CN101107360A - Hcvf蛋白质和其用途 - Google Patents

Abstract

源于HCV F蛋白质的分离的免疫原性肽和相应的核酸、抗体、组合物、疫苗和微阵列。这些产物被用于预防、治疗和诊断HCV感染以及用于HCV重组多肽的生产。

Description

HCVF蛋白质和其用途

交叉引用的相关申请

本申请要求依据U.S.C.§119(e)的在2004年11月18日提交的美国临时专利申请No.60/628,549的权益，由此以其整体通过参考并入本文中。

技术领域

本发明涉及肽和相应的核酸以及其在预防、治疗和诊断丙型肝炎病毒(HCV)感染中的应用，并且尤其涉及源于HCV F蛋白质的肽和相应的核酸、其制备方法、以及其在预防、治疗和诊断HCV感染中的应用。

背景技术

由CD4+辅助性T细胞(Th)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构成的细胞介导的免疫应答构成在宿主中能够控制HCV复制的主要机制[1-4]。由于重叠的传播途径和靶群体，很大比例的慢性丙型肝炎病毒(HCV)携带者也受到I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染，这显著地恶化了成年患者中HCV疾病的预后[5，6]。认为这至少部分地是由HIV-1对HCV特异性体液和细胞介导免疫的抑制而造成的[7-9]。利用选择性读码框(alternate reading frames)由病毒或细胞基因产物的翻译所产生的隐蔽表位已知将会引起这样的反应，并且最近已证实在某些形式的人癌症中其是肿瘤特异性抗原的重要来源[10，11]。细菌、植物和动物的各种RNA和DNA病毒使用重叠的开放读码框(ORF)以弥补大小限制对病毒基因组的影响和/或调节病毒蛋白质的表达。同样地，HCV编码选择性144-162个氨基酸、17kDa的未知功能多肽，其被称为F蛋白质或选择读码框蛋白(ARFP)，其来自核心基因的5’部分[12-14]。F蛋白质在转染细胞中表达[15]并且能够被分离自HCV感染患者的血清和T细胞所识别，这表明它是在体内产生的[13，14，16，17]。

由于HCV感染和相关疾病的流行和负面影响，因此需要开发用于预防、治疗和诊断HCV感染的方法和药剂。

发明内容

本发明涉及源自HCV F蛋白质的表位和其应用。

“HCV F蛋白质”在本领域中也被称为“选择性读码框蛋白质(ARFP)”[14]。这两个术语在意思上是等同的并且在本文中可互换使用。

在第一方面，本发明提供源于HCV F蛋白质的分离的免疫原性多肽，前提是所述多肽不是列于SEQ ID NO：8的全长HCV F蛋白质。

在一个实施方案中，HCV F蛋白质来源于不同于HCV-1b的HCV亚型。在另一个实施方案中，HCV F蛋白质源于选自HCV-1a、HCV-2a、HCV-3a、HCV-4a、HCV-5a和HCV-6a的HCV亚型。

在一个实施方案中，根据表16中所规定的HCV F蛋白质内的起始和终止位置来定义所述多肽。

在某些实施方案中，本发明的多肽或表位包含具有以下通式I的氨基酸序列(见表14)：

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶-X¹⁷-X¹⁸-X¹⁹-X²⁰-X²¹-X²²-X²³

其中，

X¹选自V、A和D或者缺失；

X²是R或者缺失；

X³是S或者缺失；

X⁴是L或者缺失；

X⁵选自V和A或者缺失；

X⁶是E或者缺失；

X⁷选自F和Y或者缺失；

X⁸是T或者缺失；

X⁹是C；

X¹⁰是C；

X¹¹是R；

X¹²是A；

X¹³选自G和R或者缺失；

X¹⁴是A或者缺失；

X¹⁵选自L、P和H或者缺失；

X¹⁶选自D、G和N或者缺失；

X¹⁷是W或者缺失；

X¹⁸是V或者缺失；

X¹⁹选自C和S或者缺失；

X²⁰是A或者缺失；

X²¹是R或者缺失；

X²²选自R、Q和L或者缺失；和

X²³选自E、G和V或者缺失。

在另一些实施方案中，本发明的多肽或者表位包含具有以下通式II的氨基酸序列(见表15)：

Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶-Z⁷-Z⁸-Z⁹-Z¹⁰-Z¹¹-Z¹²-Z¹³-Z¹⁴-Z¹⁵

其中，

Z¹选自P和H或者缺失；

Z²选自V、E和E或者缺失；

Z³选自V和A或者缺失；

Z⁴选自L和P或者缺失；

Z⁵选自G、V和D或者缺失；

Z⁶选自L、P、H和R或者缺失；

Z⁷选自A、L、P、I、T和V或者缺失；

Z⁸是G；

Z⁹是A；

Z¹⁰选自P和Q；

Z¹¹选自Q和M；

Z¹²是T；

Z¹³是P；

Z¹⁴选自G和A；

Z¹⁵选自V、I和G。

在一个实施方案中，所述肽选自：(a)包含选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列的多肽；和/或(b)(a)的功能性变体或片段，其中所述功能性变体或片段具有免疫相关活性。

在一个实施方案中，所述免疫相关活性选自：(i)诱导抗HCV的免疫应答；(ii)诱导T细胞裂解活性；(iii)结合人白细胞抗原(HLA)或MHC I类分子；(iv)与来自HCV感染对象的血清的免疫反应性；(v)改变细胞因子或趋化因子的表达或产生；以及(vi)(i)至(v)的任何组合。在一个实施方案中，所述HLA分子是HLA-A分子(例如HLA-A＊0201分子)。

在一个实施方案中，所述多肽长度为50个氨基酸或更短。

在一个实施方案中，所述多肽基本由选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列所组成。

在一个实施方案中，所述多肽是重组的。

在另外的一个方面中，本发明提供包含上述多肽的制备物，其中所述制备物基本没有除HCV F蛋白质之外的HCV蛋白质。在一个实施方案中，所述除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质是HCV核心蛋白质。

在另外的一个方面中，本发明提供分离的HCV F蛋白质的肽表位(peptide epitope)，其中所述肽表位具有免疫相关活性，前提是所述肽表位不是列于SEQ ID NO：8的全长HCV F蛋白质。

在一个实施方案中，所述免疫相关活性选自：(i)诱导T细胞裂解活性；(ii)结合人白细胞抗原(HLA)或者MHC I类分子；(iii)与来自HCV感染对象的血清的免疫反应性；(iv)改变细胞因子或趋化因子表达或产生；以及(v)(i)至(iv)的任何组合。

在某些实施方案中，所述分离的肽表位基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的约8至约50个连续氨基酸所组成，在另一些实施方案中，其基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的约8至约15个连续氨基酸所组成，在另一些实施方案中，其基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的9、10或15个连续氨基酸所组成。

在另一些实施方案中，所述分离的肽表位包含选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述分离的肽表位包含添加至选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列的另外1-15个氨基酸，在另一个实施方案中包含添加至选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列的另外1至30个氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的肽表位基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列所组成。

在另一方面中，本发明提供包含上述分离的多肽或肽表位以及药用可接受载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含辅剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含MHC分子。

在另一方面中，本发明提供包含上述分离的多肽或肽表位以及辅剂的组合物。

在另一方面中，本发明提供包含上述分离的多肽或肽表位以及MHC分子的组合物。

在另一方面中，本发明提供包含两个或更多MHC肽复合物单体的多聚体(multimer)的组合物，其中每一所述单体包含上述多肽或肽表位以及MHC分子。

在一个实施方案中，上述MHC分子包含MHC I类重链或其融合蛋白质以及β2微球蛋白或其融合蛋白质。

在一些实施方案中，所述单体通过多价实体被连在一起成为所述多聚体。在一些实施方案中，所述单体通过选自生物素-亲和素相互作用、生物素-链亲和素相互作用、卷曲螺旋结构域相互作用、以及脂质体-单体交联的相互作用与所述多价实体结合。

在一个实施方案中，上述组合物还包含不同于所述分离多肽的第二多肽，其中所述第二多肽能够诱导HCV免疫应答。在一个实施方案中，该第二多肽是另外的HCV多肽。

在另一方面中，本发明提供能够特异性结合上述多肽和/或肽表位的抗体。

在另一方面中，本发明提供编码上述多肽和/或肽表位的分离核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含能够编码选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的核苷酸序列的片段。在一个实施方案中，所述核酸包含能够编码选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ IDNO：10的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含能够编码选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列的核苷酸序列。

在另一方面中，本发明提供包含与转录调节序列可操作性连接的上述核酸的载体。

在另一方面中，本发明提供经上述载体转化或转染的宿主细胞。

在另一方面中，本发明提供生产上述多肽或肽表位的方法，该方法包括在允许所述多肽或肽表位表达的条件下培养上述宿主细胞。在一个实施方案中，该方法导致不产生或者基本不产生除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质(例如HCV核心蛋白质)。在一个实施方案中，该方法还包括回收产生的所述多肽或肽表位。

在另一方面中，本发明提供预防或治疗动物中HCV感染、或者用于在动物中诱导抗HCV免疫学或保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述动物施用选自上述多肽、制备物、肽表位、药物组合物和/或载体的药剂。

在一个实施方案中，所述动物是哺乳动物，在另一个实施方案中是人。在另一个实施方案中，所述的人还具有HIV感染。

在另一方面中，本发明提供上述多肽、制备物、肽表位、组合物或载体在制备药物中的应用。

在另一方面中，本发明提供选自上述多肽、制备物、肽表位、组合物和/或载体的药剂用于预防或治疗HCV感染、或者用于诱导抗HCV的免疫学或保护性免疫应答中的应用。

在另一方面中，本发明提供选自上述多肽、制备物、肽表位、组合物和/或载体的药剂在制备用于预防或治疗HCV感染、或者用于诱导抗HCV的免疫学或保护性免疫应答的药物中的应用。

在另一方面中，本发明提供商业包装物，其包含选自上述多肽、制备物、肽表位、药物组合物和/或载体的药剂，以及用于预防或治疗HCV感染、或者用于诱导抗HCV的免疫学或保护性免疫应答的使用说明。

在另一方面中，本发明提供检测或诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括用上述多肽、制备物、肽表位、或其任何组合来分析所述动物的生物学样本。

在另一方面中，本发明提供在动物的生物学样本中检测或者定量HCV的方法，所述方法包括用上述多肽、制备物、肽表位、或其任何组合来分析所述生物学样本。

在另一方面中，本发明提供在动物中检测或诊断HCV感染的方法，该方法包括：将所述动物的生物学样本与上述多肽、制备物、肽表位、或其任何组合接触；和确定该生物学样本的成分与所述多肽或肽表位的结合；其中所述结合指示HCV感染。

在另一方面中，本发明提供用于检测或定量动物的生物学样本中的HCV的方法，该方法包括：(a)将所述生物学样本与上述的多肽、制备物、肽表位或其任何组合进行接触；和(b)确定生物学样本的成分与所述多肽或肽表位的结合；其中所述结合指示HCV在所述样本中的存在或者量。

在另一方面中，本发明提供检测或诊断动物中HCV感染的方法，该方法包括用上述抗体或组合物分析所述动物的生物学样本。

在另一方面中，本发明提供用于检测或定量动物的生物学样本中HCV的方法，所述方法包括用上述抗体或组合物分析所述生物学样本。

在另一方面中，本发明提供上述多肽、制备物、肽表位或者其任何组合用于体外诊断、检测或定量生物学样本中HCV的应用。

在另一方面中，本发明提供包含上述多肽或肽表位、以及MHC分子的复合物用于标记、检测或分离T细胞的应用。

在另一方面中，本发明提供包含上述多肽或肽表位、以及MHC分子的复合物用于检测、选择、分选或鉴定T细胞表位和/或氨基酸序列的应用。

在一个实施方案中，上述组合物是免疫原性或疫苗组合物。

在另一方面中，本发明提供包含与基底结合的上述多肽、肽表位、或两者的多肽微阵列。在一个实施方案中，该多肽微阵列还包含与所述基底结合的MHC分子。

在另一方面中，本发明提供包含上述抗体的多肽微阵列。

在另一方面中，本发明提供包含与基底结合的MHC复合物的多肽微阵列，所述复合物包含上述多肽或肽表位以及MHC分子。

在另一方面中，本发明提供检测或诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括：将所述动物的生物学样本与上述多肽微阵列进行接触；和确定生物学样本的成分与所述多肽微阵列的结合；其中所述结合指示HCV感染。

