CN101112178A

CN101112178A - 杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生与植株再生方法

Info

Publication number: CN101112178A
Application number: CNA2007101312513A
Authority: CN
Inventors: 施季森; 龙伟; 陈金慧; 边黎明; 席梦利
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2027-09-07
Also published as: CN101112178B

Abstract

一种杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生和植株再生的方法，采用母树不同部位的芽、茎尖、叶、花器官及新枝为体细胞胚胎发生诱导材料，经历愈伤组织诱导，悬浮细胞系建立和增殖，悬浮细胞胚胎发育诱导，胚胎发育成熟、体胚萌发和植株再生阶段获得幼苗。本方法突破了无法直接用杂交鹅掌楸成年树营养体诱导体细胞胚胎发生和植株再生技术的难关，为工厂化育苗提供了一种周期短、繁殖率高、成本低廉的新方法。

Description

杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生与植株再生方法

一、技术领域

本发明属林业中通过组织培养的植物再生技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生与植株再生技术。

二、背景技术

鹅掌楸，又称马褂木、鸭脚木、九层皮、枫荷树等，是木兰科(MagnoLiaceae)鹅掌楸属(Liriondendron)的植物。该属现在仅存两种，一种是分布于我国中、北亚热带地区(从东部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越边界)的中国鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.)，另一种是分布于美国东部的北美鹅掌楸(L.tulipifera L.)。鹅掌楸属植物在被子植物分类地位中处于较原始的位置。虽然分布区广，但目前多呈小群体分布。其中分布于中国境内的鹅掌楸已被列为国家二级珍稀濒危保护树种。

中国鹅掌楸干形通直、树形美观；叶形奇特，叶片宽大，微凹，两侧有一裂片，先端截形，叶形俨然如中国古装马褂一般，故俗称马褂木；春天枝条顶端开淡黄色大型花朵，其状如杯似碗，光灿悦目，观赏价值高；果实圆锥形，亦极美观。该树种对二氧化硫和氯气有较强的抗性，广泛用于园林绿化。另外，鹅掌楸属植物木材淡红褐色，纹理通直，色泽美观，结构细密，材质轻软，刨面光洁，适合于用作胶合板、纸浆、家具以及室内装饰用材，也可用于建筑、造船等，经济价值极高，因此也是重要的用材树种。

作为世界珍稀名贵观赏风景树的北美鹅掌楸，同样树姿挺秀，叶形美丽，树形端正，树序整齐，花大而美。老龄树枝条平展，或微向下垂。每届花期，琼英压树，翠帷覆地，绮丽优雅。

叶培忠[18899～1978]教授于1963年首次选用中国鹅掌楸和北美鹅掌楸为亲本进行正、反交组合人工杂交，育成种间杂种杂交鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.×L.tulipifera L.和L.tulipifera L.×L.chinense[Hemsl.]Sarg)；1970年开始进行杂交鹅掌楸正、反交组合苗木栽培对比。试验表明，种间杂交后代具有明显的杂交优势，不仅树形比亲本更加通直，花叶更加幽丽，媲美众芳，俯视众卉，而且生长也更加迅速。如栽植于浙江富阳中国林科院亚林所的杂交鹅掌楸，25年生时树高达21m，胸径达63.7cm；另据北京市园林局将杂交鹅掌楸作城市行道树试种，在北京地区表现出耐寒性强，生长迅速的特点；同时该树种无其他树种果毛、花絮飞散造成的空气污染之弊。因此，林业上对优质杂交鹅掌楸苗木的需求相当迫切。

但鹅掌楸的天然结实率很低，亲本和杂交新种均仅有1％左右，有性繁殖能力差；鹅掌楸的扦插技术要求很高，扦插周期长、成活率低，无性繁殖困难。因此，目前的种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林的需要。

体细胞胚胎发生及其植株再生技术是20世纪90年代形成的高新林业生物技术的重要内容之一，可用于优良品种的大规模工业化繁殖和用于遗传转化体系的建立。体细胞胚，是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的过程，模拟合子胚发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生和重建过程。在正常情况下有些植物的珠心组织或助细胞也可自发产生体细胞胚。在大量的组织培养过程中，许多离体培养的细胞、组织和器官，形成类似胚的结构。这种经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体。无性胚状体可以像有性胚那样在一定的条件下发育成完整的植株。胚状体按其来源可分为两类：一类是由普通植物孢子体的各种器官的二倍体体细胞产生而来，通常称为体细胞胚；另一类是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，通常简称为花粉胚，可发育成单倍体植株，但一般必须进行染色体加倍才能正常开花结实。另外，在一些植物中也可从胚乳培养得到胚状体，但未能成功地由胚状体发育成植株。朱微认为胚状体的定义包括三点含义：

