显的疾病，除非施用通过直接的静脉内途径(Swayne and Slemons，1994，Vet.Pathol.，31：237-245)。

另外的安全性数据

[200]现在介绍另外的支持活病毒疫苗策略可行性和有效性的数据。已经使用高度致病的流行性感冒毒株(伦敦毒株)检验了活流行性感冒病毒策略。所得到的数据确定把病毒皮下输送到哺乳动物是安全的。另外，数据确立：包裹在藻酸盐凝胶中的活流行性感冒病毒，在接受者哺乳动物中诱导出有效的流行性感冒特异性的CD8+T细胞应答。重要地，数据进一步确立皮下把活病毒施用给哺乳动物诱导出抗体应答，其中在施用单剂量病毒之后，在哺乳动物中诱导了中和抗体滴度。另外，本文提出的数据确立可用包含50nm大小的量子点(Quantum dots(QDots))的藻酸盐凝胶负载纳米管，因此表明把病毒和藻酸盐负载入纳米管是可行的。进一步，本文确立了：在本文其它地方描述的条件下，超声处理(sonnication)把纳米管打断成较小的，更优选的片断。

[201]关于皮下输送活流行性感冒病毒进入Rag-/-γc-/-(不具有T细胞、B细胞或NK细胞的鼠)和野生型鼠的安全性的另外数据，被描述在下面。在图5中，用PR8流行性感冒病毒或者高度致病性的A/Equine/London/1416/73 H7N7病毒(伦敦病毒株)的新的并且更有效力的分批培养物，感染野生型和Rag-/-γc-/-动物(在所有组中，n＝5)。用0.1HAU的PR8或伦敦毒株鼻内感染的野生型动物，表现了流行性感冒病毒感染的症状，并且它们失去了高达30％的体重。这时候，当某些动物濒死时，对它们施行安乐死。相反地，当Rag-/-γc-/-鼠(图5)和野生型动物被用10HAU活病毒(即为在鼻内感染中所使用剂量的100倍)皮下接种时，在它们被观察的超过三十天的时间内，它们都没有损失任何重量，并且它们没有表现疾病的迹象。这些数据确立：病毒的施用途径对于接种过程的安全性是重要的。

在明胶聚合物凝胶中输送的疫苗的有效性和安全性

[202]为了检验基础前提——在聚合物凝胶中的活病毒可保持它的免疫原性，在30℃下，将PBS中的活PR8流行性感冒病毒(10HAU/μl)与3％(w/w)的明胶溶液混合，并且将其负载到1ml的注射器中。确定明胶/病毒比率，以致每100μl明胶中包含约10个HAU的活病毒。通过在冰上温育注射器30分钟，诱导了明胶的凝胶化。用混合有活病毒(n＝2)的100μl明胶或仅仅100μl明胶(n＝2)，经皮下使C57Bl/6J鼠被免疫。作为对照，用10个HAU的PR8活病毒经皮下免疫一组C57Bl/6J鼠(n＝2)。免疫接种之后30天，将已经接受过明胶中活病毒的鼠，用活流行性感冒病毒毒株X31经皮鼻腔再次攻击。在再次免疫反应的顶峰(在再次攻击后七天)，评估从遭到再次攻击的鼠的肺(图6A)和脾(图6B)中分离的NP特异性CD8+T细胞的频率和总的数量。在用包含在明胶凝胶中的10HAU的活病毒(3％w/w)或单独10HAU活病毒皮下免疫的鼠的肺中，有CD8+T细胞的大量积累(百分比被写在CD8+T框之外，图6A)，其占存在的淋巴细胞总数量的大约30％-40％。而且，从仅接收到病毒或接收到包含在明胶凝胶中的病毒的鼠之肺中分离的CD8+T细胞的大约一半，是对免疫优势NP₃₆₆病毒表位具有特异性的(百分比被写在NP₃₆₆特异性CD8+T细胞框之内，图6A)。相反地，在仅接受明胶的鼠中，浸润肺的CD8+T细胞的数量仅占存在的全部淋巴细胞的大约17％，且存在的NP₃₆₆特异性CD8+T细胞的百分数仅为2％，这一点与对病毒初次免疫应答的第七天一致(图6A)。当对用包含在明胶中的活病毒免疫的鼠的脾进行检测时，大约10％的CD8+T细胞为NP₃₆₆特异性CD8+T细胞(图6B)。相反地，在仅用病毒免疫的鼠中，总CD8+T细胞的大约22％是NP₃₆₆特异性的。在用明胶免疫的鼠的脾中，NP₃₆₆特异性的CD8+T细胞的百分数为1％以下(图6B)。

[203]进行下一组实验，以确定用掺和在明胶凝胶中的活病毒免疫接种而诱导的NP366特异性CD8+T细胞，在当其被肽抗原刺激时，是否是具有功能的、并且产生IFNγ。从未处理的鼠，或单独用病毒、包含在明胶中的病毒或明胶单独免疫的鼠中的全部脾细胞，在存在NP_366-374肽和布雷菲德菌素A(BrefeldinA)的情况下，在培养基中，被刺激6小时。使用荧光染料偶联的抗IFNγ抗体——该抗体结合用肽刺激超过六小时而聚集在细胞内的IFNγ——通过流式细胞计量术，评估IFNγ的产生。一旦用NP_366-374肽在体外刺激，在用包含在明胶凝胶中的活病毒免疫的鼠的脾中有大约8％的CD8+T细胞，以及在用活病毒单独免疫的鼠的脾中有大约17％的CD8+T细胞，产生IFNγ(图6C)。相反地，在用明胶凝胶单独免疫以及未接受操作处理的鼠中，低于1％的CD8+T脾细胞产生IFNγ。在不存在肽刺激的情况下，对于所有样品，产生IFNγ的CD8+T细胞的百分比都低于1％。因此，明胶聚合物有助于病毒在体内的释放，并且不会改变病毒的免疫原性，因为用这种免疫方式处理的鼠产生强免疫应答，程度相似于用活病毒单独免疫的鼠。

[204]为了检测在明胶聚合物中输送的活病毒的安全性，用100μl包含10HAU活病毒的明胶或明胶单独，经由SQ免疫Rag-/-γc-/-鼠。所有的Rag-/-γc-/-鼠保持健康，并且在超过30天时间的时期内，没有损失重量，因此证实明胶凝胶是无毒的，并且SQ输送途径不会引起活动性病毒感染。

