CN101113451A - 一种龙葵抗虫基因及其应用 - Google Patents

一种龙葵抗虫基因及其应用 Download PDF

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徐增富
罗鸣
王兆玉
李华鹏
蔡颖鹏
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Abstract

本发明公开了一种龙葵抗虫基因及其应用，该基因序列如SEQID NO：1所示。本发明的龙葵抗虫基因所编码的蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性有显著的抑制作用。该基因的超量表达能够使转基因植株获得明显的对棉铃虫和斜纹夜蛾的抗性。该基因在植物抗虫基因工程领域、医药和分子生物学领域有重要应用价值。

Description

一种龙葵抗虫基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物抗虫基因技术领域，具体的说，涉及一种龙葵抗虫基因及其应用。
背景技术
虫害是造成农业减产的重要原因之一。据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失平均达20％-30％，每年大约损失数千亿美元。植物抗虫基因工程的诞生，为防治害虫提供了一条崭新的途径。由于该方法具有安全，有效，可降低投资和减少环境污染等诸多优点，因而自1987年首次报道抗虫转基因植物以来，植物抗虫基因工程的研究取得了迅猛发展。
目前广泛应用于植物抗虫基因工程的抗虫基因按来源可分为三类：一类是来源于微生物苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白基因；第二类是来自高等植物的蛋白酶抑制剂(PI)基因和凝集素基因；第三类为动物来源的蛋白酶抑制剂基因和动物毒素基因。此外，几丁质酶基因、核糖体失活蛋白基因、淀粉酶抑制剂基因、胆固醇氧化酶基因、豌豆脂肪氧化酶基因、多酚氧化酶基因、系统肽、Bt营养期杀虫蛋白基因、异戊烯基转移酶基因及一些非蛋白类杀虫剂的合成调控基因也可用于抗虫植物基因工程。
Bt毒蛋白是最先利用的基因，其发展已经有几十年的历史了，应用的比较成熟。与其它抗虫基因相比，在同等表达量下，Bt类基因产物的抗虫能力最强。人们将克隆出的Bt转入植物后，使植物的抗虫性得到了提高，已经有很多种的植物因为转入了Bt蛋白而提高了抗虫性，转Bt蛋白的植物也成功进入商品市场。但是由于Bt蛋白的毒性太强，对昆虫的选择压力太大，昆虫容易产生抗性，从而不被Bt杀死。由此，人们普遍把目光转向了一种新的抗虫基因-蛋白酶抑制剂。
天然的蛋白酶抑制剂(PI)是一类对蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白质，普遍存在于植物，动物和微生物中。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶，抑制蛋白酶降解蛋白质的能力。几乎所有的蛋白酶抑制剂都会与其目的蛋白酶结合，形成一个稳定的，没有酶活性的蛋白酶-抑制剂复合物，从而导致蛋白酶的失活。
根据氨基酸序列的同源性，可以将目前发现的蛋白酶抑制剂划分为22个家族，包括：马铃薯蛋白酶抑制剂I家族(PIN I)、马铃薯蛋白酶抑制剂II(PIN II)家族、Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂家族、Bowman-Birk蛋白酶抑制剂家族、Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂家族、胶原酶抑制剂家族、羧肽酶抑制剂家族等等。而根据所抑制酶的活性基团，蛋白酶抑制剂则可划分为四大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂在医药领域和植物抗病抗虫领域都有重要的作用。大多数昆虫(如大部分鳞翅目、直翅目、双翅目、膜翅目以及某些鞘翅目)的消化酶以丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)为主，因此丝氨酸蛋白酶抑制剂可以有效抑制这类昆虫的生长和发育。PINII属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制作用。PIN I和PIN II可以抗鳞翅目昆虫，其中PIN II蛋白酶抑制剂的抗虫性要优于PIN I，因而在抗虫基因工程中有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的蛋白酶抑制剂龙葵抗虫基因。
本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒。
本发明的另一个目的是提供上述重组质粒转化的重组微生物。
本发明的进一步目的是提供上述龙葵抗虫基因在增强植物抗虫能力中的应用。
