CN101115481A - 苯基取代的吡咯烷酮类化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及苯基－取代的吡咯烷酮以及与苯基－取代的吡咯烷酮相关的化合物。这些化合物的一种用途为抑制病毒，例如HIV。本发明另外涉及制备这些化合物的方法、鉴别这些化合物功效的方法以及采用这些化合物抑制或预防HIV感染和相关疾病(例如AIDS)的方法。

Description

苯基取代的吡咯烷酮类化合物
与相关申请的交互参考
本申请要求提交于2005年1月28日的U.S.临时专利申请第60/648,027号的优先权，该临时申请以其全部内容引入本文作参考。
技术领域
本发明涉及苯基取代的吡咯烷酮以及与苯基取代的吡咯烷酮有关的化合物。这些化合物的一个用途为抑制病毒，例如，HIV。本发明另外还涉及制备这些化合物的方法、鉴定这些化合物的活性的方法，采用这些化合物抑制或预防HIV感染以及相关疾病(例如AIDS)的方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染了世界上数百万人。几乎每一个国家都有病例报道，世界范围内总计4000万成人和儿童生活患有HIV/AIDS。2001年，500万人成为新的HIV感染者，HIV/AIDS造成300万成人和儿童死亡。AIDS患者中整整三分之一年龄为15-24(世界卫生组织，2001)。一直存在对HIV/AIDS的治疗方法，然而，目前在治疗模式中采用的药物具有许多副作用，需要较长时间的治疗，常常会诱发药物的抗性，并且不能自机体中完全根除病毒。
AIDS是HIV-1或HIV-2病毒自身生命周期的最终结果。病毒体的生命周期开始于病毒体将其自身吸附在宿主人T-4淋巴免疫细胞，该吸附通过病毒体保护膜表面的糖蛋白与淋巴细胞上的CD4糖蛋白结合而进行。一旦吸附后，病毒体脱掉其自身的糖蛋白膜，穿透进入宿主的细胞，并开始释放其RNA。病毒体酶(逆转录酶)指引着将RNA转录进单链DNA中的进程。病毒RNA退化，产生第二条DNA链。由此双链的DNA进入人类细胞基因，这些基因被用于病毒的复制。
此时，RNA聚合酶将整合的DNA转录进病毒RNA。病毒RNA被翻译为前体gag-pol融合多蛋白。然后，多蛋白被HIV蛋白酶裂解得到成熟的病毒蛋白。HIV蛋白酶负责调节导致病毒粒子成熟为病毒从而具备完全的感染性的裂解级联。
通常的人类免疫响应系统(杀灭入侵病毒体)总是出于重压下，因为病毒感染和杀死免疫系统的T细胞。另外，病毒逆转录酶(用于制造新的病毒体的酶)并非特别专一，引起转录错误而导致病毒保护膜表面上的糖蛋白持续改变。这种专一性的缺乏降低了免疫系统的有效性，因为特异性产生的用于对抗一种糖蛋白的抗体对另一种糖蛋白可能是无效的，所以能够对抗病毒的抗体数量减少。病毒在持续复制，而免疫应答系统持续衰弱。最终，HIV占据了机体免疫系统大量区域，使得机会感染开始增加，如果不给予抗病毒药物、免疫调节剂或者同时给予以上两种药物，可能会产生死亡。
在病毒的生命周期中至少有三个关键点，它们可以作为抗病毒药物的可能的靶点：(1)病毒体在T-4淋巴细胞或巨嗜细胞位点上最初的吸附，(2)病毒RNA向病毒DNA的转录(逆转录，RT)，和(3)HIV蛋白酶对gag-pol蛋白的处理过程。
对于病毒第二关键点(病毒RNA向病毒DNA的转录过程)的抑制提供了许多目前用于治疗AIDS的方法。该转录过程对于病毒体的复制是必须的，因为病毒体的基因是在RNA中编码的，而宿主细胞只读取DNA。通过采用能够阻断逆转录酶从而不能完成病毒DNA形成的药物，可以阻止HIV-1复制。
已经开发了许多干扰病毒复制的化合物用于治疗AIDS。例如，核苷类抗病毒药物，如3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷(AZT)、2′，3′-二脱氧胞苷(ddC)、2′，3′-二脱氧胸苷(d4T)、2′，3′-脱氧肌苷(ddI)和2′，3′-二脱氧-3′-硫杂胞苷(3TC)已经被证明在逆转录酶(RT)阶段能够抑制HIV复制从而具有相当的疗效。
采用吡咯烷酮类化合物治疗呼吸道疾病在本领域中是已知的。参见，例如，Keller等，Chem.Pharm.Bull.49(8)：1009-1017(2001)和Bacher等，Bioinorg.Med.Chem.Lett.8：3229-3234(1998)。这些文献中没有公开吡咯烷酮用于治疗HIV以及相关疾病的用途。
即使逆转录酶抑制剂目前取得了成功，然而已经发现HIV患者可能会对单一的抑制剂产生抗性。所以，需要开发另外的抑制剂进一步对抗HIV感染。
发明内容
已经发现具有新结构的吡咯烷酮为对抗HIV的有效药物。本发明选定的吡咯烷酮为有效的逆转录酶抑制剂。因此，本发明提供药物制剂，预防和治疗、诊断和预测的方法和试剂盒，利用吡咯烷酮的抗-HIV活性进行药物筛选的方法。
因为本发明的吡咯烷酮能够抑制HIV复制，给予患者吡咯烷酮既可以预防或也可以治疗HIV感染。对于处于HIV感染高风险的人群，预防性治疗非常有用。本发明提供了通过给予患者药用有效量的吡咯烷酮抑制HIV复制的方法。本发明也提供了在药学上可接受的载体中含有一或多种吡咯烷酮的药物制剂。
上述抑制HIV复制的方法也可以应用于在体外培养的细胞。
另一方面，本发明提供了含有至少一种吡咯烷酮和第二种治疗成分的组合物。在一个实施方案中，第二种治疗成分用于预防或治疗HIV感染。在另一个实施方案中，第二种治疗成分用于治疗与HIV感染有关的机会感染。在另一个实施方案中，第二种治疗成分为蛋白酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、核苷类逆转录酶抑制剂、抗逆转录核苷类、侵入抑制剂或任何其它能够有效抑制或治疗HIV感染的抗病毒成分。
另一方面，本发明提供了治疗或预防人类HIV感染的方法，它包括给予人类本发明的吡咯烷酮以及联合使用的第二种治疗成分。在一个实施方案中，第二种治疗成分用于预防或治疗HIV感染。在另一个实施方案中，第二种治疗成分用于治疗与HIV感染有关的机会感染。在另一个实施方案中，第二种治疗成分为蛋白酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、核苷类逆转录酶抑制剂、抗逆转录核苷类、侵入抑制剂或任何其它能够有效抑制或治疗HIV感染的抗病毒成分。在另一个实施方案中，第二种治疗成分选自下列成分：齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、干扰素、拉米夫定、阿德福韦、奈韦拉平、地位韦啶、洛韦胺、沙奎那韦、茚地那韦和AZT。在另一个实施方案中，第二种治疗成分为抗生素或阿昔洛韦。
另一方面，本发明提供了在CD4+培养物中抑制HIV感染的方法，它包括使细胞与本发明吡咯烷酮接触的步骤，可以单独应用吡咯烷酮，也可以与第二种治疗成分联合应用，或者与其它治疗成分联合应用。在一个实施方案中，所述治疗成分用于治疗或预防HIV感染。在第二个实施方案中，所述治疗成分选自蛋白酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、核苷类逆转录酶抑制剂、抗逆转录核苷类、侵入抑制剂或任何其它能够有效抑制或治疗HIV感染的抗病毒成分。在第三个实施方案中，所述治疗成分选自齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、干扰素、拉米夫定、阿德福韦、奈韦拉平、地位韦啶、洛韦胺、沙奎那维、茚地那韦和AZT。
附图说明
图1为表示本发明实例化合物的图表。
具体实施方式
I.介绍
本发明提供了预防病毒(例如，HIV)感染、杀灭病毒感染的细胞(例如，HIV感染的细胞)和通常抑制病毒复制(例如，HIV)的方法。本发明根据或部分根据下列令人惊奇的发现：本发明的吡咯烷酮能够有效地抑制HIV感染、杀灭HIV感染细胞和/或在个体中预防HIV感染。
本发明提供了这些化合物和包含这些化合物的药物制剂。而且，本发明也提供了在细胞中抑制HIV的方法、在细胞中抑制逆转录酶的方法、在人类患者中治疗HIV感染的方法，并且提供了通过给予需要此类治疗的患者至少一种本发明化合物而预防HIV感染的方法。
II.定义
本文中所用“反应性官能团”指下列基团，包括但不限于：烯烃、炔类、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮盐、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸盐、次磺酸酸、异腈、脒、亚酰胺、亚氨酸酯(imidates)、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸酯、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团也包括那些用于制备生物轭合物(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、顺丁烯二酰亚胺等)的基团。产生这些官能团的方法在本领域中是已知的，它们的应用或者为了特别的目的而进行的修饰也在本领域技术人员的知识范围内(参见，例如，Sandler和Karo等，ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS，Academic Press，San Diego，1989).
“非共价蛋白结合基团”是能够以结合的方式与完整或变性多肽相互作用的基团。在生物学环境下，这种相互作用可以是可逆的或者是不可逆的。“非共价蛋白结合基团”与螯合试剂或本发明复合物的结合使得这些试剂或复合物能够以非共价的方式与多肽相互作用。典型的非共价相互作用包括疏水-疏水以及静电相互作用。典型的“非共价蛋白结合基团“包括阴离子基团，例如，磷酸根、硫代磷酸根、膦酸根、羧酸根、硼酸根、硫酸根、砜、硫代硫酸根和硫代磺酸根。
本文中所用“连接成员”是指包括至少一个杂原子的共价化学键。典型的连接成员包括-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等。
术语“靶向基团“是指具有下列特点的基团：(1)能够主动将其所连接的实体(例如，造影剂)指向靶向区域，例如肿瘤；或(2)能够被靶向组织(例如肿瘤)优先被动吸收或被靶向组织诱导进入。靶向基团可以是小分子，它们包括非肽类和肽类。靶向基团也可以是大分子，包括但不限于糖类、凝集素、受体、受体的配体、蛋白质(例如BSA)、抗体、聚(醚)、树枝状聚合物、聚(氨基酸)等。
术语“可裂解基团“是指能够通过裂解连接螯合物(或螯合物连接臂结构)与共轭体的键而使得螯合物自共轭体其它部分释放出来的基团。此类裂解可以是化学性质的或者是酶介导的。典型的酶裂解基团包括天然氨基酸或末端为天然氢基酸的肽序列。
除了酶可裂解位点，本发明的范围也包括一或多个能够被除了酶以外的其它成分裂解的位点。典型的非酶裂解成分包括但不限于酸、碱、光(例如，硝基苄基衍生物、苯甲酰甲基、安息香酯)和热。许多可裂解基团在本领域中是已知的。参见，例如，Jung等，Biochem.Biophys.Acta，761：152-162(1983)；Joshi等，J.Biol.Chem.，265：14518-14525(1990)；Zarling等，J.Immumnol.，124：913-920(1980)；Bouizar等，Eur.J.Biochem.，155：141-147(1986)；Park等，J.Biol.Chem.，261：205-210(1986)；Browning等，J.Immunol.，143：1859-1867(1989)。另外，大量的可裂解、双功能(同-和杂-双功能)间隔臂可以自商业供应商例如Pierce购得。
符号
Figure A20068000333400121
，无论是用作键或者是作为与键垂直的线，均是指显示的基团在此点上与分子、固体载体等的其它部分相连。
某些本发明化合物可以以非溶剂化物的形式或溶剂化物的形式(包括水合物的形式)存在。通常，溶剂化物形式与非溶剂化物形式是等效的，都包含在本发明的范围内。某些本发明化合物可以以多晶型或无定形的形式存在。通常，所有的物理形式在本发明的应用中都是等效的，也都包含在本发明的范围内。
某些本发明化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键，外消旋物、非对映异构体、几何异构体和单一异构体均包含在本发明的范围内。
本发明化合物可以制备为单一异构体(例如，对映异构体、顺-反异构体、位置异构体、非对映异构体)或异构体的混合物。在优选的实施方案中，化合物制备为基本上单一的异构体。制备基本上异构体纯的化合物的方法在本领域中是已知的。例如，富含对映体的混合物和纯对映体化合物可以通过采用合成的中间体制备，该中间体为对映体纯的，在反应中可以使得手性中心的立体化学不发生改变或者产生完全反转。或者，终产物或合成流程中的中间体可以拆分为单一的立体异构体。转化或不改变特定立体中心的技术以及用于拆分立体异构体混合物的技术在本领域中都是已知的，本领域技术人员都能够选择用于特定情况的适当的方法。参见，Furniss等(eds.)，VOGEL’S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY第五版，Longman Scientific and Technical Ltd.，Essex，1991，第809-816页；和Heller，Acc.Chem.Res.23：128(1990)。
本发明化合物也可以在构成此类化合物的一或多个原子中含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以采用放射性同位素进行标记，例如采用氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)。本发明化合物的优选的同位素改变(无论是具有放射性或者是没有)均包含在本发明的范围内。
取代基由其常规的化学式指定，书写方式自左至右，它们同样包括化学上相同的取代基，书写的结构是自右至左，例如，-CH2O-也可以表述为-OCH2-。
术语“烷基”，其自身或者是作为其它取代基的一部分，除非另外说明，是指直链或支链或环状烃基团或其组合，它们可以是完全饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括二-和多价基团，具有指定的碳原子数目(即，C1-C10是指1-10个碳原子)。饱和的烃基团的实例包括但不限于：例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲-丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和的烷基为具有一或多个双键或三键的烷基。不饱和的烷基的实例包括但不限于：乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁间二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及较高的同系物和异构体。除非另外说明，术语“烷基”也包括那些下面更详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。仅限定于烃基团的烷基称为“同烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”，其自身或者是作为其它取代基的一部分，是指衍生自链烷的二价基团，实例为但不限于-CH2CH2CH2CH2-，另外包括那些下面如“杂亚烷基”中所述的基团。通常而言，烷基(或亚烷基)具有1-24个碳原子，本发明中优选的基团具有10个或更少的碳原子。“低级烷基”或“低级亚烷基”为短链烷基或亚烷基，通常具有8个或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，分别是指那些通过氧、氨基或硫原子与分子的其它部分连接的烷基。
