CN101123942A - 具有保湿和抗皱纹性质的透明质酸级分 - Google Patents

具有保湿和抗皱纹性质的透明质酸级分 Download PDF

Info

Publication number
CN101123942A
CN101123942A CNA2005800458485A CN200580045848A CN101123942A CN 101123942 A CN101123942 A CN 101123942A CN A2005800458485 A CNA2005800458485 A CN A2005800458485A CN 200580045848 A CN200580045848 A CN 200580045848A CN 101123942 A CN101123942 A CN 101123942A
Authority
CN
China
Prior art keywords
definition
product
compositions
hyaluronic acid
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800458485A
Other languages
English (en)
Inventor
卡迪贾·施瓦切-阿布-德拉维
索伦·霍尔拜伊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes Biopharma DK AS
Original Assignee
Novozymes Biopolymer AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes Biopolymer AS filed Critical Novozymes Biopolymer AS
Publication of CN101123942A publication Critical patent/CN101123942A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Abstract

保湿、化妆或抗皱纹产品包含透明质酸或其盐，其中透明质酸或其盐的平均分子量范围是0.7－0.9MDa，包含所述产品的组合物，以及所述产品的用途。

Description

具有保湿和抗皱纹性质的透明质酸级分
发明领域
本发明涉及包含透明质酸或其盐的保湿、化妆或抗皱纹产品，其中透明质酸或其盐的平均分子量范围是0.7-0.9MDa，还涉及包含这种产品的组合物，以及所述产品和组合物的用途，例如在皮肤或透皮施用(application)中的用途和用于化妆乳膏或洗液的用途，其中HA级分兼具保湿和抗皱纹的性质。
发明背景
体内最丰富的杂多糖是糖胺聚糖。糖胺聚糖是无分枝(unbranched)的糖类聚合物，由重复的二糖单元组成(仅硫酸角质素在糖的核心区域是分枝的)。二糖单元通常包含两种修饰糖——N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)——中的任一种作为第一糖单元。第二单元通常为糖醛酸，例如葡萄糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。
糖胺聚糖为带负电分子，具有伸展的构象，该构象在溶液中可提供高粘度。糖胺聚糖主要位于细胞表面上或细胞外基质中。糖胺聚糖还在溶液中具有较低的压缩性，因此是理想的生理润滑液，例如在关节。糖胺聚糖的刚性提供了细胞结构的完整性，并提供细胞之间的通路以供细胞迁移。生理上最重要的糖胺聚糖是透明质酸(hyaluronan)、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。大多数糖胺聚糖通过特定的寡糖结构共价结合于蛋白聚糖核心蛋白。透明质酸与特定的蛋白聚糖形成大的聚集物，但这是一个例外，因为游离糖链与蛋白多糖形成非共价复合物。
已经确认了透明质酸在体内的多种作用(参见，Laurent T.C.和Fraser J.R.E.，1992，FASEB J.6：2397-2404；及Toole B.P.，1991，“Proteoglycans andhyaluronan in morphogenesis and differentiation.”于Cell Biology of theExtracellular Matrix，pp.305-341，Hay E.D.编，Plenum，New York)。透明质酸存在于透明软骨、滑膜关节液和皮肤组织，真皮和表皮均有。透明质酸同样可能在许多生理机能中具有作用，例如粘附(adhesion)、发育、细胞运动、癌症、血管发生和伤口愈合。由于透明质酸独特的物理和生理特性，人们在眼科和关节手术中应用它，并正在评估其在其他医疗程序中的用途。
文献中使用术语“透明质酸”(hyaluronic acid)来意指具有不同分子量，由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺酸残基构成的酸性多糖，其天然存在于细胞表面，脊椎动物结缔组织的细胞外基质，关节的滑膜液，眼球内液，人类脐带组织和鸡冠中。
术语“透明质酸(hyaluronic acid)”事实上通常被用来描述包含交替的D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺酸残基、具有不同分子量的一整系列的多糖，或甚至其降解的级分，因此使用其复数术语“透明质酸(hyaluronic acids)”更加正确。然而，在该说明书中同样可使用单数术语；此外，将经常用缩写“HA”代替该集合性术语。
HA在生物体中起着重要作用，作为许多组织，例如皮肤、腱、肌肉和软骨的细胞的机械支撑，它是细胞间基质的主要组成部分。HA同样在生物过程中起着重要作用，例如组织的湿润和润滑。
HA可由上述天然组织中提取，但现今优选通过微生物学方法来制备它，以将转移传染物的潜在危险降至最低，并增加产品的均匀性、质量和可用性(WO 03/0175902，Novozymes)。
HA及其各种分子量的级分(fractions)和它们各自的盐已经用作药物，特别是在治疗关节病中，用作天然器官和组织的辅助物和/或替代物，特别是在眼科和美容手术中，并用作化妆制品中的作用剂。还开发了用于整形外科、风湿病和皮肤病的透明质酸产品。
HA还可作为用于卫生和手术用品的各种聚合物，例如聚氨酯、聚酯等的添加剂，具有使得这些材料具有生物相容性的作用。
在EP 0 161 887 B1中公开一种交联HA或其盐的制品，它是通过用多官能环氧化合物交联HA而制备的。在US 4,957,744中公开了HA与脂族醇所成的交联全酯或偏酯，以及这种偏酯与无机或有机碱形成的盐。
US 6673919 B2(Chisso Corp.公布日期06/01/2004)涉及一种通过O-乙酰化、烷氧基化、或交联由透明质酸或其盐构成的复合物和阳离子化合物溶液，来化学修饰透明质酸或其盐的方法。
FR 2707653(Vetoquinol)涉及生物相容性和生物可降解聚合物与分子之间，特别是包含活动氢(mobile hydrogen)的生物活性分子之间的偶联物；用于制备它的方法；和包含该偶联物的药物组合物。
已经公知，平均分子量为大约1-大约1.5MDa的HA高分子量级分可以在化妆品组合物，例如洗液和乳膏中提供优良的保湿性质。
HA的低分子量级分，通常具有大约0.02-大约0.4MDa的平均分子量，已经有报道称其显示抗皱纹性质，据称是由于这些级分能够渗透皮肤屏障。
保湿和抗皱纹性质在许多应用中都是非常理想的，而且同时显示两种性质的单一化合物具有巨大的商业利益。
发明概述
本发明人最近生产了平均分子量为大约0.7-大约0.9MDa的HA级分，并评估了这些级分的保湿和抗皱纹作用。
令人惊讶的是，发现平均分子量位于该范围内的HA级分同时显示保湿和抗皱纹的性质。
因此，本发明的第一个方面涉及保湿、化妆或抗皱纹产品，其包含透明质酸或其盐，其中透明质酸或其盐的平均分子量范围是0.7-0.9MDa。
在第二个方面中，本发明涉及一种组合物，其包含第一个方面定义的产品和活性成分，该活性成分优选是药理活性剂。
本发明的第三个方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的第一个方面定义的产品，以及药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
