具体实施方式
制备例:
例1
本发明骨修复材料的制备:
1、利用AdMax系统,制备重组腺病毒Ad-HGF
(1)构建穿梭质粒pDC316/HGF,具体方法是:
①目的基因的扩增:
上游引物:5′-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3′,引入Sac I位点;下游引物:5′-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3′,引入Sal I位点。提取共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞的总RNA,以OligdT为引物进行逆转录,然后加入上、下游引物进行PCR扩增:95℃预变性5min,然后95℃30s,58℃ 30s,72℃2min,共30个循环,最后72℃延伸10min。
②穿梭质粒的构建 将PCR产物插入pGEM-T载体,转化感受态菌DH5α。提取质粒,DNA测序正确后,以Sac I及Sal I双酶切,回收2,200bp片段,插入穿梭载体pDC316的相离位点,以连接产物转化DH5α感受态菌,提取质粒pDC316/HGF,酶切鉴定结果如图1所示。
(2)pDC3 16/HGF与包装质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,具体方法是:
①转染前一天,将293细胞接种于六孔板中,每孔5×105个细胞,培养液为DMEM+10%Hyclone胎牛血清,置37℃含5%CO2的培养箱中培养过夜。
②转染当天换液,用新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。待细胞生长至底面积的80-90%时,取骨架质粒包装质粒pBHGloxΔE1,3Cre和穿梭质粒pDC316/HGF,用Lipofectamine2000脂质体进行转染。具体步骤为:1)每个转染孔取骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre4μg,穿梭质粒pDC316/HGF 1μg,混和均匀。2)质粒用300μl的DMEM培养液进行稀释,室温放置5min。3)取10μl的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释,室温放置5min。4)将两者混和,室温避光放置30min。然后将混合物加入到细胞中。
③转染后第二天,将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中,用含5%胎牛血清的DMEM培养液继续培养,每天观察,待细胞长满瓶底时,再传入75cm2细胞培养瓶中,密切观察有无出毒迹象。
④结果在第八天时,发现细胞有出毒迹象,细胞变大变圆,呈葡萄状,并开始出现明显噬斑。第11天时,细胞大部分病变并从底部脱落。
⑤收毒。将出毒的细胞培养瓶先后置于液氮和37℃水浴锅中反复冻融三次,使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液离心,3000rpm,收集含病毒的上清液,弃掉细胞碎片沉淀。
该病毒上清即为第一代毒种(P1),命名为Ad-HGF,作为随后大量病毒扩增的毒种。
⑥毒种鉴定:在25cm2细胞瓶中培养293细胞,待细胞生长至90%满时,取上述第一代毒种500μl接种于细胞上,待细胞完全病变时按前述方法冻融细胞三次,离心收集病毒上清液,此即为第二代毒种(P2)。取50μlP2毒种上清液,加入2μl蛋白酶K(10mg/ml),55℃消化1h,煮沸10min,立即放入冰浴5min,取1μl作为模板,用HGF上、下游引物进行PCR鉴定,扩增条件同上。若能够特异地扩增出2,200bp的条带,证明该重组腺病毒携带目的片段。
2、扩增病毒,采用HPLC色谱层析纯化,具体方法是:
(1)在1个75cm2方瓶中接种4×106293细胞,培养过夜,待细胞生长至90%满时,取2ml P2代毒种接种培养瓶内,24h,显微镜下观察发现有60%细胞病变,44h后细胞完全病变。
(2)收获病变细胞混悬液后,冻融三次,离心,取上清,按同样方法接种于另外4个75cm2方瓶中,44h完全出毒,收获病毒,用于接种转瓶。
