CN101125155A - 灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，即以灯盏花提取物为活性成分制备皮肤美白或/和祛斑化妆品、抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的医药品和食品。实验证明，灯盏花甲醇提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑素生成，且对皮肤没有副作用，可美白紫外线照射后晒黑的皮肤，预防、改善和治疗因日晒引发的老人斑、雀斑、红斑等皮肤色素沉积症状。本发明发掘了灯盏花甲醇提取物的一个全新用途，有极好的应用前景。

Description

灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用

技术领域

本发明涉及灯盏花甲醇提取物应用技术领域，更具体地说，是涉及灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用。

背景技术

人的肤色是由皮肤内的黑色素密度和分步来决定的，同时又受环境或生理因素的影响，比如太阳光中的紫外线、疲劳、压力和遗传因素。现有化妆品中广为使用的美白方式，其美白机理主要有两种：一种是黑色素还原机理，如以维生素C美白，但美白效果不是很明显；另一种重要的机理是通过抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果，如以氢醌、曲酸、桑葚提取物及熊果苷(arbutin，氢醌的天然形式)等美白。但以熊果苷、曲酸等化学物祛斑美白的临床效果不是特别明显。近些年研究发现，一些传统的增白祛斑褪色剂，如对苯二酚、皮质类固醇、汞的化合物等，可能会引起一系列健康问题，如不可逆的皮肤损害、黄褐斑等，因而也被禁止使用。可以说目前只有氢醌可用于皮肤的美白，但研究发现其可表现出诸如使黑素退化或致突变、细胞功能破坏等副作用，因此目前在一些国家氢醌被禁止在化妆品中使用。此外，一种氢醌的糖衍生物熊果苷已被开发成美白商品，但认为其增白效果很小，而抗坏血酸、曲酸等虽活性较高，但稳定性较差，以致使其应用范围受到限制。

黑色素代谢的一般过程是，黑素细胞中酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴、多巴醌和多巴色素等，最终转变为色素颗粒，并从黑素细胞分泌到邻近的角质形成细胞中去，体现出皮肤的颜色。部分色素沉着性皮肤病，如黄褐斑、雀斑等，就是由于过量水平的黑色素在表皮沉积形成。酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)，分类号为EC 1.14.18.1和EC 1.10.3.1是一种含铜的酶，兼有加氧酶和氧化酶双重功能，为黑色素合成的限速酶，其表达和活性决定黑素合成的速度和产量。在黑素生成过程中，酪氨酸酶有3个特征性的催化活性，即酪氨酸羟化酶活性、多巴氧化酶活性和5，6-二羟基吲哚氧化酶活性，分别催化酪氨酸羟化为多巴(Dopa)，多巴(Dopa)氧化为多巴醌(DQ)和5，6-二羟基吲哚(DHI)氧化为5，6-吲哚醌(IQ)。这些反应导致所在部位的黑色素沉着，如黑斑、雀斑和痣。因此，可以选择应用酪氨酸酶抑制剂，通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成从而达到祛斑增白的效果。大部分的酪氨酸酶抑制剂是酚类或邻苯二酚的衍生物，其结构类似于酪氨酸或多巴，作为一种错配底物，从而抑制酶的活性。

酪氨酸酶抑制剂在医药和化妆品行业正越来越受关注，它可以通过抑制酶的氧化而防治黑色素沉着。已报道了很多天然产物来源的酪氨酸酶抑制剂，大部分含有酚类结构或能够螯合酪氨酸酶的铜离子。但这些酪氨酸酶抑制剂都有这样那样的缺点，如活性低、毒性高，穿透能力弱等。其他一些活性较强的化学物，如曲酸和熊果苷，还没有被证实具有临床效果；氢醌，一种广泛应用的祛斑美白药物，研究发现对黑色素细胞具有细胞毒性，是潜在的有丝分裂物。克服这些缺点的一个可能的方向是应用从天然物中提取的混合物，利用混合物中的各种成分的不同作用机制以抑制酪氨酸酶和过氧化物酶等，以联合的方式起到抑制黑色素生成的作用。因此，从天然产物中提取化合物已成为化妆品的研究热点，以满足人们对祛斑美白产品的巨大需求。