1.胚状体是组织培养的产物，只限于在组织培养范围内使用，区别于无融合生殖的胚；

2.胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；

3.胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于与组织培养中分化的芽体。

1902年Haberlandt提出植物细胞的全能性观点，即每一个细胞都能不断分裂，进而形成完整的植株.Steward(1958)和Reincrt(1959)差不多同时发现，培养的胡萝卜根细胞产生一种与胚相似的结构，并观察到由这种结构长成完整的植株。从而证明Haberlandt关于细胞全能性概念的正确性。此后，植物学家对此进行了广泛的研究，并已在许多植物中利用不同的器官、组织、细胞和原生质体进行培养得到了体细胞胚。成功获得体细胞胚的有裸子植物、双子叶植物和单子叶植物。林木体细胞胚胎发生研究始于20世纪七十年代后期，八十年代后期迅速发展，并获得极大成功。全世界目前已有40多种木本植物获得了体细胞胚，尤其是用常规无性繁殖技术很难生根的针叶树的体胚发生取得了令人瞩目的进展。据初步统计，已从冷杉属、落叶松属、云杉属、松属、黄杉属和北美红杉属的至少20种不同的针叶树的外植体诱导成功了体细胞胚。在阔叶树种上，柳属、杨属、栗属、檀香属、枫香属、鹅掌楸属、榛属、栎属、板栗属、山茶属、桉树属、七叶树属、柑橘属、柚木、可可、油橄榄、橡胶、泡桐等20多个树种的组织培养中观察到体细胞胚胎发生或获得再生植株。其中，美国的惠豪公司、国际纸业公司、维斯瓦库公司和加拿大的一些公司、新西兰林业研究中心等已分别将火炬松、挪威云杉、花旗松和辐射松等树种的体细胞胚诱导和植株再生应用于生产实践。仅新西兰一家公司就形成了年产200万株辐射松体细胞胚再生植株的能力。中国科学院于1988年以华北云杉为实验材料，将幼胚产生的愈伤组织诱导出的体细胞胚胎发育成小苗。黑龙江农大(1993)进行黑穗醋粟末受精胚珠培养，成功诱导体细胞胚胎和植株。四川农大王米力等(1996)用尾叶桉种子下胚轴诱导体细胞胚胎发生，获得根苗齐全的再生植株。南京林业大学施季森、陈金慧等(一种杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生技术CNZL 02112948.7)用杂交鹅掌楸未成熟胚通过固体培养的方式，成功诱导体细胞胚胎的发生，得到完整的植株。

目前研究人员诱导体细胞胚胎发生主要利用植物体的各种器官，如根、茎、叶、花、果实、种子、子房中的胚珠、雄蕊的花丝、花药及花粉等。但S.Merkle(1996)认为，树木的胚性培养只能来源于种子或幼苗，合子胚或种子的发育程度是很重要的，在许多树种的研究中表明，未成熟种子比成熟种子或幼苗有更高的诱导潜能。

组织培养诱导脱分化都主要通过2，4-D来诱导。在多篇文献中报道2，4-D能抑制胚状体的产生和发育，因此在诱导脱分化后必须降低或去掉2，4-D，胚性细胞才能正常发育.HaLperin(1970)取胡萝卜的叶柄切段，培养于添加不同激素成分的琼脂培养基上，然后移至不加任何激素的基本培养基上(仅有无机盐、蔗糖及维生素B1)，以检查对胚状体形成的影响。结果表明：

1.促进胚性愈伤组织增殖的培养及其激素成分并不促进胚状体的分化；去除培养基申的2，4-D，则使胚状体形成；加入BA，组织增殖速度增加，但抑制了转移培养基上后胚状体的形成，并且一旦胚状体原始细胞形成后，BA对其发育成胚状体毫无影响。