胶原蛋白凝胶

[205]通过把包含病毒和载体材料的明胶聚合物块皮下输送到鼠中，进行关于凝胶包裹病毒颗粒的输送情况的初步研究。胶原蛋白被作为载体材料予以研究，原因在于在其它情形中，它的用作生物聚合物的业已充分建立的用途。通过控制胶原蛋白交联的程度和通过交联剂的选择(van Wachem et al.，1991，Biomaterials12：215-223)，可以控制胶原蛋白降解的速率——作用在于被束缚的病毒颗粒的释放。然而，交联剂的细胞毒性(van Luyn et al.，1992，J.Biomed.Materials Res.26：1091-111-；van Luyn et al.，1992，Biomaterials 13：1017-15 1024)和对钙化的加重效应(Golomb et al.，1987，Am.J.Pathol.127：122-130)，致使一些交联剂更不可用。而且，因为交联涉及了在交联剂和胶原蛋白纤维的氨基酸部分之间形成共价键，可预期：病毒颗粒的表面蛋白分子参与到该同一过程中，导致病毒的失活。尽管存在这些潜在的问题，悬浮于胶原蛋白凝胶基质的病毒颗粒，已表明提高了DNA转染和蛋白质表达和输送的效率(Schek et al.，2004，Molecular Therapy 9：130-138；Gu et al.，2004，Molecular Therapy 9：699-711)。

[206]为了使用SQ或ID途径把活病毒输送到哺乳动物体内，在无锈的针内部(30G1/2)合成胶原蛋白凝胶。贮液胶原蛋白是一种酸性溶液，其在与10X PBS缓冲液和1N氢氧化钠混合达到中性pH后，在大约4℃下保持液态。使用注射器把该溶液转移到针里，且将已经负载的针放置在37℃下温育大约30分钟，于是，胶原蛋白变为纤维状凝胶。在制备凝胶和将其负载入注射器过程中，研究了两个方法。一个涉及在微量离心管(大铸造(bulk casting))中制备凝胶；在另一个中，在温育之前，中和的胶原蛋白溶液被吸取到针中，且凝胶因此在针内铸造(微铸造(microcasting))。用聚二甲基硅氧烷(polydimethysiloxane(PDMS))的厚平板片遮蔽针的尖部，该聚二甲基硅氧烷厚平板防止在温育期间从针泄漏出材料。通过6mg/ml和10mg/ml胶原蛋白的微铸造方法所制备的水凝胶的电子显微照片，是使用Philips XL30环境扫描电子显微镜(Environmental Scanning ElectronMicroscope(ESEM))进行拍摄的，结果分别被展示在图7a和7b中。对于扫描电子显微术(Scanning Electron Microscopy(SEM))样品的制备，是在通过针挤出后，冷冻干燥凝胶，并且涂覆上铂的一层薄膜。当胶原蛋白的浓度被保持在6mg/ml时，实测到孔的大小是在500纳米到2微米的数量级范围内。对比于使用6mg/ml胶原蛋白作为起始材料时的包裹密度(图7a)，当使用10mg/ml胶原蛋白作为起始材料时，在纤维的包裹密度上有一个明显的增加。用10mg/ml胶原蛋白形成的凝胶的孔径为大约小于或等于200nm。这些结果表明：依靠起始胶原蛋白材料的性能，可控制病毒颗粒的释放速率。

[207]已经表明：环境扫描电子显微镜(Environmental Scanning ElectronMicroscope(ESEM))，可被用于在纳米尺度研究流体力学过程(Babu et al.，2005，Miccrofluiducs and Nanofluidics，1：284-288；Rossi et al.，2004，Nano Letters4：989-993)。在存在水的情况下，给生物材料照相的能力有助于在纳米尺度检验结构，同时保持了样品处于自然状态，并且减少了破坏性样品制备时间。为了说明通过扫描电子显微术在传统模式和湿模式(ESEM)检测的凝胶形态学上的差异，使用10mg/ml胶原蛋白起始溶液通过微铸造制备凝胶。在两个系统中，都拍摄显微照片。显微照片的对比揭示：两种方法评估的凝胶形态学是相同的(图7b和7c)，尽管在样品制备和检测模式上存在差异。作为在聚合物混合物中固有柔性的实例，在图7d中，示出的是1∶4比例(胶原蛋白：PEG)的胶原蛋白(10mg/ml)和聚乙二醇(分子量20,000，从Alfa Aesar获得)的冷冻干燥混合物。该水凝胶的孔径在100纳米和500纳米之间变化；当对比于单组分胶原蛋白凝胶时，水凝胶的孔径表现了增加。

[208]这些初步的结果表明：可以通过控制原始密度，以及也通过使用聚合物混合物/共聚物(即本文描述的PEG混合物)，调节胶原蛋白凝胶中的孔径。孔径是一个关键因素，其关系到聚合物释放病毒的能力，以及有助于后来树突细胞的吸收，树突细胞的吸收是引发出保护性免疫应答的至关重要的事件。

藻酸盐聚合物

[209]为了发展水凝胶包裹系统，该系统可以让包含病毒的凝胶原位固定在接种注射器的注射针头内部，研究了藻酸盐聚合物的使用。通过SQ或ID途径直接注射该凝胶，应该有助于在最小的气雾化效应的危险下，将活病毒施用给哺乳动物，因此最小化了对施用该剂量的人员的暴露。

[210]从FMC生物聚合物得到三种藻酸钠粉末样品。变化粘度的藻酸盐溶液，可通过改变藻酸盐的浓度和类型进行合成。交联的藻酸盐凝胶的强度，也可通过改变交联离子的浓度进行改变。0.5％、1％或1.5％(w/v)的藻酸钠溶液是在去离子水(DI)中制备的，通过0.45微米针筒式滤器的过滤使溶液灭菌。通过加入包含偏磷酸钠的溶液启动凝胶化，该包含偏磷酸钠的溶液已经通过高压灭菌进行了灭菌。把藻酸盐(5ml)转移到50ml圆锥管，并且加入8、4或2μg/ml的CaSO₄(来自0.4g/ml的浆液)。用力震动该管的容纳物，以确保藻酸盐和CaSO₄浆液完全混合，混合物的少量整分试样被吸入装备有22G注射针头的5ml注射器内，混合物仅仅够填充注射针头，并且在注射针头端和活塞之间留有1ml的气体空间。该注射器被夹在垂直固定的注射器泵上，并且以63ml/min的恒定速率将注射器内容纳物排出。这个过程确保对所有配制物的一致压力。记录排出凝胶态藻酸盐所需时间和凝胶的视觉检查。结果被表示在图8B中。