在另一方面中，本发明提供商业包装物，其包含选自上述多肽、肽表位、抗体和/或多肽微阵列的成分，以及用于检测或诊断HCV感染的使用说明。

在一个实施方案中，上述生物学样本是动物的组织或体液。

附图说明

图1.重组HCV F蛋白质的表达和生产。A.Fmut8 F蛋白质表达盒的结构。方框内是起始位点和推定的富含A的核糖体移码序列。引入用来转换和锁定翻译读码框的位点特异性突变用下划线标示。B.通过镍螯合色谱法纯化重组HCV F蛋白质。用空pET-30c(载体)或者用pET-30cFmut8转化pLys或BL21感受态大肠杆菌(E.coli)细胞(Novagen)。用6M盐酸胍或者8M尿素实施提取。C.通过质谱法鉴定Fmut8。在全长Fmut8序列下显示独立肽配对。

图2.在HCV感染对象和共感染HIV-1的患者中的F蛋白质特异性抗体应答。如材料和方法部分所描述的，使用Fmut8Δ11 ELISA检测到Ig应答。如先前所述[18]来确定HCV的基因型。空心三角形：未感染的对象；空心圆：HCV-1a；实心圆：HCV-1b；空心正方形：HCV-3a；实心正方形：HCV-4a；空心菱形：HCV-4c；实心菱形：HCV-5a。虚线表示检测阈。

图3.在HCV感染对象和共感染HCV和HIV-1的患者中HCV F蛋白质特异性CTL的前体频率。在标准⁵¹Cr释放分析中应用自体B淋巴母细胞样细胞系和表达HCV-1a F蛋白质或者HCV-1a p364-1618的重组痘苗来检测CTL活性[23]。如材料和方法部分描述来实施有限稀释分析。实线和空心正方形：F蛋白质特异性活性；虚线和空心圆：p364-1618。

图4.MHC-F蛋白质肽相互作用。如实施例中所述，应用T2结合分析来测试源于F蛋白质序列的肽与HLA-A＊0201的结合。对F蛋白质重叠肽群(200μg/ml)进行测试。虚线表示相应于无肽对照的阈值水平。

图5.MHC-F蛋白质肽相互作用。如实施例中所述，应用T2结合分析来测试源于F蛋白质序列的肽与HLA-A＊0201的结合。应用选定的候选肽实施剂量效应分析。空心圆：30μg/ml；空心正方形：100μg/ml；空心三角形：200μg/ml。“F”肽的命名参考由SEQ ID NO：11中指定位置(例如29-43)所定义的肽。

图6.根据以下实施例在小鼠中ARFP免疫研究的结果。在用ARFP免疫的小鼠中，通过ELISA测量总抗ARFP免疫球蛋白应答。A.方案1.空心三角形：用ARFP免疫的小鼠；空心正方形：用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫的小鼠。虚线表示ELISA检测阈。B.方案2.空心三角形：用ARFP免疫的小鼠；空心正方形：用PBS免疫的小鼠。虚线表示ELISA检测阈。C.应用作为结果获得的1600以上的ELISA效价对方案1和2的Laplan-Meier分析。

具体实施方式

HCV F蛋白质在与核心蛋白区重叠的选择性读码框中编码。实施本研究以检查在共感染HCV和HIV-1的患者中抗F蛋白质的宿主体液和细胞介导免疫应答的流行性和特征。

在本文所描述的研究中，引入突变从而使得HCV-1a F蛋白质在缺少核心的情况下进行表达。在大肠杆菌中表达该重组蛋白质和缺少了与核心共有的前11个氨基酸残基的截短形式，并且通过质谱分析证实它们的氨基酸序列。应用痘苗F蛋白质重组体来检验F蛋白质特异性细胞毒性T细胞(CTL)活性。研究源于F蛋白质的肽与HLA-A＊0201的结合以鉴定假想的CTL表位。

由此确定了在来自39名感染有各种基因型HCV患者中的23名患者的血清识别所述截短形式，其中包括共感染有HIV-1的25名对象中的13名对象，这指示在各种HCV基因型之间有抗原交叉反应并且其与F蛋白质编码序列的保守性相一致。在11名HCV感染对象中的9名对象中检测到F蛋白质特异性CTL前体细胞，其中包括9名共感染有HCV和HIV-1患者中的7名患者。最后，鉴定了三种新的假想HLA-A＊0201限制性CTL表位。

本文所描述的结果表明交叉反应性F蛋白质特异性免疫球蛋白和CTL应答能够在感染HCV的宿主中和共感染HIV-1的对象中同样地被检测到。

因此，在第一方面中，本发明涉及源于HCV F蛋白质的多肽，条件是所述多肽不是列于SEQ ID NO：8的全长HCV F蛋白质。这样的多肽包括HCV Fmut8蛋白质，其截短形式(例如Δ11形式，缺少自N末端的11个氨基酸)，以及列于SEQ ID NO：8的HCV F蛋白质的截短形式。本发明还涉及HCV F蛋白质或者HCV Fmut8蛋白质的多肽表位，即源于这些蛋白质的免疫原性多肽或片段，还涉及所述多肽的变体或片段。在一些实施方案中，所述多肽或其变体或片段具有或者能够实现或引起活性，所述活性包括但不限于诱导T细胞裂解活性、与HLA或MHC I类分子结合、与来自HCV感染对象的血清的免疫反应性、改变细胞因子或趋化因子的表达或产生、或者其任何组合。

在一些实施方案中，所述多肽的长度可以小于50、45、40、35、30、25、20、15或10个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽的长度大于或等于5、8或9个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽长度是9、10或15个氨基酸。

在一些实施方案中，所述多肽包含选自SEQ ID NO：9、11、12和/或14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列；或者其功能性(例如免疫原性)变体或片段。在一些实施方案中，所述多肽包含另外1-5、1-10、1-15、1-20、1-30或1-40个氨基酸，其加到选自9、11、12、14至38和/或51至103的氨基酸序列上。在另一个实施方案中，所述多肽基本上由选自9、11、12、14至38和/或51至103的氨基酸序列所组成。

在一些实施方案中，所述多肽基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的5-10、9、10、5-15、15、5-20、5-25、5-30、30、5-35、5-40、5-45、45或5-50个连续氨基酸所组成。

在一些实施方案中，本发明的多肽或表位包含具有以下通式I的氨基酸序列(见表14)：

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶-X¹⁷-X¹⁸-X¹⁹-X²⁰-X²¹-X²²-X²³

其中；

X¹选自V、A和D或者缺失；

X²是R或者缺失；

X³是S或者缺失；

X⁴是L或者缺失；

X⁵选自V和A或者缺失；

X⁶是E或者缺失；

X⁷选自F和Y或者缺失；

X⁸是T或者缺失；

X⁹是C；

X¹⁰是C；

X¹¹是R；

X¹²是A；

X¹³选自G和R或者缺失；

X¹⁴是A或者缺失；

X¹⁵选自L、P和H或者缺失；

X¹⁶选自D、G和N或者缺失；

X¹⁷是W或者缺失；

X¹⁸是V或者缺失；

X¹⁹选自C和S或者缺失；

X²⁰是A或者缺失；

X²¹是R或者缺失；

X²²选自R、Q和L或者缺失；和

X²³选自E、G和V或者缺失。

在另一些实施方案中，本发明的多肽或者表位包含具有以下通式II的氨基酸序列(见表15)：

Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶-Z⁷-Z⁸-Z⁹-Z¹⁰-Z¹¹-Z¹²-Z¹³-Z¹⁴-Z¹⁵

其中；

Z¹选自P和H或者缺失；

Z²选自V、E和E或者缺失；

Z³选自V和A或者缺失；

Z⁴选自L和P或者缺失；

Z⁵选自G、V和D或者缺失；

Z⁶选自L、P、H和R或者缺失；

Z⁷选自A、L、P、I、T和V或者缺失；

Z⁸是G；

Z⁹是A；

Z¹⁰选自P和Q；

Z¹¹选自Q和M；

Z¹²是T；

Z¹³是P；

Z¹⁴选自G和A；

Z¹⁵选自V、I和G。

本发明还提供药用组合物，比如疫苗或免疫原性组合物，其包含所述多肽和药用可接受载体。在另一个实施方案中，所述组合物还包含佐剂。在另一个实施方案中，所述组合物还包含MHC分子。

本发明还提供MHC肽复合物的多聚体(即2或更多)，其中每一MHC复合物包含本发明的多肽以及MHC分子。在一个实施方案中，所述MHC复合物包含本发明的多肽、MHC I类重链和β2微球蛋白。这样的多聚体系统在本领域中是公知的，并且所述复合物可以例如通过合适的相互作用与多价实体结合在一起，例如生物素-(链)亲和素(其是四价的，因此导致产生四聚体)相互作用(见美国专利5,635,363[1997年6月3日}；Altman et al.，Science，1996 Oct 4；274(5284)：94-6.Erratumin：Science 1998 Jun 19；280(5371)：1821.)。这样的多聚体也能够被用来标记、检测、分离和刺激T细胞，以及用来发现其它表位。

在一个实施方案中，本发明的组合物(例如疫苗或者免疫原性组合物)可以包含多个本发明的多肽。在一个实施方案中，所述组合物可以包含能够引起HCV免疫应答的第二多肽，比如额外的HCV多肽或其片段。

本发明还提供抗体，其抗、或者其识别、或能够特异性结合于本发明的多肽。

本发明还提供编码本发明多肽的分离的核酸或多核苷酸(比如选自SEQ ID NO：10或其片段的核苷酸序列，或者与之不同但是由于遗传密码的简并性仍编码相同多肽的序列)。

本发明还提供包含可操作性连接于转录调节或表达控制序列(例如启动子)的所述核酸的载体。本发明还提供包含所述核酸或载体的宿主细胞。

本发明还提供用于预防或治疗HCV感染的预防性和治疗性方法，其包括向动物(例如哺乳动物，例如人)施用本发明的多肽、组合物、或MHC复合物(包含本发明的多肽和一种或多种MHC分子[如MHC I类重链、β2微球蛋白])或者载体。在一些实施方案中，这样的方法包括施用本发明的多肽、组合物或载体以在动物中进行疫苗接种或免疫(即产生免疫应答)。在一个实施方案中，所述动物也患有HIV感染。

本发明还提供用于诊断和检测HCV感染的诊断方法。这样的方法可以作为试剂利用本发明的多肽或组合物、如上所示的包含两种或多种MHC肽复合物的多聚体、或者与本发明的多肽特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述方法包括将生物学样本比如动物的组织或体液(例如血、淋巴细胞)与所述试剂接触。本发明还提供包含本发明多肽的肽阵列或微阵列，以及任选地可用于上述诊断方法的其它组分比如MHC分子。

本发明还提供检测或定量生物学样本中HCV的方法。这样的方法可以作为试剂利用本发明的多肽或组合物、如上所示的包含两种或多种MHC肽复合物的多聚体、或者与本发明的多肽特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述方法包括将生物学样本比如动物的组织或体液(例如血、淋巴细胞)与所述试剂接触。本发明还提供包含本发明多肽的肽阵列或微阵列，以及任选地可用于上述方法的其它组分比如MHC分子。

本发明还提供本发明的多肽、MHC复合物(包含本发明的多肽以及一种或多种MHC分子[例如MHC I类重链、β2微球蛋白])或载体用于制备例如用于预防或治疗HCV感染的药物或疫苗中的用途。本发明还提供本发明的多肽、组合物或载体用于预防或治疗HCV感染的用途。

本发明还提供包含本发明的多肽、组合物或载体、以及用于预防或治疗HCV感染的使用说明的商业包装物。

本发明还提供包含本发明的多肽、组合物或抗体、以及用于诊断或检测HCV感染的使用说明的商业包装物。

本发明还涉及融合多肽。正如在本文中所使用的，融合多肽是包含在N-或C-末端融合至任意其它多肽(以下被称为肽尾)的本发明多肽或多肽衍生物的一种多肽。获得这样的融合多肽的一种简单方式是通过翻译所述多核苷酸序列(即，杂合序列)的框内融合物。编码融合多肽的杂合序列被插入到表达载体中，该载体被用来转化或转染宿主细胞。作为替代，编码所述多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列被插入到表达载体中，其中编码肽尾的多核苷酸已经存在于所述载体中。这样的载体及其使用说明是可商业获得的，例如来自New England Biolabs的pMal-c2或pMal-p2系统，其中所述肽尾是麦芽糖结合蛋白；Pharmacia的谷胱甘肽-S-转移酶系统，或者可从Novagen获得的His-Tag系统。这些和另外的表达系统提供用于进一步纯化本发明的多肽和衍生物的便利手段。融合多肽的一种有益实例是本发明的多肽或同源物或片段融合至具有佐剂活性的多肽，比如霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定毒素的亚基B。