第四个方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的第一个方面定义的产品作为媒介物，以及药理活性剂。
第五个方面涉及一种化妆品，其包含有效量的如第一个方面定义的产品作为活性成分。
在第六个方面中，本发明涉及一种卫生、医疗或手术用品，其包含第一个方面定义的产品，优选所述产品是手术海绵、伤口愈合海绵，或者急救绷带(band aid)或其他伤口包扎(wound dressing)材料中包含的部分。
一个重要的方面涉及药物胶囊或微胶囊，其包含如第一个方面定义的产品。
本发明的最后诸方面涉及在眼科、骨关节炎或癌症治疗、伤口处理中执行程序的方法，药理活性剂的皮肤或透皮施用方法，或化妆品皮肤施用方法中的改进，所述改进包括使用第一个方面中定义的产品，或第二、第三或第四个方面中定义的组合物。
有多个方面涉及第一个方面中定义的产品或前述任一方面中定义的组合物在制造治疗骨关节炎、癌症的药物，制造用于眼科治疗的药物，制造用于处理伤口的药物，制造用于血管发生的药物，或制造保湿液中的用途。
定义
核酸构建体
此处“核酸构建体”定义为这样的单链或双链的核酸分子：它自天然存在的基因分离，或被修饰从而包含以自然界本不存在的其他方式组合和并置的核酸片段。当核酸构建体含有表达编码序列所需的所有控制序列时，术语核酸构建体可与术语表达盒同义。此处的术语“编码序列”定义为一种序列，当其被置于下述控制序列的控制之下时，被转录为mRNA并翻译为目标酶。编码序列的界限通常由位于mRNA 5’末端开放阅读框紧邻上游的核糖体结合位点和位于mRNA 3’末端开放阅读框架紧邻下游的转录终止序列决定。编码序列包括，但不限于，DNA、cDNA和重组核酸序列。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域公知的，包括，例如，从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。由这种基因组DNA克隆核酸序列可以通过，例如，使用抗体筛选表达文库以检测带有共同结构特征的克隆DNA片段，或公知的聚合酶链反应(PCR)来实现。参见，例如，Innis等，1990，PCR protocols：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链式反应、连接活化转录(ligated activated transcription)和基于核酸序列的扩增。克隆程序可包括切出和分离含有编码多肽的核酸序列的所需核酸片段，将该片段插入载体分子，并使该重组载体掺入芽孢杆菌(Bacillus)细胞，核酸序列的克隆将在该细胞中复制。核酸序列可以是基因组来源、cDNA来源、RNA来源、半合成来源、合成来源或其任意组合。
可用多种方法对编码酶的分离核酸序列进行操作，以为酶的表达提供条件。在插入构建体或载体之前操作核酸序列可能是理想的或者是必需的，这取决于表达载体或芽孢杆菌宿主细胞。利用克隆方法修饰核酸序列的技术在本领域是众所周知的。可以理解，还可以用本领域熟知的方法在宿主细胞内对所述核酸序列进行体内操作。
透明质酸的生物合成中涉及许多的酶。这些酶包括透明质酸合酶、UDP-葡萄糖6-脱氢酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、己糖激酶、葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶(mutase)和乙酰转移酶。透明质酸合酶是透明质酸生成中的关键酶。
此处的“透明质酸合酶(Hyaluronan synthase)”定义为催化透明质酸链通过增加GlcUA和GlcNAc糖前体而伸长的合酶。链球菌透明质酸合酶、脊椎动物透明质酸合酶和病毒透明质酸合酶的氨基酸序列显著不同于巴斯德菌(Pasteurella)的透明质酸合酶，人们已建议将它们分类为第I组和第II组透明质酸合酶，其中第I组透明质酸合酶包括链球菌透明质酸合酶(DeAngelis，1999)。对于在芽孢杆菌宿主细胞中生产透明质酸而言，较不优选真核来源的透明质酸合酶，例如哺乳类透明质酸合酶。
透明质酸合酶编码序列可以是能够在芽孢杆菌宿主细胞中表达的任何核酸序列。核酸序列可为任意来源。优选透明质酸合酶基因包括任意的第I组或第II组基因，例如来自似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)的第I组透明质酸合酶基因，或多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)的第II组透明质酸合酶基因。
在本发明的HA的生产中优选加入构建体，通过该构建体透明质酸的前体糖被供应给宿主细胞，该构建体或者被加入培养基中，或者被芽孢杆菌宿主细胞中的内源基因、非内源基因、或内源基因和外源基因的组合所编码。前体糖可以是D-葡糖醛酸或N-乙酰-葡糖胺。
在本发明的方法中，核酸构建体可进一步包括一种或更多编码透明质酸前体糖的生物合成中的酶的基因。作为选择，芽孢杆菌宿主细胞可进一步包括一种或更多第二核酸构建体，所述构建体含有一种或更多编码前体糖生物合成中的酶的基因。使用这样的构建体提高了透明质酸合酶的产量：所述构建体具有编码一种或多种基因的一种或多种核酸序列，所述基因指导透明质酸前体糖合成途径中的步骤。“指导透明质酸前体糖合成途径中的步骤”是指所述基因的表达蛋白在下述物质的形成中有活性：N-乙酰葡糖胺，或D-葡糖醛酸，或作为N-乙酰葡糖胺和D-葡糖醛酸之一的前体的糖。
在一个优选的提供前体糖的方法中，提供构建体来改善具有透明质酸合酶的宿主细胞的透明质酸产出，其通过下述手段实现：培养具有重组构建体的宿主细胞，所述重组构建体中异源启动子区可操作连接于编码基因的核酸序列，所述基因指导透明质酸前体糖合成途径中的步骤。在一个优选方法中，宿主细胞还包含这样的重组构建体：它具有启动子区，该启动子区可操作地连接于透明质酸合酶，该合酶可与N-乙酰葡糖胺生物合成所涉及的合酶的核酸序列使用相同或不同的启动子区域。在一个更优选的实施方案中，宿主细胞可具有这样的重组构建体：其中启动子区域可操作地连接于不同的核酸序列，这些核酸序列编码涉及透明质酸前体糖合成的第二基因。
因此，本发明还涉及用于改善透明质酸产出的构建体，其中通过使用这样的构建体改善透明质酸产出：它具有编码指导透明质酸前体糖合成途径中的步骤的基因的核酸序列。所述前体糖的核酸序列和编码所述透明质酸合酶的核酸序列可以从相同的或不同的启动子表达。
产生透明质酸前体糖的生物合成涉及的基因包括下列：UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因、己糖激酶基因、葡糖磷酸变位酶基因、酰胺转移酶基因、变位酶基因和乙酰转移酶基因。
在含有透明质酸合酶的细胞中，可以表达下述基因中的任一个，或两个或多个的组合，以增加透明质酸合酶可用的前体糖库：hasB、hasC和hasD，或它们的同源物，分别例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)tuaD、gtaB和gcaD，以及hasE。枯草芽孢杆菌基因组描述于Kunst等，Nature，390，249-256，“The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillussubtilis”(1997年11月20日)。在某些情况下，例如宿主细胞没有天然透明质酸合酶活性时，构建体可包括hasA基因。
编码生物合酶的核酸序列可以是宿主细胞天然具备的，而在其他情况下可利用异源序列。如果表达了两种或更多基因，它们可以是在天然操纵子中彼此伴随的基因，例如似马链球菌HAS操纵子的基因，该操纵子包括hasA、hasB、hasC和hasD。在另一种情况下，可能希望使用前体基因序列的某些组合而并不包括操纵子的全部元件。在另一些情况下，可能还优选使用一些宿主细胞的天然基因和一些外源基因。如何选择取决于下列因素：给定宿主细胞中可利用的糖库，细胞容纳过量生产而不影响宿主细胞其他功能的能力，以及细胞对天然基因和外源基因表达的调节是否不同。