术语“杂烷基”，其自身或与其它术语组合，除非另外说明，是指直链或支链或环状烃基团或其组合，包括表明的碳原子的数目和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子，并且其中的氮和硫原子可以任选被氧化，氮杂原子可以任选被季铵化。杂原子O、N和S和Si可以位于杂环基的任何内部位置，或者在此位置上烷基与分子的其它部分连接。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3  、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。同样，术语“杂亚烷基”，其自身或作为其它取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于：-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基而言，杂原子也可以位于链的末端之一或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的结构式在书写时没有表明连接基团的方向性。例如，式-C(O)2R’-既代表-C(O)2R’-也代表-R’C(O)2-。
术语“环烷基”和“杂环烷基”，其自身或与其它术语合用，除非另外说明，分别代表“烷基”和“杂烷基”的环状结构。另外，在杂环烷基中，杂原子可以位于杂环与分子其它部分连接的部位。环烷基的实例包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
术语“卤代”或“卤素”，其自身或作为其它取代基的一部分，除非另外说明，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语例如“卤代烷基”包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另外说明，术语“芳基”是指多不饱和芳族取代基，它们可以是单环或多环(优选1-3环)，多环彼此稠合或通过共价连接。术语“杂芳基”是指含有1-4个选自N、O、和S的杂原子的芳基(或芳环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的其它部分相连。芳基和杂芳基的非限定性实例包括：苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述所有芳基和杂芳基环系的取代基均选自下面所述的可接受的取代基。
简而言之，当与其它术语(例如，芳氧基、芳硫基(arylthioxy)、芳烷基)组合应用时，术语“芳基”包括如上文所定义的芳基和杂芳基环。所以，术语“芳烷基”包括那些其中芳基与烷基基团连接的基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括那些其中碳原子(例如，亚甲基)已经被例如氧代替的烷基(如，苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
所有的上述术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)均包括所述基团的取代的和未取代的形式。每一类型的基团的优选的取代基如下所示。
烷基和杂烷基(包括那些通常被称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基通常称为“烷基取代基”，并且它们可以被一或多个选自但不限于下列的多种基团所取代：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R)＝NR’、-NR-C(NR’R”)＝NR、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，取代基的数量为自0至(2m’+1)，其中m’为该基团中碳原子的总数。R’、R”、R和R’均优选独立指氢、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基(例如，被1-3个卤素取代的芳基)、取代的或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当本发明化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在一个以上的R基团时，对这些R基团独立进行选择，如同当存在一个以上的R’、R”、R和R’基团时对这些基团进行独立选择一样。当R’和R”连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面关于取代基的讨论中，本领域技术人员可以理解术语“烷基”包括含有与非氢基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与烷基中所述的取代基相似，芳基和杂芳基的取代基通常称为“芳基取代基”。取代基选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R)＝NR’、-NR-C(NR’R”)＝NR、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，取代基的数目自0至芳族环系上开放的介键(openvalences)的总数；其中R’、R”、R和R’优选独立选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。当本发明化合物含有多于一个R基团时，例如，当存在一个以上的R基团时，对这些R基团独立进行选择，如同当存在一个以上的R’、R”、R和R’基团时对这些基团进行独立选择一样。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-取代基代替，其中T和U独立为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，q为0-3的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选被式-A-(CH2)r-B-取代基所代替，其中A和B独立为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，r为1-4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选被双键代替。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选被式-(CRR’)s-X-(CR”R)d-取代基代替，s和d独立为0-3的整数，X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或一S(O)2NR’-。R、R’、R”和R取代基优选独立选自氢或取代的或未取代的(C1-C6)烷基。
本文中所用术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
本文中所用术语“保护基团”是指在特定反应条件下基本上稳定的底物的一部分，但它可以在不同的反应条件下自底物裂解出来。也可以对保护基团进行选择使其能够参与本发明化合物的芳族环部分的直接氧化。可以采用的保护基团的实例参见，例如，Greene等，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991。
本文中，“与HIV感染相关的疾病”是指以HIV感染为标志的疾病状态。此类与HIV感染相关的疾病包括但不限于：AIDS；卡波氏肉瘤；机会感染，例如由卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的那些机会感染；口腔损害，包括鹅口疮、毛状黏膜白斑和口疮溃疡；全身性淋巴结病；带状疱疹；血小板减少症；无菌性脑膜炎；神经系统疾病，例如弓形虫病、隐球菌病、CMV感染、原发性CNS淋巴瘤和HIV-相关性痴呆；外周性神经疾病、癫痫发作；肌病。
在本文中，“HIV逆转录酶抑制剂“是指HIV逆转录酶(RT)的核苷和非核苷抑制剂。核苷RT抑制剂的实例包括但不限于AZT、ddC、ddI、d4T和3TC。非核苷RT抑制剂的实例包括但不限于地拉韦定(Pharmacia和Upjohn U90 152S)、依法韦仑(DuPont)、奈韦拉平(Boehringer Ingelheim)、Ro 18，893(Roche)、曲韦定(Lilly)、MKC-442(Triangle)、HBY 097(Hoechst)、ACT(Korean Research Institute)、UC-781(Rega Institute)、UC-782(RegaInstitute)、RD4-2025(Tosoh Co.Ltd.)和MEN 10979(MenariniFarmaceutici)。
在本文中，“HIV蛋白酶抑制剂是指能够抑制HIV蛋白酶的化合物。实例包括但不限于沙奎那维(Roche，Ro31-8959)、利托那韦(Abbott，ABT-538)、茚地那韦(Merck，MK-639)、安普那韦(Vertex/GlaxoWellcome)、奈非那韦(Agouron，AG-1343)、帕利那韦(BoehringerIngelheim)、BMS-232623(Bristol-Myers Squibb)、GS3333(GileadSciences)、KNI-413(Japan Energy)、KNI-272(Japan Energy)、LG-71350(LG Chemical)、CGP-61755(Ciba-Geigy)、PD 173606(ParkeDavis)、PD 177298(Parke Davis)、PD 178390(Parke Davis)、PD178392(Parke Davis)、U-140690(Pharmacia和Upjohn)和ABT-378。另外的实例包括公开于WO93/07128、WO 94/19329、WO 94/22840和PCT申请US96/03426的环状蛋白酶抑制剂。
在本文中，“治疗有效量”是指给药后能够产生疗效的剂量。精确的剂量取决于治疗的效果，本领域技术人员采用已知的技术可以确定该剂量(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，Art，Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；和Pickar，Dosage Calculations(1999))。
III.化合物
第一方面，本发明提供了吡咯烷酮以及相关的化合物。本发明典型的化合物具有下列结构式：
Figure A20068000333400181
其中A代表选自取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基的环系。符号R6代纵的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。X为取代的或未取代的碳或取代的或未取代的氮。
本发明其它典型的化合物具有下列结构式：
Figure A20068000333400182
在上式中，符号m和n代表独立选自0、1和2的整数。X基本上如上所述。
符号Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf代表独立选自下列的基团：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或者另一个如上所定义的“烷基取代基”。符号R6代表取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。
第二方面，本发明提供了下列式I化合物：
Figure A20068000333400191
其中符号R7和Y独立代表：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂环烷基或取代的或未取代的杂芳基。符号R6代表取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。
第三方面，本发明提供了下列式II化合物：
Figure A20068000333400192
其中R1和R5可以独立选自H、CN、卤素、取代的或未取代的C1-C4烷基、取代的或未取代的C2-C4链烯基和OR8。R8可以是取代的或未取代的C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基。R2和R4可以独立选自H、卤素、CN和取代的或未取代的C1-C4烷基。R3可以是H、CN和烷基。R6可以是稠合的苯基杂环环系和：
Figure A20068000333400201
和
Figure A20068000333400202
其中R9和R11可以独立选自：H、取代的或未取代的C1-C4烷基、卤素、CN、C(O)NR12R12、NR12R12和OR12。R12可以是H、取代的或未取代的C1-C4烷基。R10可以是H、CN、NR13R14、SO2NHR13、NHSO2R13、SO2NH(CH2)nOR13、SO2NH(CH2)nNR13R14、O(CH2)nSO2NHR13、O(CH2)nNR13R14、O(CH2)nSO2R15、SO2R15、SO2(CH2)nNR13R14和C(O)NR13R14。R13和R14可以是H和取代的或未取代的C1-C4烷基。另外，R13和R14可以与它们所连接的氮一起任选结合形成杂环。R15可以是取代的或未取代的C1-C4烷基。符号n可以是1-8的整数。在该实施方案中，至少一个选自R9、R10和R11的成员可以不是H。R7可以是卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基和C2-C4炔基。
在另一个选择的实施方案中，R6为稠合的苯基杂环环系。该稠合的苯基杂环环系可以是：
Figure A20068000333400203
Figure A20068000333400204
和
R16可以是H、C(O)NR18R19、C(O)NR18(CH2)nNR18R19、C(O)NR18(CH2)nOR18、C(O)NR18CH(CH2OR18)2、C(O)NR18(CH2)nC(O)NR18R19、(CH2)nSO2NR18R19、S(O)2R20。R18和R19可以独立选自H和取代的或未取代的C1-C6烷基。R18和R19可以与它们两个所连接的氮一起形成取代的或未取代的杂环。符号n可以是1-8的整数。R20可以是取代的或未取代的C1-C6烷基和取代的或未取代的苯基。R17可以是H、NH2、(CH2)mOH、C(O)NR21R22、SO2R23、NHSO2R23、NHCOR23。R21和R22可以独立选自H、取代的或未取代的C1-C6烷基和取代的或未取代的苯基。另外，R21和R22可以与它们所连接的氮一起任选结合形成环。R23可以是取代的或未取代的C1-C6烷基。符号m为1-5的整数。
在另一个选择的实施方案中，R1和R5可以独立选自：氢、卤素、CN、甲基、甲氧基、乙烯基和三氟甲氧基。
在另一个选择的实施方案中，R6可以是：
Figure A20068000333400211