2.加入赤霉素，完全抑制其后胚状体的分化。

3.细胞增殖过程中的激素环境对下一步器官分化有着明显的影响。

实验结果表明，2，4-D通过改变细胞内源IAA代谢而起作用，在水稻的早期胚性愈伤组织中，用ELISA酶联免疫分析证明胚性细胞出现时伴有较高的内源IAA水平，并且在胚性细胞转换时期添加外源IAA对胚性细胞出现有一定诱导效果。

渗透剂在林木体胚发生的各个阶段都发挥着重要作用。总的说来，渗透剂都是高度水合性的多羟基分子，包括单糖、多糖、己糖醇和环多醇。环多醇是六碳环的羟基复合物，较常用的环多醇有肌醇及其立体异构体肌醇等。蔗糖和葡萄糖是常用的两种糖类渗透剂，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直链醇形式、乙二醇如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作渗透剂。唐巍(1998)在火炬松的胚性愈伤组势诱导和植株再生的研究中，加入9000mg/L肌醇提高渗透压，以促进后期胚的发育。黄健秋(1995)将马尾松的早期原胚转至含9000mg/L肌醇的DCR培养基上，形成后期原胚。可见，体胚形成过程中适当提高渗透压可促进体胚形成。

在植物组织培养中，诱导体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有显著的特点：

1.具有两极性：在体细胞胚发生早期就具有胚根和胚芽两极，胚性细胞分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，其后有较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞进行少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性。

2.存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统联系较少，即出现所谓生理上的隔离现象。胚性细胞细胞壁加厚，与其它细胞分开，周围细胞处于解体状态，表明体细胞胚与合子胚相似，从一开始就是完整的植物体的雏形。

3.遗传相对稳定：通过体细胞胚形成的再生植株的变异性小于器官发生途径形成的再生植株，因为只有那些未经过畸变的细胞或变异较少的细胞团才能形成体细胞胚，实现全能型表达。

4.重演受精卵形态发生的特征：植物组织培养中形态发生的几种方式，虽然都是植物细胞全能性的具体表现，但体细胞胚胎发生途径是细胞全能型表达最完全的一种方式，它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且重演了合子胚形态发生的进程。

植物组织培养中诱导体细胞胚发生途径可归纳为两种：直接途径与间接途径。直接途径就是从外植体某些部位直接诱导脱分化出体细胞胚，如槐树子叶在切口处产生愈伤组织的同时，在子叶组织中分化产生体细胞胚。间接途径通过脱分化形成愈伤组织后，再从愈伤组织的某些细胞分化出体细胞胚。大多数植物的体细胞胚胎发生多通过间接途径进行，在愈伤组织中某些体细胞转化为胚性细胞、胚性细胞继续分裂形成多细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚，如经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚而发育成小苗。

体细胞胚胎发生由于能在更短的时间内得到更多的无性繁殖体，以及获得更大的遗传增益，并且由于体胚发生培养物也是分离原生质体的重要来源，可用于林木的遗传转化以及体细胞杂交研究，在理论与应用研究中具有重要的作用。利用悬浮细胞诱导产生体细胞胚胎具有数量多、速度快、结构完整等显著特点，同时可以节约大量的试验场地，缩短培养时间，因而特别适合植物的大量繁殖。由于易在体外培养，并且可以比较体外非合子胚与种子的合子胚的异同，所以广泛用于研究植物体的生长发育过程。在基因工程研究中，将分离到的基因导入单个胚性细胞中，由这个胚性细胞长成植株的组织中，就含有整合进去的基因。

目前有关植物组织培养技术的各类文献中，除美国有北美鹅掌楸(Litiondendron tulipifera L.)组培相关专利技术的报导，和陈金慧通过固体培养用未成熟胚诱导用出杂交鹅掌楸(Liriondeadron hybrid)体细胞胚胎的相关专利技术的报导外，尚未见有杂交鹅掌楸成年树营养体诱导体细胞胚胎发生和植株再生技术报道。

三、发明内容

本发明的目的是利用杂交鹅掌楸(Liriondeadron hybrid)无性系的营养体器官或组织，进行体细胞胚胎工程和克隆植株的再生技术，寻找适用于杂交鹅掌楸组织培养快速、高效繁殖的新方法。