(3)在每个转瓶中接种1.8×108个293细胞,共接种4个转瓶,等细胞生长至90%融合时,按10ml/转瓶(MOI约为1)接种第2步收获的病毒上清,染毒后70h收获病变细胞混悬液。
(4)混悬液3000rpm离心,弃上清,细胞沉淀用Tris缓冲液重悬,反复冻融三次,6000rpm离心,取上清,用DNase酶消化后,用0.45μm的滤膜过滤,然后利用Waters 600E HPLC进行纯化,具体步骤如下:
①先用含25%甘油的50mmol/LTris(pH7.5)缓冲液将样品稀释至5×1011vp/ml;
②使用200μl定量环(即上样1.0×1011vp)。使用1ml Resource Q柱(6.4×30mm),置于30℃下使用;
③洗脱梯度从50mmol/L Tris(pH7.5)到50mmol/L Tris,1mol/L NaCl(pH7.5),洗脱时间30min,流速1ml/min;
④使用260nm和280nm两个紫外波长进行检测,依据腺病毒特征吸收λ260/280=1.25±0.08,收集腺病毒峰;
⑤将纯化后的病毒保存于腺病毒培养液中,经除盐处理后用0.22μm一次性滤器过滤除菌,分装保存于-70℃冰箱。
(5)纯化后Ad-HGF质量检定:测病毒OD260值,按公式:v.p./ml=OD260×1.1×稀释倍数×1012,计算得到每ml制品中的病毒颗粒数,即物理滴度;用TCID50检测病毒的感染性滴度。结果显示:纯化的Ad-HGF物理滴度1.0×1012v.p./ml,感染性滴度2.6×1010TCID50/ml,HPLC鉴定纯度98%,PCR鉴定目的基因如图2所示。
3、兔BMSCs的分离和培养:
取4-8周龄健康新西兰大白兔,麻醉后,以髂后上棘为穿刺点,用16号髂骨穿刺针抽吸骨髓3ml,混入含肝素钠的DMEM培养液中反复抽吸吹打,800g离心5min,弃上清,用5ml含10%FCS、100u青霉素、100ug链霉素的完全DMEM培养液重悬细胞,接种入25cm2培养瓶中,置37℃、5%CO2孵箱中培养,4天时换液去除未贴壁细胞,其后每3天换液1次,待细胞汇合成单层,用0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化,传代细胞以1-2×105/孔密度接种于6孔板,培养至第二代备用。
按MOI=300,将Ad-HGF转染第二代兔BMSCs,具体的过程为:
(1)待传代细胞贴壁生长至60-70%融合时,吸去培养液,用PBS洗1次。
(2)加无血清DMEM培养液,置37℃、5%CO2孵箱孵育20min。
(3)按感染复数(MOI)=300加入病毒液,置37℃、5%CO2孵箱孵育45min后,补加完全DMEM培养液使体系中血清浓度为5%。
(4)置37℃、5%CO2孵箱孵育4h后换为完全DMEM培养液,48h后检测指标。
4、将上述含有转HGF基因骨髓基质干细胞的完全DMEM培养液低速度离心800g×5min,收集细胞沉淀,PBS洗涤三次并在计数板上计数,以无血清DMEM培养液调整细胞密度为107个/ml。
本发明骨修复材料的鉴定:
1.RT-PCR检测转染后BMSCs的HGF mRNA表达
(1)从培养的BMSCs中提取样本总RNA
①在25cm2细胞培养瓶(约1×106个细胞)中加入400μl TRK Lysis Buffer裂解细胞;
②倒置显微镜观察,细胞完全裂解后,吸出细胞裂解液,转入套在2ml收集管上的Homogenization Spin柱子中,室温14,000g离心1min;
③将收集的滤过液转移至一新的2ml收集管中,加入400μl 70%乙醇,涡旋混匀;
④将Hi Bind RNA Spin柱子套在2ml收集管中,并将上述溶液(包括沉淀)转移至柱子上,室温10,000g离心1min,弃滤过液;
⑤将柱子套回收集管,加入300μl Wash Buffer I至柱子上,按上述条件离心,弃滤过液;
⑥将柱子套回收集管,加DNase酶消化处理;
⑦加入500μl RNA Wash Buffer I至柱子上,放置5min,室温10,000g离心1min,弃滤过液;
⑧将柱子套回收集管,加入500μl RNA Wash Buffer II(已用无水乙醇稀释),室温10,000g离心1min,弃滤过液。重复该步骤1次;