发明内容

针对现有技术的美白祛斑活性成分存在的不足，本发明的目的旨在提供一种更为有效与安全的美白祛斑活性成分-灯盏花甲醇提取物，以制备皮肤美白或祛斑化妆品、抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的药物组合物和抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的食品。

为了解决本发明所要解决的上述技术问题，本发明的发明者进行了深入研究和反复实验，发现灯盏花甲醇提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的作用，从而完成了本发明。

灯盏花，又名灯盏细辛，为菊科植物短葶飞蓬(Erigeron Breviscapus(Vant.)Hand-Mass)的全草，是主要产于中国西南地区的一种中草药，具有祛风除湿、活血化瘀、消炎止痛等功效，临床上用于治疗血栓形成等多种心脑血管疾病。但至今为止，还没有发现任何有关灯盏花甲醇提取物具有皮肤美白功效的报道。

本发明所述的灯盏花甲醇提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑素生成作用，因此，本发明的灯盏花甲醇提取物可用于与皮肤美白祛斑有关症状的预防和治疗，具体来说，可用于制备皮肤美白或/和祛斑化妆品、制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的医药品，以及制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的食品等。

就灯盏花而言，其作为原料使用的部位不受特殊限制，可以是茎、叶、花、果实等，而且可以采集后立即提取，也可以干燥后再提取，优选将茎干燥后提取。

作为本发明中灯盏花的甲醇提取法，不受特殊限制，通过使溶剂与灯盏花接触来实施。提取可以在常温下进行，也可以在加温下进行。提取温度不受特殊限制，操作上优选小于或等于溶剂的沸点，提取所需时间根据温度条件、提取方法的不同而不同，通常大于等于1小时。

本发明的提取物可制成经口用(内服)和非经口用(外用)的两种制品形式。经口用时，可把本发明提取物配成医药品或食品等形式。非经口用时，可配成化妆品、医药外用品、皮肤外用剂等形式。

本发明用途之一的化妆品可以是包括软膏剂、溶液、乳霜、乳液、化妆水、洗剂、凝胶、美容液、粉底霜、填塞物、面膜、口红、粘粘剂、淋浴液等各种皮肤外用剂在内的任何一种形式的化妆品。

本发明的提取物可以制备成目前流通的任何一种化妆品剂型。例如能制成溶液、悬浮剂、乳化剂、膏状、凝胶、奶液、粉、香皂、含表面活性剂的清洁剂、油、干粉、粉底乳液、湿粉、喷剂等各种剂型。

本发明的用途之二的医药品，可制成任何给药方式的医药制品，为各种医药制剂形式。医药品制剂包括溶液剂、糖浆剂、注射剂、吸入剂、乳剂等液体制剂和片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、吸入剂等固体剂，以及软膏皮肤外用剂和栓剂等外用制剂。

本发明的用途之三的食品是指保健食品，包括饼干点心、饮料、蔬菜或果品加工品、畜肉制品和调味品等。其形式有粉末、固形制品、溶液等。根据其目的和制品形式，可适当调整食品中灯盏花甲醇提取物的配比量。

在不影响本发明效果的条件下，以本发明的灯盏花甲醇提取物制备的化妆品、医药品、食品等制品中，还可添加灯盏花甲醇提取物之外的常用于化妆品、医药品和食品的其他成分。

对于化妆品，可添加油性成分、粉末、表面活性剂、保湿剂、增粘剂、低级醇、皮膜剂、多价鳌合剂、有机胺、pH调节剂、药效成分、糖类、防腐剂、维生素类、其他美白剂、防氧化剂、香料和水等。