例如，根据细胞的代谢需要和生长条件，以及可利用的前体糖库，通过表达编码UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的核酸序列(例如hasD基因、芽孢杆菌gcaD基因及其同源物)来增加N-乙酰-葡糖胺的产量可能是理想的做法。或者，前体糖可以是D-葡糖醛酸。在一个这样的实施方案中，核酸序列编码UDP-葡萄糖6-脱氢酶。这样的核酸序列包括芽孢杆菌tuaD基因、链球菌(Streptococcus)hasB基因及其同源物。核酸序列还可编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，例如在芽孢杆菌gtaB基因、链球菌hasC基因及其同源物中。在本发明的方法中，UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因可以是hasB基因或tuaD基因，或其同源物。
本发明中认为透明质酸合酶基因和编码前体糖的一种或多种基因受同一启动子的控制。作为选择，编码前体糖的一种或多种基因受同一启动子控制，但驱动透明质酸合酶基因的是不同的启动子。另一选择是，透明质酸合酶基因和编码前体糖的每一基因均受不同启动子控制。在一个优选实施方案中，透明质酸合酶基因和编码前体糖的一种或多种基因受同一启动子控制。
本发明还涉及一种核酸构建体，其包括编码透明质酸合酶操纵子的分离的核酸序列，该操纵子包括透明质酸合酶基因和UDP-葡糖6-脱氢酶基因，以及任选的一种或多种选自下组的基因：UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因和葡萄糖-6-磷酸异构酶基因。
在某些情况下，宿主细胞具有这样的重组构建体，其中异源启动子区可操作地连接于编码基因的核酸序列，所述基因指导透明质酸的前体糖的合成途径中的步骤，该步骤可以与透明质酸合酶从重组构建体的表达协同。透明质酸合酶可以从与编码前体生物合成涉及的酶的核酸序列相同或不同的启动子区表达。在另一优选实施方案中，宿主细胞可具有重组构建体，其中启动子区可操作地连接到一不同的核酸序列，该序列编码透明质酸前体糖合成涉及的另一基因。
编码前体糖生物合成中涉及的酶的核酸序列和编码透明质酸合酶的核酸序列可以从相同或不同的启动子表达。在前一种意义下，即构建成“人工操纵子(artificial operons)”，其可能模仿似马链球菌操纵子，具有hasA、hasB、hasC和hasD的每一个或其同源物，也可以使用似马链球菌操纵子中不到全部的成员。“人工操纵子”还可包括葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(hasE)和一种或多种选自下组的基因：己糖激酶基因、磷酸葡糖变位酶基因、酰胺转移酶基因、变位酶基因和乙酰转移酶基因。在人工操纵子中，至少一个元件与另一元件是异源的，例如启动子区域与编码序列异源。
在一个优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、tuaD和gtaB。在另一优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、tuaD、gtaB和gcaD。在另一优选实施方案中，核酸构建体包含hasA和tuaD。在另一优选实施方案中，核酸构建体包含hasA。在另一优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、tuaD、gtaB、gcaD和hasE。在另一优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、hasB、hasC和hasD。在另一优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、hasB、hasC、hasD和hasE。基于以上优选实施方案，提到的基因可用其同源物代替。
在本发明的方法中，核酸构建体含有透明质酸合酶编码序列，其可操作地连接于对透明质酸合酶编码序列外源的启动子序列。启动子序列可能是，例如，单个的启动子或串联的启动子。
此处“启动子”定义为参与RNA聚合酶的结合而引发基因转录的核酸序列。此处“串联启动子”定义为两个或更多启动子序列，其中每一序列可操作地连接于编码序列，并介导该编码序列转录为mRNA。此处“可操作地连接”定义为这样的构造，其中控制序列，例如启动子序列，被置于相对编码序列的适当位置，使该控制序列指导所述编码序列所编码的多肽的生成。如先前指出的，此处的“编码序列”定义为这样的核酸序列，其当被置于适当的控制序列控制之下时，被转录为mRNA并翻译为多肽。编码序列的边界通常由位于mRNA的5’末端的开放阅读框紧邻上游的核糖体结合位点和位于mRNA的3’末端的开放阅读框紧邻下游的转录终止子序列来决定。编码序列可包括但不限于基因组DNA、cDNA、半合成、合成和重组核酸序列。
在一个优选实施方案中，启动子可从细菌来源获得。在一个更优选的实施方案中，启动子获自革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌菌株，例如Bacillusagaraderhens、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞；或链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；或获自革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属的菌种(Pseudomonas sp.)。
本发明方法中指导核酸序列转录的合适启动子的例子有从下列来源获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dafA)、迟缓芽孢杆菌或Bacillus clausii碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(sutilisin Carlsberg)基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌粉虫亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)。其他启动子实例为spo1细菌噬菌体的启动子和tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA80：21-25)。此外的启动子描述于“Usefulproteins from recombinant bacteria”，Scientific American，1980，242：74-94，和Sambrook、Fritsch和Maniatus，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor，New York。
启动子还可以是“共有”(consensus)启动子，具有TTGACA的“-35”区序列和TATAAT的“-10”区序列。共有启动子可从能在芽孢杆菌宿主细胞中起功能的任何启动子获得。“共有”启动子可以这样构建：通过定点诱变产生更完美地符合已确立的枯草芽孢杆菌营养生长“σA型”启动子“-10”和“-35”区共有序列(Voskuil等，1995，Molecular Microbiology 17：271-279)的启动子。
在一个优选实施方案中，“共有”启动子是从得自下列来源的启动子获得的：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、Bacillus clausii或迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌粉虫亚种(subsp.tenebrionis)CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，或原核β-内酰胺酶基因spo1细菌噬菌体启动子。在一个更加优选的实施方案中，“共有”启动子获自解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)。
Widner等，美国专利号6,255,076和5,955,310，描述了用于在芽孢杆菌细胞中的表达的串联启动子和构建体及方法，包括短的共有amyQ启动子(也称scBAN)。所述文献中还描述了cryIIIA稳定子(stabilizer)序列和使用该序列的构建体用于改善芽孢杆菌中的生产的用途。
串联启动子的每一启动子序列可以是在所选择的芽孢杆菌细胞中显示转录活性的任意核酸序列，包括突变、截短和杂合的启动子，并且可以从编码与该芽孢杆菌细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。每一启动子序列对于所述编码多肽的核酸序列可以是天然的或外来的，并且对于所述芽孢杆菌细胞可以是天然的或外来的。这些启动子序列可以是相同的启动子序列或不同的启动子序列。