为了实现融合，将本发明的多肽融合至具有佐剂活性的多肽的N-、或优选C-末端。作为替代，本发明的多肽片段被插入具有佐剂活性的多肽的氨基酸序列内部。

与上面的一致，本发明的多肽也编码包含异源信号肽的杂合前体多肽，其成熟后成为本发明的多肽。“异源信号肽”表示未在本发明多肽的天然存在前体中发现的信号肽。

根据本发明的多核苷酸分子，包括RNA、DNA、或其修饰物或其组合，具有多种应用。DNA分子用于，例如，(i)重组宿主系统中生产所编码多肽的方法，(ii)构建疫苗载体比如痘病毒，其进一步被用于预防和/或治疗HCV感染的方法和组合物中，和(iii)以其裸形式或与递送载体配制在一起作为疫苗剂(vaccine agent)(以及RNA分子)。

因此，本发明的另一方面涵盖(i)包含本发明的DNA分子的表达盒，其中所述分子置于表达所需元件控制之下，尤其是置于适宜的启动子控制之下；(ii)包含本发明表达盒的表达载体；(iii)用本发明的表达盒和/或载体转化或转染的原核或真核细胞，以及(iv)用于生产由本发明多核苷酸编码的多肽或多肽衍生物的方法，其包括在允许本发明的DNA分子表达的条件下培养用本发明的表达盒和/或载体转化或转染的原核或真核细胞，和从细胞培养物中回收所编码的多肽或多肽衍生物。

本发明的各种基因和核酸序列可以是重组序列。术语“重组(recombinant)”表示该物已经被重组，所以当涉及核酸构建体时，该术语表示由通过分子生物学技术连在一起或所产生的核酸序列组成的分子。当涉及蛋白质或多肽时，术语“重组”表示应用由分子生物学技术所创建的重组核酸构建体来表达的蛋白质或多肽分子。当涉及遗传组合物时，术语“重组”表示具有新等位基因组合的配子或后代或细胞或基因组，所述新等位基因组合不存在于亲代基因组中。重组核酸构建体可以包括连接至、或经操作而连接至一种核酸序列的核苷酸序列，而所述核苷酸序列原本不连接至这种核酸序列或者原本在不同位置连接至这种核酸序列。因此涉及核酸构建体时，‘重组’表示核酸分子已经用基因工程方法被操作过，即经过人为干预。重组核酸构建体可以例如通过转化被引入宿主细胞中。这样的重组核酸构建体可以包含源于相同宿主细胞物种或源于不同宿主细胞物种的序列，所述序列已经被分离并被重新引入宿主物种的细胞中。作为宿主细胞初始转化的结果或者作为随后重组和/或修复事件的结果，重组核酸构建体序列可以整合于宿主细胞基因组中。

在本发明的另一方面中，分离的核酸，例如编码本发明多肽、或其同源物、片段或变体的核酸序列还可以被导入重组表达载体中。在一个实施方案中，所述载体将包含转录调节序列或启动子，其可操作性连接于包含能够编码本发明肽化合物、多肽或结构域的序列的核酸。当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作性连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作性连接于编码序列。通常，可操作性连接的DNA序列是相邻的，并且必要时在读码框内连接两个蛋白质编码序列。然而，因为例如当与启动子分开几千个碱基时增强子通常发挥作用，并且内含子序列的长度是可变的，所以某些多核苷酸元件可以可操作性地连接，但不相邻。“转录调节元件”是诱导或控制与之可操作性连接的蛋白质编码序列转录的DNA序列的通称，比如起始和终止信号、增强子、启动子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号。

重组表达载体选自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(例如，COS1、NIH3T3或JEG3细胞)、节肢动物细胞(例如，斜纹夜蛾(Spodoptera fruglperda)(SF9)细胞)、以及植物细胞。一种优选的表达系统是原核宿主比如大肠杆菌。细菌和真核细胞可从大量不同的来源获得，包括对本领域技术人员已知的商业来源，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)。用于重组蛋白质表达的商业来源也提供这些细胞的使用说明。

表达系统的选择依赖于所期望表达多肽的特征。例如，它可用来生产特定脂化形式或任意其它形式的本发明的多肽。

本领域的技术人员应很容易地理解不能期望所有载体和表达控制序列和宿主同样好地表达本发明的多核苷酸。然而，依照以下所述的指导，可以不必用过度试验并且不偏离本发明的范围来选择载体、表达控制序列和宿主。

在载体选择中，选择与宿主相容的载体并且该载体可以在该宿主中存在并能够复制。考虑载体拷贝数、控制拷贝数的能力、其它蛋白质比如抗生素抗性的表达。在对表达控制序列的选择中，要考虑许多变量。序列的相对强度(例如在各种条件下驱动表达的能力)、控制序列功能的能力、在待表达多核苷酸和控制序列之间的相容性(例如考虑二级结构要避免阻碍有效转录的发夹结构)都是重要的变量。在宿主选择中，选择能与所选载体相容、耐受所表达产物任何可能的毒性影响、如果期望的话能有效分泌所表达产物、能够以期望构象表达产物、能够很容易地放大、以及终产物能够容易纯化的单细胞宿主。

表达盒的选择取决于所选的宿主系统以及对于所表达多肽的期望特征。典型地，表达盒包括在所选宿主系统中具有功能的并且可以是组成型或者诱导型的启动子；核糖体结合位点；如果必要的话起始密码子(ATG)；编码信号肽例如脂化信号肽的区域，；本发明的DNA分子；终止密码子；以及任选地3’末端区域(翻译和/或转录终止子)。信号肽编码区相邻于本发明的多核苷酸并被置于正确读码框中。信号肽编码区与编码成熟多肽的DNA分子是同源的或异源的并且与用于表达的宿主的分泌机制相容。由本发明的DNA分子所组成的开放读码框单独或与信号肽一起被置于所述启动子的控制下，从而在宿主系统中发生转录和翻译。启动子和信号肽编码区对于本领域的技术人员是众所周知的并且是可获得的，其包括，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的启动子(和衍生物)，其可被阿拉伯糖诱导(启动子araB)并且在革兰氏阴性细菌比如大肠杆菌中有功能(如美国专利No.5,028,530和Cagnon et al.，(Cagnon et al，ProteinEngineering(1991)4(7)：843)所述)；噬菌体T7编码RNA聚合酶的基因的启动子，其在许多表达T7聚合酶的大肠杆菌中具有功能(在美国专利No.4,952,496中有描述)；OspA脂化信号肽；以及RlpB脂化信号肽(Takaseet al.，J.Bact.(1987)169：5692)。

表达盒通常是表达载体的一部分，所选择的是其在所选表达系统中复制的能力。可以从，例如，Pouwels et al.(Cloning Vectors：A LaboratoryManual 1985，Supp.1987)所描述的那些载体中选择表达载体(例如，质粒或病毒载体)。可以从不同的商业来源选购合适的表达载体。

用表达载体转化/转染宿主细胞的方法在本领域中是熟知的并且依赖于所选的宿主系统，比如描述于Ausubel et al.(Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Inc.，1994)中。

通过表达，本发明的重组多肽(或多肽衍生物)被产生并且保持在细胞内区室中，其被分泌(secrete)/外泌(excrete)到细胞外环境中或细胞周质间隙中，或者被嵌入细胞膜中。从细胞提取物或从重组细胞培养物离心后的上清液中以基本纯形式回收所述多肽。通常上，通过基于抗体的亲和纯化法或通过本领域技术人员易于改进的其它熟知的方法，比如将编码所述多肽或其衍生物的多核苷酸与小的亲和结合结构域相融合，从而来纯化所述重组多肽。可用于通过免疫亲和纯化本发明多肽的抗体依照下述方法来获得。

在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的核酸或多肽(例如，SEQ ID No：1-128中的任意序列)同源的或基本一致的核酸和多肽变体。这样的变体可以由于替换、缺失和/或添加一个或多个残基(核苷酸或氨基酸，根据适当的情形)而不同于本发明的核酸或多肽。

“同源性”和“同源”表示两个肽或两个核酸分子间的序列相似性。可以通过在所匹配序列中比较每个位置来确定同源性。核酸之间或者氨基酸序列之间的同源性程度是在序列共有位置上一致或匹配的核苷酸或氨基酸的数目的函数。作为本文中使用的术语，如果两个序列是基本一致的并且所述序列的功能活性是保守的，那么核酸序列与另一个序列就是“同源的”(如本文中所使用的，术语“同源”不意味着进化上的关联性(relatedness))。如果在最优化比对时(允许间隙)，两个核酸序列共有至少约50％的序列相似性或一致性，或者如果序列共有确定的功能基序，那么就认为它们是“基本一致的”。在替代性实施方案中，在最优比对中基本一致序列的序列相似性可以是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。正如在本文中所使用的，序列间同源性的指定百分比表示在最优比对序列中序列一致性的程度。“不相关的”或“非同源的”序列与SEQ ID NO：1-128中的任何序列共有少于40％的一致性，但是优选少于约25％的一致性。

基本互补的核酸是其中一个分子的互补物与另一个分子基本一致的核酸。如果在最优比对时，两个核酸或蛋白质序列共有至少约70％的序列一致性，那么就认为它们是基本一致的。在替代性实施方案中，序列一致性可以例如是与SEQ ID NO：1-128中的任何序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列一致性。可以应用各种算法实施用于一致性比较的序列的最优比对，所述算法比如有Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2：482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48：443的同源性比对算法、Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索法，以及这些算法的计算机化实施手段(比如Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。也可以应用描述于Altschul et al，1990，J.MoI.Biol.215：403-10的BLAST算法(应用公布的默认设置)来确定序列一致性。实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information)(通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站)获得。BLAST算法包括首先通过当与数据库序列中相同长度的词进行比对时鉴定匹配或满足一些正分阈值T的查询序列中的短词长W，来鉴定高得分的序列对(HSP)。T被称作相邻性词评分阈值(neighbourhood word scorethreshold)。起始命中相邻词串(Initial neighbourhood word hits)作为种子用来启动搜索以发现较长的HSP。为了尽可能增加累积比对评分，沿着每个序列的两个方向上延伸命中词串。在每个方向上命中词串的延伸在以下参数被满足时将被停止：累积比对评分从其最大获得值下降量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或者以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。BLAST程序可以应用作为默认的词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(Henikoff and Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：10915-10919)的比对值(B)50、期望值(E)10(或者1或者0.1或者0.01或者0.001或者0.0001)、M＝5、M＝4、和比较两条链。一种应用BLAST算法测量两个序列间统计学相似性的方法是最小和概率法(the smallestsum probability)(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然发生匹配的概率的指标。在本发明的替代性实施方案中，如果在比较受试序列中最小和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，以及最优选小于约0.001，那么就认为核苷酸或氨基酸序列是基本一致的。

对于基本互补的两个核酸序列的替代性指标是两个序列在适度严谨、或者优选严谨的条件下相互杂交。适度严谨条件下与滤膜结合序列的杂交可以，例如，在0.5M NaHPO₄、7％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM EDTA中在65℃进行，并在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(见Ausubel，et al.(eds)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，GreenPublishing Associates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，New York，at p.2.10.3)。作为替代，严谨条件下与滤膜结合序列的杂交可以，例如，在0.5M NaHPO₄、7％SDS、1mM EDTA中在65℃进行，并在68℃在0.1xSSC/0.1％SDS中洗涤(见Ausubel，et al(eds)，1989，同上)。取决于感兴趣序列可以依照公知方法来改进杂交条件(见Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology——Hybridization withNucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，NewYork)。一般来说，严谨性条件选择是对于特定序列而言在确定离子强度和pH条件下的熔链温度之下约5℃。

在一个方面中，本发明的多肽是基本纯化的。正如在本文中使用的，“基本纯化的多肽”被定义为与其天然存在环境中相分离的和/或没有在其合成环境中所存在大部分多肽的多肽。例如，基本纯化的多肽是没有细胞质多肽的。本领域的技术人员应易于理解，本发明的多肽可以是化学合成的、通过重组手段产生的、或者从天然来源中产生的。