所述油性成分包括：液体石蜡、大颗粒蜡、三十碳烷基等碳氢化合物；硬脂酸等高级脂肪酸类；十六烷醇、硬脂醇等高级醇；辛酸三甘油酯、十四烷酸异丙醇、苹果酸二异硬脂酸酯、二-2-庚基十一烷酸甘油酮、三-2-乙基己酸三羟甲基丙烷等。根据化妆品的性状和剂型，可适当选择调整化妆品中的油性成分含有量。

所述粉末成分包括：滑石粉、云母、高岭土、二氧化硅、氧化锌、云母钛、氧化钛、氧化铁、尼龙粉末等。

所述表面活性剂包括：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯等非离子表面活性剂；十六烷酸钠等阴离子表面活性剂；氧化硬脂酸三甲基铵等阳离子表面活性剂；磺基三甲铵乙内酯型两性表面活性剂。

所述保湿剂包括：甘油、1，3-丁二醇、聚乙二醇等。

所述增粘剂包括：羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素、聚乙烯醇等水溶性高分子，膨润土等粘土矿物。

所述多价螯合剂包括：EDTA.4Na、柠檬酸等。低级醇包括乙醇等。

所述有机胺类包括：乙醇胺和三乙醇胺等。

所述pH调节剂包括；乳酸-乳酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠等缓冲液。

所述药效成分包括；泛酸醇乙醚和甘草酸盐等。

所述糖类包括：蔗糖、葡萄糖、果糖、透明质酸等。

所述防腐剂包括：氨基乙基苯酸、对氨基丁基苯酸、安息香酸钠等。

所述维生素类包括：维生素B类、维生素C及其衍生物、维生素E及其衍生物。

所述美白剂包括：抗坏血酸及其衍生物、曲酸及其衍生物、甘草提取物、氢醌衍生物、谷胱甘肽等。

所述防氧化剂包括：生育酚类、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯等。

对于医药品，可添加赋形剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、吸收促进剂、pH调节剂、表面活性剂、稀释剂、载体等添加成分。这些添加成分可以是淀粉、乳糖等糖类；硫酸镁、滑石粉、明胶、羟丙基纤维素等纤维素衍生物；大豆油、芝麻油、动物油或合成油等油类；橡胶；生理盐水等水分；乙醇、1，3-丁二醇、聚二烯醇等醇类。另外，还可在上述配制化妆品的成分中选择添加成分。

对于食品，可添加甜味剂、酸味剂、保存剂、香料、着色剂、赋形剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、吸收促进剂、pH调节剂、表面活性剂、稀释剂、载体等添加成分。这些添加成分包括蘑菇提取液、人参提取液、生姜提取液、蜂蜜等各种食品提取液、液状食品。作为糖类可以是环状低聚糖、还原麦芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖脂肪酸酯等糖类。另外，还可在上述配制化妆品和医药品的成分中选择添加成分。

灯盏花甲醇提取物临床上被批准用于治疗脑血栓形成的多种心脑血管疾病已有多年，已证明安全无毒。本发明的发明人在研究中发现并通过实验证明灯盏花甲醇提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑素生成，即有效地抑制皮肤的色素沉积，药理作用强，对皮肤没有副作用，可美白紫外线照射后晒黑的皮肤，预防、改善和治疗因日晒引发的老人斑、雀斑、红斑等皮肤色素沉积症状，为灯盏花甲醇提取物发掘了一个全新的医疗用途，开拓了一个新应用领域，预示着灯盏花甲醇提取物有更好的药用前景。作为灯盏花甲醇提取物生产原料的灯盏花，其茎、叶、花、果实等都可作为原料，而且可以采集后立即用于提取，也可以干燥后再进行提取，来源丰富，价格低廉。灯盏花甲醇提取物的提取制备工艺成熟，操作易于掌握。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，阐述灯盏花甲醇提取物在美白祛斑防治中的有益效果。

实施例1——灯盏花甲醇提取物提取制备

灯盏花甲醇提取物可通过以下方法制备：干燥的灯盏花全枝茎500g，用甲醇在室温下浸泡12小时左右，浸泡提取结束后，经过滤、减压浓缩、干燥成粉末即为灯盏花甲醇提取物。