本发明克隆的龙葵抗虫基因，属于PIN II基因家族，是一种在龙葵韧皮部特异表达的基因，其mRNA主要在伴胞和未成熟的筛分子中转录，其蛋白质主要定位于筛分子周壁细胞质和筛分子腔内，以及筛域孔部位。其编码的蛋白是一种可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的丝氨酸型蛋白酶抑制剂。该基因构建的植物表达载体，在花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子的驱动下超量表达，可获得具有抗虫能力的转基因植株。
本发明为了得到理想的外源蛋白表达效果，在龙葵蛋白酶抑制剂Ha基因(SaPIN2a)基础上克隆了包含其5’端非翻译区(5’UTR)的全长龙葵蛋白酶抑制剂A的cDNA序列，得到的基因命名为NPIA，该基因长496 bp(见SEQ ID NO：1)。其编码的氨基酸序列见SEQ IDNO：2。
本发明中的NPIA基因可与植物表达载体质粒pBI121重组，构建获得龙葵蛋白酶抑制剂A基因的植物表达载体pF-121，NPIA基因由CaMV 35S启动子控制表达。
本发明参照分子克隆第三版98-99页方法，将含有NPIA基因的植物表达载体pF-121转入大肠杆菌或农杆菌；参照Horsch等人(1985)发展的叶盘转化法，利用携带该质粒的农杆菌转化烟草，获得转NPIA基因的烟草。
本发明通过PCR检测转基因阳性植株。从转基因子一代(T1代)开始，做卡那霉素抗性筛选。将卡那抗性植株再做PCR检测，选择阳性植株。
本发明通过Northern blot检测转基因阳性植株。当PCR检测阳性植株长到8-10片叶，约40cm高的时候，取各个植株相同部位比较嫩的叶片提取总RNA，做Northern blot检测。选取非转基因烟草及转pBI-121空载体烟草的叶片总的RNA做负对照，非转基因龙葵茎的总RNA做正对照。探针选取龙葵蛋白酶抑制剂基因基因AcDNA片段。结果表明NPIA基因在转基因烟草叶片中发生转录。
本发明通过Western blot检测阳性植株龙葵蛋白酶抑制剂基因蛋白的表达。提取转基因烟草相同位置的叶片总蛋白做Western blot检测，选取非转基因烟草及转pBI-121空载体烟草叶片总蛋白做负对照，非转基因龙葵纯化的龙葵蛋白酶抑制剂蛋白做正对照。用龙葵蛋白酶抑制剂基因A特异性抗体。结果表明NPIA基因在转基因烟草叶片中表达。
本发明参照Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)的方法测量转基因烟草和对照烟草总蛋白对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶以及昆虫中肠类胰蛋白酶的抑制能力。其结果表明NPIA基因在转基因烟草中超量表达时，具有较高的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。转基因的烟草蛋白粗提液对胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶以及昆虫中肠类胰蛋白酶有抑制活性。其与对照组存在极显著差异。
本发明通过向转基因烟草人工接种棉铃虫和斜纹夜蛾幼虫试验，用向非转基因烟草接种幼虫作对照，研究转基因烟草抗虫效果。观察植株受损情况，发现转基因植株的受损程度明显低于对照。本发明通过转基因烟草叶片人工喂养棉铃虫和斜纹夜蛾幼虫试验，用非转基因烟草叶片饲喂幼虫作对照，研究转基因的烟草对上述两种害虫幼虫的毒害效果。结果表明进食转基因烟草的幼虫的体重与对照存在极显著差异。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的NPIA基因是在茄科植物龙葵中分离的基因，其功能是生产蛋白酶抑制剂，提高植物抗虫性。利用本发明NPIA基因作为目的基因构建植物表达载体，在花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子的驱动下超量表达，提高了转基因植株的抗虫能力，该基因可以用于抗虫植物基因工程的研究以及棉铃虫，斜纹夜蛾等磷翅目昆虫的生物防治。
附图说明
图1为植物表达载体pBI121和pF-121的示意图；
图2：转基因烟草PCR检测图
图3：转基因烟草Northern blot检测图
图4：转基因烟草Western blot检测图
图5：转基因烟草总蛋白抑制活性柱形图
图6：转基因烟草喂食棉铃虫和斜纹夜蛾，植株受损情况对比图。
图7：喂食棉铃虫和斜纹夜蛾后，幼虫体重分析柱形图。
其中，图1中，A：pBI-121，包括35S启动子，GUS基因和Nos终止子；B：pF-121，包括35S启动子，NPIA基因和Nos终止子。
图2中，1：Marker，2：非转基因烟草，3：转空载体烟草，4-8：转NPIA基因烟草。
图3中，1：用非转基因龙葵作正对照，出现一条杂交条带；2，3：用非转基因烟草和转空载体烟草作负对照，无杂交条带；4，5：转NPIA基因烟草，出现一条杂交条带。
图4中，1：用纯化的龙葵蛋白酶抑制剂蛋白作正对照，出现一条杂交条带；2，3：用非转基因烟草和转空载体烟草作负对照，无杂交条带；4，5：转NPIA基因烟草，出现一条杂交条带。