在另一个选择的实施方案中，R16可以是选自C(O)NR18R19和S(O)2R20的基团。在另一个选择的实施方案中，R18和R19可以是H。在另一个选择的实施方案中，R20可以是CH3。在另一个选择的实施方案中，R17为NH2。在另一个选择的实施方案中，R6可以是：
Figure A20068000333400212
其中R9可以是选自NH2和C(O)NH2的基团。R10可以是选自C(O)NH2、NHSO2CH3和SO2NH2的基团。
在另一个典型的实施方案中，本发明化合物可以选自下列结构之一：
Figure A20068000333400221
Figure A20068000333400222
和
Figure A20068000333400223
在另一个典型的实施方案中，取代基中至少一个为能够增加母体化合物水中溶解度的基团。用于增加化合物水中溶解度的典型的基团包括醚和多醚，例如，选自乙二醇和乙二醇低聚物，它们具有自约60道尔顿至约10,000道尔顿的分子量，优选自约100道尔顿至约1,000道尔顿的分子量。
有代表性的多醚取代基包括但不限于下列结构：
Figure A20068000333400224
Figure A20068000333400225
和
其中b优选为包括1-100的数。另外的官能化的多醚是本领域技术人员所熟知的，许多可以得自商业，例如，Shearwater Polymers，Inc.(Alabama)。
在另一个典型的实施方案中，R1-R7中至少有一个为连接基团，它包括能够使得化合物与其它分子或表面共轭的反应性官能团。本发明化合物中采用的连接基也可以包括可裂解基团。在典型的实施方案中，可裂解基团能够插入吡咯烷酮核心和靶向试剂或大分子骨架之间。具有代表性的反应性基团在随后的章节中将更详细讨论。有用的反应性基团的其它信息是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996。
III.a)化合物上的特殊部分
在本章节中，将对本发明化合物的某些部分进行详细介绍，例如反应性官能团、靶向成分、大分子复合物、多糖、树枝状聚合物成分和聚(乙二醇)成分。在本章节中，描述了连接本发明化合物的这些部分的方法。在这些方法中，本发明化合物与一部分反应形成本发明的“共轭物”。请注意：这些“共轭物”也包含在说明书和权利要求书中所使用的术语“化合物”和“本发明化合物”的范围内。“共轭物”仅用于区别反应物“化合物”(它可以是“本发明化合物”)与产物(它也可以是“本发明化合物”)。
III.a1)反应性官能团
在上面的讨论中，本发明化合物的吡咯烷酮核心任选通过吡咯烷酮上的反应性官能团或与吡咯烷酮的连接基和其它部分上的补充反应性的反应性官能团之间形成的键连接于其它部分。为了清楚地说明，随后的讨论将关注本发明的具有代表性的吡咯烷酮与聚合物(包括多(醚)和树枝状聚合物)和靶向成分(用于改变吡咯烷酮-靶向成分共轭物通过膜的位置)的共轭。该关注以本发明的选择的实施方案为例证，根据该实施方案，本领域技术人员可以很容易推断其它实施方案。关注关于代表性实施方案的讨论并不构成对本发明的限制。
典型的本发明的吡咯烷酮携有反应性官能团，它们通常位于吡咯烷酮环或与该环连接的取代的或未取代的烷基或杂烷基链上，使得它们容易连接到其它部分上。反应性基团的较好的位置为吡咯烷酮核心的烷基或杂烷基取代基的末端位置。
用于实施本发明的反应性基团和反应的种类通常是那些在生物共轭化学领域中众所周知的。目前可用于反应性类似物的经常采用的反应种类是那些在相对温和条件下的反应。这些反应包括但不限于亲核置换反应(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电子置换反应(例如，烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂杂原子多键上的加成反应(例如，Michael反应、Diels-Alder加成反应)。这些反应以及其它有用的反应在下列文献中讨论：例如，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第三版，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，SanDiego，1996；和Feeney等，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances inChemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
典型的反应性基团包括羧基及其各种衍生物，包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对-硝基苯基酯、烷基、链烯基、炔基和芳族酯。羟基可以转化为酯、醚、醛等。卤代烷基可以通过与例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子的反应转化为新的成分。亲二烯体(例如，顺丁烯二酰亚胺)基团参与了Diels-Alder反应。醛或酮基团可以转化为亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或者通过此类反应机理转化，如Grignard加成或烷基锂加成。磺酰卤很容易与胺反应，例如，形成磺酰胺。胺或巯基可以被例如酰化、烷基化或氧化。采用环加成反应、酰化反应、Michael加成反应等，烯烃可以转化为一系列新的成分。环氧化物很容易与胺和羟基化合物反应。
在本发明化合物和靶向基团(或聚合物或连接基)上含有的反应性官能团的典型的组合列于下面表1。如果反应性官能团为化学官能度1，则靶向基团为化学官能度2，反之亦然。
表1
化学官能度1 化学官能度2 连接基团
羟基 羧基 酯
羟基 碳酸酯
胺 氨基甲酸酯
SO3 硫酸酯
PO3 磷酸酯
羧基 酰氧基烷基
酮 缩酮
醛 缩醛
羟基 酸酐
巯基 巯基 二硫化物
羧基 酰氧基烷基
硫醚
羧基 硫酯
羧基 氨基酰胺
巯基 硫酯
羧基 酰氧基烷基
酯
羧基 酰氧基烷基
酰胺
氨基 酰氧基烷氧基
羰基
羧基 酸酐
羧基 N-酰基酰胺
羟基 酯
羟基 羟基甲基
酮酯
羟基 烷氧基羰基
氧基烷基
氨基 羧基 酰氧基烷基胺
羧基 酰氧基烷基酰胺
氨基 脲
羧基 酰胺
羧基 酰氧基烷氧基羰基
酰胺 N-Mannich碱
羧基 酰氧基烷基氨基甲酸酯
磷酸盐 羟基 磷酸酯
氧酯 胺 氨基磷酸酯
巯基 硫代磷酸酯
酮 羧基 烯醇酯
磺酰胺 羧基 酰氧基烷基磺酰胺
酯 N-磺酰基-亚氨酸酯
本领域技术人员易于理解：许多上述连接基团可以通过各种方式采用各种条件产生。对于酯的制备，参见，例如，March，上述，第1157页；硫酯的制备参见：March，上述，第362-363页，第491页，第720-722页，第829页，第941页和第1172页；碳酸酯参见：March，上述，第346-347页；氨基甲酸酯参见：March，上述，第1156-57页；酰胺参见：March，上述，第1152页；脲和硫脲参见：March，上述，第1174页：缩醛和缩酮参见：Greene等，上述，第178-210页和March，上述，第1146页；酰氧基烷基衍生物参见：PRODRUGS：TOPICAL AND OCULAR DRUGDELIVERY，K.B.Sloan编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；烯醇酯参见：March supra at 1160；N-磺酰基亚氨酸酯参见：Bundgaard等，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；酸酐参见：March，上述，第355-56页，第636-37页，第990-91页和第1154页；N-酰基酰胺参见：March，上述，第379页；N-Mannich碱参见：March，上述，第800-02页和第828页；羟基甲基酮酯参见：Petracek等Annals NY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；二硫化物参见：March，上述，第1160页；膦酸酯和phosphonamidates。
可以对反应性官能团加以选择，使其不能参与或干扰制备反应性配体类似物的必须反应。或者，可以对反应性官能团加以保护，使其不能参与保护基团存在的反应。本领域技术人员可以理解并知道如何保护特定的官能团，使其不能干扰一系列选定的反应条件。有用的保护基团的实例参见：Greene等，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC DYSTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991.
通常，在配体和靶向(或其它)成分以及任选的连接基团之间形成连接之前，化学官能度中至少一个是活化的。本领域技术人员可以理解：采用多种标准方法和条件可以激活多种化学官能度，包括羟基、氨基和羧基。例如，配体(或靶向成分)的羟基可以通过采用光气处理而激活，形成相应的氯代甲酸酯或对-硝基苯基氯代甲酸酯，形成相应的碳酸酯。
在一个典型的实施方案中，本发明使用包括羧基官能度的靶向成分。羧基可以通过例如转化为相应的酰卤或活性酯而被活化。该反应可以在March，如上，第388-89页中所描述的多种条件下进行。在一个典型的实施方案中，酰卤可以通过含有羧基的基团与草酰氯反应而进行制备。活化的成分与配体或配体-连接基臂的组合结合形成本发明的共轭物。本领域技术人员可以理解：含有羧基的靶向成分的使用仅仅是用于说明，同样，具有许多其它官能团的成分也可以与本发明的配体共轭。
III.a2)靶向成分
本发明化合物也可以与使得化合物靶向疾病的特殊组织或部位的成分共轭结合。靶向成分包括那些能够被细胞通过主动或被动机制吸收的成分。
例如，“膜转运多肽”具有两亲性或疏水性氨基酸序列，它们能够作为膜转运载体。在一个实施方案中，同源域蛋白具有转运通过细胞膜的能力。同源域蛋白的最短的内化肽(Antennapedia)已经被证明是蛋白质的第三螺旋，自氨基酸位置43至58(参见，例如，Prochiantz，Current Opinion inNeurobiology 6：629-634(1996))。另一个序列，信号肽的h(疏水性)域被证明具有相似的细胞膜转运特性(参见，例如Lin等，J.Biol.Chem.270：14255-14258(1995))。
肽序列的实例包括但不限于：HIV的tat蛋白的11氨基酸肽；相应于p16蛋白的氨基酸84-103的20残基肽序列(参见Fahraeus等，CurrentBiology 6：84(1996))；Antennapedia的60-氨基酸长同源域的第三螺旋(Derossi等，J.Biol.Chem.269：10444(1994))；信号肽的h域，例如Kaposi成纤维细胞生长因子(K-FGF)h域(Lin等，如上)；或源自HSV的VP22转运域(Elliot&O’Hare，Cell 88：223-233(1997))。能够提供增强的细胞摄取的其它适当的化学基团也可以与本发明化合物进行化学连接。
此类序列可以用于将本发明化合物转运通过细胞膜。本发明化合物可以容易地与此类序列稠合或采用此类序列衍生。通常，转运序列用作稠合蛋白的一部分。本文中所述的连接基任选地用于连接本发明化合物和转运序列。可以采用任何适当的连接基，例如肽连接基或其它化学连接基。
毒素分子也能够将化合物转运通过细胞膜。通常，此类分子由至少两部分组成(称为“二元毒素”)：转运域或结合域或者多肽和不相连的毒素域或多肽。通常，转运域或多肽域与细胞受体结合，然后将毒素转运到细胞中。几种细菌性毒素(包括产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)iota毒素、白喉毒素(DT)、假单孢菌(Pseudomonas)外毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)毒素和百日咳腺苷酸环化酶(CYA))已经被作为内部或氨基-末端融合物用于将肽转运到细胞的细胞液中(Arora等，J.Biol.Chem.，268：3334-3341(1993)；Perelle等，Infect.Immun.，61：5147-5156(1993)；Stenmark等，J.Cell Biol.113：1025-1032(1991)；Donnelly等，PNAS 90：3530-3534(1993)；Carbonetti等，Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.95：295(1995)；Sebo等，Infect.Immun.63：3851-3857(1995)；Klimpel等，PNAS U.S.A.89：10277-10281(1992)；和Novak等，J.Biol.Chem.267：17186-171931992))。
非共价蛋白结合基团也用于将本发明化合物靶向至机体的特定区域，通过蛋白结合增加成分的半衰期。
III.a3)大分子复合物
在典型的实施方案中，本发明提供了吡咯烷酮核心和大分子成分的大分子(即MW＞1000D)共轭物。在一个实施方案中，吡咯烷酮通过反应性官能团共轭到大分子上形成本发明的大分子共轭物。在另一个实施方案中，通过吡咯烷酮衍生物与大分子(如血清蛋白)之间的非共价相互作用形成大分子复合物。
在下列讨论中，通过参考用于与本发明新的吡咯烷酮核心形成共轭物的特殊大分子描述本发明。本领域技术人员可以理解：该讨论的重点在于更清楚地阐明本发明，并非对本发明加以限定。本发明提供了大分子共轭物，包括衍生自生物分子和合成分子的成分。典型的生物分子包括多肽(例如，抗体、酶、受体、抗原)；多糖(例如，淀粉、菊粉、葡聚糖)；凝集素；非肽抗原等。典型的合成聚合物包括聚(丙烯酸)、聚(赖氨酸)、聚(谷氨酸)、聚(乙烯亚胺)等。
III.a3i)大分子复合物的共价共轭物
本领域技术人员能够很好地选择能够形成期望的大分子种类的本发明吡咯烷酮核心上的适当的反应性官能团。用于形成本发明的共价共轭物的典型的反应性官能团在上面进行了讨论。本领域技术人员能够很好地选择和制备本发明的吡咯烷酮核心，它具有适当的反应性官能团，用于补充其共轭对上的反应基团的反应性。
在一个实施方案中，大分子的反应性官能团和吡咯烷酮的反应性官能团之间形成的键通过成分之间的“稳定键”基本上不可逆地将吡咯烷酮连接到大分子上。本文中所用“稳定键”是能够在较宽的条件范围内保持其化学完整性的键(例如，酰胺、氨基甲酸酯、碳-碳、醚等)。在另一个实施方案中，大分子和吡咯烷酮通过“可裂解键”连接。本文中所用“可裂解键”是在有选择的条件下能够断裂的键。可裂解键包括但不限于二硫化物、亚胺、碳酸酯和酯键。如前面章节中所讨论，反应性官能团可以位于吡咯烷酮的一或多个位置。
III.a4)多糖
在典型的实施方案中，本发明提供了吡咯烷酮核心和糖类(例如多糖)之间的共轭物。在典型的实施方案中，本发明提供了氧供体螯合物和菊粉之间的共轭物。菊粉为天然存在的多糖，对该物质作为诊断成分的载体已经进行了研究(Rongved，P.K.，J.Carbohydr.Res.1991，214，315；Corsi，D.M.V.E.等，Chem.Eur.J.2001，7，64)。菊粉的结构可以描述为线性β-(2→1)-连接的在末端具有一个a-D-吡喃葡糖基单位的a-D-呋喃果糖基链的混合物。各种分子量和聚合度为10-30的菊粉可以得自商业，分子量的范围分布在1500-5000 Da之间。菊粉的高亲水性、pH稳定性、低溶液粘度和生物相容性保证其共轭物具有良好的药理学的特性。