在一个实施方案中，本发明的多肽是重组多肽。

在一个方面中，本发明提供用于生产多肽的方法，其不产生或基本上不产生除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质(例如HCV核心蛋白质)。本发明还提供本发明的多肽或者包含所述多肽的制备物，所述多肽基本上没有除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质(例如HCV核心蛋白质)。

正如在本文中使用的，本发明的免疫原性或疫苗组合物通过疫苗领域中已知的常规途径来施用，例如施用至粘膜(例如，眼、鼻内、肺、口腔、胃、肠、直肠、阴道、或尿道)表面、经胃肠外(例如皮下、皮内、肌内、静脉内、或腹膜内)途径、或者通过局部施用(例如经贴剂)。施用途径的选择取决于许多因素，比如与多肽联合的佐剂。如果应用粘膜佐剂，那么鼻内或口腔途径是优选的。如果应用脂质配制物或铝化合物，胃肠外途径是优选的，并且皮下或肌内途径是最优选的。所述选择也取决于疫苗剂的自身特性。

对于在本发明组合物中的应用，多肽或其衍生物被配制为以下形式或与之一起配制，脂质体，优选中性或阴离子脂质体，微球，ISCOMS，或病毒样颗粒(VLP)，以促进递送和/或增强免疫应答。对于本领域的技术人员这些化合物易于获得；例如，见Liposomes：A Practical Approach，RCP New Ed，IRL press(1990)。

也可以使用除脂质体等之外的佐剂，它们也是本领域已知的。佐剂可以通过将其隔离在局部储库中而保护抗原免于快速分散，或者它们可以包含这样的物质，其刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统其它组分有趋化性的因子。本领域的技术人员可以常规地作出适宜的选择，例如，依照以下所述。

本发明的多核苷酸也能够作为疫苗使用。有两个主要的途径，应用病毒或者细菌宿主作为基因递送载体(活疫苗载体)或者以游离形式施用基因，例如将其插入质粒中。本发明多核苷酸的治疗性或预防性功效依照以下所述进行评估。

由此，本发明另一个方面提供(i)疫苗载体比如痘病毒，其包含本发明的DNA分子，所述DNA分子被置于表达所需元件的控制之下；(ii)包含本发明疫苗载体的材料加上稀释剂或载体的组合物；特别地(iii)包含治疗或预防有效量的本发明疫苗载体的药物组合物；(iv)用于在哺乳动物(例如人；作为替代，该方法也能被用于兽医用途来治疗或预防非人动物的HCV感染)中诱导抗HCV免疫应答的方法，其包括给所述哺乳动物施用免疫原性有效量的本发明疫苗载体从而引起针对HCV的保护性或治疗性免疫应答；特别地(v)用于预防和/或治疗HCV感染的方法，其包括向感染个体施用预防或治疗量的本发明疫苗载体。此外，本发明还提供本发明疫苗载体在制备预防和/或治疗HCV感染的药物中的用途。

正如在本文中使用的，疫苗载体表达一种或多种本发明的多肽或其衍生物。所述疫苗载体还可以另外表达增强免疫应答(辅助作用)的细胞因子，比如白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-12(IL-12)。应该理解，待表达的每一组分被置于在哺乳动物细胞中表达所需元件的控制之下。

本发明还提供包含几种本发明多肽或其衍生物或者疫苗载体(其中每个都能表达本发明的多肽或其衍生物)的组合物。组合物也可以包含额外的HCV抗原，或者其亚基、片段、同源物、突变体、或衍生物；任选地或者与细胞因子比如IL-2或IL-12(或者能够表达它们的疫苗载体)一起。

本文中使用的“疫苗”表示包含一种或多种本发明多肽/肽或者本发明疫苗载体的组合物或配制物。用于治疗或预防哺乳动物感染的接种疫苗方法包括通过任何常规途径应用本发明的疫苗或疫苗载体。

可以以单次或间隔的重复剂量实施治疗。适当的给药方案依赖于本领域技术人员已知的多种参数，比如疫苗或疫苗载体的自身、施用途径或待接种疫苗的哺乳动物的状况(体重、年龄等)。

在本领域中可利用的活疫苗载体包括病毒载体比如腺病毒和痘病毒以及细菌载体，例如，志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、卡介苗(BacilleCalmette-Guerin)(BCG)和链球菌属(Streptococcus)。

在美国专利No.4,920,209中描述了腺病毒载体的实例以及构建能表达本发明DNA分子的腺病毒载体的方法。痘病毒载体包括痘苗病毒和金丝雀痘病毒，它们分别描述于美国专利No.4,722,848和美国专利No.5,364,773中(也可参见，例如Tartaglia et al.，Virology(1992)188：217)用于描述痘苗病毒载体和Taylor et al，Vaccine(1995)13：539用于描述金丝雀痘病毒载体)。通过描述于Kieny et al.，Nature(1984)312：163的同源重组方法获得能够表达本发明多核苷酸的痘病毒载体，使得本发明的多核苷酸在适于在哺乳动物中表达的条件下被插入病毒基因组中。通常，用于治疗性或预防性用途的疫苗病毒载体的剂量可以是每千克约1×10⁴至约1×10¹¹，有利地约1×10⁷至约1×10¹⁰，优选约1×10⁷至约1×10⁹个空斑形成单位。优选地是，胃肠外施用病毒载体；例如，3次给药，每次间隔4周。优选地避免向含有本发明病毒载体的组合物中添加化学佐剂并且由此尽可能降低对病毒载体本身的免疫应答。

可用作活口服疫苗的非产毒霍乱弧菌突变体菌株是公知的。Mekalanos et al.，Nature(1983)306：551和美国专利No.4,882,278描述了对于两个ctxA等位基因中每一个具有实质量缺失的菌株，从而不产生功能性霍乱毒素。WO 92/11354描述了一种菌株，其中通过突变使irgA基因座失活；这种突变可以与ctxA突变组合在单菌株中。WO 94/01533描述了一种缺少功能性ctxA和attRS1 DNA序列的缺失突变体。这些突变菌株经遗传工程化处理从而表达异源抗原，如WO 94/19482中所述。能表达由本发明DNA分子所编码多肽或多肽衍生物的霍乱弧菌菌株的有效疫苗剂量包含在所选施用途径的适宜体积中约1×10⁵至约1×10⁹、优选约1×10⁶至约1×10⁸个活细菌。优选的施用途径包括所有粘膜途径；最优选地是，这些载体经鼻内或口服施用。

经或不经遗传工程化处理以重组表达异源抗原的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)减毒菌株，以及它们作为口服疫苗的用途在Nakayama et al.(Bio/Technology(1988)6：693)和WO 92/11361中有描述。优选的施用途径包括所有粘膜途径；最优选地是，这些载体经鼻内或口服施用。

在本发明背景下用作疫苗载体的其它细菌菌株，对于弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)而言描述于High et al.，EMBO(1992)11：1991和Sizemore et al.，Science(1995)270：299中；对于格氏链球菌(Streptococcusgordonii)而言描述于Medaglini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：6868中；以及对于卡介苗(Bacille Calmette Guerin)而言描述于FlynnJ.L.，Cell.MoI.Biol.(1994)40(suppl.I)：31、WO 88/06626、WO 90/00594、WO 91/13157、WO 92/01796和WO 92/21376中。

在细菌载体中，本发明的多核苷酸被插入细菌基因组中或者以游离状态保持作为质粒的一部分。

包含本发明多肽或疫苗载体的组合物还可以包含佐剂。对于本领域的技术人员许多佐剂都是公知的。优选的佐剂依照以下所述进行选择。

由此，本发明另一个方面提供(i)包含本发明的多肽或多核苷酸的物质以及稀释剂或载体的组合物；(ii)包含治疗或预防有效量的本发明多肽或多核苷酸的药用组合物；(iii)通过施用免疫原性有效量的本发明多肽或者多核苷酸从而引发针对HCV的保护性免疫应答，以在哺乳动物中诱导抗HCV免疫应答的方法，(iv)通过向受感染个体施用预防或治疗量的本发明多肽或多核苷酸，来预防和/或治疗HCV感染的方法。此外，本发明还提供本发明的多肽或多核苷酸在制备治疗和/或预防HCV感染的药物中的用途。

本发明的多核苷酸的用途包括将它们作为疫苗施用给哺乳动物，用于治疗或者预防目的。这样的多核苷酸以作为不能在哺乳动物细胞中复制以及不能整合于哺乳动物基因组中的质粒一部分的DNA形式来使用。通常，这样的DNA分子被置于适宜在哺乳动物细胞中表达的启动子的控制下。所述启动子以普遍存在的或组织特异性的方式来发挥功能。非组织特异性启动子的实例包括早期巨细胞病毒(CMV)启动子(见美国专利No.4,168,062)和劳斯肉瘤病毒启动子(见Norton & Coffin，Molec.Cell Biol.(1985)5：281)。组织特异性启动子的实例是桥粒蛋白(desmin)启动子，其在肌肉细胞中驱动表达(Li et al.，Gene(1989)78：243，Li & Paulin，J.Biol.Chem.(1991)266：6562和Li & Paulin，J.Biol.Chem.(1993)268：10403)。使用启动子对于本领域的技术人员是熟知的。在许多的出版物中描述了可应用的载体，具体说有WO 94/21797和Hartikka et al.，Human Gene Therapy(1996)7：1205。

被用作疫苗的本发明的多核苷酸编码相应多肽的前体或者成熟形式。在前体形式中，信号肽是同源的或者是异源的。在后者的情况中，真核细胞前导序列比如组织型纤维蛋白溶酶原因子(tPA)的前导序列是优选的。

使用制备和纯化多核苷酸的分子生物学标准技术来制备本发明的多核苷酸治疗剂。对于用作疫苗，按照以下描述的各种方法来配制本发明的多核苷酸。

一种方法利用裸形式即没有任何递送载体的所述多核苷酸。这种多核苷酸简单稀释在在生理可接受的溶液比如无菌盐水或者无菌缓冲盐水中，其中有或有载体。当其存在时，所述载体优选是等渗的、低渗的、或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度，比如由蔗糖溶液(例如含20％蔗糖的溶液)所提供的。

一种替代方法利用与辅助细胞吸收的试剂相结合的所述多核苷酸。这种试剂的实例是(i)改变细胞渗透性的化学物，比如布比卡因(bupivacaine)(见，例如，WO 94/16737)，(ii)用于包裹所述多核苷酸的脂质体，或者(iii)阳离子脂质或者硅、金、或钨微粒，其自身与所述多核苷酸结合。

阴离子和中性脂质体在本领域中是众所周知的(见，例如，Liposomes：A Practical Approach，RPC New Ed，IRL press(1990)，关于制备脂质体的方法的详细说明)并且可用于递送大范围的产物，包括多核苷酸。

阳离子脂质在本领域中也是公知的并且通常用于基因递送。这样的脂质包括Lipofectin^TM也被称作DOTMA(N-[1-(2，3-二油烯基氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1，2-双(油烯基氧)-3-(三甲基氨基)丙烷)、DDAB(二甲基二十八烷基溴化铵)、DOGS(双十八烷基酰胺甘氨酰精胺)(dioctadecylamidologlycyl spermine)和胆固醇衍生物比如DC-Chol(3 β-(N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰基)胆固醇)。能够在EP 187,702、WO 90/11092、美国专利No.5,283,185、WO 91/15501、WO 95/26356和美国专利No.5,527,928中找到这些阳离子脂质的说明。用于基因递送的阳离子脂质优选与中性脂质比如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)结合在一起应用，比如作为实例在WO 90/11092中描述。

包含阳离子脂质体的配制物可以任选地包含另外的转染促进化合物。其中很多描述于WO 93/18759、WO 93/19768、WO 94/25608和WO95/02397中。它们包括精胺衍生物，其用于促进DNA通过核膜的转运(见，例如，WO 93/18759)，以及膜渗透化合物比如GALA、短菌杆肽S和阳离子胆汁盐(见，例如，WO 93/19768)。

金或者钨微颗粒被用于基因递送，如WO 91/00359、WO 93/17706、和Tang et al.Nature(1992)356：152中所述。使用无针注射装置(“基因枪”)经真皮内或者上皮内途径注射微颗粒包被的多核苷酸，如它们描述于美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,015,580和WO 94/24263中。