实施例2——灯盏花甲醇提取物对纯化蘑菇酪氨酸酶的抑制作用：

试验方法：将蘑菇酪氨酸酶(Sigma，E.C.1.14.18.1)用于研究试验例1制备的粉末灯盏花提取物的抑制活性。将酪氨酸酶溶解于1/15M的磷酸缓冲液(PH6.8)，使酶溶液的浓度为368U/ml。作为底物，在1/15M的磷酸缓冲液(PH6.8)中溶解L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，使L-DOPA浓度为5mM/ml。灯盏花甲醇提取物用蒸馏水配制成0，125，250，500，1000，2000μg/ml5个浓度。以上溶液均为现用现配。

在25℃，依次向试管中加入5mM的左旋多巴(L-DOPA)0.8ml、1/15M的PBS(PH6.8)1.2ml以及0.1ml的受试物，阴性对照组加入等量蒸馏水，37℃孵育5min，再加入368U/ml的蘑菇酪氨酸酶0.3ml，调节紫外分光光度计的波长为A475，测定反应0.5min和2min后的光吸收值，用L-DOPA的自身氧化作参比。使用曲酸作为阳性对照。实验重复3次。

根据以下公式计算酶抑制率＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)

其中：

A：阴性对照组2分钟时475nm处吸光度；

B：阴性对照组0.5分钟时475nm处吸光度；

C：受试物组2分钟时475nm处吸光度；

D：受试物组0.5分钟时475nm处吸光度。

实验数据经统计后显示125～1000μg/ml的灯盏花甲醇提取物对酪氨酸酶活性具有抑制作用，抑制率为9.49％～73.33％，且随浓度增加，抑制作用也逐渐增加，并呈剂量依赖性(P＜0.05)。

表1灯盏花提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用

受试物	浓度(μg/ml)	酶抑制率(％)
			阴性对照	0	0
灯盏花甲醇提取物曲酸(阳性对照)	125250500100020006.2512.52550100	9.43±1.4729.10±2.6247.47±4.6973.14±2.1696.05±1.6420.558±3.6232.68±2.9550.39±2.5676.74±1.37103.5±8.51

实施例3-灯盏花甲醇提取物对B16小鼠黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用

试验方法：B16小鼠黑色素瘤细胞(四川大学卫生部移植工程与移植免疫重点实验室提供)，将培养的细胞消化配置成单个细胞悬液后，以1×10⁵/ml细胞密度接种于6孔板，将6孔板放入CO₂孵箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下，培养24小时后添加含受试物的培养液2ml，72h后消化并收集细胞。用离心机以1000r/min频率离心5min，用PBS洗2次，加入PBS制成细胞悬液。计数细胞密度后，调整细胞密度为1×10⁶/ml。取1ml细胞悬液离心后弃去上清液，加入1％Triton X-100(用PH7.4的磷酸缓冲液S配制)1ml，迅速放入-80℃冰箱冷冻，30min后取出在37℃溶解，加入5mM的L-DOPA 2ml。调节紫外分光光度计的波长为A475，测定即时反应的光吸收值；再置于37℃条件下30min后测定光吸收值。均用L-DOPA的自身氧化作为参比。以曲酸作为阳性对照。实验重复3次。

根据以下公式计算酶抑制率＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)

其中：

A：阴性对照组37℃孵育30分钟后475nm处吸光度；

B：阴性对照组37℃孵育前475nm处吸光度；

C：受试物组37℃孵育30分钟后475nm处吸光度；

D：受试物组37℃孵育前475nm处吸光度；

实验数据经统计后显示31.25～250μg/ml灯盏花甲醇提取物对活体B16细胞的酪氨酸酶的活性和细胞内黑素含量有抑制作用，酶抑制率为9.95％～80.36％，且随着浓度的增加其对活体细胞酪氨酸酶活性的抑制作用越强，并呈剂量依赖性(P＜0.05)。见表2。