III.a5)树枝状聚合物成分
另一方面，本发明提供了前面所述的吡咯烷酮，它通过反应性官能团与树枝状聚合物相连。与前面所讨论的聚合基团相似，树枝状聚合物具有至少两个反应性官能团。在一个实施方案中，一或多个形成的吡咯烷酮与树枝状聚合物。或者，吡咯烷酮直接在树枝状聚合物上形成。
在典型的实施方案中，水溶性和生物调配的聚酯(聚丙酸酯)类树枝状聚合物造影剂已经设计出来以提供良好的药物动力学性质。参见，例如，Ihre，H.等，Macromolecules 1998，31，4061；Ihre，H.等，J.Am.Chem.Soc.1996，118，6388；Anders，H.，Ihre，H.，Patent W0/9900440(Sweden))。在典型的实施方案中，树枝状聚合物的末端共轭到本发明的吡咯烷酮核心上。
III.a6)聚(乙二醇)成分
在另一个典型的实施方案中，本发明提供了本发明的吡咯烷酮核心与聚(乙二醇)之间的共轭物。在生物技术和生物医学的应用中采用聚(乙二醇)(PEG)。在文献中综述了该成分的用途(POLY(ETHYLENEGLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL和BIOMEDICAL APPLICATIONS，J.M.Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992)。在聚乙二醇应用中，某些最近的进展包括酶(Chiu等，J.Bioconjugate Chem.，4：290-295(1993))、RGD肽(Braatz等，Bioconjugate Chem.，4：262-267(1993))、脂质体(Zalipsky，S.Bioconjugate Chem.，4：296-299(1993))和CD4-IgG糖蛋白(Chamow等，Bioconjugate Chem.，4：133-140(1993))的修饰。采用PEG处理表面被证明能够抵抗蛋白质的沉积，当在与血液接触的生物材料上包被PEG后，能够提高其对致血栓性的抗性(Merrill，“Poly(ethylene oxide)and Blood Contact：A Chronicle of One Laboratory，”in POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL和BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，(1992)，第199-220页)。
许多途径能够将本发明的吡咯烷酮核心连接到聚合物或低聚物上。参见，例如，DuRn，R.L.，等，Eds.POLYMERIC DRUGS和DRUG DELIVERYSYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991；Herren等，J.Couoid and Interfacial Science 115：46-55(1987)；Nashabeh等，J.Chromatography 559：367-383(1991)；Balachandar等，Langmuir 6：1621-1627(1990)；和Burns等，Biomaterials19：423-440(1998)。
聚(乙二醇)的许多活化的衍生物可以得自商业和文献中。本领域技术人员能够选择和合成(如果需要)适当的活化PEG衍生物，可以用其制备用于本发明的共轭物。参见，Abuchowski等Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Abuchowski等，J.Biol.Chem.，252：3582-3586(1977)；Jackson等，Anal.Biochem.，165：114-127(1987)；Koide等，BiochemBiophys.Res.Commun.，111：659-667(1983))，tresylate(Nilsson等，Methods Enzymol.，104：56-69(1984)；Delgado等，Biotechnol.Appl.Biochem.，12：119-128(1990))；N-羟基琥珀酰亚胺衍生的活性酯(Buckmann等，Makromol.Chem.，182：1379-1384(1981)；Joppich等，Makromol.Chem.，180：1381-1384(1979)；Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：1487-1491(1987)；Kitamura等，Cancer Res.，51：4310-4315(1991)；Boccu等，Z.Naturforsch.，38C：94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等，POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICALAPPLICATIONS，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，第347-370页；Zalipsky等，Biotechnol.Appl.Biochem.，15：100-114(1992)；Veronese等，Appl.Biochem.Biotech.，11：141-152(1985))，咪唑基甲酸酯(Beauchamp等，Anal.Biochem.，131：25-33(1983)；Berger等，Blood，71：1641-1647(1988))，4-二硫代吡啶(Woghiren等，Bioconjugate Chem.，4：314-318(1993))，异氰酸酯(Byun等，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和环氧化物(U.S.Pat.No.4,806,595，授权给Noishiki等，(1989)。其它连接基团包括氨基和活化的PEG之间的脲烷连接基。参见，Veronese，等，Appl.Biochem.Biotechnol.，11：141-152(1985)。
IV.吡咯烷酮的合成和纯化
本发明化合物通过众所周知的合成方法的适当的组合进行合成。用于合成本发明化合物的技术是相关领域中技术人员容易理解和接受的。下面的论述用于阐明在合成本发明化合物中所采用的各种可用方法，它并非用于限定用于制备本发明化合物的反应或反应顺序的范围。
流程1
试剂和条件：a)苄基溴，K2CO3的DMF液；b)CH3NO2，NH4OAc，AcOH，回流，3h；c)3-乙酰基-4-苄基-唑烷-2-酮，LDA，THF，-78℃，Py；d)RaneyNi/H2，氧和氮气环境中，50℃
合成本发明化合物的一种方法见流程1。在该流程中，使羟基苯甲醛与苄基反应以提供2(反应a)。然后，使2与硝酸酯反应以提供3。下一步中，使3与唑烷酮反应以提供4。采用Raney Nickel将4还原以诱导分子内环化，产生5，一种含有3，4-取代的苯基的内酰胺。
流程2
试剂和条件：e)CH3CN，0.4N HCl，rt，1h；f)Rh(cat)，(R)-BINAP，K2CO3，二氧六环/H2O，80℃，6h；g)CAN，CH3CN/H2O，0℃，4h
合成本发明化合物的另一个典型方法见流程2，它描述了含有3，4-取代的苯基的内酰胺5的合成。使二氢呋喃6与对-茴香胺7反应以得到8(反应e)。然后，使8与硼酸酯9反应以得到10(反应f)。最后，将10上的N-苯基除去产生5(反应g)。
流程3
Figure A20068000333400332
试剂和条件：h)CH3CN，0.4N HCl，rt，1h；i)Rh(cat)，(R)-BINAP，K2CO3，二氧六环/H2O，80℃，6h；
根据流程3，使5进一步官能化。首先将5上的苄基保护基团除去得到11(反应h)。然后，使11与取代的苯基偶合得到12(反应i)。
流程4
试剂和条件：j)CuI，K3PO4，1，2-环己二胺k)肼；l)加热；m)氯代磺酰基异氰化物
在另一个典型的合成方法中，流程1-3中内酰胺终产物的氮可以如流程4-9中所示衍生。在流程4中，合成自12开始。使该化合物与碘取代的芳基反应得到22(反应j)。然后，使22与肼反应以产生稠合的环N-吡咯烷酮化合物23。保护基团(例如邻苯二甲酸酐)加至23上的游离胺基团上以得到25。然后将保护基团除去得到26(反应m)。
流程5
Figure A20068000333400342
试剂和条件：n)吡啶，甲磺酰氯，NH4C.
除脲以外的其它基团采用25中的内环氮形成。此类反应的实例见流程5中所示。使25与磺酰氯反应以得到30。本领域技术人员可以理解：采用各种取代的(例如，烷基、杂芳基、芳基烷基和杂环烷基取代的)芳基卤化物可以得到多种N-取代的内酰胺衍生物。
流程6
Figure A20068000333400351
试剂和条件：o)CuI/K3PO4，1，2-环己二胺；p)SnCl2.
得自流程3的内酰胺产物(也适用于流程1和流程2的产物)的其它典型的N-置换反应见流程6所示。使12与卤代苯基27反应以得到28(反应o)。然后，28可以经过各种反应从而官能化新加入的苯基环。该官能化反应的实例见28向29的转化中所示(反应p)。
流程7
Figure A20068000333400352
试剂和条件：q)NaH；r)NaOH；s)(PMB)2NH.
为了合成本发明的某些化合物，某些成分一定要分别合成，然后再与吡咯烷酮反应。该方法的实例见流程7-10。在流程7中，化合物13和化合物14在q条件下反应以产生化合物15。随后，将氢化物还原得到化合物16(反应r)。然后，将16上的羧酸酯基团在反应条件s下进行保护以产生化合物17。
流程8
Figure A20068000333400361
试剂和条件：t)K3PO4，CuI，反式-环己二胺；u)TFA
流程8描述了将得自流程3的内酰胺的氮官能化的另一种方法(它也适用于流程1的产物)。其中，将被保护的溴或碘取代的化合物17加至12中以产生化合物32(反应t)。随后，将化合物32上的保护基团除去得到化合物33(反应u)。
流程9
试剂和条件：v)NaBH4，EtOH；w)2-氟-4-溴苯磺酰氯；x)4-甲氧基苄基胺，DMF，K2CO3.
流程7的方法的变通方法见流程9所示。其中，使化合物17和化合物18在条件v下反应以产生保护基团19。然后，使19与硫酸酯或砜取代的苯基化合物反应以保护含硫基团16(反应w)。然后使化合物20进一步与胺基团反应以产生21(反应x)。
流程10
Figure A20068000333400371
试剂和条件：y)K2CO3，DMSO；z)K3PO4，CuI，反式-环己二胺；
aa)TFA.
流程10描述了将得自流程3的内酰胺产物的氮官能化的另一种方法(它也适用于流程1的产物)。首先，通过34将化合物11的苯酚基团上的氧官能化以得到35(反应y)。然后，将保护的溴或碘取代的化合物21加至35中以产生化合物36(反应z)。随后将化合物36上的保护基团除去以得到化合物37(反应aa)。
通过本领域技术人员所熟知的纯化方法，可以将本发明化合物自反应混合物中分离和纯化。例如，化合物可以采用已知的色谱方法进行纯化，例如反相HPLC、凝胶渗透色谱、离子交换色谱、体积排阻色谱、亲和色谱、分配色谱或逆流分配色谱。
V.药物制剂
本发明化合物可以以口服、胃肠外和局部剂型进行制备和给药。所以，本发明化合物可以通过注射给药，即通过静脉内、肌肉、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内给药。或者，本文中所述化合物也可以通过吸入给药，例如鼻内给药。另外，本发明化合物可以透皮给药。因此，本发明也提供含有药学上可接受的载体或赋形剂以及一或多种本发明化合物的药物制剂。
对于本发明化合物的药物制剂的制备而言，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，它们也可以作为稀释剂、矫味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或囊材。
在粉末剂中，载体为微粉化固体，它与微粉化的活性成分一起构成混合物。在片剂中，活性成分与具有必要的粘合性的载体以适当的比例混合，压制成期望的形状和大小。
粉末剂和片剂优选含有5％或10％至70％的活性化合物。适当的载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”包括活性化合物与作为载体的囊材的制剂，从而得到胶囊，其中活性成分(有或无载体)被载体所包围，所以，它们彼此结合。同样，扁囊剂和锭剂也包括在内。片剂、粉末剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适用于口服给药的固体剂型。
在制备栓剂时，首先将低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯的混合物或可可油)熔化，然后，通过搅拌，将活性成分均匀分散其中。然后，将均匀熔融的混合物倒入适当大小的模具中，使其冷却并固化。
液体形式的制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如，水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射剂而言，液体制剂可以在聚乙二醇的水溶液中配制。
适用于口服的水溶液可以通过将活性成分溶于水中进行制备，并可以根据需要加入适当的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂。适用于口服的水溶性悬浮液可以通过将微粉化的活性成分分散在含有粘性物质的水中进行制备，所述粘性物质为例如天然或合成的胶类、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠以及其它众所周知的悬浮剂。
也包括固体形式的制剂，在使用前，可以将其转化为用于口服给药的液体形式的制剂。此类液体形式的制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。除了活性成分外，这些制剂可以含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
本发明中给予患者的剂量应该在一定的时间内足以在患者中产生有益的治疗响应。剂量应该取决于使用的特定化合物的功效和患者的状况，以及待治疗患者的体重和表面积，。剂量的大小也取决于在特定患者中伴随着特定化合物给药所产生的任何副作用的存在与否、性质和程度。
化合物也可以通过微粒和脂质体以及脂质体衍生物(如免疫脂质体)被引导进入动物细胞(优选哺乳动物细胞)。术语“脂质体”是指含有一或多个集中有序排列的脂质双层的囊，它将水相包封在内。水相通常含有待传递到细胞的化合物。
脂质体与细胞膜融合，从而将药物释放进胞质溶浆中。或者，脂质体在转运囊中被细胞吞噬或摄取。一旦引入核内体或吞噬体，脂质体或者降解或者与转运囊的膜融合，然后将其内容物释放。
在目前通过脂质体传递药物的方法中，脂质体最终成为可渗透的，并且在目标组织或细胞处释放包封的药物。对于全身或组织的特定传递，这可以通过例如被动的方式完成，其中脂质体双层在一定的时间内通过体内各种成分的作用而降解。或者，活性药物的释放包括采用一种成分诱导脂质体囊的通透性发生变化。脂质体膜的构成应该是当接近脂质体膜的环境变成酸性时它们就会变得不稳定(参见，例如，PNAS 84：7851(1987)；Biochemistry28：908(1989))。当脂质体被目标细胞吞噬时，例如，它们就变得不稳定并释放其内容物。这种不稳定被称为融合产生(fusogenesis)。二油酰磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)是多种“融合产生系统的基础。