串联启动子中的两个或更多启动子序列可同时促进核酸序列的转录。或者，串联启动子中的一个或更多启动子序列可在芽孢杆菌细胞的不同生长阶段促进核酸序列的转录。
在一个优选的实施方案中，串联启动子至少包含解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因中的amyQ启动子。在另一优选实施方案中，串联启动子至少包含具有TTGACA序列的”-35”区和TATAAT序列的”-10”区的“共有”启动子。在另一优选实施方案中，串联启动子至少包含地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因的amyL启动子。在另一优选实施方案中，串联启动子至少包含cryIIIA启动子或其部分(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology 13：97-107)。
在一个更优选的实施方案中，串联启动子至少包含amyL启动子和cryIIIA启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少包含amyQ启动子和cryIIIA启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子至少包含具有TTGACA序列的”-35”区和TATAAT序列的”-10”区的“共有”启动子和cryIIIA启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子包含至少两个拷贝的amyL启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子包含至少两个拷贝的amyQ启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子包含至少两个拷贝的具有”-35”区的TTGACA和”-10”区的TATAAT序列的“共有”启动子。在另一个更优选的实施方案中，串联启动子包含至少两个拷贝的cryIIIA启动子。
此处的“mRNA加工/稳定序列”定义为如下所述的序列：其位于一个或多个启动子序列的下游及与该一个或多个启动子序列中的每一个可操作连接的编码序列的上游，使得从每一启动子序列合成的所有mRNA均可被加工生成5’末端具有稳定子序列的mRNA转录本。该稳定子序列在mRNA转录本5’末端的存在增加了这些转录本的半衰期(Agaisse和Lereclus，1994，前文，Hue等，1995，Journal of Bacteriology 177：3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌的16S核糖体RNA的3’末端互补。在一个优选实施方案中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的、含有位于转录本5’末端的稳定子序列的转录本。mRNA加工/稳定序列优选为一个与细菌的16S核糖体RNA3’端互补的序列。参见美国专利Nos.6,255,076和5,955,310。
在一个更优选的实施方案中，mRNA加工/稳定序列为公开于WO94/25612和Agaisse和Lereclus，1994，前文的苏云金芽孢杆菌cryIIIA mRNA加工/稳定序列，或其保持mRNA加工/稳定功能的部分。在一个更优选的实施方案中，mRNA加工/稳定序列为公开于Hue等，1995，前文的枯草芽孢杆菌SP82 mRNA加工/稳定序列，或其保持mRNA加工/稳定功能的部分。
当本发明的方法中应用所述cryIIIA启动子和其mRNA加工/稳定序列时，可以使用这样的DNA片段：它含有WO 94/25612和Agaisse和Lereclus，1994(同上)中所公开的序列，或其保留启动子功能和mRNA加工/稳定功能的片段。进一步地，可以使用本领域熟知的方法制备仅含有cryIIIA启动子或仅含有cryIIIA mRNA加工/稳定序列的DNA片段，以构建多种串联启动子与mRNA加工/稳定序列的组合。在这个实施方案中，所述cryIIIA启动子和其mRNA加工/稳定序列优选被置于组成该串联启动子的另外一个或多个启动子序列的下游，及目的基因编码序列的上游。
然后，可以对编码涉及透明质酸生产的目标酶的分离核酸序列作进一步的操作，改善该核酸序列的表达。“表达”应当理解为包括多肽生产中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰，和分泌。利用克隆方法来修饰核酸序列的技术在本领域是公知的。
包含编码酶的核酸序列的核酸构建体可以与一种或多种控制序列可操作地连接，其中该控制序列可以指导编码序列在与该控制序列相容的条件下在芽孢杆菌细胞中表达。
术语“控制序列”在本文中定义为包括所有对于核酸序列的编码序列的表达而言是必需或有利的组分。每一控制序列对于所述编码酶的核酸序列而言可以是天然的或外来的。除了上述的启动子序列以外，这样的控制序列还包括但不限于，前导序列、信号序列和转录终止子。至少，控制序列包含启动子和转录和翻译终止信号。控制序列可以具有接头，用于导入特定的限制位点，以促进控制序列与所述编码酶的核酸序列的编码区的连接。
控制序列也可以是适当的转录终止子序列，即由芽孢杆菌细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作地连接于编码所述酶或操纵子的最后一个酶的核酸序列的3’末端。在所选择的芽孢杆菌细胞中起作用的任何终止子都可用于本发明。
控制序列还可以是适当的前导序列，即对芽孢杆菌细胞翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码所述酶的核酸序列的5’末端。在所选择的芽孢杆菌细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。
控制序列还可以是信号肽编码区，它编码连接于多肽的氨基末端的氨基酸序列，该氨基酸序列可指导表达的多肽进入细胞的分泌途径。信号肽编码区域可以是对该多肽而言天然的，也可以从外部来源获得。核酸序列的编码序列的5’末端可固有地包含信号肽编码区，它与编码分泌多肽的编码区片段天然地共翻译阅读框连接。或者，编码序列的5’末端可以包含对编码序列的编码分泌多肽的部分而言是外来的信号肽编码区。如果编码序列通常不含有信号肽编码区，则可能需要外来的信号肽编码区。或者，外来的信号肽编码区可直接替换天然信号肽编码区，以使多肽分泌相对于通常于所述编码序列相关的天然信号肽编码区得到提高。该信号肽编码区可以从来自芽孢杆菌属菌种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。但能够指导表达的多肽进入所选择的芽孢杆菌细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明。
对于芽孢杆菌细胞，有效的信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌的prsA基因获得的信号肽编码区。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137中描述了更多的信号肽。
控制序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得到的多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(有时称作酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的，并可以通过催化或自主催化将前肽从多肽原中切割除去，而被转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可获自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE)和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)。
当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区位于靠近多肽氨基末端的位置，而信号肽区位于靠近前肽区的氨基末端位置。