由于种种原因，目前通过树木的营养体获得杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生的难度较大，而通过未成熟胚获得杂交鹅掌楸体细胞胚胎和植株再生的方法则存在一定的变异性。因此本发明所用具有优良性状的杂交鹅掌楸不同部位的芽、茎尖、叶、花器官及新枝诱导出胚状体，能较好保持无性系的遗传上的稳定性；且试验材料较易获得，克服了未成熟胚取材受杂交和时间限制等因素的影响。该方法成本较低，降低了可能由于授粉造成的结实率低，表型变异等情况。本发明中，采用每10～14天继代一次的工艺路线，可用两个月左右的时间得到杂交鹅掌楸的子叶胚，时间较短，缩短了繁殖时间；取材方便，解决了授粉中花期控制的难题；一年四季皆可取材，便于开展对体细胞胚胎形成机制的研究。

本发明的具体技术解决方案如下：一种杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于采用杂交鹅掌楸不同基因型的营养体器官或组织为体细胞胚胎发生诱导的材料，经历愈伤组织诱导，悬浮细胞系的建立和增殖，悬浮细胞系的胚胎发育诱导，胚胎发育成熟、体胚萌发和植株再生阶段获得幼苗。

其中，杂交鹅掌楸不同基因型的营养体器官或组织可为杂交鹅掌楸不同部位的芽、茎尖、叶、花器官及新枝。

愈伤组织诱导阶段使用MS培养基，附加2.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA、琼脂和5mg/L的维生素C；

悬浮细胞系的建立阶段使用MS基本液体培养基，附加0.2mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L 2，4-D，摇床暗培养；

胚性悬浮细胞的诱导阶段使用MS基本液体培养基，附加2.0mg/L KT、0.1mg/L NAA、0.4mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、500-1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1-5mg/L的维生素C，摇床暗培养；

b.胚性悬浮细胞的成熟阶段使用MS改良液体培养基，附加1.0-10.0mg/L的ABA、0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C，摇床暗培养；

体细胞发育成熟阶段使用MS基本液体培养基，附加1.0-10.0mg/L的ABA、0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C、琼脂5g/L，暗培养；

球形胚形成以后，再转入附加1.0-8.0mg/L的ABA，0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C、琼脂5g/L的的MS改良固体培养基中继续暗培养，直至成幼苗。

附MS培养基(Murashing and Skoog medium)标准配方：

NH₄NO₃ 1650mg/l

KNO₃ 1900mg/l

CaCl₂·2H₂O 440mg/l

MgSO₄·7H₂O 370mg/l

KH₂PO₄ 170mg/l

KI 0.83mg/l

H₃BO₃ 6.2mg/l

MnSO₄·H₂O 16.9mg/l

ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/l

Na2MoO4·2H₂O 0.25mg/l

CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l

CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l

FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l

Na₂-EDTA 37.3mg/l

肌醇 100mg/l

烟酸 0.5mg/l

盐酸硫胺素 0.1mg/l

盐酸吡哆醇 0.5mg/l

甘氨酸 2mg/l

在该标准配方中添加使用肌醇80mg/L，即可获得MS基本固体培养基；

在该标准配方中添加使用KNO₃ 1000mg/L，即可获得MS改良固体培养基；

在该标准配方中添加使用肌醇60mg/L，即可获得MS基本液体培养基；

在该标准配方中添加使用KNO₃ 800mg/L，CaNO₃ 400mg/L，即可获得MS改良液体培养基。

四、附图说明

图1为胚性悬浮细胞诱导阶段的细胞状态；

图2为胚性悬浮细胞成熟阶段的细胞状态；

图3为体细胞发育、形成阶段的状态；

图4为体细胞发育、形成后植株再生阶段的不同状态。

五、具体实施方式

春季从野外采集杂交鹅掌楸无性系成年树上采集新梢，取芽、茎尖、花器官及新枝等不同部位材料，在实验室内用洗涤精清洗10分钟，然后用自来水冲洗2小时，于超净工作台上用75％的酒精浸泡30s，0.1％HgCl₂：浸泡8-12min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干材料表面的水分，放入到愈伤诱导培养基MS培养基，附加浓度2.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L6-BA、琼脂和5mg/L的维生素C，调pH为5.7，暗培养温度为24-26℃；