此类脂质体通常含有选定的化合物和脂质成分，例如，中性和/或阳离子脂质，任选包括受体-识别分子例如抗体，它与预先确定的细胞表面受体或配体(例如抗原)结合。如下所述的多种方法可以用于制备脂质体：例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)；U.S.Pat.Nos.4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085，、4,837,028、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,946,787；PCT公开号WO 91\17424；Deamer&Bangham，Biochim.Biophys.Acta 443：629-634(1976)；Fraley，等，PNAS 76：3348-3352(1979)；Hope等，Biochim.Biophys.Acta 812：55-65(1985)；Mayer等，Biochim.Biophys.Acta 858：161-168(1986)；Williams等，PNAS 85：242-246(1988)；Liposomes(Ostro(ed.)，1983，Chapter 1)；Hope等，Chem.Phys.Lip.40：89(1986)；Gregoriadis，Liposome Technology(1984)和Lasic，Liposomes：from Physics to Applications(1993))。适当的方法包括例如超声、挤出、高压/均化、微射流、洗涤剂透析、钙-诱导的小脂质体囊的融合和醚-融合方法，所有的这些方法在本领域中都是众所周知的。
在本发明的某些实施方案中，希望通过采用对特定细胞类型、组织等具有专一性的靶向部分使得本发明的脂质体具有靶向性。采用各种靶向部分(例如，配体、受体和单克隆抗体)的脂质体的靶向性先前已有报道(参见，例如，U.S.Patent Nos.4,957,773和4,603,044)。
可以采用使得靶向成分与脂质体偶合的标准方法。这些方法通常包括脂质体脂质成分(例如磷脂酰乙醇胺，它们可以被活化从而与靶向成分结合)或衍生的亲脂性化合物(例如脂质衍生的博莱霉素)的结合进入。抗体靶向的脂质体可以采用例如与蛋白质A结合的脂质体进行构建(参见Renneisen等，J.Biol.Chem.，265：16337-16342(1990)和Leonetti等，PNAS87：2448-2451(1990)。
在确定给予治疗或预防HIV感染所引起的疾病的化合物的有效量时，医师可以评价化合物的循环血液水平、化合物毒性、疾病的进程以及病毒对于化合物抗性的产生。
药物制剂优选为单位剂型。在此类形式中，制剂被细分为含有适当量的活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂、含有制剂独立单位的包装，例如包装的片剂、胶囊和在小瓶或安瓿中的粉末。或者，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是以适当的数量的这些单位剂型的包装形式。根据特定的用途以及活性成分的效能，单位剂量的制剂中的活性成分的量可以改变或调整，自0.1mg至10g，更优选为1.0mg至1g，最优选为10mg至500mg。如果需要，组合物也可以含有其它可配伍使用的治疗或诊断药物。给药可以以单剂量或分剂量的形式完成。
VI.方法
本发明也提供治疗或改善HIV疾病及相关疾病的方法。该方法包括给予患有HIV疾病或HIV-相关疾病的患者治疗有效量的至少一种本发明化合物。本发明也提供联合治疗的方法，其中至少一种本发明化合物与至少一种其它具有对抗HIV疾病或HIV-相关疾病活性的化合物联合给药。
VI.a)联合治疗
在许多实施方案中，本发明化合物与一或多种另外的化合物或治疗方法联合使用。例如，多种逆转录酶抑制剂可以联合给药，或者一或多种本发明化合物可以与另一种治疗化合物联合给药。在一个实施方案中，另一种治疗药物为用于预防或治疗HIV感染的药物。在另一个实施方案中，其它治疗药物为用于治疗与HIV感染有关的机会感染和/或治疗或预防HIV感染的药物。
与本发明化合物联合应用的适当的治疗药物包括但不限于：蛋白酶抑制剂、非-核苷逆转录酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、抗逆转录核苷类、侵入抑制剂以及其它能够有效抑制或治疗HIV感染的抗病毒药物。适当的治疗药物的其它实例包括但不限于齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、干扰素、拉米夫定、阿德福韦、奈韦拉平、地位韦啶、洛韦胺、沙奎那韦、茚地那韦和AZT。其它适当的治疗药物包括但不限于抗生素或其他抗病毒药物，例如阿昔洛韦。
本领域技术人员所熟知的其它联合治疗方法也可以与本发明的组合物和方法联合应用。
如上所述，现在已经发现本发明的吡咯烷酮具有抗病毒活性。所以，本发明化合物可以用于抑制各种病毒，从而治疗各种人类病毒感染。采用本发明化合物可以抑制的病毒包括但不限于DNA病毒、RNA病毒以及逆转录病毒。采用所述化合物可以抑制的病毒的实例包括但不限于疱疹病毒、肝炎(A、B和C)病毒、流感病毒、POX病毒、鼻病毒和HTLV(人类T-细胞白血病)病毒(例如，HTLV 1和2)。根据其抗病毒活性，本领域技术人员可以理解采用本发明化合物可以治疗的其它病毒。
VI.b)逆转录酶调节剂的分析
逆转录酶的调节以及HIV和病毒感染的相应的调节(优选抑制)可以采用各种体内和体外分析(包括细胞模型)进行评定。此类分析可以用于实验逆转录酶的抑制剂和激活剂，因此，也可以用于实验HIV感染和HIV-相关疾病的抑制剂和激活剂。此类逆转录酶的调节剂可以用于治疗本文中所述的与HIV感染有关的疾病。可以采用重组体(化学合成的或天然存在的逆转录酶)对逆转录酶的调节剂进行实验。
本发明优选的调节剂是那些能够在蛋白质水平上降低逆转录酶活性的物质。优选的调节剂也包括那些能够在核酸水平上降低逆转录酶表达的物质，例如，逆转录酶启动子抑制剂、能够增加逆转录酶基因的染色体可达性的化合物、能够降低逆转录酶RNA稳定性和进程的化合物以及能够在细胞质和细胞核中降低逆转录酶RNA水平的化合物。
采用逆转录酶抑制剂对HIV感染进行调节的测定可以采用各种本文中所述的分析(体外、体内以及离体分析)进行。影响活性(例如酶的活性)、细胞增殖(例如，CD4+淋巴细胞增殖)、HIV复制、HIV蛋白表达或者配体或底物结合的适当的物理、化学或表型的变化都可以用于评价实验化合物对本发明多肽的影响。当采用完整的细胞或动物测定功效时，人们也可以测定各种效果，例如血清中病毒RNA水平或病毒效价、配体的结合、对已知和不典型基因标记物的转录的改变(例如，northern blots)、细胞代谢的改变、与细胞增殖相关的改变、病毒标记物的表达、DNA分析、标记物和染色稀释分析(例如，GFP和细胞追踪分析)等。
VI.c)体外分析
对具有逆转录酶调节活性的化合物进行鉴别的分析可以在体外进行。如下面所述，分析可以在固体状态或溶解状态下进行。蛋白质可以以共价或非-共价的方式结合在固体载体上。通常，本发明的体外分析为底物或配体的结合或亲和分析，所述结合或亲和可以是非竞争性的也可以是竞争性的。其它体外分析包括测定蛋白质的光谱的改变(例如，荧光、吸收度、折射指数)、流体动力学改变(例如，外形)、色谱改变或溶解度改变。
在一个实施方案中，进行高通量结合分析，其中使逆转录酶或其片段与可能的调节剂接触并温育适当的时间。在一个实施方案中，可能的调节剂与固体载体结合，并加入逆转录酶。在另一个实施方案中，逆转录酶与固体载体结合。各种分析可以用于鉴别逆转录酶-调节剂的结合，包括标记的蛋白-蛋白结合分析、电泳迁移率改变、免疫分析、酶分析(例如激酶分析)等。在某些情况下，通过采用竞争性结合分析测定可能的调节剂的结合，其中在可能的调节剂的存在下，测定与已知配体或底物结合的干扰。首先使调节剂或已知的配体或底物结合，然后加入竞争者。洗涤逆转录酶后，测定与可能的调节剂或已知配体或底物结合的干扰。通常，可能的调节剂或已知配体或底物是标记的。
VI.d)细胞体内分析
在另一个实施方案中，将逆转录酶在细胞中表达，对功能性的改变(例如，物理和化学或表型的改变)进行分析以鉴别逆转录酶调节剂和HIV复制以及HIV感染细胞的调节剂。表达逆转录酶的细胞也可以用于结合分析和酶分析。可以如本文中所述测定任何适当的功能性作用，例如细胞形态学(例如，细胞体积、细胞核体积、细胞周长以及细胞核周长)、配体结合、淋巴细胞增殖、细胞凋亡、病毒标记物表达、GFP阳性(positivity)和染色稀释分析(例如，采用与细胞膜结合的染色剂的细胞追踪分析)、DNA合成分析(例如，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷和荧光DNA-结合染色，例如采用FACS分析的BrdU或Hoechst染色)，它们都是采用细胞体系鉴别可能的调节剂的适当的分析方法。用于此类细胞分析的适当的细胞包括原始细胞(例如PBMCs、淋巴细胞(例如，CD4+)、中性白细胞、多形核白细胞)及其它吞噬细胞和细胞系(例如，Jurkat细胞、BJAB细胞等)。逆转录酶可以是天然存在的或者是重组体。
细胞的逆转录酶RNA和多肽水平可以通过测定蛋白或mRNA的水平而加以测定。逆转录酶或与逆转录酶有关的蛋白质的水平可以通过免疫分析(例如蛋白质印迹法、ELISA等)采用能够选择性地与逆转录酶、多肽或其片段结合的抗体进行测定。对于mRNA的测定，优选采用扩增分析(例如，采用PCR)、LCR或杂交分析(例如，RNA杂交))、RNA酶保护、点渍法。蛋白或mRNA的水平可以如本文中所述采用直接或间接标记的测定试剂进行测定，例如，荧光或放射性标记的核酸、放射性或酶标记的抗体等。
或者，逆转录酶表达可以采用报告基因系统进行测定，例如，采用与逆转录酶启动子相连的融合蛋白或基因。此类系统可以采用与报告基因操纵性连接的逆转录酶蛋白启动子进行设计，所述报告基因为例如氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。另外，关注的蛋白可以通过与第二报告分子连接而作为间接的报告分子，例如红或绿荧光蛋白(参见，例如，Mistili&Spector，NatureBiotechnology 15：961-964(1997))。报告分子构建物通常被转染到细胞内。采用可能的调节剂处理后，根据本领域技术人员已知的标准技术，可以测定报告基因转录、翻译或活性的量。
VI.e)动物模型
HIV感染的动物模型也可以用于筛选逆转录酶调节剂。同样，转基因动物技术(包括基因剔除技术，例如由于与适当的靶向基因载体进行同源重组或基因过度表达)将导致逆转录酶不表达或表达增加。同样的技术也可以用于制备剔除细胞。如果需要，逆转录酶蛋白的组织特异性表达或剔除可以是必须的。
通过同源重组将标记物基因或其它异种基因插入小鼠基因组中内源性逆转录酶基因位点，可以制备剔除细胞和转基因鼠。通过使得内源性逆转录酶突变(例如，暴露在致癌基因中)，用逆转录酶基因的突变体代替内源性逆转录酶，也可以制备此类小鼠。
将DNA构建物引入胚胎干细胞的胞核中。将含有新构建的基因损伤的细胞注射到宿主小鼠胚胎中，它被再植入雌性受体中。这些胚胎中的部分胚胎发展为具有部分衍生自突变细胞系的胚细胞的嵌合小鼠。因此，通过喂食嵌合小鼠，可能获得含有引入损伤基因的新小鼠系(参见，例如，Capecchi等，Science 244：1288(1989))。嵌合目标小鼠可以根据下列文献获得：Hogan等，Manipulating Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold  Spring Harbor Laboratory(1988)和Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells：A Practical Approach，Robertson，ed.，IRL Press，Washington，D.C.，(1987)。
VI.f)固态和可溶性高通量分析
在优选的实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在的治疗化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合小有机分子和肽库。然后，在一或多个如本文中所述的分析中筛选此类“组合的化学库”或“配体库”，鉴别那些具有期望的特殊活性的库成员(特别是根据化学类别或亚类)。如此鉴别的化合物可以作为常规的“引导化合物(lead compound)”，或者其自身可以作为可能的或实际上的治疗药物。
组合化学库是化学合成或生物学合成产生的各种化学化合物的集合，由大量的化学“构建模块”例如反应物组成。例如，对于给定的化合物长度(即，多肽化合物中氨基酸的数目)，线性组合的化学库(例如多肽库)由一系列化学构建模块(氨基酸)以每一种可能的方式组合而形成。通过此类化学构建模块的组合混合，可以合成数百万种化学化合物。
组合化学库的制备和筛选是本领域技术人员所熟知的。此类组合的化学库包括但不限于肽库(参见，例如，U.S.Patent 5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature354：84-88(1991))。也可以采用能够产生多种化学库的其它化学。此类化学包括但不限于：类肽(例如，PCT公开号WO 91/19735)、编码的肽(例如，PCT公开号WO 93/20242)、随机的生物低聚物(例如，PCT公开号WO92/00091)、苯并二氮杂(例如，U.S.Pat.No.5,288,514)；diversomers例如乙内酰脲、苯并二氮杂和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6909-6913(1993))，乙烯类多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))，具有葡萄糖构架的非肽肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))，小化合物库的类似有机合成(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，低聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 261：1303(1993))和/或肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))，核酸库(参见Ausubel，Berger和Sambrook，all supra)，肽核酸库(参见，例如，U.S.Patent 5,539,083)，抗体库(参见，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)，碳水合物库(参见，例如，Liang等，Science，274：1520-1522(1996)和U.S.Patent5,593,853)，小有机分子库(参见，例如，苯并二氮杂，Baum C&EN，Jan18，第33页(1993)；isoprenoids，U.S.Patent 5,569,588；噻唑烷酮和间噻嗪酮(metathiazanones)，U.S.Patent 5,549,974；吡咯烷，U.S.Patents 5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，U.S.Patent 5,506,337；苯并二氮杂，5,288,514等)。