添加可允许相对于宿主细胞的生长调节多肽表达的调节序列，也可能是理想的。调节系统的实例是能响应化学或物理刺激，包括调节化合物的存在，而引起基因表达的开启或关闭的那些系统。在原核系统中，调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。
生产
在本发明的方法中，利用本领域众所周知的方法在适于产生透明质酸的营养培养基中培养宿主细胞。例如，所述细胞可以通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料-分批、或固态发酵)来培养，上述培养在实验室或工业发酵罐中，于适当的培养基中，并在使得透明质酸合成中涉及的酶可以被表达且透明质酸可以被分离的条件下进行。培养在含有碳和氮源以及无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的程序进行。适宜的培养基可从商业供应商获得，或者可根据已公布的组成来制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录中)。被分泌的透明质酸可以直接从培养基中回收。
所得透明质酸可通过本领域已知的方法分离。例如，透明质酸可通过常规方法，包括但不限于：离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基中分离。分离的透明质酸可以通过本领域已知的多种方法进一步纯化，包括但不限于：层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如制备性等电聚焦)、溶解度差异(例如硫酸铵沉淀)、或萃取(例如参见Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
附图
图1：水化作用的短期评估。在所有时刻，活性乳膏均导致皮肤水化作用的平均基本值产生高度显著的变化。
图2：水化作用的长期评估。处理8周后，记录到水化作用显著提高了7％。
图3：单次施用后，透表皮水分损失(trans epidermal water loss，TEWL)的短期变化。施用活性乳膏60、90、120、180分钟后TEWL的平均基本值产生了显著变化。
图4：施用8周后的整体弹性。观察到整体弹性(R2)显著提高了27％。
发明详述
“透明质酸”在本文中定义为非硫酸化的糖胺聚糖，其由重复的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)二糖单位组成，这些二糖单位由交替的β-1，4和β-1，3糖苷键连接到一起。透明质酸又被称为hyaluronan，hyaluronate，或HA。在本文中术语hyaluronan和hyaluronic acid可以互换使用。
雄鸡鸡冠是透明质酸的重要商业来源。微生物是另一可选来源。美国专利No.4,801,539公开了一种制备透明质酸的发酵方法，其涉及一种兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)菌株，报道的产率为每升大约3.6g透明质酸。欧洲专利No.EP0694616公开了使用改进的兽瘟链球菌菌株的发酵方法，报道的产率为大约每升3.5g透明质酸。如WO 03/054163(Novozymes)所公开的(其以全文并入本文)，透明质酸或其盐可以重组生产，例如在革兰氏阳性的芽孢杆菌宿主中重组生产。
已经描述了来自脊椎动物、细菌病原体和藻类病毒的透明质酸合酶(DeAngelis，P.L.，1999，Cell.Mol.Life Sci.56：670-682)。WO 99/23227公开了来自似马链球菌的第I组透明质酸合酶。WO 99/51265和WO 00/27437描述了来自多杀巴斯德氏菌的第II组透明质酸合酶。Ferretti等人公开了酿脓链球菌的透明质酸合酶操纵子，其由hasA、hasB和hasC三个基因组成，这三个基因分别编码透明质酸合酶、UDP葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，4658-4663，2001)。WO 99/51265描述了具有似马链球菌透明质酸合酶的编码区的核酸区段。
由于重组芽孢杆菌细胞的透明质酸被直接表达到培养基中，可以利用简单的方法来从培养基分离该透明质酸。首先，从培养基中物理地去除芽孢杆菌细胞和细胞碎片。如果需要，可以先稀释该培养基以降低其粘度。本领域的技术人员知道很多从培养基中去除细胞的方法，例如离心或微滤。然后如果需要，可以过滤剩下的上清，例如通过超滤，来浓缩该透明质酸并从其中去除小分子的污染物。去除细胞和细胞碎片后，利用已知的方法将透明质酸从培养基中简单地沉淀下来。可以用盐、醇或盐和醇的组合来从滤液中沉淀透明质酸。透明质酸一旦变为沉淀，就可以通过物理手段容易地将其从溶液中分离出来。可以通过本领域已知的蒸发技术，例如冷冻干燥或喷雾干燥，从滤过溶液中干燥或浓缩透明质酸。
本发明的第一个方面涉及包含透明质酸或其盐的保湿、化妆或抗皱纹产品，其中透明质酸或其盐的平均分子量范围是0.7-0.9MDa。
宿主细胞
一个优选的实施方案涉及第一个方面的产品，其中透明质酸或其盐是重组生产的，优选通过革兰氏阳性细菌或宿主细胞，更优选通过芽孢杆菌属的细菌重组生产。
所述宿主细胞可以是任何适于透明质酸的重组生产的芽孢杆菌细胞。该芽孢杆菌细胞可以是野生型的芽孢杆菌细胞或其突变体。在本发明的实践中有用的芽孢杆菌细胞包括但不限于，Bacillus agaraderhens、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。WO 98/22598描述了被特别改造以适于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞。不产荚膜的(non-encapsulating)芽孢杆菌细胞在本发明中特别有用。
在一个优选的实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、Bacillus clausii、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是Bacillusclausii细胞。在另一个更优选的实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是迟缓芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在最优选的实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌A164Δ5(参见美国专利No.5,891,701)或枯草芽孢杆菌168Δ4。
用本发明的核酸构建体转化芽孢杆菌宿主细胞可以通过例如下列手段实现：原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，Molecular GeneralGenetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或接合(参见如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。
分子量
透明质酸的水平可以根据修改的咔唑法(Bitter和Muir，1962，AnalBiochem.4：330-334)来确定。另外，透明质酸的平均分子量可以使用本领域的标准方法来确定，例如Ueno等，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta 272：1-40；和Wyatt Technologies，1999，“Light Scattering University DAWN Course Manual”和“DAWN EOSManual”Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，California所描述的那些方法。
盐和交联HA
优选的实施方案涉及第一个方面的产品，其包括透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠，透明质酸钾，透明质酸铵，透明质酸钙，透明质酸镁，透明质酸锌，或透明质酸钴。