将用于疫苗接受者的DNA的量依赖于，例如，在DNA构建体中所用启动子的强度、所表达基因产物的免疫原性、施用目标哺乳动物的条件(例如，哺乳动物的体重、年龄和总体健康情况)、施用模式、以及配制物类型。通常，可以给成年人施用治疗性或预防性有效剂量是约1μg至约1mg，优选约10μg至约800μg，更优选约25μg至约250μg。可以通过单剂量或有间隔的多剂量形式来实现施用。

尽管不是绝对需要的，这样的组合物也可以包含佐剂。如果这样的话，不需要为了表现佐剂作用而伴随施用的全身性佐剂是优选的，比如，例如，QS21，其在美国专利No.5,057,546中有描述。

本领域技术人员很容易确定，以单次给药或者以必要间隔而重复给药的形式来实现治疗。例如，引发给药之后接着是以周计或月计为间隔的三次加强给药。合适的剂量依赖于各种因素，其包括接受者(例如，成年或婴儿)、具体的疫苗抗原、施用途径和频率、佐剂的存在与否或类型、和所期望作用(例如，保护和/或治疗)，它们能够很容易的由本领域的技术人员确定。在一个实施方案中，作为疫苗施用的本发明的多肽通过粘膜途径施用，其用量为约10μg至约500mg，优选约1mg至约200mg。对于胃肠外施用途径而言，所述剂量通常不超过1mg，优选约100μg。

当作为疫苗剂应用时，本发明的多肽和多核苷酸可以作为多步骤免疫过程的部分来依次施用。例如，用本发明的疫苗载体比如痘病毒，例如，经胃肠外途径来初始引发哺乳动物，随后用由疫苗载体编码的多肽，例如，通过粘膜途径来加强两次。在另一个实施例中，也应用与本发明的多肽或其衍生物结合的脂质体进行引发，并用与粘膜佐剂(例如，LT)组合的本发明的可溶性多肽或其衍生物经由粘膜途径进行加强。

依照本发明另外的方面，本发明的多肽或其变体或衍生物也用作诊断试剂用于检测，例如，血液样本中抗HCV抗体的存在。这样的多肽长度约5至约80、优选约10至约50个氨基酸。取决于诊断方法，它们被标记或者未被标记。涉及这种试剂的诊断方法在以下描述。

可用于上述任何疫苗组合物的佐剂如以下所述。

用于胃肠外施用的佐剂包括铝化合物，比如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸氢氧化铝(aluminum hydroxy phosphate)。根据标准方案，用铝化合物与抗原一起沉淀，或者将所述抗原吸附于其上。其它佐剂比如RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)也用于胃肠外施用。

用于粘膜施用的佐剂包括细菌毒素，例如，霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、艰难梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)，或者其组合、亚基、类毒素、或突变体，比如天然霍乱毒素亚基B(CTB)的纯化制备物。任何这些毒素的片段、同源物、衍生物和融合物也是适合的，只要它们保持佐剂活性。优选地是，应用毒性降低的突变体。例如，在WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)、WO 96/06627(Arg-192-Gly LT突变体)和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体)中描述了合适的突变体。用于本发明方法和组合物中的另外的LT突变体包括，例如，Ser-63-Lys、Ala-69Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。其它佐剂，比如，例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、或弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的细菌单磷酰脂质A(MPLA)；皂角苷、或者聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)微球，也被用于经粘膜施用。

既可用于粘膜又可用于胃肠外施用的佐剂包括聚磷腈(polyphosphazene)(WO 95/02415)、DC-chol(3b-(N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)-氨甲酰基)胆固醇；美国专利No.5,283,185和WO 96/14831)和QS-21(WO 88/09336)。

以常规方式制备包含本发明的多肽、多肽衍生物、多核苷酸或者抗体的本发明的任何药用组合物。特别地，用药用可接受的稀释剂或者载体，例如，水或盐溶液比如磷酸盐缓冲液进行制备。通常，根据施用的模式和途径以及标准制药规范选择稀释剂或者载体。合适的药用载体或者稀释剂，以及它们在药物配制中所需要的制药必需物在Remington′s PharmaceuticalSciences中有描述，其在此领域中和在USP/NF中是标准参考书。

“治疗有效量”表示在必要的给药方案以及时间期间为实现期望治疗结果而有效的量，比如减轻HCV感染症状并进而减轻HCV感染和相关疾病进程并改善对HCV感染和相关疾病的预后。治疗有效量可以根据各种因素变化，比如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述化合物在个体中引发期望反应的能力。可以调整给药方案以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也在于治疗有益效果胜过该化合物的任何有毒或有害效果。“预防有效量”表示在必要的给药方案和时间期间为实现期望预防结果而有效的量，比如预防或抑制HCV感染以及相关症状和疾病的发作或进行。可以依照上述有关治疗有效量来确定预防有效量。对于任何特定对象，具体的给药方案可以根据个体需要和施用或监管所述化合物施用的人员的专业判断随时间作出调整。

正如本文中所使用的，“药用可接受载体”或“赋形剂”包括任何和所有的生理相容的溶剂、分散介质、包衣剂(coatings)、抗细菌和抗真菌剂、等渗压和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，所述载体适于胃肠外施用。作为替代，所述载体可以适于静脉内、腹膜内、肌内、舌下或口服施用。药用可接受载体包括用于即时制备无菌注射溶液或者分散体(dispersions)的无菌水溶液或者分散体以及无菌粉末。对于药物活性物质而言，这种介质和试剂的应用在本领域中是众所周知的。除了与所述活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外，其在本发明的药物组合物中的应用在本发明的考虑范围内。补充的活性化合物也能够加入所述组合物中。

典型的治疗性组合物必须是无菌的并且在制造和贮藏条件下是稳定的。所述组合物能够被配制成溶液、微乳、脂质体、或者适于高药物浓度的其它有序结构。所述载体可以是溶剂或者分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。能够，例如，通过应用涂料比如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持必要的颗粒大小、以及通过应用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况中，它将优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇比如甘露醇、山梨醇，或者氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收试剂，例如单硬脂酸盐和明胶造成可注射组合物的吸收延长。此外，本发明的多肽能够在定时释放配制物(time release formulation)中，例如在包含延释聚合物的组合物中来施用。活性化合物可以与载体一起配制，所述载体将保护化合物以抵抗快速释放，比如控释制备物，其包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用生物降解、生物相容的聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸的共聚物(PLG)。许多制备这种制剂的方法是受专利保护的或者通常是本领域技术人员所公知的。

本发明的另一方面提供识别本发明多肽的抗体。

本发明的抗体是多克隆的或者是单克隆的。抗体可以是重组体，例如，嵌合体(例如，由鼠源可变区与人恒定区结合所组成)、人源化(人免疫球蛋白恒定骨架加上动物如鼠源的高变区)和/或单链。多克隆和单克隆抗体也可以是免疫球蛋白片段形式，例如，F(ab)’₂、Fab或者Fab’片段。本发明的抗体是任何亚型，例如，IgG或IgA，并且多克隆抗体是单亚型或者亚型混合。

通过用包含所述多肽的部分纯化的级分免疫哺乳动物来产生抗本发明多肽的抗体。这种抗体可以是多克隆的或者单克隆的。产生多克隆或单克隆抗体的方法在本领域中是众所周知的。有关综述见Harlow和Lane(1988)和Yelton et al.(1981)，它们通过引用并入本文中。对于单克隆抗体，见Kohler和Milstein(1975)，其通过引用并入本文中。

由包含本发明多肽的部分纯化的级分而产生本发明的抗体，生产并使用标准免疫分析方法鉴定这些抗体，所述方法例如，Western印迹分析、斑点印迹分析或者ELISA(见，例如，Coligan et al.(1994)，其通过参考并入本文中)。在诊断方法中应用所述抗体来检测样本比如组织和体液中HCV F蛋白质或其片段或HCV的存在。所述抗体也被用于亲和色谱中以获得包含本发明多肽的纯化的级分。

由此，本发明的另一方面提供(i)用于检测组织或者体液中HCVF蛋白质多肽或其片段和/或HCV存在的试剂；(ii)用于检测组织或体液中HCV F蛋白质多肽或其片段和/或HCV存在的诊断方法，其是通过将所述组织或体液与本发明的抗体进行接触，从而形成免疫复合物，并通过检测该复合物来指示在所述样本中或该样本来源的生物体中HCVF蛋白质多肽或其片段和/或HCV的存在来实现的。

本领域的技术人员应很容易地理解在样本组分和所述抗体之间形成了所述免疫复合物，并且在检测该复合物之前去除任何未结合的物质。应理解地是，应用本发明的抗体筛选样本，比如，例如，血、血浆、淋巴细胞、脑脊髓液、尿、唾液、上皮细胞和成纤维细胞，以分析HCV F蛋白质多肽或其片段和/或HCV的存在。

相似地，本发明的多肽可以被用作检测组织或者体液中抗HCV F蛋白质或其片段和/或HCV的抗体存在的试剂，因此本发明还提供这样的试剂，以及用于检测抗HCV F蛋白质或其片段和/或HCV的抗体存在的诊断方法，其是通过将组织或体液与本发明的多肽进行接触，从而形成免疫复合物并通过检测该复合物来指示在所述样本中或该样本来源的生物体中HCV F蛋白质或其片段和/或HCV的存在来实现的。

对于诊断应用而言，所述试剂(例如，本发明的多肽或者抗体)是游离状态或者被固定在固体支持物上，比如管、珠、板或孔，或者任何本领域中的其它常规支持物(比如肽微阵列)。使用直接或者间接手段实现固定。直接手段包括所述支持物和所述试剂间的被动吸附(非共价结合)或者共价结合。“间接手段”表示与所述试剂相互作用的抗试剂化合物首先被附着到固体支持物上。间接手段也可以应用配体-受体系统，例如，分子比如维生素被结合到所述试剂上并且相应的受体被固定到固相上。生物素-链亲和素系统是一个实例。作为替代，以化学方式或通过遗传工程方法将肽尾添加到所述试剂上并且接枝或融合产物通过肽尾的被动吸附或者共价连接而被固定。

这样的诊断试剂可以被包含于试剂盒中，该试剂盒也可以包含使用说明。所述试剂经检测手段标记，检测手段允许当所述试剂与其靶标结合时对该试剂进行检测。检测手段可以是荧光剂比如荧光素异氰酸酯或者荧光素异硫氰酸酯，或者酶比如辣根过氧化物酶或荧光素酶或碱性磷酸酶，或者放射性元素比如¹²⁵I或⁵¹Cr。

尽管在本文中公开了本发明的各种实施方案，但是技术人员根据本领域的普通常规知识可以在本发明的范围内作出许多适应性修改和改进。这样的改进包括用于本发明任何方面的公知等同物的替换，从而以基本相同的方式实现同样的结果。数字范围包括用于限定范围的数字。在权利要求中，单词“包含”用作开放型术语，实质上等同于短语“包括，但不限于”。以下实施例用来举例说明本发明的各个方面，但并不限制本文中所公开发明的宽范围。

实施例

实施例1：材料和方法

研究对象和临床参数

对于体液免疫应答的研究，39名女性患者选自SIDA母婴中心亲子组群(the Centre maternel et infantile sur Ie SIDA(CMIS)mother-child-cohort)(CHU mere-enfant Sainte-Justine，Montreal，.Canada)的参加者。平均年龄是29.6+/-5.75岁(范围＝20.1-41.3岁)。根据魁北克省的临床规范和诊断算法，通过ELISA和重组免疫印迹分析确定HCV感染。平均HCV RNA水平(COABS Amplicor HCV Monitor assay version 2.0，Roche Diagnostics，Montreal，Canada)是5.37 log IU/ml血浆(范围＝2.78-7.09 log IU/ml血浆)。通过5’非编码区的序列分析实施HCV基因型分析，如参考文献所述[18]。通过ELISA和非定量PCR确定在这39名患者的25名患者中具有HIV-1的共感染。在共感染的患者中，使用流式细胞仪测量的平均CD4细胞计数是509+/-243细胞/mm³(范围＝33-1287细胞/mm³)，并且平均HIV-1病毒载量(Versant HIV RNA version 3.0 assay，Bayer，Pittsburgh，Pennsylvania)是2.81 log RNA拷贝/ml血浆(范围＝l.70-4.73 log RNA拷贝/ml血浆)。用抗逆转录病毒疗法，包括单剂(n＝3)、双联疗法(n＝6)和三联疗法(n＝11)治疗这25名对象中的19名。所报告的HIV风险分类包括使用注射药物(n＝22)、可能的异性传播(n＝7)、以及在HIV流行地区中所实施的外科手术和/或输血。对于细胞介导免疫的研究，患者选自St-Luc静脉注射药物使用者组群(CHUM-