表2灯盏花甲醇提取物对B16细胞酪氨酸酶活性的影响

受试物	浓度(μg/ml)	黑素生成抑制率(％)
			阴性对照DHZ曲酸(阳性对照)	031.2562.51252506.2512.52550	04.33±1.2524.86±5.6355.46±6.5569.22±9.4713.80±3.5818.01±4.6344.65±9.3577.42±8.27

实施例4-灯盏花甲醇提取物对B16小鼠黑色素瘤细胞内黑素生成的抑制作用

试验方法：

(1)黑素标准曲线的制作：用含10％DMSO的1mol/lNaOH溶液配制6个黑素(Sigma)溶液浓度，分别为0、40、80、120、160、200μg/ml，各浓度终体积均为3ml。将配置好的黑素系列液置于80℃水浴中30分钟后，调节紫外分光光度计的波长为475nm，测定黑素系列液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标绘制黑素标准曲线。

(2)蛋白含量标准曲线的制作及细胞悬液蛋白浓度的测定：按照蛋白分析试剂盒(Bio-Rad)进行。

(3)B16小鼠黑色素瘤细胞将培养的细胞消化配置成单个细胞悬液后，以1×10⁵/ml细胞密度接种于6孔板，将6孔板放入CO₂孵箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下，培养24小时后添加含受试物的培养液2ml，72h后消化并收集细胞。用离心机以1000r/min频率离心5min，用PBS洗2次，加入PBS制成细胞悬液。计数细胞密度后，调整细胞密度为1×10⁶/ml。取上述细胞悬液1ml离心去上清液，加入3ml含10％DMSO的1mol/l NaOH溶液，80℃水浴30min，测定A475。根据黑素标准曲线计算黑素含量，用蛋白含量进行校正。按公式(i)黑素含量＝黑素浓度/蛋白含量、公式(ii)黑素生成抑制率＝(对照黑素含量-药物黑素含量)/对照黑素含量，求出黑素生成抑制率。

实验数据经统计后显示31.25～250μg/ml灯盏花甲醇提取物对活体B16细胞的酪氨酸酶的活性和细胞内黑素含量有抑制作用，黑素生成抑制率为4.33％～69.22％，且随着浓度的增加其对活体细胞黑素生成的抑制作用越强，并呈剂量依赖性(P＜0.05)。见表3。

表3灯盏花甲醇提取物对B16细胞黑素含量的影响

受试物	浓度(μg/ml)	黑素生成抑制率(％)
			阴性对照DHZ曲酸(阳性对照)	031.2562.51252506.2512.52550	04.33±1.2524.86±5.6355.46±6.5569.22±9.4713.80±3.5818.01±4.6344.65±9.3577.42±8.27

实施例5-灯盏花甲醇提取物毒理学评价(第一阶段和致突变评价)

(1)第一阶段评价

试验所用动物均由由四川省医科院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(川)2004-16号。实验前检疫一周，整个实验过程中，动物饲养于屏障级动物房(许可证号：四川省实验动物管理委员会第011号)，动物自由摄食和饮水，动物房温度20℃～24℃，相对湿度60％～75％。

a)大鼠急性经口毒性试验：采用最大限量法。设5000mg/kg一个剂量组，20只SD大鼠，雌雄各半。以1ml/100g.bw于动物空腹下一次性灌胃染毒。灌胃后观察其中毒症状、体征，连续观察二周，判定毒性分类。

灯盏花甲醇提取物5g/kg.bw剂量经口染毒后，两周内未见动物死亡，亦无明显的中毒症状或不良反应，结果见表4。两周实验结束后剖杀全部动物，内脏器官未见明显异常改变。即灯盏花甲醇提取物对雌、雄性SD大鼠的急性经口MTD大于5g/kg.bw，属实际无毒类。