⑨将柱子套回收集管,室温10,000g离心1min;
⑩将柱子转移至新的1.5ml的Eppendorf管中,加入30μl DEPC水至柱子的膜中央,放置1min,室温10,000g离心1min;
(2)测定总RNA的纯度和浓度:测260mn和280nm值,计算纯度(260nm/280nm)和浓度(RNA μg/ml=A260×40×稀释倍数)。
(3)One-Step RT-PCR扩增HGF基因
①cDNA反应总体系为50μl,取约1μg总RNA为模板,分别加入2×Reaction Mix 25μl,10μM上、下游引物各1μl,RT/Platinum Taq HiFi Mix 2μl,补充DEPC水至50μl,轻轻混匀。
②cDNA合成反应条件为:55℃ 30min,94℃ 2min,1个循环;
③PCR扩增反应条件为:94℃ 15s,60℃ 30s,68℃ 1.5min,35个循环;72℃延伸10min。
④取PCR产物5μl经1%琼脂糖凝胶电泳,20min,溴化乙锭染色后采用凝胶成像系统照相,剩余产物-20℃保存备用。
检测结果:RT-PCR扩增出2,200bp条带,表明转染后BMSCs有HGF mRNA表达,结果如图3所示。
2.原位杂交检测到转染后BMSCs的HGF mRNA表达:
(1)消化BMSCs,以1.5×105/孔的浓度接种于6孔板中,在37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养24h。
(2)按照前述方法,将Ad-HGF病毒以MOI=300转染细胞。
(3)48h后胰酶消化细胞,计数。以0.5~1.0×105/200μl的浓度滴加于经紫外照射消毒的硅化玻片上,置于湿盒中,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养过夜。
(4)取出玻片,0.1M PBS(pH 7.4)洗涤2min×3次后,置于4℃丙酮中固定30min。蒸馏水充分洗涤,干燥后置于-20℃冰箱备用,或直接进行检测。
(5)30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30min。蒸馏水洗涤3次。
(6)暴露mRNA片段:玻片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),室温消化10s。0.1M PBS洗涤5min×3次。蒸馏水洗涤1次。
(7)预杂交:湿盒的准备---干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱38-42℃孵育2-4h。吸取多余液体,不洗。
(8)杂交:按每张玻片20μl杂交液,加在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜。
(9)杂交后洗涤:37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次;37℃ 0.5×SSC洗涤15min×1次;37℃ 0.2×SSC洗涤15min×1次。
(10)滴加封闭液:37℃ 30min。甩去多余液体,不洗。
(11)滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃ 60min或室温120min,原位杂交用PBS洗涤5min×4次。
(12)滴加SABC:37℃ 20min或室温30min,原位杂交用PBS洗涤5min×3次。
(13)滴加生物素化过氧化物酶:37℃ 20min或室温30min,原位杂交用PBS洗涤5min×3次。
(14)DAB显色:使用DAB显色试剂盒--1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴,混匀,加至标本上,显微镜下观察至出现明显的特异性染色,充分水洗。
(15)苏木素复染:苏木素染色5min,充分水洗后,1%盐酸-乙醇分化2s,充分水洗,玻片浸于水中反蓝至适当的程度。
(16)系列浓度的酒精脱水,二甲苯透明,封片。
(17)显微镜观察照相。