图5中，A图：转基因烟草总蛋白对胰蛋白酶抑制活性；B图：转基因烟草总蛋白对胰凝乳蛋白酶抑制活性；C图：转基因烟草总蛋白对棉铃虫中肠类胰蛋白酶抑制活性；D图：转基因烟草总蛋白对斜纹夜蛾胰蛋白酶抑制活性；1：未加烟草总蛋白，蛋白酶的活性；2：加非转基因烟草总蛋白后，蛋白酶的剩余活性；3：加转空载体烟草总蛋白后，蛋白酶的剩余活性；4：加转NPIA基因烟草转总蛋白后，蛋白酶的剩余活性。
具体实施方式
实施例1：龙葵蛋白酶抑制剂基因A的获得及植物表达载体的构建
根据龙葵蛋白酶抑制剂基因IIa(SaPIN2a)序列，设计基因特异引物，用cDNA末端快速扩增方法获得5’非翻译区(UTR)。利用GeneRacer 5’primer和GeneRacer 5’nested primer和反向基因特异引物2A-KDELSAC1以cDNA为模板进行扩增，将RT-PCR产物克隆到pMD-18T载体得到含5’UTR的载体p5’RACE-TV。合成2a-full-1和2a-full-2一对引物，从p5’RACE-TV-1扩增从转录起点到UAA终止密码子的龙葵蛋白酶抑制剂IIa基因cDNA。产物也克隆到pMD-18T得到pF-TV。用BamH I+Sac I双酶切pF-TV就得到NPIA基因，该基因长496 bp(见SEQ ID NO：1)。
将得到的NPIA基因代替pBI121上的GUS基因，质粒命名为pF-121，用pF-121质粒转化农杆菌(A.tumefaciens)LBA4404。
本发明中的NPIA基因与植物表达载体质粒pBI121重组，见图1A；构建获得龙葵蛋白酶抑制剂A基因的植物表达载体pF-121，见图1B，NPIA基因由CaMV 35S启动子控制表达。
引物序列：
GeneRacer 5’primer：
5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’
GeneRacer 5’nested primer：
5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’
2A-KDELSAC1：
5’-CTGAGCTCTTATAGCTCATCTTTGAAATAAGCAGTGGTCTTGG-3’
2a-full-1：
5’-GTGGATCCACCCAGAAAAAACAACAACAAAGAAGGCAA-3’
2a-full-2：
5’-ATGAGCTCTTAGAAATAAGCAGTGGTCTTGGGTTCA-3’
实施例2：农杆菌介导的烟草转化和卡那霉素抗性筛选
从平板接种对应的农杆菌菌株于5mlYEB液体培养基(卡那霉素50mg/ml，利福平50mg/L)，28℃180 rpm培养两天；然后用液体TRM培养基稀释农杆菌液至OD600约为0.2-0.3。将无菌的叶片切成小叶盘，放入稀释的农杆菌液中5分钟。取少量切好的叶片放入无农杆菌的液体TRM培养基中，分别移到不含或含有Kan(50mg/L)的平板上做为转化的正负对照。28℃暗培养两天；用液体TRM培养基漂洗外植体至少5次。在无菌滤纸上吸干液体。将外植体移至TRM固体平板(含有100μg/ml的卡那霉素，250μg/ml的羧苄青霉素)上，28℃培养。每两周换一次培养基；4至6周后，切下1～2cm的小芽移到组织培养瓶中生根壮苗。培养基为含有100μg/ml卡那霉素及100μg/ml羧苄青霉素的MS培养基；待长根后，移入土中。结果见表1。
表1
出芽数
转NPIA基因烟草转空载体烟草侵染农杆菌不含Kan的正对照 582546
未侵染农杆菌含Kan的负对照 0
实施例3：将卡那霉素抗性转基因植株作PCR检测
鉴定pF-121(F系列)所用引物
5’端引物序列：ZF56  5’-TCCCACTATCCTTCGCAAGACCC-3’
3’端引物序列：
ZF103  5’GCGGATCCTTAGAAATAAGCAGTGGTCT-3’
鉴定pBI-121(B系列)所用引物
5’端引物序列：ZF56  5’-TCCCACTATCCTTCGCAAGACCC-3’
3’端引物序列：ZF47  5’-TCACCGAAGTTCATGCCAGT-3’
PCR反应条件为：95℃，5分钟1个循环，后经95℃50秒，58℃40秒，72℃ 40秒，35个循环，然后72℃延伸10分钟。选择PCR鉴定为阳性的材料。结果见表2和图2。
表2
  阳性     阴性   阳性率
  转NPIA基因烟草转空载体烟草   197     11   95％87.5％
  非转基因烟草   0     0   0
实施例4：转基因植株Northern blot检测