表4灯盏花甲醇提取物对SD大鼠的急性经口毒性试验结果

动物品系	性别	动物数(只)	剂量(g/kg.bw)	死亡动物数(只)	MTD(g/kg.bw)	结论
							SD大鼠	雄雌	1010	55	00	＞5＞5	实际无毒实际无毒

b)大鼠急性经皮毒性试验：采用最大限量法。设5000mg/kg一个剂量组，20只SD大鼠，雌雄各半。备皮：剪去大鼠脊柱两侧的被毛，去毛面积为4×5cm²。24h后确认无皮肤损伤，以1ml/100g.bw将该剂量组溶液滴于6层纱布上，贴敷于已去毛的皮肤上，覆盖称量纸，胶布固定。4h后，取下纱布，洗去残留物，观察其中毒症状、体征，连续观察二周，判定其毒性分类。

灯盏花甲醇提取物5g/kg.bw剂量经皮染毒后，两周内未见动物死亡，亦无明显的中毒症状或不良反应，结果见表5。两周实验结束后剖杀全部动物，内脏器官未见明显异常改变。即灯盏花甲醇提取物对雌、雄性SD大鼠的急性经皮MTD大于5g/kg.bw，属实际无毒类。

表5灯盏花甲醇提取物对SD大鼠的急性经皮毒性试验结果

动物品系	性别	动物数(只)	剂量(g/kg.bw)	死亡动物数(只)	MTD(g/kg.bw)	结论
							SD大鼠	雄雌	1010	55	00	＞5＞5	实际无毒实际无毒

c)皮肤刺激性试验

家兔急性皮肤刺激试验：白色家兔4只，剪去脊柱两侧的被毛，去毛面积两侧各为2×3cm²，24h后确认无皮肤损伤，将0.5mg灯盏花甲醇提取物原粉涂布在已去毛的兔背右侧皮肤上，左侧用蒸馏水作对照，覆盖2层纱布和称量纸，胶布固定。持续4h后，取下纱布，洗去残留物，观察去除受试物后的1、24、48及72h的皮肤刺激反应和恢复情况，计算刺激反应的平均分值，作出评价。

多次皮肤刺激性试验：白色家兔4只，剪去脊柱两侧的被毛，去毛面积两侧各为2×3cm²，24h后确认无皮肤损伤，将0.5mg灯盏花甲醇提取物原粉涂布在已去毛的兔背右侧皮肤上，左侧用蒸馏水作对照，每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水清除残留受试物。一小时后观察结果，计算刺激反应的平均分值，作出评价。

灯盏花甲醇提取物对四只家兔急性皮肤刺激反应和多次皮肤刺激反应的红斑、水肿形成评分之和的均值最高为0，见表6，7。根据评判标准，表明灯盏花甲醇提取物对家兔皮肤无刺激性。

表6灯盏花甲醇提取物对家兔皮肤刺激试验结果

动物编号	性别	1小时				24小时				48小时				72小时
																		受试物		对照		受试物		对照		受试物		对照		受试物		对照
		红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿
																		1234	雄雄雌雌	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000	0000
积分均值		0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
																		刺激强度		无刺激		无刺激		无刺激		无刺激		无刺激		无刺激		无刺激		无刺激

表7灯盏花甲醇提取物对家兔多次皮肤刺激性试验结果

涂抹天数	动物数(只)	刺激反应积分
								受试物			对照
		红斑	水肿	总分	红斑	水肿	总分
								1234567891011121314	44444444444444	00000000000000	00000000000000	00000000000000	00000000000000	00000000000000	00000000000000
14天每只动物积分均值		0	0	0	0	0	0
								每天每只动物积分均值		0	0	0	0	0	0

d)家兔眼刺激试验：白色家兔4只，确认无眼疾病后，在一侧眼结膜囊中滴入0.1mg的灯盏花甲醇提取物原粉，另一侧眼作空白对照。观察滴眼后1、24、48、72h及4、7d的眼结膜、虹膜、角膜的刺激反应和恢复情况，计算眼刺激积分指数，作出评价。