检测结果:Ad-HGF转染的BMSCs胞浆中有棕黄色阳性染色颗粒,表明转染后BMSCs有HGF mRNA表达,结果如图4所示。
3.免疫组化检测到HGF蛋白的表达:
①消化BMSCs,以1.5×105/孔的浓度接种于6孔板中,在37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养24h。
②按照前述方法,将Ad-HGF病毒以MOI=300转染细胞。
③48h后胰酶消化细胞,计数。以0.5~1.0×105/200μl的浓度滴加于经紫外照射消毒的硅化玻片上,置于湿盒中,在37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养过夜。
④取出玻片,0.1M PBS(pH 7.4)洗涤2min×3次后,置于4℃丙酮中固定30min。蒸馏水充分洗涤,干燥后置于-20℃冰箱备用,或直接进行检测。
⑤每张玻片上滴加适量0.01%胰酶消化细胞5min以暴露抗原,充分水洗。
⑥每张玻片上滴加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液,室温下孵育10min,0.02M PBS冲洗3min×3次。
⑦除去PBS液,每张玻片上滴加1滴或50μl封闭液,室温下孵育10min。
⑧除去多余的封闭液,每张玻片上滴加1滴或50μl anti-hHGF单克隆抗体(用10%BSA-PBS做1∶100倍稀释),4℃过夜。
⑨0.02M PBS冲洗5min×3次。除去PBS液,每张玻片上滴加1滴或50μl生物素标记的第二抗体,室温下孵育10min。0.02M PBS冲洗3min×3次。
⑩除去PBS液,每张玻片上滴加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液,室温下孵育10min,0.02M PBS冲洗3min×3次。
(11)除去PBS液,每张玻片上滴加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液(1ml双蒸水加显色剂A、B、C各1滴,混匀),显微镜下观察至出现明显的特异性染色,充分水洗。
(12)苏木素复染:苏木素染色5min,充分水洗后,1%盐酸-乙醇分化2s,充分水洗,玻片浸于水中反蓝至适当的程度。
(13)系列浓度的酒精脱水,二甲苯透明,封片。
(14)显微镜观察照相。
检测结果:Ad-HGF转染的BMSCs胞浆中有棕黄色阳性染色颗粒,表明转染后BMSCs有HGF蛋白表达,结果如图5所示。
4.ELISA检测HGF蛋白的分泌:
(1)将试剂盒平衡至室温(20-25℃)后取出反应板,并于临用前15min配制工作液。
(2)将浓缩洗涤液(40×)用双蒸水稀释成1×(至1000ml)。
(3)稀释标准品和待测样品:
①用样品稀释液稀释标准品:标准品用1ml标准品稀释液复溶,得到16000pg/ml的高浓度标准品。将之稀释成一组标准品,即:8000、4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml。
②用样品稀释液稀释待测样品:将各个待测样品从-80℃冰箱中取出,室温融化后分别用标准品稀释液首先5倍稀释,然后倍比稀释成一组样品。
(4)加100μl标准品、100μl待测样品于相应反应板孔中。
(5)轻轻混匀30s,封住板孔,37℃温育60min。
(6)洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次。
(7)临用前15min配制1×Biotin:一支Biotine anti HGF加入6ml Biotin稀释液,混匀。每孔加入100μl 1×Biotin。轻轻混匀30s,封住板孔,37℃温育60min。
(8)洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次。
(9)临用前15min配制1×HRP:一支HRP加入6m酶联物稀释液,混匀。每孔加入100μl1×HRP。轻轻混匀30s,封住板孔,37℃温育30min。
(10)洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次。
(11)每孔加入100μl TMB显色液。轻轻混匀10s,37℃暗处温育15±10min。