取上述材料诱导出的白色愈伤、外观湿润、质地松软的愈伤组织，放入添加了0.2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.2mg/L 2，4-D的MS液体培养基中进行悬浮培养7-10天，将培养的悬浮液用量筒沉淀后，弃上清，按照细胞和液体培养基1∶9的比例进行继代培养。继代时，总体积不应超过50ml。培养条件为：摇床转速100r.p.m，25±1℃，暗培养，共培养30-50d；

a.胚性悬浮细胞的诱导阶段——把上阶段摇散获得的均匀、松散的悬浮细胞沉淀后，弃上清，将悬浮细胞转入附加2.0mg/L KT、0.1mg/L NAA、6-BA0.3mg/L、30g/L蔗糖、500-1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1-5mg/L的维生素C的MS基本液体培养基中进行胚性悬浮细胞诱导；摇床转速为70-100r.p.m，暗培养温度为23-25℃，调pH到5.7。

b.胚性悬浮细胞的成熟阶段——把a阶段获得的胚性悬浮细胞沉淀后，弃上清，转入附加1.0-10.0mg/L的ABA、0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C的MS改良液体培养基中培养；摇床转速为70-100r.p.m，暗培养温度为23-25℃.；调pH到5.7。

本阶段中使用的脱落酸ABA，对体细胞胚胎的形成起着重要的作用。在高浓度生长素的作用下，细胞生长速度很快，这样形成的大量薄壁细胞并不有利于体细胞胚胎的形成，而脱落酸ABA可以中和生长素的后续效应，调整细胞状态，减慢细胞生长速度，经过两个阶段悬浮处理以后，细胞逐渐开始分裂，开始形成如附图2所示形状；

c.体细胞发育成熟阶段——把b阶段获得的悬浮细胞沉淀后，弃上清，转入附加1.0-10.0mg/L的ABA、0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C、琼脂5g/L的MS液体培养基中培养；调pH到5.7，暗培养温度为23-25℃，直至培养形成球形胚；

球形胚形成以后，再转入附加1.0-8.0mg/L的ABA，蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C、琼脂5g/L的MS改良培养基使其继续发育，球形胚经过近两个月的发育，会依次经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚阶段而发育成苗。

MS改良培养基可成功调整营养体悬浮细胞的生长状况，使畸形苗的发生得到有效控制，并且使悬浮细胞团能最大限度地发育形成子叶胚，最终形成植株。

幼苗在MS培养基上发育成小植株后，转入光照培养条件下，子叶不断伸长，最终形成一株完整的植株。如附图4。

移苗定植阶段——体胚长成植株后，苗高在2厘米左右，且根叶发达时，从瓶中取出洗去幼苗根部培养基，植入主要由珍珠岩构成的基质中，并按常规苗木栽培工艺进行育苗、定植。

成年母树上采集的芽、茎尖、和叶片等不同部位，在诱导体细胞胚胎发生频率之间存在一定的差异，其中叶片组织诱导体细胞胚胎发生频率较易。在体细胞胚发育成熟培养阶段，在直径0.5厘米大小的培养物。在30d天可诱导出12个体胚，同时发现随着培养时间继续，培养物不断有新的体细胞胚胎产生。

本方法突破了无法直接用杂交鹅掌楸成年树营养体诱导体细胞胚胎发生和植株再生技术的难关。采用本发明提供的的方法，可以为杂交鹅掌楸的工厂化无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，突破了鹅掌楸天然结实率低，扦插困难，种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的限制。

Claims

1.一种杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于采用杂交鹅掌楸不同基因型的营养体器官或组织为体细胞胚胎发生诱导的材料，经历愈伤组织诱导，悬浮细胞系的建立和增殖，悬浮细胞系的胚胎发育诱导，胚胎发育成熟、体胚萌发和植株再生阶段获得幼苗。

2.如权利要求1所述的杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于杂交鹅掌楸不同基因型的营养体器官或组织为杂交鹅掌楸不同部位的芽、茎尖、叶、花器官及新枝。

3.如权利要求1所述的杂交鹅掌楸无性系营养体悬浮细胞系诱导体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于不同阶段使用的培养基和培养条件分别为：

胚性悬浮细胞的诱导阶段使用MS基本液体培养基，附加2.0mg/L KT、0.1mg/L NAA、6-BA 0.3mg/L、30g/L蔗糖、500-1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1-5mg/L的维生素C，摇床暗培养；

球形胚形成以后，再转入附加1.0-8.0mg/L的ABA，蔗糖20-60g/L、1-5mg/L的维生素C、琼脂5g/L的MS改良固体培养基中继续暗培养，直至成幼苗。