用处理液(1％SDS，0.1M NaOH)处理电泳槽、胶板、梳子、量筒等所有的需用的器皿，DEPC水冲洗干净。每个样品取20μgRNA，加入Eppendorf管，用SpeedVac Equipment真空离心机抽干15min。用6μl DEPC水溶解。每个样加入10μl DMSO，1μl 0.2 M Na3PO4(pH6.5)，3μl乙二醛，混匀。50℃温育30min。用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制1.5％的琼脂糖凝胶，倒好胶板。每个样品加3μl的RNA上样缓冲液，100V于10mM磷酸缓冲液(pH6.5)电泳。待样品进胶后，打开磁力搅拌器，令电泳槽两极的搅拌子转动，使电泳缓冲液循环流动，待蓝色染料到达胶底时电泳结束。用滤纸制作转移的盐桥，纸桥两端搭于转移缓冲液(20×SSC)中，转移过夜。将膜在2×SSC中漂洗一下，然后在空气中干燥10min。于80℃抽真空烘烤2h。紫外交联3min。然后将杂交膜置于预杂交液中42℃温育4h。预杂交液中加入新鲜制备的探针(NPIA基因片段)，混匀，42℃杂交过夜。用2×SSC，0.1％SDS室温洗膜15min。再用0.1×SSC，0.1％SDS室温洗30min。然后用保鲜膜将杂交膜包好，放在磷屏中，用透明胶在4个角固定，室温下放置4h以上或过夜。使用Typhoon8600 Variable Mode Imager扫描信号。结果见表3和图3。
表3
    阳性   阴性     阳性率
    转NPIA基因烟草转空载体烟草     150     40     78.9％0
    非转基因烟草     0     0     0
实施例5：转基因植株Westem blot检测
提取植物总蛋白，制备15％的分离胶，5％的浓缩胶。待胶凝固后，组装垂直电泳槽，灌进SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液。将蛋白样品与等体积的上样缓冲液混合，95℃变性5分钟，冷却后点样。200V，电泳40～45分钟，至溴酚蓝即将跑出胶。转膜按照Amersham公司的Transphor TE 62型推荐的程序进行：裁剪与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜一张和滤纸数张，分别用双蒸水和转移缓冲液浸泡充分。按3层滤纸、膜、胶、3层滤纸的顺序叠好，排除气泡。用提供的转移夹子固定转移装置。往转移容器中加入1L预冷到4℃的转移缓冲液；将整个转移装置插到转移容器中，尽量驱除留在海绵上的气泡。恒电流350mA转移1小时。Western杂交采用NBT/BCIP蛋白显色检测系统，其二抗为连有碱性磷酸酶的羊抗兔抗体。操作按照建议进行：将电转移之后的硝酸纤维素膜浸泡在TBS中，温和摇动5-10分钟。再重复洗一次。将膜45度浸入到封闭液中，温和摇动30分钟到1小时。将膜转到TTBS中，温和摇动5分钟。再重复洗一次。倾去TTBS，加入一抗溶液(NPIA基因特异性抗体，浓度1∶20000溶于抗体缓冲液)，温和摇动过夜。将膜转到TTBS中，温和摇动5-10分钟。再重复洗一次。倾去TTBS，加入二抗溶液(浓度1∶3000溶于抗体缓冲液)，温和摇动1-2小时。用TTBS重复洗两次。加入显色液，待膜上出现明显杂交带，终止反应。结果见表4和图4。
表4
    阳性     阴性     阳性率
    转NPIA基因烟草转空载体烟草     120     70     63.2％0
    非转基因烟草     0     0     0
实施例6：转基因烟草总蛋白抑制活性检测方法
胰蛋白酶(TAME法)：参考Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)的方法，将样品与胰蛋白酶混匀，于室温下放置3分钟，再加入底物溶液(1.1mmol/L TAME)至总体积为3mL。迅速混匀后，将反应液放入分光光度计中，37℃，于247nm处扫描3分钟，每30秒计数一次。找出反应过程中的线性变化部分的ΔA，即可计算出活性值。
胰凝乳蛋白酶(BTEE法)：参考Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)，将样品与胰凝乳蛋白酶混匀，于室温下放置3分钟，再加入底物溶液(1mmol/L BTEE)至总体积为3mL。迅速混匀后，将反应液放入分光光度计中，37℃，于256nm处扫描3分钟，每30秒计数一次。找出反应过程中的线性变化部分的ΔA，即可计算出活性值。
昆虫中肠提取物的类胰蛋白酶测定方法参考胰蛋白酶活性测定方法，由适量昆虫中肠提取物代替商用蛋白酶，不足部分用相应分析缓冲液补足。室温下放置3分钟，再加入相应底物溶液至总体积为3mL。迅速混匀后，将反应液放入分光光度计中，37℃，相应波长下扫描3分钟，每30秒计数一次。找出反应过程中的线性变化部分的AA，即可计算出活性值。
由图5可以看出，转基因的烟草蛋白粗提液对胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶以及昆虫中肠类胰蛋白酶有抑制活性。其与对照组存在极显著差异(P＜0.01)。
实施例7：人工接种棉铃虫、斜纹夜蛾幼虫试验
当移栽到温室的转基因植株长至约50cm高，10-12片叶龄时，25℃条件下，将植株分为两组。一组植株接种二龄棉铃虫幼虫10头，另一组接种二龄夜蛾幼虫10头，重复三次，十四天后分析结果。
如图6所示，A图是喂食棉铃虫，1为非转基因烟草；2为转空载体烟草；3为转NPIA基因烟草。B图是喂食斜纹夜蛾；1为非转基因烟草；2为转空载体烟草；3为转NPIA基因烟草。这说明转基因植株的受损程度明显低于对照组。