[211]随着分子量的减小，藻酸盐的粘度降低。因此，凝胶变得更容易排出(例如在8μg/ml的CaSO₄和1％的凝胶时，排出的时间为：HV＝65s＞MV＝62s＞LV＝25s)。随着藻酸盐对钙比例的下降，通常达到一个限制点，在达到该限制点，凝胶不会形成(例如，通过HV/0.5％的柱子：当钙浓度降至2.0μg/ml时，没有凝胶形成)。对于高粘度的藻酸盐，在没有凝胶形成时的限制钙浓度是最低的。例外的是，在1％的藻酸盐时，对于所有三种藻酸盐，其在钙浓度下形成凝胶。在所有1％藻酸盐浓度的情况下，形成结实的凝胶，随着钙离子浓度下降，从注射器中排出该凝胶越来越容易。当用1％溶液的结果作图时(图8A)，明显的是：高粘度和中粘度的藻酸盐行为方式非常相似，而低粘度的藻酸盐从注射针头更容易除去。

从藻酸盐聚合物释放病毒

[212]为了评估从藻酸盐聚合物释放病毒的潜能，实施下列实验。本文描述的数据提供了参数，以改变藻酸盐凝胶的力学性质。根据这些数据，确定的一点是：量子点(quantum dots(QDots))将是一个方便的包囊化病毒的模式。QDOts为10-20nm直径的纳米晶体，其由内部的CdSe/ZnS核和带有使偶联容易的功能基团的外部的壳组成。不但QDots的大小和形状对本文描述的应用是理想的，而且QDots强烈地发荧光，使它们很容易被探测和被测定数量。

[213]使用4μg/ml的CaSO₄和包含QDots的1％藻酸盐凝胶的混合物，把样品吸入5ml注射器的22G注射针头内，按照本文其它地方描述的方法，让其固定。然后，包含QDots的凝胶沉淀被注入到4ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，磷酸缓冲盐溶液是置于RTI荧光计中的比色池中。从注入时刻监控荧光。在图9a和9b中，表明两种明显截然不同的荧光图，荧光图是一目了然的。一但其被注入PBS，低粘滞度的藻酸盐就释放其内容物。荧光强度在注入时间50秒时上升到最大。在50秒时注入后，高粘滞度凝胶逐步释放器内含物，在400秒以后，达到完全释放。

从包裹病毒的凝胶中释放活性病毒的体外分析

[214]开发了一种体外分析，以检测从藻酸盐凝胶释放病毒颗粒。MDCK细胞是贴壁细胞株系，其可支持包括流行性感冒病毒在内的多种病毒的生长。在初步研究中，用被限制在藻酸盐聚合物中的活病毒培养MDCK细胞5天，然后使用鸡红血球细胞悬液的血细胞凝集分析检测细胞，以评估感染。在阴性对照中，单独使用藻酸盐，没有检测到病毒(缺乏血细胞凝集)。相反地，对于在藻酸盐凝胶中含有50％和75％病毒的情况，观察到强烈的血细胞凝集；以及在阳性对照中，在溶液中6HAU和3HAU病毒被评估，也观察到强烈的血细胞凝集。这些研究表明流行性感冒病毒的感染性在藻酸盐凝胶中得以保留，并且活的、有感染性的病毒在37℃下从凝胶中被释放出来。

被捕获在藻酸盐凝胶中的病毒

[215]美国食物和药物管理局(the U.S.Food and Drug Administration(FDA))已经批准藻酸盐凝胶，其被普遍上认为是安全的(generally regarded as safe(GRAS))。本文提供的数据确定在藻酸盐凝胶中捕获的活流行性感冒病毒是免疫原性的，并能在哺乳动物中诱导出细胞毒性CD8+T细胞和病毒中和性抗体(图10)。在图l0中，可以看出，在藻酸盐凝胶中施用的活PR8病毒强烈地刺激了CD8+T细胞在老鼠中的应答。在用藻酸盐凝胶中的活病毒皮下接种，然后用X31流行性感冒病毒再次攻击的动物中，诱导出大量的肺部NP₃₆₆特异性CD8+T细胞。对于未处理的老鼠(即，对照老鼠)，或用PR8活病毒单独、藻酸盐单独或者包囊在藻酸盐中的PR8活病毒皮下接种的鼠，在用X31流行性感冒病毒鼻内再次攻击后的第七天，将这些鼠群中的肺进行分析。用抗CD8抗体和识别免疫显性NP_366-374肽的MHCI类I/NP_366-374四聚体复合物，对从鼠中获得的单细胞悬液进行染色。用流式细胞计量术分析染色细胞。表示在图10中的值代表了从每组的两只鼠所获得的平均值。

[216]另外，在鼠中诱导出高滴度IgG抗体应答，正如图11所示。存在于用单独PR8病毒或包裹在藻酸盐凝胶中的PR8病毒免疫的C57BL/6鼠血清中的抗PR8抗体，被使用采用PR8病毒作为捕获抗原的ELISA进行检测。以三倍连续稀释，进一步稀释1/270初始血清稀释液，并且加入到结合于平板的PR8病毒上。未感染的动物没有表现对PR8病毒的抗体应答。

[217]大多数预防性疫苗通过在宿主中产生中和抗体而发挥作用，中和抗体阻止该病毒的后来感染。图12中所示数据确定：除了显示在图10中的细胞毒性CD8+T细胞应答之外，捕获在藻酸盐凝胶中的活流行性感冒病毒在鼠中诱导出高滴度的中和抗体。在图12中，使用PR8、鸡红血球细胞和从免疫动物中获得的血清的稀释液，施行血细胞凝集抑制分析。对于用藻酸盐凝胶中的活病毒予以免疫的动物，指出了表现血细胞凝集抑制的最大血清稀释度。从非免疫动物中得到的血清不表现血细胞凝集抑制。

纳米管

[218]如本文其它地方讨论的，优选的疫苗是被负载到纳米管中的。能够合成各种直径(50-250nm)的碳纳米管(Bradley et al.，2003，Chemistry Preprint Server，Miscell.：1-6，CPS：chemistry/0303002；Babu et al.，Microfluidics and Nanofluidics1：284-288；Rossi et al.，2004，Nano Letters 4：989-993)。具有较大直径(250nm)的纳米管合成的模板，是商业上可获得的。较大直径的纳米管有助于如此结构的产生，这些结构可保持和释放流行性感冒病毒大小的颗粒。在目前应用中优选的纳米管类型，已知为多壁纳米管(multi-wall nanotube(MWNT))，尽管这种类型的纳米管缺乏恰当的晶型结构，此种晶型结构通常在使用金属催化的化学气相沉积(Chemical Vapor Deposition(CVD))法合成的那些纳米管中看到。通过遵循Miller等(Miller et al.，2001，J.Amer Chem.Soc.123：12335-12342)建立的模板辅助方法，合成纳米管。在图13中，示出了用本文描述的方法合成的一个典型的大直径纳米管的横截面。