已经发现，透明质酸钠与聚乳酸单/双酰基氯反应可产生连接的或交联的HA-PLA或HA-PLA-HA产物，其在IR光谱上与未经处理的HA或PLA的标准光谱相比，在1736cm-1处显示有增强的峰，其对应于连接的HA-PLA产物中新形成的聚乳酸酯的存在。
因此，优选的实施方案涉及第一个方面的产物，其中透明质酸或其盐包含聚合α羟基酸的酯，优选聚乳酸或乙醇酸的酯。
还发现，用硼酸处理透明质酸钠溶液可产生交联的HA-硼酸(HA-borate)水凝胶，其在FT-IR光谱上与未经处理的Na-HA的标准光谱相比，于1200和945cm-1处显示有新峰，对应于交联的HA-硼酸水凝胶中新形成的硼酸酯的存在。
因此，一个优选的实施方案涉及第一个方面的产物，其中透明质酸或其盐包含硼酸酯。
在第一个方面产物的另一个优选实施方案中，透明质酸或其盐与二乙烯基砜(DVS)完全或部分交联。
保湿和抗皱纹作用
如下面的实施例所示，第一个方面的产物具有皮肤保湿的作用，在优选的实施方案中，当按照下文实施例中的定义测量时，在8周的时间里，皮肤保湿作用至少为3％，优选至少5％，更优选至少7％。
另外，第一个方面的产物能够提高整体皮肤弹性R2，在优选的实施方案中，当按照下文实施例中所定义的测量时，在8周的时间里，R2提高了至少10％，优选至少15％，更优选至少20％。
其他成分
在优选实施方案中，本发明的产品还可以包含其他成分，优选一种或多种活性成分，优选一种或多种药理活性物质，还优选水溶性赋形剂，例如乳糖。
在另一个优选实施方案中，本发明的产品还可包括一种或多种酶，优选连接酶、转移酶、氧化还原酶、水解酶、裂合酶和/或异构酶；更优选淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulytic enzymes)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶，更优选具有选自下组的活性的酶：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
可用于本发明的活性成分或药理活性物质的非限制性例子包括蛋白质和/或肽药物，例如人生长激素，牛生长激素，猪生长激素，生长激素释放激素/肽，粒细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，红细胞生成素，成骨蛋白，干扰素或其衍生物，胰岛素或其衍生物，心房肽(atriopeptin)III，单克隆抗体，肿瘤坏死因子，巨噬细胞活化因子，白介素，肿瘤变性因子，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，组织纤维蛋白溶酶原激活剂，因子IIV，因子IIIV，和尿激酶。
用了稳定所述活性成分，可以包含水溶性的赋形剂，这样的赋形剂可以包含蛋白质，例如白蛋白或明胶；氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和其盐；糖类例如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖和硫酸软骨素；无机盐例如磷酸盐；表面活性剂例如TWEEN(ICI)，聚乙二醇，和其混合物。所述赋形剂或稳定剂可以以所述产品重量的0.001-99％的量使用。
本发明的一些方面涉及多种组合物和药物，它们除了其他组分以外，还包含有效量的如所述第一个方面定义的产品和活性成分，优选该活性成分是药理活性剂；药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂，优选为水溶性的赋形剂，最优选为乳糖。
另外，本发明的一些方面涉及这样的物品，其包含如所述第一个方面定义的产品或如上述方面和实施方案所定义的组合物，例如化妆品、卫生用品、医疗或手术用品。本发明的最后一个方面涉及药物胶囊或微胶囊，其包含如第一个方面定义的产品或本发明其他方面和实施方案中定义的组合物。
产品或组合物的使用方法
本发明的多个方面涉及使用所述第一个方面的产品或使用本发明的组合物执行治疗程序，例如在医疗领域中执行治疗程序的方法。
一个方面涉及眼科中执行程序的方法，其包括使用如所述第一个方面所定义的产品或本发明的组合物。
另一个方面涉及骨关节炎的治疗中执行程序的方法，其包括使用如所述第一个方面所定义的产品或本发明的组合物。
另一个方面涉及癌症治疗中执行程序的方法，其包括使用如第一个方面所定义的产品或本发明的组合物。
一个方面是涉及药理活性剂透皮或皮肤施用的执行方法，其包括使用如第一个方面定义的产品或本发明的组合物。
另一个方面涉及进行化妆品皮肤施用的执行方法，其包括使用本发明的产品或组合物。
实施例
使用称为“活性乳膏”的下述配方的组合物来进行HA在化妆品制剂中的效能测试。
    成分     ％w/w
    水     74.20
    透明质酸钠(HA)     0.10
    氢化聚癸烯     20.00
    Steareth-2     3.00
    Steareth-21     1.00
    Ceteraryl醇     1.50
    丙二醇，二偶氮烷基脲
    羟苯甲酯，羟苯丙酯     0.20
“安慰剂乳膏”由相同成分构成，但没有HA。
实施例1.保湿效果(水化作用)
利用皮肤湿度测定(comeometry)来评估受测试者的皮肤表面水化作用，由此确定角质层(stratum corneum，SC)的电容，其精确地反映相对SC湿度。使用皮肤湿度仪(Corneometer)：Combi CM 825(Courage&Khazaka)进行测量。
水化作用的研究如下述进行：将乳膏施用在12位志愿者(女性，平均年龄38岁)的前臂上，然后比较由于施用活性乳膏和安慰剂乳膏导致的水化作用与未处理区域的水化作用。
在施用乳膏后较短的期间内(直到180min)评估水化作用；通过比较8周内的结果来评估较长期的水化作用。
短期水化作用的测量结果如图1所示。在所有时刻，活性乳膏均明显地引起皮肤水化作用的平均基本值发生了非常显著的变化。
长期评估结果如图2所示。在活性乳膏处理8周内，记录到水化作用显著提高了7％。
实施例2.透皮水分损失(TEWL)
透皮水分损失(TEWL)是用于评估对水化作用或保湿作用(moisturization)而言的皮肤屏障效率的重要参数。TEWL根据Fick扩散公式测量由皮肤表面释放的水蒸气。用于测量该参数的设备是Tewameter TM210(Courage&Khazaka)。在施用活性乳膏(0.1％HA)和安慰剂乳膏之后，对12位志愿受测试者进行测量，并对未处理的皮肤区域进行测量。
图3显示了单次施用后TEWL的短期变化。活性乳膏在施用后60、90、120和180min引起TEWL的平均基本值显著降低。
实施例3.抗皱纹效果(弹性)
抗皱纹研究如下进行：使用12位人类志愿受试者(女性，平均年龄46岁)，每天在面部施用乳膏两次，经过8周。所有的测试均在24℃和50％相对湿度(RH)的生物气候室内进行。
使用Cutometer SEM 575(Courage&Khazaka)测量受试者的皮肤弹性。Cutometer测量皮肤被吸入测量探头的开口中时的垂直变形(verticaldeformation)。这一方法提供了与皮肤弹性有关的如下变形参数：R0(最大变形)，R2(整体弹性)和R6(粘弹性比)。在用活性乳膏(包含0.1％HA)和安慰剂乳膏处理的8周时间里，在每次面部施用乳膏之后均进行弹性测试。
结果如图4所示。施用8周之后，观察到整体弹性(R2)显著提高了27％。
实施例4.皮肤形态(skin topography)
通过皮肤表面复制品和图象分析来评估皮肤表面的形态。测试的原理是通过施加快速硬化的合成聚合物(SILFLO-Flexico Ltd.UK.)来获得皮肤表面的负印记(negative imprint)。然后通过图象数字化对复制品进行分析。从该图象计算标准粗糙度参数Ra(平均粗糙度)和Rz(深皱纹的最大粗糙度)。
测试如下进行：每天用活性乳膏处理面部2次经8周，并与使用安慰剂乳膏进行比较。在用活性产品处理的区域中，在处理8周之后，平均最大粗糙度(Rz)值显著降低了10％。安慰剂处理的区域的Rz值没有显示出任何变化。

Claims (31)

1.保湿、化妆或抗皱纹产品，其包含透明质酸或其盐，其中透明质酸或其盐的平均分子量范围是0.7-0.9MDa。
2.根据权利要求1的产品，其中透明质酸或其盐是重组产生的，优选由革兰氏阳性细菌，更优选由芽孢杆菌属的细菌产生。