灯盏花甲醇提取物对四只家兔眼睛急性刺激反应的最高刺激指数均值为0.25，见表8，24h后为0，根据评判标准，表明灯盏花甲醇提取物对家兔眼睛无刺激性。

表8灯盏花甲醇提取物对家兔眼睛刺激性试验结果

动物编号	部位	眼刺激反应积分								刺激强度
												1小时		24小时		48小时		72小时
		样	对	样	对	样	对	样	对											样	对
										1234	结膜虹膜角膜积分结膜虹膜角膜积分结膜虹膜角膜积分结膜虹膜角膜积分	0.500000000.50000000	0000000000000000	0000000000000000	0000000000000000	0000000000000000	0000000000000000	0000000000000000	0000000000000000			无刺激无刺激无刺激无刺激	无刺激无刺激无刺激无刺激
总积分		1	0	0	0	0	0	0	0											无刺激	无刺激
										平均刺激指数		0	0	0	0	0	0	0	0

e)豚鼠皮肤致敏试验：60只成年豚鼠，随机分为3个组，即受试物组、阴性对照组和阳性对照组。每组20只，雌雄各半。经预试，灯盏花甲醇提取物对皮肤无明显刺激，正式试验采用原粉。阳性药物用2％的2，4-二硝基氯苯。试验方法如下：致敏接触。试验前24h剪去豚鼠背部左侧的被毛，面积为3×3cm²。24h后确认无皮肤损伤，分别将涂有0.2mg的灯盏花甲醇提取物或0.2ml的2％的2，4-二硝基氯苯的滤纸贴敷于豚鼠已去毛区，封闭固定，持续6h后，去除斑贴，洗去残留物。第7天和第14天以同样方法各重复诱导一次。阴性对照组不经致敏诱导。激发接触：于末次致敏后15d，用上述方法在另一侧已去毛皮肤进行激发接触试验；阴性对照组仅用受试物进行激发接触。激发接触后24h和48h观察皮肤反应，进行评分，判定受试物的致敏强度。

阴性对照组动物均未出现皮肤变态反应，阳性对照组豚鼠经三次诱导和一次激发后，所有动物均出现不同程度红斑、水肿，致敏率达100％，提示本试验系统是可靠的。而经灯盏花甲醇提取物三次诱导、二次激发试验组动物均未出现红斑和水肿，致敏率为0％，见表9。试验结果表明灯盏花甲醇提取物对豚鼠皮肤属弱致敏物。

表9灯盏花甲醇提取物对豚鼠皮肤变态反应试验结果

组别	动物数	诱导剂量	激发剂量	观察时间(h)	皮肤反应强度									≥2的动物数(％)
															红斑					水肿
					0	1	2	3	4	0	1	2	3
															阴性对照受试物组阳性对照	202020	00.2mg0.2ml	0.2mg0.2mg0.2ml	244824482448	10010010010000	000000	00001510	00004530	00004060	10010010010000	00002010	00003025	00005065	00100

注：在皮肤反应强度栏为当皮肤反应积分为0、1、2、3...时，发生反应的动物数占受试动物数的比例

(2)致突变试验

a)Ames试验：采用经鉴定符合要求的TA97、TA98、TA100和TA102菌株，进行加与不加大鼠肝S9的标准平皿掺入法试验(S9mix用量为0.5ml/皿)。设四个灯盏花甲醇提取物剂量组：40、200、1000和5000μg/皿(准确称取受试物1.0g，加蒸馏水至20ml得最高工作浓度50mg/ml，取该液100μl加入平皿为最高终浓度5000μg/皿。其它浓度以最高工作浓度为基础，依次用蒸馏水5倍往下稀释)，同时设自发对照、溶剂对照(蒸馏水100μl/皿)和阳性对照。不加S9试验的阳性对照为2，4，7-TNFone(0.2μg/皿，适用菌株TA97、TA98)；4-NQNO(0.5μg/皿，适用菌株TA100)、MMC(0.5μg/皿，适用菌株TA102)；加S9试验的阳性对照为2-AF(10.0μg/皿，适用菌株TA97、TA98、TA100)、1，8-二羟基蒽醌(Dan)(50.0μg/皿，适用菌株TA102)。每个试验剂量作三个平行皿，重复试验一次。