[219]  用磁纳米颗粒(Korneva et al.，2005，Nano Letters，5：879-884)或荧光纳米颗粒(Kim et al.，2005，Nano Letters 5：873-878)负载碳纳米管的能力，近来已经被用相当简单的方法学进行了展示，尽管小管子直径是275+/-25nm并且导致毛细作用。用于这些实验的纳米管，是通过CVD方法进行合成的。已表明管内溶剂的蒸发速度超过受到捕获的颗粒的移动，导致颗粒沿纳米管的壁沉淀(Kim et al.，2005，Nano Letters，5：873-878)。这是基于本性而设计的一种安全措施。因此，负载到这些纳米管内的病毒，将不会自由地扩散出管的内腔。这些研究的这些结果确立了：250纳米直径的纳米管，通过浓缩，可用各种水溶液进行负载(Babu et al.，见上文；Rossi et al.，见上文)。优选地，在本发明中，将用比水更粘的液体负载纳米管。然而，这预期不会产生任何问题，因为与甘油和乙二醇具有相同粘度的液体已经在其它装置中被成功地负载(Kim et al.，见上文)。

[220]本文介绍的实验应该被考虑为：可以适用于将纳米包囊化的活病毒应用到聚合物中，例如胶原蛋白基质、藻酸盐、明胶聚合物，其可在体温下释放病毒。这些方法使空气传播病毒更加安全地用作疫苗，同时又利用了所需的在免疫接种个体中诱导出保护性免疫应答的非常低的剂量之优势。

准直碳纳米管(aligned carbon nanotubes)的合成

[221]简言之，置于石英反应器的氧化铝膜(Whatman Anodisc 13mm直径，以及250nm孔径)被作为模板，用于碳纳米管的生长。使用可达到至少1000℃的管式炉，裂解以20sccm的速率流动通过氧化铝膜的乙烯和氩气的混合物。乙烯气在670℃下的分解导致碳沉积在氧化铝膜的内部壁的周围；因此，沉积的碳层的厚度依赖于工艺时间。对于所计划的目标，6小时的反应时间是足够的。可用适度的超声波(47kHz，水浴超声波仪)除去在膜的每一边的碳层。带有碳纳米管的膜必须完全沉浸在1M NaOH中至少12个小时，以完全除去模板。在通过具有1微米孔的聚碳酸酯膜过滤器(SPI Supplies)过滤除去模板之后，纳米管可从悬液中移出。该过程的示意性图示被表示在图14中。

纳米管充填

[222]已经发展了允许有效地把液体和凝胶充填入纳米管的充填方法。本文提供的数据确立：将包含藻酸盐凝胶的病毒充填在纳米管中是可行的。将包含大约是病毒颗粒大小(大约50-100nm直径)的QDots的藻酸盐凝胶，充填入纳米管。正如在图15和图16可见的，QDots被充填入纳米管内部。注意纳米管是透明的，并且QDots荧光透射通过管壁。作为对照，与藻酸盐和QDots的溶液混合、但并没有经历充填过程的纳米管被显示出来(图17)。在后一个情况下，QDots作为背景在管外，而不是在管内发荧光。这些实验的细节如下。

[223]图15描述了用藻酸钠填充的碳纳米管的共聚焦图，以及示出了量子点。将含有50nm QDpts的藻酸盐凝胶和纳米管相混合，然后经历一个充填过程。荧光存在在管内表明：采用包含QDots的凝胶对纳米管的充填效应。箭头指向独立的纳米管。

[224]图16为包含藻酸钠的碳纳米管的一系列扫描电镜图，量子点(QDots)被显示出来。凝胶和QDots可清楚地在管子的内部看到(图16a和16b)。两张图象上的比例标尺为2μm。

[225]图17描述了纳米管，其只是与包含QDots的凝胶混合，但没有充填。存在藻酸钠和QDots的碳纳米管的共聚焦图被示出。用包含50nm QDots的藻酸盐凝和纳米管相混合，但是没有经历充填步骤。源自QDots的荧光被作为背景观察到，而不在纳米管的内部，纳米管内部表现为黑暗的。箭头指向单个纳米管。

用超声处理将纳米管打断至长度小于500nm

[226]生物活性剂释放策略的一个重要要素是使用超声波打断纳米管的能力，以便于在被给予生物活性剂的动物中，发生生物活性剂的受控释放。为了释放生物活性剂，纳米管应该被打断为如此大小，在该尺寸下，管中的毛细作用力有助于把凝胶和活病毒释放到周围组织中。在图18中，示出的数据展示了：用1.36MHz超声处理10-12微米长的纳米管30秒，打断为小得较多的纳米管，具有的尺寸为大约小于1微米。基于本文提供的实验，技能熟练的技术人员将明白：如何最优化实验条件，以调节纳米管中的内容物到周围组织的释放。在图18中，显示出：超声处理(x1,000放大率)之前(图18a)和超声波处理(x10,000放大率)之后(图18b)的碳纳米管的扫描电子显微镜图，超声处理为1.36MHz，持续达30秒。在超声处理前，纳米管为10-20微米长(图18a)。在超声处理之后，纳米管长度小于1微米(图18b)。

藻酸盐水凝胶

[227]使用除Ca²⁺之外的多价阳离子，例如不溶的盐，诸如碳酸钡、磷酸钡或硫酸钡，以及磷酸铝或氢氧化铝代替硫酸钙，本文所描述的原位凝胶化的方法可被最优化，并且可被扩展去研究对于凝胶特性的影响。不同分子量和组成成分的藻酸盐(古洛糖醛酸与甘露糖醛酸在聚合物主链中的比例)。对注射的容易性和QDOts(对病毒颗粒而言，为容易地可定量模式)的释放曲线的影响，将作为病毒输送功效的研究的开场白，其中采用体外血细胞凝集分析和最终在鼠中的体外研究(参见上面)。使用HA或藻酸盐和壳聚糖的其它混合物，或其它对本领域技术人员已知的组合物，可进行相似的研究。