3.根据权利要求1或2的产品，其包含透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴。
4.根据权利要求1-3中任一项的产品，其在如本文所定义地进行测量时，经过8周的时间具有至少3％的皮肤保湿作用，优选至少5％，更优选至少7％的皮肤保湿作用。
5.根据权利要求1-4中任一项的产品，其在如本文所定义地进行测量时，经过8周的时间能够将整体皮肤弹性R2提高至少10％，优选至少15％，更优选至少20％。
6.根据权利要求1-5中任一项的产品，其中透明质酸或其盐包括硼酸和/或聚合α羟基酸的酯，优选聚乳酸或乙醇酸的酯。
7.根据权利要求1-6中任一项的产品，其中透明质酸或其盐与二乙烯基砜(DVS)完全或部分交联。
8.根据权利要求1-7中任一项的产品，其还包括活性成分，优选药理活性物质。
9.根据权利要求1-8中任一项的产品，其还包括水溶性赋形剂，优选乳糖。
10.组合物，其包括如权利要求1-9中任一项定义的产品和活性成分，优选地，该活性成分是药理活性剂。
11.根据权利要求10的组合物，其还包括水溶性赋形剂，优选乳糖。
12.药物组合物，其包括有效量的如权利要求1-9中任一项定义的产品，以及药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
13.药物组合物，其包括有效量的如权利要求1-9中任一项定义的产品作为媒介物，以及药理活性剂。
14.化妆品，其包括有效量的如权利要求1-9中任一项定义的产品作为活性成分。
15.卫生、医疗或手术用品，其包括如权利要求1-9中任一项定义的产品；优选所述用品是手术海绵、伤口愈合海绵，或者急救绷带或其它伤口包扎材料中包含的部分。
16.药物胶囊或微胶囊，其包括如权利要求1-9中任一项定义的产品。
17.眼科中执行程序的方法中的改进，包括使用如权利要求1-9中任一项定义的产品，或如权利要求10-13中任一项定义的组合物。
18.骨关节炎治疗中执行程序的方法中的改进，其包括使用权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物。
19.癌症治疗中执行程序的方法中的改进，其包括使用权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物。
20.进行药理活性剂的透皮施用的方法中的改进，其包括使用权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物。
21.进行药理活性剂的皮肤施用的方法中的改进，其包括使用权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物。
22.进行化妆品的皮肤施用的方法中的改进，其包括使用权利要求1-9中任一项定义的产品，或权利要求10-13中任一项定义的组合物。
23.一种眼科方法，其使用如权利要求1-9中任一项定义的产品，或如权利要求10-13中任一项定义的组合物。
24.一种治疗骨关节炎的方法，其包括对哺乳动物施用有效量的权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物，优选该施用是皮肤施用、透皮施用、口服施用或通过注射。
25.一种处理伤口的方法，其包括对哺乳动物施用有效量的权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物。
26.权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物在制造治疗骨关节炎的药物中的用途。
27.权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物在制造用于眼科治疗的药物中的用途。
28.权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
29.权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物在制造用于伤口处理的药物中的用途。
30.权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物在制造用于血管发生的药物中的用途。
31.权利要求1-9中任一项定义的产品或权利要求10-13中任一项定义的组合物在制造保湿剂中的用途。
CNA2005800458485A 2005-01-03 2005-12-22 具有保湿和抗皱纹性质的透明质酸级分 Pending CN101123942A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200500006 2005-01-03
DKPA200500006 2005-01-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101123942A true CN101123942A (zh) 2008-02-13

Family

ID=35840188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800458485A Pending CN101123942A (zh) 2005-01-03 2005-12-22 具有保湿和抗皱纹性质的透明质酸级分

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080274999A1 (zh)
EP (1) EP1835942A1 (zh)
JP (1) JP2008526693A (zh)
CN (1) CN101123942A (zh)
CA (1) CA2592860A1 (zh)
WO (1) WO2006072243A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106109265A (zh) * 2016-08-02 2016-11-16 山东华熙海御生物医药有限公司 一种透明质酸保湿组合物及其制备方法和应用
CN106137786A (zh) * 2016-08-02 2016-11-23 山东华熙海御生物医药有限公司 一种透明质酸抗衰组合物及其制备方法和应用
CN106998780A (zh) * 2014-07-22 2017-08-01 Hl科学株式会社 含有石榴浓缩物作为活性成分的用于改善皮肤的组合物
CN108992369A (zh) * 2018-07-02 2018-12-14 山东天晟生物科技有限公司 一种透明质酸、其制备方法和用途

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0618475B1 (pt) 2005-11-09 2016-10-11 Klox Technologies Inc composição, método para branqueamento de dentes e kit
WO2008003321A2 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Novozymes Biopolymer A/S Compositions with several hyaluronic acid fractions for cosmetic use
WO2008031196A1 (en) * 2006-09-13 2008-03-20 Enhance Skin Products, Inc. Treatment of aged skin with autologous growth factors in a hyaluronic acid delivery system
US20100266989A1 (en) 2006-11-09 2010-10-21 Klox Technologies Inc. Teeth whitening compositions and methods
FR2919185B1 (fr) * 2007-07-23 2010-09-10 Ard Sa Utilisation d'acide hyaluronique pour la preparation de compositions destinees a l'amelioration notamment de l'etat des muqueuses