 St-Luc，Montreal，Canada)(n＝7；HND、HTM和PSL编码)或者选自CMIS组群(n＝4；TVC编码)。在此第二研究组中对象的临床特征总结于表1中。用Synchron LX20 system(Beckman Coulter，Palo Alto，California)检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。在进行研究时，没有用抗HCV疗法治疗过任一组群中的对象。

HCV F蛋白质基因克隆和突变

从感染HCV-1a的对象(TVC33)所获得的500μl血清中分离病毒基因组RNA，并且对其进行逆转录，以及使用QIAamp^TM法(Qiagen，Mississauga，Ontario)进行扩增，其中使用引物HCV 1a 1-16(5′-GCCAGC CCC CTG ATG G-3′[SEQ ID NO：1])和HCV 988-970(5′GCCTCG TAC ACA ATA CTC G-3′[SEQ ID NO：2])(Alpha DNA，Montreal，Canada)。RT-PCR的条件是在T3TM热循环仪(Biometra，Goettingen，Germany)中50℃/30分钟，95℃/15分钟变性，然后40个循环的94℃/30秒、55℃/1分钟和72℃/1分钟，接着是72℃/10分钟的延伸期。扩增子被克隆至pCRScript Amp SK+(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，California)的SrfI位点(pCore1a33)。随后通过突变修饰核心序列，a)强制移位翻译成为(+2)读码框；和b)通过在移码相关滑动样序列(frameshift-associated slippery-like sequence)内引入三个沉默突变来锁定翻译(Fmut8)。这首先通过将来自pCore1a33的Aat II-Not I片段插入用Stu I和Not I切割的pSC11ss疫苗转移载体中[19](pSC11ssF16)。应用引物Fmut S Sal(5′-GAC CGT CGA CCA TGA GCA CGA ATC CTA AACCTC AGA GGAAGA CCC CAAACG TAA-3′[SEQ ID NO：3])和Fmut ASKpn(5′-AAG GGT ACC CGG GCT GAG CCC AGG TCC TGC CCT CGGG-3′[SEQ ID NO：4])再扩增pCorela33。PCR条件是在TGradient^TM热循环仪(Biometra)中94℃/3分钟，25个循环的94℃/30秒、60-72℃/l分钟和72℃/1分钟，接着是72℃/15分钟的延伸。随后利用Sal I和Kpn I切割该扩增子，并且被穿梭至pSC11ssF16中从而形成pSC11ssFmut8。使用引物HCVIa Sal I(5′-TCA AGT CGA CCC AAA CGT AAC ACC AACCG-3′[SEQ ID NO：5])和pCRSl(5′-GGAAAC AGC TAT GAC CAT GATTAC GCC AAG C-3′[SEQ ID NO：6])相似地产生缺少与核心共有的N末端最初11个氨基酸的F蛋白质的截短形式(Fmut8Δ11)。PCR条件是25个循环的94℃/30秒、53℃/1分钟和72℃/1分钟，接着是72℃/15分钟的延伸。最后，Fmut8和Fmut8Δ11也分别被亚克隆至Sal I-Not I-消化的pET-30c和pET-30b中(Novagen，Madison，Wisconsin)，用于在大肠杆菌中诱导型、N末端His标记的表达。通过自动DNA测序鉴定所有构建体的结构。

重组F蛋白质的生产

在大肠杆菌BL21细胞中表达pET-30cFmut8和pET-30bFmut8Δ11并且在变性条件下在Ni-NTA His-Bind^TM树脂(Novagen)上、接着使用Mini Prep^TM槽(Bio-Rad Laboratories，Hercules，California)的制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳，来纯化F蛋白质。使用Fmut8Δ11基因产物来产生没有抗核心蛋白质交叉反应性的兔抗血清。对于质谱分析，用考马斯蓝染色的蛋白质凝胶带再水化并使其胰蛋白酶化。随后从纳级C18反相HPLC毛细管柱中洗提所提取肽并且使用LCQ DECA离子阱质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，California)进行电喷雾离子化MS。通过利用SEQUEST程序进行与蛋白质或翻译核苷酸数据库的序列比对来评定蛋白质的身份[20]。

F蛋白质ELISA

在平底96孔聚苯乙烯板中，在100μl的0.1M NaHCO₃ pH 8.6中，在4℃下过夜孵育抗原(2μg/ml Ni-NTA-纯化的Fmut8Δ11)。用溶于100mM NaHCO₃ pH 8.6的5mg/ml牛血清白蛋白、每孔用200μl按照2小时/4℃的条件封闭板子，并且用10mM tris碱、150mM NaCl、0.05％Tween-20 pH 7.4(IX TBST)洗涤6次。随后加入患者的血清稀释物(在100μl 1×TBST中1/50至1/6400)并在室温条件下伴随轻微振荡孵育2小时。用1×TBST洗涤孔6次，添加每孔100μl在1×TBST+5mg/ml BSA中的碱性磷酸酶偶联的抗人IgG抗体(1/3000；Sigma，Saint Louis，Missouri)或者抗兔抗体(1/1000/Biosys，Compiegne，France)。在室温条件下并伴随轻微振荡孵育1小时后，清洗孔6次并用50mM NaHCO₃、1mMMgCl₂和1mg/ml磷酸对硝基苯酯显示抗体结合。90分钟后，用MR7000分光光度计(Dynatec，Chantilly，Virginia)在410nm处测量光密度。抗Fmut8Δ11或者纯化核心蛋白的兔抗血清被用作阳性和阴性对照。

重组痘苗病毒的制备

在添加10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Burlington，Canada)的Dulbecco最小必需培养基(DMEM)中维持CV1细胞，并用痘苗病毒Western Reserve(WR)株进行感染，并随后通过CaCl₂沉淀法用pSC11ssFmut8进行转染。通过3次冻融循环提取后代病毒，用0.25mg/ml胰蛋白酶(Worthington，Lakewood，New Jersey)和超声进行处理，接着在孵育在添加2×DMEM、0.05mg/ml中性红、80μM溴脱氧尿苷(BrdU)和400μM 5′-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GaI)的2％w/v低熔点琼脂糖(Invitrogen)中的HuTK-143B细胞上进行3轮空斑选择[19]。通过PCR和自动DNA测序来鉴定从空斑纯化的重组痘苗的身份和结构。

细胞毒性T淋巴细胞分析

为了充当在细胞的细胞毒性检测中的靶标，通过在1μM环孢霉素A存在下用来自B95-8 Epstein-Barr病毒(EBV)感染细胞系的上清液与用Ficoll梯度法(Amersham Biosciences，Mississauga，Canada)所分离的患者外周血单个核细胞(PBMC)一起孵育，获得源于每个研究对象的自体B淋巴母细胞样细胞系(BLCL)(Sandoz，Vienna，Austria)[21]。对于有限稀释分析(LDA)，患者PBMC的系列稀释物(500细胞/孔至7细胞/孔)被平行接种于含200,000放射性(3000rads)异源饲养细胞的孔中，并在添加10％FBS、1μg/ml植物凝集素(PHA)(Sigma)和80单位/ml重组白细胞介素-2(IL-2)(Hoffman-La Roche，Nutley，New Jersey；通过NIH AIDSResearch and Reference Reagents Program获得)的RPMI培养基中培养21天。自体BLCL用特定重组痘苗以MOI为10进行感染，细胞用⁵¹Cr-铬酸钠(Amersham Biosciences)进行标记并且在标准5小时孵育之后检测所培养效应物的细胞毒活性[22]。野生型痘苗WR和表达HCV-1a的氨基酸残基364-1618(E2、p7、NS2和NS3)的痘苗SC59 NNRd在这些试验中被用作对照。特异性裂解百分率被定义为100×(测试释放-自发释放)/(总释放-自发释放)，其显著性阈值被设置于负对照值之上2.67的标准偏差。应用在Walter JB，et al.(1997，Int Immunol 9：451-459)中描述的软件计算CTL前体频率和95％置信限。

肽结合分析

基于HCV-1a F蛋白质的序列(GenBank登记号M62321)使用Fmoc化学法合成源于F蛋白质的37种重叠肽(15个氨基酸残基中有10个残基重叠)和对应核心蛋白质序列的选择性N末端移码产物的另外5种15聚体肽[24]，并且将这些肽重溶解于溶于1×HBSS的25％w/v二甲基亚砜中。在添加3％w/v FBS的DMEM中，将所述肽稀释为30、100和200μg/ml终浓度，并且与100,000个去血清(3％FBS持续24小时)的T2细胞[25]在37℃和5％CO₂条件下一起孵育12小时。随后用荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的W6/32单克隆抗体(Sigma，Saint Louis，Missouri)对T2细胞进行MHC I类分子染色(在室温下30分钟)，并在具有基于前向和侧向散射(forward and side scatter)的活门控的FACSCalibur^TM流式细胞仪上(Becton-Dickinson ImmunocytometrySystems，La Jolla，California)进行分析。

实施例2：F蛋白质特异性体液免疫应答的分析

在假想的移码相关滑动样序列中引入5个同义核苷酸替换以促使HCV-1a F蛋白质在缺少核心基因产物的情形下表达(图1A)。这种重组蛋白质(图1B)和其缺少与核心共有的前11个氨基酸残基的截短形式(数据未显示)在大肠杆菌中进行表达并且通过镍螯合色谱法进行纯化。因为在F蛋白质在不同表达系统中表达时报导有很多翻译重编码事件发生[13、26、27]，应用MS确定Fmut8和Fmut8Δ11的氨基酸序列，其中对于Fmut8和Fmut8Δ11通过氨基酸计数获得的肽覆盖率分别为87.0％和68.2％(图1C和数据未显示)。在ELISA中使用纯化的Fmut8Δ11来测量在源于39名感染各种亚型HCV患者的血清中抗F蛋白质的反应活性，所述亚型包括HCV-1a(n＝20)、HCV-1b(n＝9)、HCV-3a(n＝7)、HCV-4a(n＝l)、HCV-4c(n＝l)和HCV-5a(n＝l)。在这些患者中，25名也共感染有HIV-1。所产生的抗Fmut8Δ11或者纯化核心蛋白质的兔抗血清(描述于Majeau N，et al.(2004)J.Gen.Virol.85：971-981)被用作阳性和阴性对照。ALT和AST在共感染患者中的水平明显高于只感染HCV患者的水平(分别为p＝0.0464和p＝0.00542，Student′s t检验)。在共感染对象中的血浆HCV载量也更大，但是该差异没有统计学显著性(p＝0.0778，Student′st检验)。

总之，来自39名HCV感染患者中23名患者(59.0％)的血清样本在稀释比为1∶400或更大时具有对Fmut8Δ11的阳性反应(图2)。这些患者中包括感染有HCV-1a的20名患者中的10名患者(50％)、感染有HCV-1b的9名患者中的7名患者(77.8％)、感染有HCV-3a的7名患者中的4名患者(57.1％)、感染有HCV-4a或4c的2名患者中的2名患者(100％)和感染有HCV-5a的1名患者中的0名患者(0.00％)。抗F蛋白质的体液应答只在HCV感染对象中被检测到(图2)。血浆HCV病毒载量、ALT和AST水平在可检测到对比未检测到抗F抗体应答的对象之间没有显著差异(分别为p＝0.137、0.112和0.105，Student′s t检验)。此外，在线性回归分析中，在抗F抗血清的效价与HCV病毒载量、ALT、或AST之间没有相关性(分别为r²＝0.124、0.134和0.125)。