胶原蛋白凝胶

[228]基于胶原蛋白凝胶合成的初步数据，可合成水凝胶；并且根据它们包裹、储存和当它们被体内施用时以特定速率释放病毒的能力，描述这些水凝胶的性质。具有渐增的胶原蛋白起始材料(4、6、8和10mg/ml)密度的凝胶，可根据本文其它地方公开的方法进行合成，并且可由大铸造和微铸造，予以铸造。按照标准的临界点干燥方法(Philips XL30)干燥凝胶，并且在扫描电镜(scanning electronmicroscope(SEM))下，检查凝胶，以便检查孔大小上的变化。在存在计算量的荧光量子点颗粒(quantum dot particles(QDots))下，也可以合成胶原蛋白凝胶。这些QDots可购自Quantum Dot Corporation或Evident Technologies。分离凝胶，并在使用前，用PBS缓冲液洗涤几次。根据QDots的发射光谱，估计凝胶中QDots的扩散速率，同时把凝胶保持在37℃。使用带有温度控制的比色池支架的UV-可见分光计，在不同时间，收集发射光谱。比较扩散速率的数据和从SEM获得的孔隙率信息，并使用其确定最优化的胶原蛋白浓度，该浓度满足受到捕获的病毒颗粒的要求释放速率。在达到最优化的胶原蛋白浓度之后，在合成过程中，将聚乙二醇(PEG，分子量10,000、8,000、6,000和1,000)作为添加剂加入。在存在QDots下，使用本文描述的相同过程，合成胶原蛋白/PEG复合材料。PEG的浓度可进行改变，是通过把胶原蛋白对PEG的比例改变为下列情况而进行，1∶0.5、1∶1、1∶2和1∶4。保持原来的扩散速率、但是增加了均匀性并且减小了分相的比例，可被选出，作为用于体内测试的配方。在PEG加入之后，在凝胶中的形态学变化可用SEM进行监控。

明胶水凝胶

[229]基于本文提供的关于明胶包裹病毒用途的数据，可合成水凝胶，并且根据包裹病毒、储藏病毒和被体内施用时释放病毒，描述水凝胶的性质。使用低压冻干和γ照射的明胶，来制备如本文其它地方公开的水凝胶。为了获得最佳的释放速率，改变水中明胶的浓度(从1％到3％w/v)。在储存期间，水凝胶失水导致明胶水凝胶的收缩。这可以通过在凝胶形成过程中，加入计算量的PEG(占明胶的1到10％w/w)低聚物(分子量400到1000)而被减小。使用凝胶强度和对外形尺寸(physical measurement)的测量，来确定收缩率。使用振荡流变试验器(伯林应力控制流变计(Bohlin Controlled Stress Rheometer))，周期性测量凝胶的粘度和交联密度，这应该揭示凝胶黏弹特性性质上的变化。通过把凝胶放置于两个圆盘之间，且当这个仪器中的底部那个圆盘进行振荡时，频率传播通过凝胶，并且通过上面的盘测量扭矩。可使用如本文描述的用于胶原蛋白和QD’s的相同方法，使用明胶和QD’s来确定病毒大小颗粒的释放速率。

评价安全性的方法

[230]为了排除气溶胶化的潜在可能，需要测量气溶胶的产生。为了这个目的，填充了50nm QDots的聚合物凝胶被喷到培养皿(Petridish)上。使用SKS生物采样器(SKS Biosampler)收集空气样品，SKS生物采样器被设计为与声流泵一起工作，并且其在收集生物气溶胶方面是特别有效的。生物采样器由玻璃制成，并且装配了三个切向喷嘴，这些喷嘴作为关键开口发挥作用，每一个允许4.2升的周围空气通过，导致了每分钟12.5升的总流动速率。生物气溶胶被PBS、水或培养基的漩涡液体捕集器所捕获。生物采样器使用高容量声流泵，以捕获气载的活微生物，用于进行后来的分析。在聚合物凝胶喷射的表面正前方的10cm和100cm处，进行气溶胶取样，其代表了最大可能的释放。使空气样品通过20ml PBS(针对QDots)或培养基(针对病毒)，以便收集颗粒。溶液被浓缩10倍，进行分析。对于QDots实验，用荧光计测量荧光。对于病毒的研究，将2ml(10倍浓缩的)样品在MDCK细胞中培养5天后，当在鸡RBC分析中收集的样本没有表现血细胞凝集时，聚合物则被为认为是安全的。按照本文描述的用于非包囊病毒的方法，评估病毒负载的聚合物凝胶的免疫原性和安全性。相同的方法，或那些容易被本领域技术人员确定的方法，可被应用于任意生物活性剂。使用量子点是病毒颗粒大小的光学生物传感器的一个简单例子。可以使用病毒颗粒大小的任意光学的、磁性的、电的标签来估计气溶胶的形成。

纳米管

[231]为了研究纳米管作为凝胶包裹的生物活性剂的强有力的输送载体，施行了下列的实验。聚合物凝胶负载的纳米管的纳米流体负载和释放特性，以及聚合物从纳米管中受控释放的条件，可用下面描述的方法评估。按照本文其它地方描述的方法评估安全性和免疫原性。用包含生物活性剂的聚合物凝胶负载的纳米管，是对于现在普遍使用的传统注射器和注射针头制剂输送的方法的一种替代策略。

[232]通过在适当的液体中，把聚碳酸酯200nm膜上的纳米管浸泡1分钟，然后运用低真空，将流体和聚合物负载到纳米管。该过程重复五次。当使用50nm大小的银纳米颗粒时，这个过程导致胶态颗粒负载效率为30-40％。

[233]为了研究纳米管的纳米流体负载，使用以各种不同浓度被包囊在凝胶中的50nm QDots，来定量凝胶的负载效率。在强烈的洗涤后，用纳米管的荧光强度来计量QDots浓度。已经被负载的纳米管的数量，用共聚焦显微术进行定量。纳米管壁对于紫外光是透明的，因此管中的荧光可被看得见。为了负载聚合物凝胶，在聚合作用之前，将纳米管与凝胶相混合，并施加数个真空循环。然后取决于所使用的聚合物，将纳米管暴露于交联剂或暴露于催化交联的温度中。

[234]在有或者没有超声处理(20kHz-1.3MHz)下，研究了凝胶负载纳米管的释放特性。使用荧光计评估包含50纳米QDots的凝胶，以测量QDots的释放。然而，共聚焦显微术有助于量化QDots负载的纳米管数量，或者有助于量化在超声处理后释放它们的纳米管数量。

[235]在把包含QDots的聚合物负载入纳米管的最佳条件确定后，在体外和体内，按照本文其它地方描述的方法，检测包括活病毒的聚合物负载的纳米管，这里不再重复。

[236]当与现有技术方法相比较时，基于纳米管的输送系统具有几项优点。因为病毒颗粒被捕获限制在管的内部，偶然的溢出不可能发生，因此增强了处于邻近区域中的人员的安全。在管中的溶剂的蒸发速率已表明比捕获限制的颗粒的位移更快，导致沿纳米管壁沉积颗粒，形成了一种自然选择的安全措施。