KR101449687B1 (ko) * 2008-03-13 2014-10-14 주식회사 바이오랜드 저분자 및 고분자 히알루론산과 유근피로부터 분리된다당체 추출물을 함유하는 노화방지용 조성물
CN102256591B (zh) 2008-11-07 2016-02-10 克洛克斯科技公司 包含透明质酸、葡糖胺或尿囊素的氧化光活化皮肤再生组合物
EP2453922B1 (en) 2009-07-17 2017-10-25 Klox Technologies Inc. Antibacterial oral composition
US20130281913A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Klox Technologies Inc. Biophotonic compositions and methods for providing biophotonic treatment
US11116841B2 (en) 2012-04-20 2021-09-14 Klox Technologies Inc. Biophotonic compositions, kits and methods
US20140276354A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Klox Technologies Inc. Biophotonic materials and uses thereof
EP3016686A4 (en) 2013-07-03 2017-01-25 Klox Technologies Inc. Biophotonic compositions comprising a chromophore and a gelling agent for treating wounds
WO2015149177A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Klox Technologies Inc. Tissue filler compositions and methods of use
WO2016065488A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Klox Technologies Inc. Photoactivatable fibers and fabric media
US10098832B1 (en) 2017-03-31 2018-10-16 L'oreal Compositions for short and long term benefits for minimizing wrinkles and fine lines

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266563A (en) * 1984-06-11 1993-11-30 Biomatrix, Inc. Hyakyribate-poly (ethylene oxide) mixtures
US5639738A (en) * 1992-02-20 1997-06-17 Hyal Pharmaceutical Corporation Treatment of basal cell carcinoma and actinic keratosis employing hyaluronic acid and NSAIDs
CA2199756A1 (en) * 1996-03-14 1998-09-12 Linda May Pilarski Methods for cell mobilization using in vivo treatment with hyaluronan (ha)
DE69828193T2 (de) * 1997-10-31 2005-12-01 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, Norman Hyaluronan synthase gen und seine verwendung
JP2001172126A (ja) * 1999-12-14 2001-06-26 Chisso Corp 化粧料
KR101285626B1 (ko) * 2004-05-27 2013-07-15 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 건조되고 응집된 히알루론산 생성물

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106998780A (zh) * 2014-07-22 2017-08-01 Hl科学株式会社 含有石榴浓缩物作为活性成分的用于改善皮肤的组合物
CN106998780B (zh) * 2014-07-22 2021-11-12 Hl科学株式会社 含有石榴浓缩物作为活性成分的用于改善皮肤的组合物
CN106109265A (zh) * 2016-08-02 2016-11-16 山东华熙海御生物医药有限公司 一种透明质酸保湿组合物及其制备方法和应用
CN106137786A (zh) * 2016-08-02 2016-11-23 山东华熙海御生物医药有限公司 一种透明质酸抗衰组合物及其制备方法和应用
CN106109265B (zh) * 2016-08-02 2018-08-21 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种透明质酸保湿组合物及其制备方法和应用
CN106137786B (zh) * 2016-08-02 2018-09-18 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种透明质酸抗衰组合物及其制备方法和应用
CN108992369A (zh) * 2018-07-02 2018-12-14 山东天晟生物科技有限公司 一种透明质酸、其制备方法和用途
CN108992369B (zh) * 2018-07-02 2021-07-30 山东天晟生物科技有限公司 一种透明质酸、其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006072243A1 (en) 2006-07-13
EP1835942A1 (en) 2007-09-26
US20080274999A1 (en) 2008-11-06
JP2008526693A (ja) 2008-07-24
CA2592860A1 (en) 2006-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101123942A (zh) 具有保湿和抗皱纹性质的透明质酸级分
US20080057091A1 (en) Compositions with several hyaluronic acid fractions for cosmetic use
US20080003271A1 (en) Compositions with Several Hyaluronic Acid Fractions for Cosmetic Use
US20100210588A1 (en) Hyaluronic Acid Linked with a Polymer of an Alpha Hydroxy Acid
CN101415732B (zh) 芳基/脂族烃基乙烯基砜透明质酸衍生物
CN101500535A (zh) 用于化妆品和医学用途的具有几种透明质酸级分的组合物
JP5313497B2 (ja) 乾燥および凝集されたヒアルロン酸生成物
US7956180B2 (en) Dried and agglomerated hyaluronic acid product
US20050272695A1 (en) Fast dissolving dried hyaluronic acid product
WO2005116130A1 (en) A fast dissolving dried hyaluronic acid product
KR20070017374A (ko) 신속하게 용해하는 건조 히알루론산 생성물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080213