此外，在共感染HCV和HIV-1的患者中检测到抗F蛋白质抗体应答(25名对象中的13名；52.0％)的患者比例与在只感染HCV的对象中所观测到的(14名对象中的10名；71.4％)没有显著差异(p＝0.317，Fisher′s精确检验)，并且与最近针对HCV感染对象的调查中所报导的结果是相似的[17]。F蛋白质的HCV亚型交叉反应性识别在共感染患者中也被观察到(图2)。当分析限于可检测抗F抗体应答的患者时，共感染患者(n＝13)的ELISA效价与在来自只感染HCV对象(n＝10)的血清中所测量的ELISA效价相比没有显著差异(p＝0.170，Mann-Whitney U检验)(图2)。在CD4计数范围为33细胞/mm³至1287细胞/mm³的共感染患者中检测到F蛋白质特异性抗体应答(图2C)。然而，在抗F抗体效价和CD4细胞计数之间没有显著的相关性(r²＝0.146)(图2B)，尽管在从本分析中排除CD4计数＜200细胞/mm³的对象时，相关系数得到改进(r²＝0.205)并接近统计学显著性。在抗F抗体效价和HIV-1病毒载量之间没有显著相关性(r²＝0.00172)。最后，在来自共感染患者的血清中观测到F蛋白质的交叉反应性HCV亚型识别(图2)。ELISA结果由Western印迹所证实。总之，这些数据指出共感染患者能够产生抗HCV F蛋白质的免疫球蛋白应答，并且这些应答在HCV亚型之间是可交叉反应的。

实施例3：F蛋白质特异性CTL活性的分析

T细胞微量培养物是源于从11名HCV感染患者(包括9名共感染HCV和HIV-1的对象)获得的外周血单个核细胞(PBMC)样本。产生痘苗-Fmut8重组病毒并用于⁵¹Cr-释放LDA以检测F蛋白质特异性CTL活性(表1；图3)。总之，在11名HCV感染对象中的9名对象中(81.8％)检测到CTL前体，其具有前体频率范围1/177至1/13372 T细胞。这些包括感染HCV-1a(n＝6)、HCV-2a(n＝1)和HCV-3a(n＝2)的患者，表明HCV亚型之间CTL表现出F蛋白质的交叉反应性识别。尽管有另外的报道用源于F蛋白质的肽在体外刺激T细胞来产生IFN-γ和IL-10[16]，我们的结果代表了有关在HCV感染对象中抗HCVF蛋白质的细胞介导细胞毒活性的首次直接证明。也在9名共感染有HIV-1患者中的7名患者(77.8％)中检测到CTL前体(平均CD4 T细胞计数：519细胞/μl；平均HIV病毒载量：3.46log RNA拷贝/ml，表1)。在8名对象的6名对象中(75％)也观测到识别其它HCV蛋白质(残基364-1618，即E2、p7、NS2、NS3，但不是核心或者F蛋白质)的CTL前体，其具有前体频率范围1/1608至1/12188，其与就F蛋白质所观测到的没有显著性差异(p＝0.529，Mann-Whitney U检验)。患者HTM319没有显示出抗任一所测试靶标的细胞毒活性，然而患者HTM325和PSL19具有对F蛋白质和p364-1618不一致的应答(表1；图3)。最后，在F蛋白质特异性CTL前体频率和患者CD4细胞计数、HIV-1或HCV病毒载量之间没有相关性。

实施例4：F蛋白质肽结合的分析

抗原性肽与I类主要组织相容性复合物(MHC)分子的相互作用是由宿主细胞毒T淋巴细胞(CTL)对它们识别的先决条件。由此实施T2结合分析，其中在TAP肽转运子缺陷型细胞系T2中，评价外源供应肽对拯救CMH-1分子HLA-A2的细胞表面表达的能力[25]。

应用T2肽结合分析法对相应于HCV-1a F蛋白质序列的42个重叠15聚体肽与HLA-A＊0201分子的相互作用进行检测[25]。具体地，基于HCV-1a ARFP的序列(GenBank登记号M62321)使用Fmoc化学法合成源于F蛋白质的37种重叠肽(15个氨基酸残基中有11个残基重叠)以及另外5种相应于核心蛋白质序列的选择性N末端移码产物的15聚体肽[24]，并依照实施例1中所述进行肽结合评价。HCV-1 NS3 1406-1415肽(KLVALGINAV[SEQ ID NO：13])用作阳性对照，其是一种已充分表征的HLA-A＊0201限制性T细胞表位[28]。经W6/32单克隆抗体对I类MHC染色的平均荧光强度被用作读出值。应用无肽对照设置阈值水平(在图4和5中的虚线)。

尽管个体的源于F蛋白质的肽促进HLA-A＊0201在细胞表面表达的功效有相当大的变化，但是有6种15聚体在初步筛选试验中作为高度结合物被突出地显示出(F29-43、F33-47、F37-51、F61-75、F65-79和F101-115)(200μg/ml，图4)。 其中，只有肽F29-43(VRSLVEFTCCRAGAL[SEQ ID NO：14])、 F37-51(CCRAGALDWVCARRE[SEQ ID NO：21])和 F101-115(PVALGLAGAPQTPGV[SEQ ID NO：29])明显地介导I类MHC在T2细胞表面表达的剂量依赖性增加(图5A)。对于从肽F29-43、F37-51和F101-115获得的荧光峰值分别达到了从NS3 1406-1415所获得水平的87.6％、79.2％和83.2％(图5A)。

在本文中对肽F29-43内的进一步表位(VRSLVEFTCCRAGAL[SEQID NO：14；SEQ ID NO：15下划线])进行了分析，并且确定了将T2细胞与肽F31-40(SLVEFTCCRA；SEQ ID NO：15)接触明显地导致I类MHC在细胞表面表达中的剂量依赖性增加(图5B)。这有力地支持了能够在感染HCV-1a的HLA-A＊0201对象中通过CTL来识别F31-40的这一事实。使用BIMAS网络工具(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)[34])对该肽的分析表明它是一种预测的HLA-A＊0201限制性表位，预测MHC-肽解离时间20.4秒(表2)。

对肽F101-115内的进一步表位(PVALGLAGAPQTPGV)[SEQ IDNO：29；SEQ ID NO：30下划线)的分析表明该肽(F103-112)不能拯救HLA-A2在T2细胞表面的表达(图5C)。对该肽的BIMAS分析表明它是一种推测的HLA-A＊0201限制性表位，其推测MHC-肽解离时间为7.45秒(表2)。

对位于F37-51和F101-115内的进一步表位进行分析，这包括CRAGALDWV(F38-46；SEQ ID NO：22)、CCRAGALDWV(F37-46；SEQID NO：23)、GLAGAPQTP(F105-113；SEQ ID NO：31)、AGAPQTPGV(F107-115；SEQ ID NO：32)和LAGAPQTPGV(F106-115；SEQ ID NO：33)。这些当中，F107-115显示出剂量依赖性拯救A2在T2细胞表面表达的能力(在肽浓度为200μg/ml时，观测到显著的A2表达)(表2；图5C)。应用SYFPEITHI算法(http://www.syfpeithi.de)[35]对这些肽(F38-46；F37-46；F105-113；F107-115和F106-115)的分析表明这些是潜在的HLA-A＊0201限制性表位(表2)。

因此，在本文中列举的数据表明分别在F29-43和F101-115内发现的F31-40和F107-115代表最小的A2限制性CTL表位。

在我们的研究组中，SLVEFTCCRA(F31-40；SEQ ID NO：15)只在单个肽(即F29-43)中被代表。它位于在HCV亚型之间最保守的ARFP区(表3)，这表明它们能呈现抗原交叉反应性。此外，HLA-A＊0201锚定残基(P2和P9)在所有检测的HCV基因型中是完全保守的(表3)。肽F37-51同样是高度保守的，其在15个氨基酸中有9个氨基酸(60％)在所有亚型中是完全一致的(表11)。相比之下，AGAPQTPGV(SEQ ID NO：32)残基位于在各基因型之间高度可变的ARFP部分内，并且这种可变性也延及到锚定残基。这表明AGAPQTPGV(SEQ ID NO：32)可能是HCV-1亚型特异性的并且也许它在感染其它HCV株的对象中不能被同样的识别。

使用SYFPEITHI算法也提示位于肽F33-47和F37-51之中的潜在HLA-A＊0201限制性表位(CRAGALDWV[SEQ ID NO：22])。与F37-51相比，关于F33-47缺乏明显的剂量效应可能是由于T2细胞的差异性肽加工造成的。

总之，几种源于HCV-1a ARFP的肽序列在细胞培养中能够结合HLA-A＊0201并且因此对应于新的、HLA-A＊0201限制性CTL表位。这些表位不同于先前所报道的有关HCV-1b的表位[16]，其具有SLVEFTCCRA(F31-40；SEQ ID NO：15)和F37-51，它们位于对应由该组所用99氨基酸合成肽的序列的上游[16；36]。

表1.在HCV感染患者中抗F蛋白的细胞毒活性

对象	年龄	性别	HIV	CD4计数(细胞/μl)	HIV载量(log拷贝/ml)	HCV载量(logIU/ml)	HCV基因型	ALT(U/ml)	AST(U/ml)	CTLpFmut8(l/x)	95％置信区间(l/x)	CTLpNNRd(l/x)	95％置信区间(l/x)
														HND 013	40.0	M	+	480	4.46	7.39	3a	306	135	3671	1523-8848	9311	2395-37298
HND 025	43.9	M	+	580	5.39	6.69	3a	60	53	9702	4027-23372	12188	4559-32587
														HTM 316	45.3	M	+	771	4.08	6.39	1a	76	60	7697	3846-15404	6122	3291-11389
HTM 319	43.7	M	+	364	2.00	7.33	1a	223	158	nd	nd	nd	nd
														HTM 322	47.0	M	+	344	＜1.70	7.26	2a	45	43	13772	5565-32131	6612	3300-13246
HTM 325	44.9	M	+	604	1.72	6.55	3a	127	137	nd	nd	3667	2306-5833
														PSL 019	43.9	M	+	370	4.79	7.28	1a	22	37	8278	4127-16604	nd	nd
TVC13	20.1	F	+	598	4.69	7.37	1a	65	66	238	132-430	nt	nt
														TVC25	31.9	F	+	561	2.35	6.82	1a	18	24	221	124-392	nt	nt
TVC29	24.2	F	-	nt	nt	4.61	1a	47	20	177	84-369	nt	nt
														TVC57	23.4	F	-	nt	nt	6.56	1a	30	25	1422	894-2260	1608	983-2631

根据下面材料和方法中的描述获得CTL前体频率和95％置信区间。nd：未检测到。nt：未测试。

表2.ARFP肽结合分析的总结

肽	SEQIDNO：	氨基酸序列	A2结合1	Bimas2t1/2	SYFPEITHI3评分
						NS3  1406	13	KLVALGINAV	+	559.894	27
F29-43	14	VRSLVE FTCCRAGAL	+	na	na
						F31-40	15	SLVEFTCCRA	+	20.369	18
F37-51	21	CCRAGALDWVCARRE	+	na	na
						F38-46	22	CRAGALDWV	-	0.060	18
F37-46	23	CCRAGALDWV	-	0.608	14
						F101-115	29	PVALGLAGAPQTPGV	+	na	na
F103-112	30	ALGLAGAPQT	-	7.452	17
						F105-113	31	GLAGAPQTP	-	0.015	17
F107-115	32	AGAPQTPGV	+	0.454	20
						F106-115	33	LAGAPQTPGV	-	1.642	18

¹导致T2细胞表面上HLA-A2表达水平以剂量依赖性增加的肽处理(T2肽结合分析)

²见参考文献34；http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/。

³见参考文献35；http://www.syfpeithi.de。

表3.在HCV亚型之间定位于F蛋白质肽F29-43、F37-51和

F101-115的潜在HLA-A*0201限制性表位的保守性

HCV亚型	F29-43	F37-51	F101-115
				1a  [M62321]	SLVEFTCCRA(SEQ ID NO：15)	CRAGALDWV(SEQ ID NO：22)	ALGLAGAPQT(SEQID NO：30)
2a  [D00944]	SLAEYTCCRA(SEQ ID NO：16)	CRAGAPGWV(SEQ ID NO：24)	VPVPLGAPMT(SEQ ID NO：34)
				3a  [D17763]	SLVEYTCCRA(SEQ ID NO：17)	CRAGAHDWV(SEQID NO：25)	APVHPGAQMT(SEQ ID NO：35)
4a  [Y11604]	SLAEFTCCRA(SEQ ID NO：18)	CRAGAPDWV(SEQ ID NO：26)	ALDRLGAQMI(SEQID NO：36)
				5a  [Y13184]	SLVEFTCCRA(SEQ ID NO：19)	CRAGALNWV(SEQID NO：27)	ALGLIGAPMT(SEQID NO：37)
6a  [Y12083]	SLAEFTCCRA(SEQ ID NO：20)	CRARAPGWV(SEQID NO：28)	APGHTGAPMT(SEQ ID NO：38)