[237]本文引用的每一项专利、专利申请和出版物的公开内容，以整体引入于此，作为参考。

[238]虽然参考具体的实施方式，本发明已经被公开，但是明显地，该发明的其它实施方式和变化可被本领域的其他技术人员所设计，而没有背离本发明的精神和范围。附加的权利要求拟被理解为包括所有这些实施方式和等价的变化。

序列表

<110>德雷塞尔大学

P.考奇克斯

E.帕帕佐格卢

M.惠特利

<120>  输送载体、生物活性物质和病毒疫苗

<130>  53844-5026WO

<150>  60/641,502

<151>  2005-01-05

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  9

<212>  PRT

<213>  流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)

<400>  1

Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met

1      5

Claims (168)

1.一种包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护的病毒量的疫苗，其中，在将所述病毒通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述动物之后，所述病毒在所述动物中诱导免疫保护性的CD8+T细胞和/或抗体应答。

2.一种包含CD8+T细胞免疫保护量的病毒的疫苗，其中，在将所述病毒通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述动物之后，所述病毒在所述动物中诱导免疫保护性的CD8+T细胞应答。

3.权利要求1所述的疫苗，其中所述病毒是活病毒。

4.权利要求1所述的疫苗，其中所述病毒是减毒病毒。

5.权利要求1所述的疫苗，其中所述病毒是死病毒。

6.权利要求1所述的疫苗，其中所述病毒是呼吸病毒。

7.权利要求1所述的疫苗，其中所述病毒选自正黏病毒、副黏病毒、冠状病毒属、小RNA病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、细小病毒和腺体病毒、杯状病毒、星状病毒、诺沃克病毒、沙粒病毒、黄病毒、线状病毒、汉坦病毒属、甲病毒属、逆转录病毒和慢病毒。

8.权利要求7所述的疫苗，其中所述病毒是正黏病毒。

9.权利要求8所述的疫苗，其中所述正黏病毒是流行性感冒病毒。

10.权利要求9所述的疫苗，其中所述流行性感冒病毒是甲型流行性感冒病毒。

11.权利要求10所述的疫苗，其中所述甲型流行性感冒病毒具有选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的血凝素抗原(HA)。

12.权利要求10所述的疫苗，其中所述甲型流行性感冒病毒具有选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的神经氨酸酶抗原(NA)。

13.权利要求10所述的疫苗，其中所述甲型流行性感冒病毒具有选自H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H2N2、H1N1、H1N2和H3N2的HA:NA的抗原谱。

14.权利要求10所述的疫苗，其包括低剂量的所述甲型流行性感冒病毒。

15.权利要求14所述的疫苗，其中所述低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.001到5000个血细胞凝集单位(HAU)的病毒。

16.权利要求15所述的疫苗，其中所述低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.005个到500个HAU的病毒。

17.权利要求16所述的疫苗，其中所述低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.01个到100个HAU的病毒。

18.权利要求1所述的疫苗，其中所述动物是哺乳动物。

19.权利要求18所述的疫苗，其中所述哺乳动物是人。

20.权利要求1所述的疫苗，其中所述病毒包括两种或多种成员的组合，所述成员选自活病毒、减毒病毒和死病毒。

21.权利要求1所述的疫苗，其中所述途径是非自然途径。

22.权利要求21所述的疫苗，其中所述途径选自皮下、皮内、肌肉内、粘膜和口。

23.包含权利要求1所述疫苗的试剂盒。

24.一种包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗，其中，在把所述病毒通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述动物之后，所述病毒在所述动物中诱导免疫保护性的CD8+T细胞和/或抗体应答，并且进一步，其中所述病毒与包囊载体相结合。

25.一种包含CD8+T细胞免疫保护量病毒的疫苗，其中，在把所述病毒通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述动物之后，所述病毒在所述动物中诱导免疫保护性的CD8+T细胞应答，并且进一步，其中所述病毒与包囊载体相结合。

26.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒被包囊在所述包囊载体中。

27.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒，在被包囊到所述包囊载体中之前，与纳米管、脂质体或蛋白质相结合。

28.权利要求24所述的疫苗，其中所述包囊载体包括一种或多种成员，所述成员选自凝胶、液体或粉末。

29.权利要求28所述的疫苗，其中所述包囊载体被负载入纳米管。

30.权利要求24所述的疫苗，其中所述包囊载体包括聚合物。

31.权利要求30所述的疫苗，其中所述聚合物，当被施用给动物时，是无毒的。

32.权利要求30所述的疫苗，其中所述聚合物与所述病毒相连接，因此延迟了把所述病毒释放到周围环境中。

33.权利要求30所述的疫苗，其中所述聚合物是凝胶。

34.权利要求33所述的疫苗，其中所述凝胶包括胶原蛋白。

35.权利要求33所述的疫苗，其中所述凝胶是水凝胶。

36.权利要求35所述的疫苗，其中所述水凝胶选自藻酸盐、明胶、壳聚糖和透明质酸。

37.权利要求35所述的疫苗，其中所述水凝胶选自聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。

38.权利要求33所述的疫苗，其中所述凝胶包括胶原蛋白、藻酸盐、明胶、壳聚糖、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素中的一种或多种的组合。

39.权利要求33所述的疫苗，其中所述凝胶是交联的。

40.权利要求24所述的疫苗，进一步包括添加剂。

41.权利要求40所述的疫苗，其中所述添加剂是聚乙二醇。

42.权利要求24所述的疫苗，其中所述包囊载体包括微胶囊。

43.权利要求24所述的疫苗，其中所述包囊载体包括纳米胶囊。

44.权利要求24所述的疫苗，其中所述包囊载体包括纳米管。

45.权利要求44所述的疫苗，其中所述纳米管具有的直径为500nm或更小。

46.权利要求24所述的疫苗，其中所述包囊载体包括溶液、粉末或凝胶中的一种或更多种的组合。

47.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒是活病毒。

48.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒是减毒病毒。

49.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒是死病毒。

50.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒是呼吸病毒。

51.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒选自正黏病毒、副黏病毒、冠状病毒属、小RNA病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、细小病毒和腺体病毒、杯状病毒、星状病毒、诺沃克病毒、沙粒病毒、黄病毒、线状病毒、汉坦病毒属、甲病毒属、逆转录病毒和慢病毒。