用于制备组合库的装置可以得自商业(参见，例如，357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。另外，大量的组合化学库自身也可以得自商业(参见，例如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
在一个实施方案中，本发明提供采用表达逆转录酶的天然存在的或重组逆转录酶蛋白或细胞或组织的可溶性分析方法。在另一个实施方案中，本发明提供了高通量形式的固相体外分析，其中逆转录酶与固相相连。本文中所述的任何一种分析均适用于高通量筛选。
在本发明的高通量分析中，无论是可溶性状态或固态，在一天内都可以筛选数千种调节剂或配体。该方法可以用于逆转录酶的体外分析，或用于含有逆转录酶蛋白的细胞或膜分析。具体而言，微孔板的每一个孔可以用于对选择的可能的调节剂进行不同的分析，或者，如果需要观察浓度或培养时间的影响，每5-10孔可以实验一种调节剂。因此，每块标准微孔板可以分析约100(例如，96)种调节剂。如果采用1536孔板，则每块板可以很容易分析约100-约1500种化合物。每天分析许多块板也是可能的；因此采用本发明的整合系统，可以分析筛选至多约6,000、20,000、50,000或多于100,000种不同的化合物。
对于固态反应而言，所关注的作为融合蛋白一部分的蛋白或其片段(例如细胞外域)或者含有所述蛋白或其片段的细胞或膜可以与固态成分结合，通过共价或非共价键直接或间接结合。共价或非共价结合的标记可以是任何成分。通常，结合标记物的分子(标记结合剂)可以固定在固体载体上，标记的目标分子与固体载体通过标记物和标记结合剂的相互作用而连接。
根据文献中所述的已知的分子相互作用，可以采用多种标记物和标记结合剂。例如，当标记物含有天然结合剂时，例如生物素、蛋白A或蛋白G，它可以与适当的标记结合剂(抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中和亲和素(neutravidin)、免疫球蛋白Fc域等)连接。具有天然结合剂的分子(例如生物素)的抗体也是广泛使用的并且是适当的标记结合剂，参见SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA，St.Louis MO)。
同样，任何不全抗原或抗原化合物可以与适当的抗体连接从而形成标记物/标记激活剂对。数千种特异性抗体均可以得自商业，许多其它抗体如文献中所述。例如，在一个普通的构型中，标记物为第一抗体，标记结合剂为能够识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用外，受体-配体相互作用也可以适当作为标记物和标记-结合剂对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体的相互作用，如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族(cadherein family)、整联蛋白家族、选择蛋白家族等；参见，例如，Pigott&Power，The Adhesion Molecule Facts BookI(1993)。同样，毒素和毒液、病毒抗原决定基、激素(例如，鸦片类、类固醇等)、细胞内受体(例如，其介导了各种小配体和肽的作用，包括类固醇、甲状腺激素、类维生素A和维生素D、肽)、药物、凝集素、糖类、核酸(包括线性和环状聚合物构型)、低聚糖、蛋白质、磷脂和抗体都可以与各种细胞受体相互作用。
合成的聚合物，例如聚氨酯类、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯也可以形成适当的标记物或标记结合剂。许多其它标记物/标记结合剂对也可以用于本文所述的分析系统，技术人员可以根据本公开的综述加以理解。
常见连接剂(例如肽、聚醚等)也可以用作标记物，包括多肽序列，例如约5-200个氨基酸的聚甘氨酸序列。此类柔性连接剂是本领域技术人员所熟知的。例如，聚(乙二醇)连接剂可以得自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama。这些连接剂任选具有酰胺键、巯基键或杂官能团键。
标记结合剂可以通过各种常规方法固定在固体底物上。通常，通过将所有的或一部分底物暴露在化学试剂中将固体底物衍生化或官能化，所述试剂能够将化学基团固定在可以与部分标记结合剂反应的表面上。例如，适合与长链部分连接的基团包括胺、羟基、硫羟基和羧基。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可以用于官能化各种表面，例如玻璃表面。此类固相生物聚合物阵列的构建在文献中有详细的描述。参见，例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)(描述了例如肽类的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102：259-274(1987)(描述了针式(on pins)固相合成)；Frank&Doring，Tetrahedron 44：60316040(1988)(描述了各种肽序列在纤维素膜(disks)上的合成)；Fodor等，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine2(7)：753-759(1996)(都描述了固定在固体底物上的生物聚合物阵列)。用于将标记结合剂固定于底物的非化学方法包括其它常规方法，例如加热、通过UV辐射交联等。
实施例
下列实施例用于阐述本发明，并非用于限定其范围。化学原料购自Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI)，未经任何处理使用。硅胶板得自Analtech(Newark，DE)。NMR色谱在300 MHz Brucker设备上记录。化学位移得自TMS低场，以ppm表达，在列出的溶剂中记录。峰模式表示如下：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；m，多重峰；br，宽峰。
实施例1
5的制备
1.12的合成
4-氯-3-羟基-苯甲醛(1)根据下列文献所述方法进行制备：O.Langer，等，Bioorg.Med.Chem.，9：677-694(2001)和S.A.Adediran，等，Bioorg.Med.Chem.9：1175-1183(2001)。将26mL的64mmol K2CO3的DMF液和苄基溴(15.3mmol)加到苯酚1(12.9mmol)中，将反应物于室温下搅拌过夜。次日早晨，将反应混合物过滤，滤液用EtOAc萃取，用饱和的NH4Cl、H2O和盐水洗涤，干燥并浓缩。硅胶纯化得到需要的3-苄氧基-4-氯-苯甲醛化合物2。
1.2结果
结构2的分析数据提供如下。
1.2a 3-苄氧基-4-氯-苯甲醛
1H NMR(CDCl3)：9.92(s，1H)1，7.57(d，1H，J＝8.0Hz)，7.49(d，3H，J＝7.2 Hz)，7.43-7.40(m，3H)，7.39-7.35(m，1H)，5.23(s，2H)。
1.23的合成
将3-苄氧基-4-氯-苯甲醛(化合物2)(20mmol)、乙酸铵(22mL的60mmol的硝基甲烷液)和6mL乙酸的混合物加热3小时。将反应混合物冷却至室温并放置过夜。形成结晶物质，将其过滤并用少量EtOAc和己烷洗涤，得到黄色产物。将母液浓缩，溶于氯仿，用水和盐水洗涤并干燥。将自母液形成的产物浓缩，经硅胶层析纯化(EtOAc∶己烷＝1∶3)，得到更多为黄色固体的黄色产物，2-苄氧基-1-氯-4-(2-硝基-乙烯基)-苯(3)。
1.3结果
结构3的分析数据提供如下。
1.3a 2-苄氧基-1-氯-4-(2-硝基-乙烯基)-苯
1H NMR(CDCl3)：8.06(d，1H，J＝13.6Hz)，7.66-7.48(m，7H)，7.26(dd，1H，J＝2.0，8.0Hz)，7.2 1(d，1H，J＝2.0Hz)，5.35(s，2H)。LCMS m/z 290.20[M+H]+。
1.44的合成
于-78℃，通过注射器将50mL 3-乙酰基-4-苄基-唑烷-2-酮(1mmol)的无水THF溶液滴加至二异丙基氨化锂的THF液(1.0eq)中，搅拌1小时。将25mL硝基链烯溶液(1mmol的无水THF溶液)缓慢加至反应混合物中。将反应物搅拌1小时，用饱和的NH4Cl水溶液淬灭，温热至室温。将反应混合物用EtOAc萃取，干燥，过滤并浓缩。残留物经硅胶色谱纯化(EtOAc∶己烷)，得到为白色固体的需要的产物，4-苄基-3-[3-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-4-硝基-丁酰基]-唑烷-2-酮(4)。
1.5结果
结构4的分析数据提供如下。
1.5a 4-苄基-3-[3-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-4-硝基-丁酰基]-唑烷-2-酮
1H NMR(CDCl3)：7.48(d，2H，J＝7.2Hz)，7.40(t，2H，J＝7.2Hz)，7.36-7.28(m，5H)，7.17(dd，2H，J＝1.6，8.0)，6.90(d，1H，J＝2.0Hz)，6.83(dd，1H，J＝2.0，8.4Hz)，5.16(s，2H)，4.69(dd，1H，J＝6.8，12.4Hz)，4.62-4.54(m，2H)，4.18-4.07(m，3H)，3.51(dd，1H，J＝7.6，17.2Hz)，3.30-3.21(m，2H)，2.74(dd，1H，J＝9.6，13.6Hz)；LCMS m/z 509.20[M+H]+。
1.65的合成
将4溶于EtOH(或部分溶解)。向该溶液中加入Raney Nickel.将混合物置于氢气环境中，搅拌10-24小时。将混合物通过硅藻土过滤并浓缩。残留物经硅胶纯化，得到为白色固体的纯产物，4-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-吡咯烷-2-酮(5)。
1.7结果
结构5的分析数据提供如下。
1.7a 4-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-吡咯烷-2-酮
1H NMR(CDCl3)：7.41(d，2H，J＝7.6Hz)，7.35(t，2H，J＝6.8Hz)，7.29(d，2H，J＝8.0Hz)，6.78(d，1H，J＝2.0Hz)，6.75(dd，1H，J＝2.0，8.0Hz)，5.58(brs，1H)，5.11(s，2H)，3.70(t，1H，J＝8.4Hz)，3.62-3.56(m，1H)，2.27(dd，1H，J＝6.8，9.2Hz)，2.66(dd，1H，J＝8.8，16.8Hz)，2.36(dd，1H，J＝9.2，17.2Hz)；LCMS m/z 302.20[M+H]+。
实施例2
2.18的合成
向750mL的对-茴香胺7(18.48g，0.15mol，1eq)和2，5-二甲氧基-2，5-二氢呋喃6(39.04g，0.3mol，2eq)的乙腈溶液中加入600mL的0.4 N HCl水溶液。将反应混合物于室温下搅拌1小时，用NaHCO3(40.32g，0.48mol，2eq，HCl)淬灭，于27℃减压浓缩，在EtOAc和H2O之间分配。水相用EtOAc萃取，合并的有机萃取液用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。粗品残留物经硅胶柱色谱纯化，用己烷∶EtOAc(1∶1)混合溶剂洗脱，得到1-(4-甲氧基-苯基)-1，5-二氢-吡咯-2-酮8(10.85g，38％)。
2.2结果
结构8分析结果提供如下。
2.2a 1-(4-甲氧基-苯基)-1，5-二氢-吡咯-2-酮
1H NMR(CDCl3)：δ7.57(2H，d，J＝9.2Hz)，7.14(1H，dt，J＝0.8，6.0Hz)，.6.92(2H，d，J＝9.2Hz)，6.26(1H，dt，J＝0.8，6.0Hz)，4.40(2H，t，J＝1.6)，3.80(3H，s)。
2.3 9的合成
将2-苄氧基-4-溴-1-氯-苯(120g，0.4mol)、二硼酸盐(107.5g，0.42mol)、KOAc(117.8g，3eq)、Pd(dppf)2Cl2(1％mol)和500mL DMF的混合物在搅拌下脱气，再充入氮气。将混合物加热至80℃3小时。真空除去DMF。残留物与乙酸乙酯混合。过滤后，固体用乙酸乙酯洗涤(3×20mL)，在乙酸乙酯中重结晶，得到97g纯产物。母液也浓缩。残留物经短硅胶柱色谱纯化(10％乙酸乙酯∶己烷)，得到粗品产物，将其在乙酸乙酯中重结晶得到2-(4-氯-3-苄氧基-苯基)-4，4，5，5，-四甲基[1，3，2]二氧硼杂环戊烷9。
2.4结果
结构9的分析数据提供如下。
2.4a 2-(4-氯-3-苄氧基-苯基)-4，4，5，5，-四甲基[1，3，2]二氧硼杂环戊烷
1H NMR(CDCl3)：δ7.35(2H，d，J＝7.6Hz)，7.28(1H，br s)，7.17-7.26(5H，m)，7.11(1H，s)，5.02(2H，s)，1.20(12H，s)。
2.5 10的合成
在二氧六环(200mL)和水(20mL)的混合溶剂中，制备1-(4-甲氧基-苯基)-1，5-二氢-吡咯-2-酮8(9g，47.57mmol，1eq)、2-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼条环戊烷9(32.8g，95.14mmol，2eq)、氯代(1，5-环辛二烯)铑(I)二聚物(352mg，0.7136mmol，0.015eq)、(R)-BINAP(1.04g，1.665mmol，0.035eq)和K2CO3(3.3g，23.8mmol，0.5eq)的溶液。向溶液中充入氮气，于80℃的油浴中加热26小时。将反应混合物在EtOAc和盐水之间分配。水相用乙酸乙酯萃取，合并的乙酸乙酯萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。经短柱色谱纯化，用5∶4己烷∶EtOAc洗脱，得到固体产物，将其在EtOAc和己烷中重结晶，得到(R)-4-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-1-(4-甲氧基-苯基)-吡咯烷-2-酮10。
2.6结果
结构10的分析数据提供如下。
2.6a(R)-4-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-1-(4-甲氧基-苯基)-吡咯烷-2-酮
1H NMR(CDCl3)：δ7.48(2H，d，J＝9.2Hz)，7.44(2H，m)，7.32-7.39(4H，m)，6.92(2H，d，J＝9.2Hz)，6.86(1H，d，J＝1.6Hz)，6.83(1H，dd，J＝0.8，8.0Hz)，5.16(2H，s)，4.12(1H，dd，J＝8.0，9.6Hz)，3.81(3H，s)，3.75(1H，dd，J＝6.8，9.6Hz)，3.63(1H，dddd，J＝8Hz)，2.98(1H，dd，J＝8.8，16.8 Hz)，2.68(1H，dd，J＝16.8，8.4Hz)ppm。
2.7 5的合成