(12)每孔加入100μl终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30s;30min内在450nm处读OD值。
(13)以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
检测结果:转染后BMSCs表达的HGF蛋白分泌到培养上清中,表达高峰在转染后48h,表达量为103ng/ml,表达持续至少2周以上,结果如图6所示。
5.流式细胞术检测细胞周期:
(1)取第2代BMSCs,用0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA室温消化后制成单细胞悬液,PBS漂洗3次。
(2)收集大约1×106个细胞,用预冷至4℃的70%乙醇固定30min;预冷的PBS漂洗3次。
(3)50mg/L RNA酶0.3ml 37℃处理30min。
(4)将细胞悬液移入流式细胞仪专用试管,加入50mg/L的PI 0.4ml,4℃避光染色30min后上机检测。
检测结果:Ad-HGF转染对BMSCs的细胞周期无影响。结果如表1所示,
表1:不同组别细胞周期流式细胞仅分析结束(%)(x±s,n=3)
例2
1、转HGF基因骨髓基质干细胞的制备和纯化方法见制备例1。
2、将上述含有转HGF基因骨髓基质干细胞的完全DMEM培养液低速度离心800g×5min,收集细胞沉淀,PBS洗涤三次并在计数板上计数,以无血清RPMI 1640培养液调整细胞密度为108个/ml。
例3
1、转HGF基因骨髓基质干细胞的制备和纯化方法见制备例1。
2、将上述含有转HGF基因骨髓基质干细胞的完全DMEM培养液低速度离心800g×5min,收集细胞沉淀,PBS洗涤三次并在计数板上计数,以无血清DMEM培养液调整细胞密度为5×106个/ml。
效果例:
为了说明本发明的应用效果,下面以新西兰大白兔为对象进行效果实验。
1、制作兔早期激素性ANFH模型
采用新西兰大白兔,平均体重3kg,经耳缘静脉注射10ml/kg马血清,间隔二周后,按5ml/kg连续2天以相同方法注射马血清;2周后,腹腔注射7.5mg/kg醋酸泼尼松龙,每周二次,共4次,制造兔激素性ANFH模型,于注射激素第5周末进行影像学和病理组织学检查,确定ANFH分期,选择I、II期进行治疗。模型组动物随机分2组进行治疗:本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗组、单纯髓芯减压治疗组,每组10只。
2、实验材料:制备例1所述的骨修复材料。
3、实验方法和结果:将I、II期股骨头坏死的兔麻醉后,在CT引导下行髓芯减压术,取本发明骨修复材料100μl经减压隧道、移植入兔股骨头坏死区,术后4周,采用DR数字放射成像、MRI、CT、CT灌注、动脉墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫组化等方法对疗效进行综合评价。
(1)对兔早期激素性ANFH治疗的DR检查:
具体实验过程:兔麻醉后采用仰卧位,固定双侧髋关节,摄包括双侧髋关节后前位片。照射条件:75KV,250mA,16ms/4mAs。
实验结果:如图7所示,正常组:股骨头边界清楚,表面光滑,骨骺线清晰;造模组:造模5周时开始出现双侧股骨头密度增高,骺线不清楚,骨纹理不清晰,关节间隙正常,股骨头无变形;未见股骨头塌陷;治疗组:实验动物右侧为本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗侧,密度稍增高,纹理较清楚;实验动物左侧为单纯髓芯减压侧,股骨头密度明显增高硬化,纹理不清楚。
(2)对兔早期激素性ANFH治疗的MRI检查:
①实验兔麻醉方法:将兽用速眠新II注射液1支(1.5ml)与硫酸阿托品注射液1支(1ml)混匀,臀肌注射,首次剂量:按体重0.7-0.8ml/kg,30-40min后半量追加。