52.权利要求51所述的疫苗，其中所述病毒是正黏病毒。

53.权利要求52所述的疫苗，其中所述正黏病毒是流行性感冒病毒。

54.权利要求53所述的疫苗，其中所述流行性感冒病毒是甲型流行性感冒病毒。

55.权利要求54所述的疫苗，其中所述甲型流行性感冒病毒具有血凝素抗原(HA)，选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

56.权利要求54所述的疫苗，其中所述甲型流行性感冒病毒具有神经氨酸酶抗原(NA)，选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。

57.权利要求54所述的疫苗，其中所述甲型流行性感冒病毒具有HA:NA抗原谱，选自H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H2N2、H1N1、H1N2和H3N2。

58.权利要求54所述的疫苗，包括低剂量的所述甲型流行性感冒病毒。

59.权利要求58所述的疫苗，其中所述低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.001到5000血细胞凝集单位(HAU)的病毒。

60.权利要求59所述的疫苗，其中所述低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.005到500 HAU的病毒。

61.权利要求60所述的疫苗，其中所述低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.01到100 HAU的病毒。

62.权利要求24所述的疫苗，其中所述动物是哺乳动物。

63.权利要求62所述的疫苗，其中所述哺乳动物是人。

64.权利要求24所述的疫苗，其中所述病毒包括活病毒、减毒病毒和死病毒中的两种或多种的组合。

65.权利要求24所述的疫苗，其中所述途径是非自然途径。

66.权利要求65所述的疫苗，其中所述途径选自皮下、皮内、肌肉内、粘膜和口中的至少一项。

67.包含权利要求24所述疫苗的试剂盒。

68.一种将疫苗输送给动物的装置，所述装置包括：(a)CD8+T细胞免疫保护和/或抗体量病毒，其中，在将所述病毒通过非自然途径施用给动物之后，所述病毒在所述动物中诱导免疫保护性的CD8+T细胞应答和/或抗体应答，(b)用于将所述疫苗输送给所述动物的输送工具。

69.一种把疫苗输送给动物的装置，所述装置包括(a)CD8+T细胞免疫保护量的病毒，其中在把所述病毒通过非自然途径施用给动物之后，所述病毒在所述动物中诱导免疫保护性CD8+T细胞应答，(b)用于把所述疫苗输送给所述动物的输送工具。

70.权利要求68所述的装置，其中所述输送工具包括空心管。

71.权利要求70所述的装置，其中所述空心管具有锥形末端。

72.权利要求71所述的装置，其中所述输送工具包括针。

73.权利要求70所述的装置，其中所述空心管，任选地，被附加到冲压器械上。

74.权利要求73所述的装置，其中所述冲压器械是注射器。

75.权利要求68所述的装置，其中所述输送工具是基因枪。

76.权利要求68所述的装置，其中所述输送工具是导管。

77.权利要求68所述的装置，其中所述输送工具是贴剂。

78.权利要求68所述的装置，其中所述输送工具是吸入器。

79.权利要求68所述的装置，其中所述输送工具是黏膜施用器。

80.权利要求68所述的装置，进一步包括包囊载体。

81.权利要求80所述的装置，其中所述病毒被封装在所述包囊载体中。

82.权利要求80所述的装置，其中，所述病毒，在被封装到所述包囊载体中之前，是与纳米管、脂质体或蛋白质相结合的。

83.权利要求80所述的装置，其中所述包囊载体包括一种或更多种成员，所述成员选自凝胶、液体或粉末。

84.权利要求83所述的装置，其中所述包囊载体被负载入纳米管。

85.权利要求80所述的装置，其中所述包囊载体包括聚合物。

86.权利要求85所述的装置，其中所述聚合物，当被施用给动物时，是无毒的。

87.权利要求86所述的装置，其中所述聚合物与所述病毒相结合，因此延迟了所述病毒到周围环境中的释放。

88.权利要求85所述的装置，其中所述聚合物是凝胶。

89.权利要求88所述的装置，其中所述凝胶包括胶原蛋白。

90.权利要求88所述的装置，其中所述凝胶是水凝胶。

91.权利要求90所述的装置，其中所述水凝胶选自藻酸盐、明胶、壳聚糖和透明质酸。

92.权利要求90所述的装置，其中所述水凝胶选自聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。

93.权利要求88所述的装置，其中所述凝胶包括胶原蛋白、藻酸盐、明胶、壳聚糖、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素中的一种或多种的组合。

94.权利要求88所述的装置，其中所述凝胶是交联的。

95.权利要求80所述的装置，进一步包括添加剂。

96.权利要求95所述的装置，其中所述添加剂是聚乙二醇。

97.权利要求80所述的装置，其中所述包囊载体包括微胶囊。

98.权利要求80所述的装置，其中所述包囊载体包括纳米胶囊。

99.权利要求80所述的装置，其中所述包囊载体包括纳米管。

100.权利要求99所述的装置，其中所述纳米管具有500nm或更小的直径。

101.权利要求80所述的装置，其中所述包囊载体包括：溶液、粉末或凝胶中的一种或多种的组合。

102.权利要求80所述的装置，其中所述病毒是活病毒。

103.权利要求80所述的装置，其中所述病毒是减毒病毒。

104.权利要求80所述的装置，其中所述病毒是死病毒。

105.权利要求80所述的装置，其中所述病毒是呼吸道病毒。

106.权利要求80所述的装置，其中所述病毒选自正黏病毒、副黏病毒、冠状病毒属、小RNA病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、细小病毒和腺体病毒、杯状病毒、星状病毒、诺沃克病毒、沙粒病毒、黄病毒、线状病毒、汉坦病毒属、甲病毒属、逆转录病毒和慢病毒。

107.权利要求106所述的装置，其中所述病毒是正黏病毒。

108.权利要求107所述的装置，其中所述正黏病毒是流行性感冒病毒。

109.权利要求108所述的装置，其中所述流行性感冒病毒是甲型流行性感冒病毒。

110.权利要求109所述的装置，其中所述甲型流行性感冒病毒具有选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的血凝素抗原(HA)。

111.权利要求109所述的装置，其中所述甲型流行性感冒病毒具有选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的神经氨酸酶抗原(NA)。

112.权利要求109所述的装置，其中所述甲型流行性感冒病毒具有选自H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H2N2、H1N1、H1N2和H3N2的HA:NA的抗原谱。

113.权利要求109所述的装置，包括低剂量的所述甲型流行性感冒病毒。

114.权利要求113所述的装置，其中所述的低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.001到5000血细胞凝集单位(HAU)的病毒。

115.权利要求114所述的装置，其中所述的低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.005到500 HAU的病毒。