于0℃，向1400mL的4-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-1-(4-甲氧基-苯基)-吡咯烷-2-酮10(16.5g，40mmol，1eq)的CH3CN溶液中滴加硝酸铈铵(CAN)(65.8g，0.12mol，3eq)的50％的CH3CN溶液。将反应混合物于0℃搅拌1小时，加入Na2SO3(45.4g，0.36mol，9eq)。将反应混合物于0℃搅拌1小时，通过硅藻土过滤除去沉淀物。母液减压浓缩，残留物在5％MeOH的EtOAc液和H2O之间分配。水相用5％MeOH的EtOAc液萃取，合并的萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。经短柱色谱纯化，用40∶1CH2Cl2∶MeOH洗脱，得到(R)-4-(3-苄氧基-4-氯-苯基)-吡咯烷-2-酮5。
实施例3
12的制备
3.1 11的合成
向5(10.5g，34.8mmol)和3.2g的Pd/C(10％)中加入500mL THF和500μL 4M HCl的二氧六环溶液。将反应混合物脱气并充入氢气10次，在氢气环境中搅拌19小时，通过硅藻土过滤。滤液蒸发得到粗品产物，将其在EtOAc和己烷中重结晶，得到(R)-4-(4-氯-3-羟基-苯基)-吡咯烷-2-酮11。
3.2 12的合成
向11(3.57g，16.9mmol，1eq)和3-氯-2-氟苄腈(5.25g，33.74mol，2eq)的无水DMSO(125mL)溶液中加入K2CO3(7g，50.6mmol，3.1eq)。将反应混合物于室温下搅拌24小时，将其在EtOAc和盐水中分配。水相用乙酸乙酯萃取，合并的乙酸乙酯萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。硅胶柱色谱纯化，用20∶1 CH2Cl2∶MeOH洗脱，得到(R)-3-氯-2-[2-氯-5-(5-氧代-吡咯烷-3-基)-苯氧基]-苄腈12。
2.4结果
结构9的分析数据提供如下。
2.4a(R)-3-氯-2-[2-氯-5-(5-氧代-吡咯烷-3-基)-苯氧基]-苄腈
MS m/z 347.0(M+1)。
实施例4
26的制备
4.1 22的合成
在氮气环境中，向无水圆底烧瓶加入0.5mmol的12、0.9mmol磷酸钾、2-氟-5-碘苄腈(0.75mmol)、1，2-反式-环己二胺(60μL)和CuI(80mg)。向反应物中充入氮气，加入DMF(5mL)和二氧六环(5mL)。将混合物搅拌并于110℃加热20小时，然后冷却至室温。于室温下，将溶液用EtOAc稀释并过滤。滤液用饱和的氯化铵、水和盐水洗涤，干燥。浓缩并将残留物经硅胶色谱纯化，得到纯的3-氯-2-{2-氯-5-[1-(3-氰基-4-氟-苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-基]-苯氧基}-苄腈22。
4.2结果
结构22的分析数据提供如下。
4.2a 3-氯-2-{2-氯-5-[1-(3-氰基-4-氟-苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-基]-苯氧 基}-苄腈
MS m/z 466(M+1)。
4.3 23的合成
向22(20mg，0.043mmol)的丙醇(0.5mL)溶液中加入肼(17mg，0.344mmol)。将混合物于100℃搅拌14小时，然后冷却至室温。真空除去溶剂，残留物经反相LC/MS纯化，得到2-{5-[1-(3-氨基-1H-吲唑-5-基)-5-氧代-吡咯烷-3-基]-2-氯-苯氧基}-3-氯-苄腈23。
4.4结果
结构23的分析数据提供如下。
4.4a2-{5-[1-(3-氨基-1H-吲唑-5-基)-5-氧代-吡咯烷-3-基]-2-氯-苯氧 基}-3-氯-苄腈
1H NMR 400 MHz(MeOD)：δ7.99(1H，d)，7.94(1H，dd)，7.85(1H，dd)，7.78(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.47(1H，d)，7.43(1H，t)，7.21(1H，d)，6.64(1H，d)，4.28(1H，dd)，3.89(1H，dd)，3.74(1H，m)，3.01(1H，dd)，2.67(1H，dd)；MS m/z478(M+1)。
4.5 25的合成
将2-{5-[1-(3-氨基-1H-吲唑-5-基)-5-氧代-吡咯烷-3-基]-2-氯-苯氧基}-3-氯-苄腈23(80mg，0.167mmol)和邻苯二甲酸酐(30mg，0.2mmol)加至1mL二氧六环中，加热至120℃。3小时后，将混合物冷却至室温，真空除去溶剂。残留物经快速层析纯化(硅胶，0-8％MeOH的CH2Cl2溶液)，得到为浅黄色固体的3-氯-2-(2-氯-5-{1-[3-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-1H-吲唑-5-基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-苯氧基)-苄腈25。
4.6 26的合成
将25(62mg，0.102mmol)的无水CH2Cl2(2mL)溶液用氯代磺酰基异氰化物(20μL)处理。于室温下搅拌1小时后，除去溶剂。残留物用水(1mL)处理，于室温下搅拌1小时。然后，真空除去水，留下残留物。将残留物溶于EtOH(2mL)，用肼(60μL)处理3小时。然后真空除去溶剂，残留物经快速层析纯化(硅胶，0-5％MeOH的CH2Cl2溶液)，得到为白色固体的3-氨基-5-{4-[4-氯-3-(2-氯-6-氰基-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷-1-基}-吲唑-1-羧酸酰胺26。
4.7结果
结构26的分析数据提供如下。
4.7a 3-氨基-5-{4-[4-氯-3-(2-氯-6-氰基-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷 -1-基}-吲唑-1-羧酸酰胺
1H NMR 400MHz(MeOD)：δ8.10(1H，d)，7.83(1H，d)，7.80(1H，dd)，7.73(1H，dd)，7.67(1H，dd)，7.53(1H，d)，7.37(1H，t)，7.17(1H，d)，6.58(1H，d)，4.26(1H，dd)，3.86(1H，dd)，3.71(1H，m)，3.00(1H，dd)，2.61(1H，dd)；MSm/z 521(M+1)。
实施例5
29的制备
5.1 28的合成
使12(200.0mg，0.58mmol)与4-溴-2-硝基苄腈27(156.9mg，0.69mmol)偶合，得到为浅黄色固体的(R)-3-氯-2-(2-氯-5-(1-(4-氰基-3-硝基苯基)-5-氧代吡咯烷-3-基)苯氧基)苄腈28。
5.2结果
结构28的分析数据提供如下。
5.2a(R)-3-氯-2-(2-氯-5-(1-(4-氰基-3-硝基苯基)-5-氧代吡咯烷-3-基)苯 氧基)苄腈
1H NMR 400MHz(MeOD)：δ8.88(1H，d)，7.99(2H，m)，7.85(1H，dd)，7.78(1H，dd)，7.54(1H，d)，7.44(1H，t)，7.19(1H，dd)，6.64(1H，d)，4.30(1H，dd)，3.88(1H，dd)，3.72(1H，m)，3.00(1H，dd)，2.73(1H，dd)；MS m/z 493.0(M+1)。
5.3 29的合成
在氮气环境中，将28(277.7mg，0.56mmol)和SnCl22H2O(393.8mg，1.75mmol)在5.6mL EtOH中的混合物于50℃加热2小时。然后将反应混合物用6mL水稀释，用1N NaOH水溶液使其碱化，直到pH在9和10之间。然后加入6mL EtOAc。将混合物于室温下搅拌1小时，然后经硅藻土过滤。分离渗透的两层，水相用乙酸乙酯萃取。合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩并经硅胶色谱纯化(己烷∶EtOAc)，得到为黄色固体的(R)-2-氨基-4-(4-(4-氯-3-(2-氯-6-氰基苯氧基)苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-苯甲酰胺29。
5.4结果
结构29的分析数据提供如下。
5.4a(R)-2-氨基-4-(4-(4-氯-3-(2-氯-6-氰基苯氧基)苯基)-2-氧代吡咯烷 -1-基)-苯甲酰胺
1H NMR 400MHz(MeOD)：δ7.81(1H，dd)，7.74(1H，dd)，7.52(2H，m)，7.39(1H，t)，7.13(1H，dd)，6.94(1H，d)，6.83(1H，dd)，6.51(1H，d)，4.18(1H，dd)，3.76(1H，dd)，3.64(1H，m)，2.97(1H，dd)，2.55(1H，dd)；MS m/z 481.0(M+1)。
实施例6
30的制备
6.1 30的合成
将25(10mg，0.016mmol)溶于0.5mL吡啶中，加入10μL甲磺酰氯。将混合物于室温下搅拌16小时。真空除去溶剂，残留物用饱和的氯化铵(2mL)处理，然后萃取(3mL×3)。合并萃取液，浓缩并再溶于0.5mL EtOH中。加入5μL肼，将混合物于室温下搅拌3小时。真空除去溶剂，残留物经反相LC/MS纯化，得到2-{5-[1-(3-氨基-1-甲磺酰基-1H-吲唑-5-基)-5-氧代-吡咯烷-3-基]-2-氯-苯氧基}-3-氯-苄腈30。
6.2结果
结构30的分析数据提供如下。
6.2a 2-{5-[1-(3-氨基-1-甲磺酰基-1H-吲唑-5-基)-5-氧代-吡咯烷-3- 基]-2-氯-苯氧基}-3-氯-苄腈
1H NMR 400MHz(MeOD)：δ7.94(1H，d)，7.81-7.95(3H，m)，7.75(1H，dd)，7.54(1H，d)，7.39(1H，t)，7.18(1H，dd)，6.60(1H，d)，4.28(1H，dd)，3.88(1H，dd)，3.72(1H，m)，2.93(3H，s)，3.00(1H，dd)，2.64(1H，dd)；MS m/z556(M+1)。
实施例7
31的制备
7.1 31的合成
根据实施例6和7中化合物30的相同制备方法，制备目标化合物。
7.2结果
结构31的分析数据提供如下。
7.2a 2-{5-[1-(3-氨基-1-甲磺酰基-1H-吲唑-5-基)-5-氧代-吡咯烷-3- 基]-2-氯-苯氧基}-3-氟-苄腈
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)：δ7.85(1H，d，J＝2.0)，7.81(1H，dd，J＝2.4，5.2Hz)，7.65-7.69(2H，m)，7.58(1H，d，J＝9.2Hz)，7.46(1H，d，J＝8.0Hz)，7.34(1H，dt，J＝4.8，8.0Hz)，7.14(1H，dd，J＝2.0，8.4Hz)，6.94(1H，s)，6.40(2H，s)，3.99(1H，t，J＝8.4Hz)，3.66(1H，t，J＝8.0Hz)，3.59(1H，ddd，J＝8.4 Hz)，3.15(3H，s)，2.70(1H，dd，J＝8.4，16.4Hz)，2.55(1H，dd，J＝8.4，16.4Hz)。
实施例8
17的制备
8.1 15的合成
将搅拌的N-(4-甲氧基-苄基)-甲磺酰胺14(613mg，2.85mmol)的无水DMF溶液用冰浴冷却至0℃，用60％氢化钠分散液(114mg，4.75mmol)处理。将5mL 2-氟-5-碘苄腈13的DMF溶液加入反应混合物中。使得到的溶液温热至室温，然后于80℃加热1小时。将反应物冷却至室温，用饱和的NH4Cl水溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经色谱(SiO2，3∶1 Hex∶EtOAc)纯化，得到为白色固体的N-(2-氰基-4-碘-苯基)-N-(4-甲氧基-苄基)-甲磺酰胺15。
8.2 16的合成
将6mL的15(600mg，1.4mmol)的3∶2∶1 THF∶MeOH∶H2O溶液用氢氧化钠(1.0g，27.0mmol)处理。将反应混合物于回流下加热12小时。使反应混合物冷却至室温，用乙醇洗涤。将水层酸化至pH1，用EtOAc萃取。有机层将Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到为白色固体的5-碘-2-[甲磺酰基-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-苯甲酸16。
8.3结果
结构16的分析数据提供如下。
8.3a 5-碘-2-[甲磺酰基-(4-甲氧基苄基)-氨基]-苯甲酸
1H NMR(CDCl3)：δ8.34(1H，d，J＝2.0Hz)，7.76(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz)，7.15(2H，d，J＝8.8Hz)，6.79(3H，m)，4.51(1H，br s)，3.78(3H，s)，2.98(3H，s)。
8.4 17的合成
将16(366mg，0.79mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液于0℃搅拌，用甲磺酰氯(183mg，1.6mmol)和Et3N(162mg，1.6mmol)处理。将反应物搅拌1小时，用二-(4-甲氧基-苄基)-胺(257mg，0.87mmol)处理。使反应物温热至室温，用饱和的NaHCO3水溶液洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。色谱(SiO2，1∶1Hex∶EtOAc)纯化，得到为白色固体的5-碘-2-[甲磺酰基-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-N，N-二-(4-甲氧基-苄基)-苯甲酰胺17。
8.5结果
结构17的分析数据提供如下。
8.5a 5-碘-2-[甲磺酰基-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-N，N-二-(4-甲氧基-苄 基)-苯甲酰胺
1H NMR(CDCl3)：δ7.63(1H，d，J＝2.0Hz)，7.56(1H，dd，J＝2.0，8.4Hz)，7.30(2H，d，J＝8.4Hz)，7.18-7.21(2H，m)，7.08(2H，d，J＝8.4Hz)，6.91(2H，d，J＝8.4Hz)，6.88(2H，J＝8.4Hz)，6.38-6.55(2H，m)，6.67-6.70(1H，m)，5.36(1H，m)，4.71(2H，m)，4.42(1H，m)，4.12(1H，m)，3.96(1H，m)，3.83(3H，s)，3.81(3H，s)，3.79(3H，s)。
实施例9
33的制备
9.1 32的合成
在氮气环境中，向无水圆底烧瓶中加入0.5mmol的12、0.9mmol磷酸钾、17(0.75mmol)、1，2-反式-环己二胺(60μL)和CuI(80mg)。向反应物中充入氮气，加入DMF(5mL)和二氧六环(5mL)。将混合物搅拌并于110℃加热20小时，然后冷却至室温。于室温下将溶液用乙酸乙酯稀释并过滤。滤液用饱和的氯化铵、水和盐水洗涤，干燥并浓缩，残留物经硅胶色谱纯化，得到纯的32。
9.2 33的合成