②采用头部正交线圈,将线圈中心定于髋关节位置。扫描序列选用快速自旋回波序列(fast spin echo,FSE),T2加权像(T2 weighted imaging,T2WI)TR/TE 4500ms/96ms,T1加权像(T1 weighted imaging,T1WI)TR/TE 550ms/20ms,以及T2WI脂肪抑制像(FS-T2WI),均为2次采集,冠状位,层厚3mm,层间隔0.3mm,扫描野(Field of View,FOV)100×100mm2。
实验结果:如图8所示,正常组:正常股骨头双侧对称,FS-T2WI股骨头皮质下高信号脂肪、髋臼高信号脂肪均明显被抑制呈低信号;造模组:关节腔积液增多;FS-T2WI干骺端高信号,提示骨髓水肿,股骨头松质骨出现小点/线状不均匀高信号影,提示囊变坏死;治疗组:实验动物右侧为本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗侧,左侧为单纯髓芯减压侧,MRIFS-T2WI可见右侧关节腔积液较前减少,股骨头点线状高信号影左侧较右侧明显,提示右侧骨坏死囊变轻。
(3)对兔早期激素性ANFH治疗的常规CT检查:
①实验兔麻醉方法:将兽用速眠新II注射液1支(1.5ml)与硫酸阿托品注射液1支(1ml)混匀,臀肌注射,首次剂量:按体重0.7-0.8ml/kg,30-40min后半量追加。
②常规CT扫描:实验兔麻醉后仰卧固定于自制木板架上,双髋关节呈外展位,尽量使双侧髋关节对称。行包括髋关节上下缘的常规横断面扫描,扫描参数:电压100KV,电流220mA,探测器组合:16×0.625mm,螺距0.625∶1(床速5.62mm/r),重建层厚1.25mm,FOV直径9.6cm。
实验结果:如图9所示,正常组:双侧股骨头对称,关节面清晰,皮质光滑、清晰、完整,骨质密度正常,骨松质纹理正常,骺线清楚。造模组:股骨头点状低密度影,示囊变区,干骺端密度增高,有骨硬化,股骨头皮质模糊,关节受损,骨皮质变薄、密度减低。双侧股骨头基本对称。治疗组:实验动物右侧为本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗侧,左侧为单纯髓芯减压侧,右侧股骨头点状低密度影较左侧数量减少,提示右组骨坏死轻。
(4)对兔早期激素性ANFH治疗的CT灌注检查:
根据常规扫描图像,定位选择包括双侧股骨头在内的1cm范围内的层面,进行同层动态增强扫描。选择轴扫(axial)模式,层厚2.5mm×4,1s1次,间隔1s,电压、电流、FOV同上。碘海醇注射液4ml(约相当于1.5ml/kg),用CT压力注射器自耳缘静脉自动推注,注射速度1.5ml/s,注射后延迟0s开始扫描,共扫描45次,产生180帖图像(每次4帖),监控时间90s。
实验结果:如图10所示,正常组:双侧股骨头基本对称,BV较高呈红色;造模组:双侧股骨头基本对称,血容量较正常组明显减少,呈兰色;本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗组:实验动物右侧,血容量接近正常组,BV较高呈红色;单纯髓芯减压治疗组:实验动物左侧,血容量较治疗组少,红色/绿色区增多。
(5)对兔早期激素性ANFH治疗的墨汁灌注造影:
动物麻醉后,静脉注射肝素1万IU,切开腹部,暴露腹主动脉,用带12号针头的聚乙烯管离心方向插入,生理盐水加压灌洗约3000ml,最后用墨水(上海墨水厂出品214型)和右旋糖酐(上海富民制药厂)以7∶3的比例混合注入血管约100ml,至双侧下肢皮肤、甲床变为均匀黑色。尸体放4℃冰箱过夜,第二天取材,置于4%多聚甲醛溶液固定3天;10%EDTA-PBS缓冲液脱钙(将EDTA溶于0.02M,PH7.4的PBS缓冲液中制成),每3天更换脱钙液一次,观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度,直到满意为止。取材逐级脱水,二甲苯透明,水杨酸酯钠透明,切成50μm的切片,立体显微镜下观察股骨头形态结构和血管分布和生长情况。
实验结果:如图11所示,正常组:血管分布均匀丰富;模型组:血管闭塞,血管稀少,股骨头浅层血管几乎消失;单纯髓芯减压治疗组:血管部分恢复,仍有明显栓塞;本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗组:软骨下血管重建,干骺端大血管恢复。
(6)对兔早期激素性ANFH治疗的病理组织学观察:
具体实验过程:实验兔以空气注射法处死,剖取双侧股骨头连同干骺端及股骨,肉眼观察后,置于4%多聚甲醛溶液固定3天;10%EDTA-PBS缓冲液脱钙(将EDTA溶于0.02M,PH7.4的PBS缓冲液中制成),每3天更换脱钙液一次,观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度,直到满意为止。取材逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,然后行苏木素-伊红(HE)染色,光镜观察骨膜、软骨组织、骨小梁、造血组织的变化。
实验结果:如图12所示,正常组:股骨头关节面表面光滑,软骨细胞排列整齐,骨小梁结构清晰,骨髓造血组织丰富;模型组:股骨头关节面不规整,部分软骨细胞坏死脱落,结构紊乱,骨小梁变细,结构紊乱,骨细胞消失,骨髓中造血组织明显减少或消失。单纯髓芯减压治疗组:造血组织部分恢复,但较为稀少,以脂肪细胞为主,可见空陷窝和血栓;干骺端成骨细胞增殖旺盛,有新骨生成。本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗组:骨小梁排列基本规则,骨基质量增多;仍可见少量空骨陷窝,骨小梁骨板上可见新生毛细血管,边缘有大量成骨细胞,骨髓中造血组织基本恢复。
(7)对兔早期激素性ANFH治疗的病理免疫组化观察:
实验兔以空气注射法处死,剖取双侧股骨头连同干骺端及股骨,肉眼观察后,置于4%多聚甲醛溶液固定3天;10%EDTA-PBS缓冲液脱钙(将EDTA溶于0.02M,PH7.4的PBS缓冲液中制成),每3天更换脱钙液一次,观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度,直到满意为止。取材逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片。
①病理切片经二甲苯和系列浓度的乙醇逐级脱蜡后,按前述方法行免疫组化检测VEGF蛋白的表达。浸于双蒸水中备用。
②每张玻片上滴加适量0.01%胰酶消化细胞5min以暴露抗原。充分水洗。
③每张玻片上滴加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液,室温下孵育10min。0.02M PBS冲洗3min×3次。
④除去PBS液,每张玻片上滴加1滴或50μl封闭液,室温下孵育10min。
⑤除去多余的封闭液,每张玻片上滴加1滴或50μl anti-hVEGF单克隆抗体(用10%BSA-PBS做1∶100倍稀释)。4℃过夜。
⑥0.02M PBS冲洗5min×3次。除去PBS液,每张玻片上滴加1滴或50μl生物素标记的第二抗体,室温下孵育10min。0.02M PBS冲洗3min×3次。
⑦除去PBS液,每张玻片上滴加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液,室温下孵育10min。0.02M PBS冲洗3min×3次。
⑧除去PBS液,每张玻片上滴加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液(1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴,混匀),显微镜下观察至出现明显的特异性染色。充分水洗。
⑨苏木素复染:苏木素染色5min,充分水洗后,1%盐酸-乙醇分化2s,充分水洗。玻片浸于水中反蓝至适当的程度。
⑩系列浓度的酒精脱水,二甲苯透明,封片。显微镜观察照相。
实验结果:如图13所示,正常组:软骨细胞和血管内膜上可见淡黄色颗粒,有较低水平的VEGF表达。模型组:血管内膜VEGF表达缺失,骨髓腔中不见破骨细胞,少见成骨细胞。单纯髓芯减压治疗组:血管内皮细胞和骨小梁表面的成骨细胞可见淡染黄色颗粒,VEGF表达水平较本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗组。本发明骨修复材料移植+髓芯减压治疗组:VEGF表达上升;成骨细胞成多层粘贴在骨小梁表面,并成批演化为骨细胞;髓腔中骨小梁之间破骨细胞增多,紧贴于坏死骨小梁的表面,功能活跃;阳性软骨细胞显著上升,软骨下阳性血管明显增多。