116.权利要求115所述的装置，其中所述的低剂量甲型流行性感冒病毒是从0.01到100HAU的病毒。

117.权利要求80所述的装置，其中所述动物是哺乳动物。

118.权利要求117所述的装置，其中所述哺乳动物是人。

119.权利要求80所述的装置，其中所述病毒包括至少两种成员，选自活病毒、减毒病毒和死病毒。

120.权利要求80所述的装置，其中所述途径是非自然途径。

121.权利要求120所述的装置，其中所述途径是至少一项，选自皮下、皮内、肌肉内、黏膜和口。

122.一种制造包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗的方法，所述方法包括：将CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量的病毒与包囊载体相组合，从而制造所述疫苗。

123.一种制造包含CD8+T细胞免疫保护量病毒的疫苗的方法，所述方法包括：将免疫保护量的病毒与包囊载体相组合，从而制造所述疫苗。

124.一种在动物中诱导出CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫应答的方法，所述方法包括将包含CD8+T细胞和/或抗体免疫保护量病毒的疫苗施用给所述动物，由此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答。

125.一种在动物中诱导出CD8+T细胞免疫应答的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量病毒的疫苗施用给所述动物，因此在所述动物中诱导出CD8+T细胞免疫应答。

126.权利要求124所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

127.权利要求126所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

128.一种保护动物免于病毒感染的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的所述病毒的疫苗施用给所述动物，由此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，以保护所述动物免于所述感染。

129.一种保护动物免于病毒感染的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量的所述病毒的疫苗施用给所述动物，由此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞免疫应答，以保护所述动物免于所述感染。

130.权利要求128所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

131.权利要求130所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

132.一种预防动物中的病毒感染的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的所述病毒的疫苗施用给所述动物，因此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，从而在所述动物中预防病毒感染。

133.一种预防动物中的病毒感染的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量的所述病毒的疫苗施用给所述动物，因此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞免疫应答，从而在所述动物中预防病毒感染。

134.权利要求132所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

135.权利要求134所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

136.一种治疗动物中的病毒感染的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的所述病毒的疫苗施用给所述动物，因此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，从而治疗所述动物。

137.一种治疗动物中的病毒感染的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的所述病毒的疫苗施用给所述动物，因此，在所述动物中诱导出CD8+T细胞和/或抗体免疫应答，从而治疗所述动物中。

138.权利要求136所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

139.权利要求138所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

140.一种包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的生物活性剂的组合物，其中，在把所述生物活性剂通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述的动物之后，所述生物活性剂在所述动物中诱导免疫保护性CD8+T细胞和/或抗体应答。

141.一种包含CD8+T细胞免疫保护量的生物活性剂的组合物，其中，在把所述生物活性剂通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述的动物之后，所述生物活性剂在所述动物中诱导免疫保护CD8+T细胞应答。

142.权利要求140所述的组合物，其中所述途径是非自然途径。

143.权利要求140所述的组合物，其中所述途径选自皮下、皮内、肌肉内、黏膜和口。

144.权利要求140所述的组合物，其中所述生物活性剂被封装在所述包囊载体中。

145.权利要求140所述的组合物，其中所述生物活性剂在被封装到所述包囊载体中之前，与纳米管、脂质体或蛋白质相结合。

146.权利要求140所述的组合物，其中所述包囊载体包括至少一种成员，选自凝胶、液体或粉末。

147.权利要求146所述的组合物，其中所述包囊载体被负载入纳米管。

148.权利要求147所述的组合物，其中所述包囊载体包括聚合物。

149.权利要求148所述的组合物，其中所述聚合物，当被施用给动物时，是无毒的。

150.权利要求148所述的组合物，其中所述聚合物与所述生物活性剂相结合，因此延迟了把所述生物活性剂释放到周围环境中。

151.权利要求148所述的组合物，其中所述聚合物是凝胶。

152.权利要求140所述的组合物，其中所述生物活性剂选自微生物和蛋白质。

153.一种增加当把生物活性剂施用给动物时的安全性的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护和/或抗体免疫保护量的生物活性剂的组合物施用给所述动物，其中，在把所述生物活性剂通过不会在所述动物中引起疾病的途径施用之后，所述生物活性剂在所述动物中诱导免疫保护CD8+T细胞和/或抗体应答，并且进一步地，其中所述生物活性剂被封装在包囊载体中。

154.一种增加当把生物活性制剂施用给动物时的安全性的方法，所述方法包括把包含CD8+T细胞免疫保护量的生物活性剂的组合物施用给所述动物，其中，在把所述生物活性剂通过不会在所述动物中引起疾病的途径施用之后，所述生物活性剂在所述动物中诱导免疫保护CD8+T细胞应答，并且进一步地，其中所述生物活性剂被封装在包囊载体中。

155.权利要求153所述的方法，其中所述生物活性剂选自微生物和蛋白质。

156.一种包含生物有效量的生物活性剂的组合物，其中，在把所述生物活性剂通过不会在动物中引起疾病的途径施用给所述动物之后，所述生物活性剂在所述动物中诱导期望的应答，同时减低了所述动物中的危险。

157.权利要求156所述的组合物，其中所述途径是非自然途径。

158.权利要求157所述的组合物，其中所述途径选自皮下、皮内、肌肉内、黏膜和口。

159.权利要求156所述的组合物，其中所述生物活性剂被封装在包囊载体中。

160.权利要求156所述的组合物，其中所述生物活性剂在被封装到所述包囊载体中之前，与纳米管、脂质体或蛋白质相结合。

161.权利要求156所述的组合物，其中所述包囊载体包括至少一种成员，选自凝胶、液体或粉末。

162.权利要求159所述的组合物，其中所述包囊载体被负载入微胶囊、纳米胶囊或纳米管。

163.权利要求159所述的组合物，其中所述包囊载体包括聚合物。

164.权利要求163所述的组合物，其中所述聚合物，当被施用给动物时，是无毒的。

165.权利要求163所述的组合物，其中所述聚合物与所述生物活性剂相结合，因此延迟了把所述生物活性剂释放到周围环境中。

166.权利要求163所述的组合物，其中所述聚合物是凝胶。

167.权利要求156所述的组合物，其中所述生物活性剂选自微生物和蛋白质。

168.一种当把生物活性剂施用给动物时增加安全性的方法，所述方法包括把组合物施用给所述的动物，所述组合物包含可诱导期望的应答同时减低动物的风险的一定量的生物活性剂，其中所述生物活性剂施用途径是不会在所述动物中引起疾病的途径，并且进一步地，其中所述生物活性剂被封装在包囊载体中，因此当施用所述生物活性剂时，增强了安全性。

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