取下植株上的棉铃虫和二龄夜蛾幼虫，称重并将数据进行方差分析。如图7所示，A图是接种棉铃虫，1为非转基因烟草；2为转空载体烟草；3为转NPIA基因烟草。B图是接种斜纹夜蛾，1为非转基因烟草；2为转空载体烟草；3为转NPIA基因烟草。这说明食转基因烟草的幼虫的体重明显小于对照组，P＜0.01。
综上所述，本发明提供的NPIA基因是在茄科植物龙葵中分离的基因，其功能是生产蛋白酶抑制剂，提高植物抗虫性。利用本发明NPIA基因作为目的基因构建植物表达载体，在花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子的驱动下超量表达，提高了转基因植株的抗虫能力，该基因可以用于抗虫植物基因工程的研究以及棉铃虫，斜纹夜蛾磷翅目昆虫的生物防治。
一种龙葵抗虫基因及其应用.txt
SEQUENCE LISTING
<110>中山大学
<120>一种龙葵抗虫基因及其应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>496
<212>DNA
<213>龙葵(Solanum americanum)
<220>
<221>CDS
<222>(50)..(493)
<400>1
acccagaaaa aacaacaaca aagaaaacaa ggtggagaaa gcattcata atg gct gtt     58
                                                      Met Ala Val
                                                      1
cac aaa gtt agc ttc ctt gct tgc cta ctt gtt ctt gga tgg atg ttt      106
His Lys Val Ser Phe Leu Ala Cys Leu Leu Val Leu Gly Trp Met Phe
    5                   10                  15
cta ctt gcg aaa cat gtt gat gcc aag gct tgt act aga gaa tgt ggt      154
Leu Leu Ala Lys His Val Asp Ala Lys Ala Cys Thr Arg Glu Cys Gly
20                  25                  30                  35
cat ttt agc tat ggc ata tgc cca cgt tca gaa gga agt ccc caa aaa      202
His Phe Ser Tyr Gly Ile Cys Pro Arg Ser Glu Gly Ser Pro Gln Lys
                40                  45                  50
cct ata tgc acc aat tgt tgc tca ggc tat aag ggt tgc aac tat tac      250
Pro Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ser Gly Tyr Lys Gly Cys Asn Tyr Tyr
            55                  60                  65
agt gct aaa gga gat ttg att tgt gaa gga gaa tct gac cct aga aac      298
Ser Ala Lys Gly Asp Leu Ile Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn
        70                  75                  80
cca aaa gat tgt acc ttc gaa tgt gat aca cag att gct tat tca aaa      346
Pro Lys Asp Cys Thr Phe Glu Cys Asp Thr Gln Ile Ala Tyr Ser Lys
    85                  90                  95
tgt cct cgt tca gaa gga aag atg ata att aaa ccc act gga tgc acc      394
Cys Pro Arg Ser Glu Gly Lys Met Ile Ile Lys Pro Thr Gly Cys Thr
100                 105                 110                 115
act tgt tgc acg ggc tat cag ggt tgc tac tat ttc gat caa gat ggt      442
Thr Cys Cys Thr Gly Tyr Gln Gly Cys Tyr Tyr Phe Asp Gln Asp Gly