本试验结果表明，无论加与不加S9的试验，自发对照组的每皿平均回变菌落数均在正常值范围内，而阳性对照组诱发的每皿平均回变菌落数均为自发对照组二倍以上，呈明显阳性反应。灯盏花甲醇提取物各剂量组的平均回变菌落数均未超过溶剂对照组的一倍，呈阴性反应，即灯盏花甲醇提取物无诱导试验菌株回复突变的作用。

b)体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：以CHL细胞(中国仓鼠肺成纤维细胞系，由上海细胞生物学研究所提供)进行加与不加S9的染色体畸变试验。用MTT法检测灯盏花甲醇提取物对CHL细胞的半数生长抑制浓度(IC₅₀)，得灯盏花甲醇提取物(24h)IC₅₀为5.92mg/ml。正式试验设5.92，2.96，1.48mg/ml三个剂量组，同时设立阴性对照(不含血清MEM培养基)和阳性对照，加S9试验增设S9对照。不加S9试验的阳性对照为MMC(0.5μg/ml，作用24小时)，加S9试验的阳性对照为CP(20μg/ml，作用6小时)，阳性对照均采用1％体积比加至5ml的MEM培养基中。每个试验剂量作两个平行样，重复试验一次。

按5～10×10⁴个/ml的密度接种细胞，24小时贴壁后进行实验。不加S9时，每个25ml培养瓶内加入5ml MEM受试物浸提液，处理6小时或24小时。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10％新生小牛血清的培养液5ml，放回培养箱，于24h内收获细胞；加S9时，每个25ml的培养瓶内加入4.5ml MEM受试物浸提液，0.5ml S9混合液，处理6小时或24小时后，弃培养液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10％新生小牛血清的培养液5ml，放回培养箱，于24h内收获细胞。于收获前4h，加入终浓度为0.2μg/ml秋水仙碱，培养4小时后收获细胞，低渗、固定后常规制片染色，每个剂量组油镜下观察分裂中期相细胞100个，记录畸变类型，计算细胞染色体畸变率(％)。

试验结果表明，无论是培养6小时或24小时两个时间段，加S9与不加S9，阳性对照组的染色体畸形率显著高于空白对照组(P＜0.01)，畸变类型以断裂、缺失和交换为主；灯盏花甲醇提取物各剂量组和S9对照组的染色体畸形率均＜5％，且与空白对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)，即灯盏花甲醇提取物在CHL细胞染色体畸变试验中为阴性结果。

Claims (8)

1.灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用。

2.如权利要求1所述灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征是灯盏花甲醇提取物在制备皮肤美白或/和祛斑化妆品中的应用。

3.如权利要求1所述灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征是灯盏花甲醇提取物在制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成药物中的应用。

4.如权利要求1所述灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征是灯盏花甲醇提取物在制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成食品中的应用。

5.如权利要求2所述的灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征是所述化妆品为软膏剂、溶液、乳霜、乳液、化妆水、洗剂、凝胶、美容液、粉底霜、填塞物、面膜、口红、粘粘剂和淋浴液中的一种形式。

6.如权利要求2或5所述的灯盏花甲醇提取物在在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征在于所述化妆品中添加有油性成分、粉末、表面活性剂、保湿剂、增粘剂、低级醇、皮膜剂、多价鳌合剂、有机胺、pH调节剂、药效成分、糖类、防腐剂、维生素类、其他美白剂、防氧化剂、香料和水中的至少一种。

7.如权利要求3所述的灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征在于所述药物中添加有赋形剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、吸收促进剂、pH调节剂、表面活性剂、稀释剂和载体中的至少一种。

8.如权利要求4所述的灯盏花甲醇提取物在皮肤美白祛斑防治中的应用，其特征在于所述食品中添加有可添加甜味剂、酸味剂、保存剂、香料、着色剂、赋形剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、吸收促进剂、pH调节剂、表面活性剂、稀释剂和载体中的至少一种。