将32(200mg)溶于3mL TFA中，将得到的溶液于80℃加热4小时，然后冷却至室温。减压除去TFA，残留物经硅胶柱色谱纯化(EtOAc∶MeOH＝20∶1)，得到纯的5-{4-[4-氯-3-(2-氯-6-氰基-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷-1-基}-2-甲磺酰基氨基-苯甲酰胺33。
9.3结果
结构33的分析数据提供如下。
9.3a 5-{4-[4-氯-3-(2-氯-6-氰基-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷-1-基}-2- 甲磺酰基氨基-苯甲酰胺
1H NMR 400MHz(CDCl3)：δ10.9(1H，br s)，7.88(1H，dd)，7.86(1H，br s)，7.81-7.74(3H，m)，7.53(1H，d)，7.46(1H，d)，7.41(1H，apparent t)，7.15(1H，d)，7.06(1H，br s)，6.75(1H，s)，4.09(1H，d)，3.74(1H，dd)，3.61(1H，m)，2.92(3H，s)，2.73(1H，dd)，2.48(1H，dd)；MS m/z 559.0(M+1)。
实施例10
21的制备
10.1 19的合成
向对-茴香醛(146mmol)的乙醇(500mL)溶液中加入4-甲氧基苄基胺(146mmol)。将混合物于冰浴中冷却。分次加入NaBH4(294mmol)，使反应混合物逐渐温热至室温。加入冰水混合物(100mL)，将混合物浓缩至其原体积的一半。然后，混合物用乙醚萃取，合并有机相，用盐水洗涤，干燥并浓缩。加入己烷(～50mL)，过滤沉淀物，得到35g为白色固体的二-(4-甲氧基-苄基)-胺19。
10.2 20的合成
向19(9.41g)的溶液中加入10.2mL三乙胺和100mL二氯甲烷。然后于0℃、搅拌下，分次加入10g的2-氟-4-溴苯磺酰氯。将反应混合物缓慢温热至室温，搅拌过夜。加入二氯甲烷(100mL)，将混合物用1N HCl溶液、饱和的NaHCO3、盐水洗涤，干燥。除去溶剂后，将固体与己烷混合，过滤得到纯的4-溴-2-氟-N，N-二-(4-甲氧基-苄基)-苯磺酰胺20。将母液浓缩并纯化得到更多的产物。
10.3结果
结构20的分析数据提供如下。
10.3a 4-溴-2-氟-N，N-二-(4-甲氧基-苄基)-苯磺酰胺
1H NMR(CDCl3)：δ7.74(1H，t，J＝7.6Hz)，7.36(2H，dt，J＝8.4，1.6Hz)，6.98(4H，d，J＝8.4Hz)，6.76(4H，d，J＝8.4Hz)，4.33(4H，s)，3.78(6H，s)。
10.4 21的合成
向20mL微波试管中加入760mg K2CO3、20(2g)、660μL 4-甲氧基苄基胺和18mL DMF。将试管在微波反应器中于180℃加热2500秒，冷却。将该反应进行10次，直至总共使用了20g的2-氟-碘酰胺。合并10次反应的有机物，用乙酸乙酯萃取，用饱和的氯化铵溶液和水洗涤。如果需要，浓缩并将残留物自己烷和乙酸乙酯中重结晶，得到需要的4-溴-N，N-二-(4-甲氧基苄基)-2-(4-甲氧基-苄氨基)-苯磺酰胺21。
10.4结果
结构21的分析数据提供如下。
10.4a 4-溴-N，N-二-(4-甲氧基-苄基)-2-(4-甲氧基-苄氨基)-苯磺酰胺
1H NMR(CDCl3)：δ7.60(1H，d，J＝8.4Hz)，7.15(2H，d，J＝8.4Hz)，6.94(4H，d，J＝8.4Hz)，6.88(1H，d，J＝1.6Hz)，6.80-6.85(3H，m)，6.77(4H，d，J＝8.4Hz)，6.35(1H，t，J＝4.8Hz)，4.24(2H，d，J＝4.8Hz)，4.18(4H，s)，3.78(9H，s)。
实施例11
37的制备
11.1 35的合成
向11(3.57g，16.9mmol，1eq)和3-氟-2-氟苄腈(5.25g，33.74mol，2eq)的无水DMSO(125mL)溶液中加入K2CO3(7g，50.6mmol，3.1eq)。将反应混合物于室温下搅拌24小时，然后在EtOAc和盐水之间分配。水相用EtOAc萃取，合并的EtOAc萃取液用盐水洗涤，Na2SO4干燥并蒸发。硅胶柱色谱纯化，用20∶1 CH2Cl2∶MeOH洗脱，得到(R)-3-氯-2-[2-氯-5-(5-氧代-吡咯烷-3-基)-苯氧基]-苄腈35。
11.2结果
结构35的分析数据提供如下。
11.2a 5-{4-[4-氯-3-(2-氯-6-氰基-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷-1- 基}-2-甲磺酰基氨基-苯甲酰胺
1H NMR(CDCl3)：δ7.51(1H，dt，J＝1.2，7.6Hz)，7.43(1H，d，J＝8.0Hz)，7.42(1H，dt，J＝1.6，10.4Hz)，7.31(1H，dd，J＝4.8，8.0Hz)，7.00(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz)，6.65(1H，brs)，5.61(1H，br s)，3.73(1H，t，J＝9.2Hz)，3.60(1H，dddd，J＝8.4Hz)，3.31(1H，dd，J＝6.8，9.2Hz)，2.68(1H，dd，J＝9.2，17.2Hz)，2.37(1H，dd，J＝8.4，16.8Hz)。
11.3 36的合成
在氮气环境中，向干燥的圆底烧瓶中加入35(0.5mmole)、磷酸钾(0.9mmol)、21(0.75mmol)、1，2-反式-环己二胺(60μL)和CuI(80mg)。向反应器中充入氮气，加入DMF(5mL)和二氧六环(5mL)。将混合物搅拌并于110℃加热20小时，然后冷却至室温。用EtOAc稀释并过滤。滤液用饱和的氯化铵、水和盐水洗涤，然后干燥。浓缩并将残留物经硅胶色谱纯化，得到4-{4-[4-氯-3-(2-氰基-6-氟-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷-1-基}-N，N-二-(4-甲氧基-苄基)-2-(4-甲氧基-苄基)-苯磺酰胺36。
11.4 37的合成
将36(120mg)溶于2mL的50∶50 TFA∶二氯甲烷中。将溶液于室温下搅拌过夜，浓缩。残留物溶于氯仿中，用饱和的碳酸氢钠溶液处理。将得到的混合物搅拌10分钟，然后分离有机层，用盐水洗涤，硫酸钠干燥。除去溶剂后，残留物经硅胶色谱纯化(EtOAc∶MeOH＝50∶1)，得到纯的2-氨基-4-{4-[4-氯-3-(2-氰基-6-氟-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷-1-基}-苯磺酰胺37。
11.5结果
结构37的分析结果提供如下。
11.5a 2-氨基-4-{4-[4-氯-3-(2-氰基-6-氟-苯氧基)-苯基]-2-氧代-吡咯烷 -1-基}-苯磺酰胺
1H NMR(CDCl3)：δ7.55-7.60(2H，m)，7.48(1H，d，J＝6.4Hz)，7.46(1H，d，J＝6.4Hz)，7.40(1H，dt，J＝4.8，8.0Hz)，7.17(2H，m)，6.95(1H，s)，6.83(1H，dd，J＝2.4，9.2Hz)，6.34(2H，br s)，5.52(2H，br s)，4.08(1H，m)，3.59-3.70(2H，m)，2.76(1H，dd，J＝8.4，16.4Hz)，2.51(1H，dd，J＝8.4，16.4)。
通过重复上面实施例中所述的方法，采用适当的原料，可以获得如表1中所确定的本发明化合物。
实施例12
生物学实验分析
通过下列分析实验本发明化合物抑制HIV的能力。在本分析中采用水泡性口炎病毒糖蛋白(“VSV-g”)假型HIV-1荧光素酶报告病毒(“HIV-1假型病毒”)。采用由VSV-g被膜表达质粒、包装构建物(packaging construct)(delta psi)和HIV-1 LTR:Luc质粒组成的三种质粒HIV-1慢病毒载体系统进行三重瞬时转染(CaP，Clontech)，然后自人类胚胎肾(HEK)293T繁殖细胞(producer cell)(“HEK293T”)捕获病毒。VSV-g被膜表达质粒产生假型病毒受体，使其具有更宽的向性并介导进入HEK293T靶细胞。delta psi包装构建物供给产生假型病毒需要的所有结构及调控基因产物。除荧光素酶报告基因和HIV-1 LTR外，自HIV-1 LTR:Luc质粒合成的病毒载体或RNA还拥有cis RNA包装信号(psi序列)。转染的繁殖细胞的上清液含有在病毒基因组中仅携带荧光素酶基因的HIV-1假型病毒。当靶293T细胞转导时，病毒基因组的RNA将经历由PGK(磷酸甘油酸酯激酶启动子)驱动的整合的荧光素酶基因的逆转录、核转运、整合和转录。采用CLIPR平板读板仪(Molecular Devices)测定感染后48小时使用Bright-Glo试剂(Promega)作底物的荧光素酶的活性，确定EC50值。
生物学实验分析方案
在293T靶细胞中对抗复制-缺陷HIV报告病毒的活性(单一周期感染分析)：
在补充有10％FBS、1X Pen/Strep/谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中按常规方法培养HEK 293T细胞。方案如下：
1.采用Aquamax(Molecular Devices)液体分配器，以每孔700个细胞(5μL体积)的浓度将293T细胞接种于1536孔板上。
2.将细胞于37℃、5％CO2环境中培养24小时。
3.采用PinTool(GNF)转移50nL各种化合物(在DMSO中连续稀释)。
4.37℃培养1小时后，采用Aquamax将2μL HIV报告病毒转移至细胞中，相当于感染复数(MOI)约为1.0。
5.将处理和感染的细胞于37℃再培养48小时。
6.通过加入Bright-Glo(Promega，Cat.#E263B和E264B)荧光素酶试剂(5μL/孔，Aquamax)，随后在CLIPR仪器(Molecular Devices)上采用20秒的穿梭速度(shuttle speed)读取平板，检测荧光素酶活性。
细胞毒性分析(与所有的感染抑制分析平行进行)
1.采用Aquamax(Molecular Devices)液体分配器，以每孔700个细胞(5μL体积)的浓度将293T细胞接种于1536孔板上。
2.将细胞于37℃、5％CO2环境中培养24小时。
3.采用PinTool(GNF)转移50nL各种化合物(在DMSO中连续稀释)。
4.将处理和未感染的细胞于37℃再培养48小时。
5.通过加入1μL的在DMEM中以1∶1的比例稀释的AlamarBlue(Promega，Cat.#00-100)，评价细胞生存能力。
6.将细胞于室温下另外再4小时，随后采用装备有50/50光束分离器(beam splitter)的Acquest(TREK systems)读取荧光强度。
可以理解：本文中所描述的实施例和实施方案只是用于说明，本领域技术人员可以对其进行各种修改或改进，它们都包含在本申请的精神和权限以及权利要求书的范围内。本文引述的所有出版物、专利和专利申请均以其全部内容在此引入作为参考。

Claims (22)

1.具有下式结构的化合物：
Figure A2006800033340002C1
其中：
R1和R5独立选自H、CN、卤素、取代的或未取代的C1-C4烷基、取代的或未取代的C2-C4链烯基和OR8，其中R8选自取代的或未取代的C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
R2和R4选自H、卤素、CN和取代的或未取代的C1-C4烷基；
R3选自H、CN和烷基；
R6选自稠合的苯基杂环环系和：
其中：
R9和R11独立选自H、取代的或未取代的C1-C4烷基、卤素、CN、C(O)NR12R12、NR12R12和OR12，其中R12选自H、取代的或未取代的C1-C4烷基；
R10选自H、CN、NR13R14、SO2NHR13、NHSO2R13、SO2NH(CH2)nOR13、SO2NH(CH2)nNR13R14、O(CH2)nSO2NHR13、O(CH2)nNR13R14、O(CH2)nSO2R15、SO2R15、SO2(CH2)nNR13R14和C(O)NR13R14，
其中：
R13和R14选自H和取代的或未取代的C1-C4烷基，它们与它们所连接的氮一起任选结合形成杂环；
R15为取代的或未取代的C1-C4烷基；
n为1-8的整数；
其中至少一个选自R9、R10和R11的基团不为H；并且
R7选自卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基和C2-C4炔基。
2.权利要求1的化合物，其中R6为稠合的苯基杂环环系，该稠合的苯基杂环系选自：
Figure A2006800033340003C1
其中：
R16选自H、C(O)NR18R19、C(O)NR18(CH2)nNR18R19、C(O)NR18(CH2)nOR18、C(O)NR18CH(CH2OR18)2、C(O)NR18(CH2)nC(O)NR18R19、(CH2)nSO2NR18R19、S(O)2R20，
其中：
R18和R19独立选自H和取代的或未取代的C1-C6烷基；或者R18和R19与它们两个所连接的氮原子一起形成取代的或未取代的杂环；
n为1-8的整数；
R20为取代的或未取代的C1-C6烷基和取代的或未取代的苯基；并且
R17选自H、NH2、(CH2)mOH、C(O)NR21R22、SO2R23、NHSO2R23、NHCOR23，
其中：
R21和R22独立选自H、取代的或未取代的C1-C6烷基和取代的或未取代的苯基，它们与它们所连接的氮一起任选结合形成环；
R23为取代的或未取代的C1-C6烷基；且
m为1-5的整数。
3.权利要求1的化合物，其中R1和R5独立选自氢、卤素、CN、甲基、甲氧基、乙烯基和三氟甲氧基。
4.权利要求1的化合物，其中R6为：
Figure A2006800033340004C1
5.权利要求4的化合物，其中R16选自C(O)NR18R19和S(O)2R20。
6.权利要求5的化合物，其中R18和R19为H。
7.权利要求5的化合物，其中R20为CH3。
8.化权利要求4的合物，其中R17为NH2。
9.权利要求1的化合物，其中R6为：
Figure A2006800033340004C2
其中：
R9选自NH2和C(O)NH2；且
R10选自C(O)NH2、NHSO2CH3和SO2NH2。
10.权利要求1的化合物，具有选自下列的结构式：
Figure A2006800033340005C1
11.药物制剂，该药物制剂含有权利要求1的化合物以及药学上可接受的载体。
12.在细胞中抑制HIV的方法，所述方法包括使所述细胞与足以抑制所述HIV量的权利要求1的化合物接触。
13.权利要求12的方法，其中所述HIV为药物抗性HIV菌株。
14.权利要求12的方法，其中所述细胞为人类细胞。
15.在细胞中抑制逆转录酶的方法，所述方法包括使所述细胞与足以抑制所述逆转录酶量的权利要求1的化合物接触。
16.权利要求15的方法，其中所述逆转录酶为HIV逆转录酶。
17.权利要求16的方法，其中所述HIV为药物抗性HIV菌株。
18.权利要求15的方法，其中所述细胞为人类细胞。
19.在人类患者中治疗HIV感染的方法，该方法包括给予所述患者足以抑制所述HIV量的权利要求1的化合物。
20.权利要求19的方法，其中所述HIV感染由药物抗性HIV菌株引起。
21.预防HIV感染的方法，该方法包括给予处于HIV感染风险的人预防量的权利要求1的化合物。
22.权利要求21的方法，其中所述HIV为药物抗性HIV菌株。
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