                120                 125                 130
gat ttt gtc tgt gaa gga gag agt cct gaa ccc aag acc act gct tat      490
Asp Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Pro Glu Pro Lys Thr Thr Ala Tyr
            135                 140                 145
ttc taa                                                              496
Phe
<210>2
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<212>PRT
<213>龙葵(Solanum americanum)
<400>2
Met Ala Val His Lys Val Ser Phe Leu Ala Cys Leu Leu Val Leu Gly
1               5                   10                  15
Trp Met Phe Leu Leu Ala Lys His Val Asp Ala Lys Ala Cys Thr Arg
            20                  25                  30
Glu Cys Gly His Phe Ser Tyr Gly Ile Cys Pro Arg Ser Glu Gly Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Lys Pro Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ser Gly Tyr Lys Gly Cys
    50                  55                  60
Asn Tyr Tyr Ser Ala Lys Gly Asp Leu Ile Cys Glu Gly Glu Ser Asp
65                  70                  75                  80
Pro Arg Asn Pro Lys Asp Cys Thr Phe Glu Cys Asp Thr Gln Ile Ala
                85                  90                  95
Tyr Ser Lys Cys Pro Arg Ser Glu Gly Lys Met Ile Ile Lys Pro Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Tyr Gln Gly Cys Tyr Tyr Phe Asp
        115                 120                 125
Gln Asp Gly Asp Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Pro Glu Pro Lys Thr
    130                 135                 140
Thr Ala Tyr Phe
145
<210>3
<211>
<212>DNA
<213>引物
<400>3
GeneRacer 5’primer：
5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’
GeneRacer 5’nested primer：
5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’
2A-KDELSACl：
5’-CTGAGCTCTTATAGCTCATCTTTGAAATAAGCAGTGGTCTTGG-3’
2a-full-1：
5’-GTGGATCCACCCAGAAAAAACAACAACAAAGAAGGCAA-3’
2a-full-2：
5’-ATGAGCTCTTAGAAATAAGCAGTGGTCTTGGGTTCA-3’

Claims (7)

1.一种龙葵抗虫基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述龙葵抗虫基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.含有权利要求1所述龙葵抗虫基因的重组质粒。
4.含有权利要求1所述龙葵抗虫基因的植物表达载体。
5.含有权利要求1所述龙葵抗虫基因的转基因植物细胞及其再生植株。
6.含有权利要求1所述龙葵抗虫基因的宿主菌。
7.权利要求1所述龙葵抗虫基因在增强植物抗虫能力中的应用。
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