括号内显示GenBank登记号。保守的HLA-A*0201锚定残基用粗体表示。

实施例4：在小鼠中诱导ARFP特异性免疫应答

实施一系列试验以证明重组ARFP(即在大肠杆菌产生并通过镍螯合色谱法和制备电泳所纯化的Fmut8Δ11形式)是否能够在小鼠中诱导明显的和特异的免疫应答。在第一组试验中，依照以下所述来检验对ARFP特异性体液(即抗体)免疫应答的诱导

ARFP特异性体液免疫应答

方案1.在第0天(day 0)，15只5周龄雌性C57B1/6小鼠经皮下(背部)注射用50μl弗氏不完全佐剂乳化的10μg(50μl)纯化的Fmut8Δ11蛋白质(总共100μl)。给10只5周龄雌性C57B1/6小鼠注射100μl磷酸盐缓冲液并用作对照。在第13天(day 13)重复相同的免疫步骤，并在第35天(day 35)再重复一次。在每次免疫之前(第0、13、35天)通过下颚放血获得200μl血液。在第53天(day 53)通过CO₂窒息处死小鼠并通过心脏穿刺放血。所有的血液样本被离心并收集血清，在使用之前将其冷冻在-80℃。除了用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠多价免疫球蛋白(G、A、M)(A-0162，Sigma，St.Louis，MO)代替碱性磷酸酶偶联的单克隆抗人IgG(A-2064，Sigma)之外，根据实施例1中所述用酶联免疫吸附分析(ELISA)来检测总免疫球蛋白(Ig)反应(IgA、IgM和IgG)。用50mM碳酸氢钠、1mM氯化镁和1mg/ml磷酸对硝基苯酯显示抗ARFP抗体的结合。在410nm处测量光密度(表4)。ELISA对照包括：a)无抗原、无小鼠抗血清、无第二抗体；b)无抗原、小鼠抗血清、第二抗体；c)ARFP、小鼠抗血清、无第二抗体；d)ARFP、无小鼠抗血清、第二抗体；e)ARFP、抗ARFP兔抗血清[在本文所述研究中用Fmut8Δ11作为免疫原制备]、抗兔第二抗体(阳性对照)；和f)ARFP、小鼠抗血清、抗人第二抗体(表6)。将ELISA阈值设置为在具有最高读出值(表6中突出显示部分)的阴性对照中所测量到的OD₄₁₀的3倍值。结果被表示为显示出大于阈值的OD₄₁₀值的最低倒数血清稀释度的平均值+/-标准偏差。结果表明抗ARFP Ig效价在第35天达到1400+/-419.5，在第53天达到1547+/-199.6(表4，图6A)。抗ARFP效价在所有对照小鼠中一律是负值的(表5，图6A)。在第35天，用重组ARFP免疫的15只小鼠中的12只(80％)的抗ARFP Ig效价已经达到＞1600，并且在第53天时该比例达到93.3％(15只小鼠中的14只)(表4，图6C)。

方案2.在第0天，15只5周龄雌性C57B1/6小鼠经皮下(背部)注射用50μl弗氏不完全佐剂乳化的10μg(50μl)纯化Fmut8Δ11蛋白质(总共100μl)。给14只5周龄雌性C57B1/6小鼠注射100μl磷酸盐缓冲液并用作对照。在第14天重复相同的免疫步骤，以及在第29天(day29)再重复一次。在每次免疫之前(第0、14、29天)通过下颚放血获得200μl血液。在第52天通过CO₂窒息处死小鼠并通过心脏穿刺放血。血清的分离以及ELISA依照上述实施。ELISA对照包括：a)ARFP、小鼠抗血清、无第二抗体；b)ARFP、无小鼠抗血清、第二抗体；c)ARFP、抗ARFP兔抗血清[在本文所述研究中用Fmut8Δ11作为免疫原制备]、抗兔第二抗体(阳性对照)；以及d)ARFP、小鼠抗血清、抗人第二抗体(表9)。将ELISA阈值设置为在具有最高读出值(表9中突出显示部分)的阴性对照中所测量OD₄₁₀的3倍值。依上所述确定检测阈和抗ARFP Ig效价。结果显示抗ARFP Ig效价在第29天达到883.3+/-694.7，在第52天达到1493+/-272.0(表7，图6B)。如前所述，抗ARFP效价在所有对照小鼠中一律为负值(表8，图6B)。在第29天，用重组ARFP免疫的15只小鼠中的7只(46.7％)的抗ARFP Ig效价已经达到＞1600，并且在第52天该比例达到86.7％(15只小鼠中的13只)(表7，图6C)。

在方案1和2中的抗体应答动力学是相似的，但是不重叠，因为在第二次免疫之前所测量的ARFP特异性Ig效价在方案2中(190.0+/-401.7)要高于方案1中(10.00+/-27.08)。然而，这种差异没有统计学显著性(p＝0.116，Student′s t检验)。相似地，在第二次免疫之前已经达到可检测的抗ARFP Ig效价的动物的比例在方案1和2之间没有显著差异(p＝0.215，Fisher′s精确检验)(表4和7)。最后，当获得ARFP特异性Ig效价＞1600在Kaplan-Meier分析中被用作免疫的基本结果时(图1C)，方案1和2在功效方面没有显著性差异(p＝0.892，时序检验)。由此，在方案1和2中所获得结果之间是完全一致的。总的来说，这两个方案的结果表明在C57B1/6小鼠中应用ARFP(Fmut8Δ11)免疫导致产生高水平的ARFP特异性Ig应答。例如，可以通过由以规定2周间隔应用10μg纯化ARFP(Fmut8Δ11)进行3次皮下免疫所组成的方案来实现这样的免疫。

表4.方案1：ARFP免疫，ELISA结果

第1次免疫(第0天)
																稀释度	小鼠
31	32	33	34	35	36	37	38	3 9	40	41	42	43	44	45
															1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.1660.1150.1230.1320.1190.138	0.2360.1610.1500.1640.1380.122	0.2430.1610.1280.1140.1130.109	0.2470.1450.1360.1180.1180.110	0.2080.1340.1140.1160.1150.109	0.2060.1320.1110.1210.1170.116	0.2050.1420.1210.1330.1280.124	0.2170.1270.1130.1150.1150.108	0.2110.1280.1130.1040.1080.106	0.2090.1150.1040.1100.1030.107	0.1990.1740.1170.1200.1050.105	0.2180.2080.1360.1280.1230.119	0.3230.1860.1640.1910.1340.129	0.2780.1710.1440.1380.1370.127	0.2290.1520.1400.1260.1140.114
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0
第2次免疫(第13天)
																稀释度	小鼠
31	32	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45
															1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.7320.3060.1650.1470.1240.120	0.2720.1170.1130.1100.1060.118	0.7500.1970.1660.1540.1370.119	0.2930.1570.1270.1210.1230.118	0.2310.1380.1600.1170.1250.120	0.9650.8900.8150.6770.4540.590	0.1370.1130.1080.1100.1050.104	0.9160.7420.4410.3280.2190.171	0.1320.1120.1070.1070.0990.105	0.130.1160.1110.1050.1060.108	0.1860.1050.1070.1150.1060.103	0.0490.0450.1020.1010.0970.096	0.0460.0530.7980.2790.2730.223	0.0480.0480.1160.1030.1060.110	0.0450.0460.1230.1200.1060.110
效价	0	0	0	0	0	100	0	50	0	0	0	0	0	0		0
第3次免疫(第35天)
																稀释度	小鼠
31	32	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45
															1/501/1001/2001/4001/800		3.6523.6423.6163.5693.434	3.5512.6832.0461.6811.072	3.1423.7003.6303.2963.166	3.6232.8412.0881.5220.937	3.5093.5633.5563.4653.213	3.3343.6253.5963.5903.438	3.5303.3062.4361.8591.297	3.887＞4.0003.9573.7993.425	3.4643.8083.5413.5823.053	3.796＞4.000＞4.0003.8962.776	1.6281.0933.4943.2382.442	1.4671.9412.6572.3972.015	2.1402.4871.7221.9291.185	2.3361.2640.9930.7250.508	2.4532.0581.7721.6071.517

1/1600	3.521	0.641	3.190	0.590	3.181	3.455	690.931	3.139	2.783	1.989	1.713	1.578	0.957	0.408	1.453
																效价	＞1600	800	＞1600	800	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	200	＞1600
																处死(第53天)
稀释度	小鼠
																31	32	33	34	35	36	37	38	39	4 0	4 1	42	43	44	45
	1/501/1001/2001/4001/8001/1600	2.0232.0282.2022.3762.4902.209	2.0081.5422.6022.5471.5741.970	1.6581.8301.8761.8891.8742.157	1.0541.6461.8371.9131.8141.987	1.7091.8391.8051.7761.6171.674	1.4111.8292.0912.2252.1172.269	1.3141.4831.9481.9251.6711.574	1.7362.1392.1682.3561.6641.671	2.2241.9042.4222.4562.1961.659	1.7411.7141.5401.2660.9280.648	1.0061.8721.7731.7831.8251.749	1.4241.7901.6581.9072.0592.062	1.6131.9121.7241.3121.4781.233	1.4341.4891.4711.2231.1361.157																1.3731.8802.0061.9192.1971.672
效价																＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	800	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600

表5.方案1：伪免疫(PBS)，ELISA结果

第1次免疫(第0天)
											稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.1350.1520.1160.1110.1060.129	0.1660.1190.1120.1070.1110.115	0.1960.1340.1210.1410.1160.109	0.1690.1280.1150.1270.1230.115	0.2070.1240.1120.1080.1040.102	0.1870.1160.1080.1040.1050.102	0.2070.1460.1080.1130.1110.105	0.1420.1930.1270.0920.0840.068	0.1310.1160.1030.1020.1070.106	0.2200.1050.1000.1000.0990.096
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0
第2次免疫(第13天)
											稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.0500.0470.1220.1080.1090.109	0.0560.0460.1140.1160.1140.110	0.0480.4800.1250.1370.1390.117	0.0560.0460.1210.1180.1110.105	0.0500.0480.1170.1090.1060.104	0.0500.0480.1150.1050.1070.109	0.0480.0540.1210.1130.1080.104	0.0500.0480.1160.1080.1050.109	0.2690.1330.1170.1080.0940.115	0.3740.1850.1840.1440.1350.119
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0
第3次免疫(第35天)
											稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.2240.1400.1170.1250.1160.113	0.2380.1390.1260.1660.1170.118	0.1830.1290.1040.1020.1020.098	0.2050.1410.1120.0980.1020.111	0.2660.1530.1400.1130.0990.104	0.2570.1630.1480.1180.1000.069	0.6640.2910.2120.1540.1290.046	0.1540.1130.1060.0890.0900.116	0.2020.1640.1340.1200.1130.139	0.1970.1510.1110.1160.1020.102
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0
处死(第53天)
											稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.2330.1440.1280.1260.1220.119	0.1690.1260.1100.1020.1030.105	0.1830.1320.1170.1030.1030.106	0.2660.1740.1340.1170.1110.109	0.4090.2540.1960.1530.1340.120	0.2240.1570.1310.1190.1130.109	0.2380.1990.1800.1240.1140.102	0.1930.1600.1350.1290.1250.117	0.2120.2090.1860.1160.1130.095	0.220.140.130.110.110.11
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0

表6.方案1：ELISA对照

稀释度		对照1	对照2	对照3	对照4	对照5	对照6
								Ag	0	0	ARFP	ARFP	ARFP	ARFP
	Ab1	0	血清[N°31，TP4]	血清[N° 31，TP4]	0	抗ARFP兔多克隆	血清[N° 31，TP4]
								Ab2	0	AP偶联的山羊抗小鼠Ig[G，A，M]	0	AP偶联的山羊抗小鼠Ig[G，A，M]	AP偶联的山羊抗兔IgG	AP偶联的小鼠抗人IgG
	1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.1310.1250.1090.1020.1130.108	0.290＊0.1250.1470.1280.1310.131	0.1360.1250.1210.1160.1100.117	0.1940.1270.1060.1100.1090.109	1.7591.3331.4941.4101.1271.974								0.1570.1180.1040.1130.1020.144
效价									0	0	0	0	＞1600	0

*用于确定检测阈的OD410值

表7.方案2：ARFP免疫，ELISA结果

第1次免疫(第0天)
																稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	21	22	23	24	25
															1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.1660.1150.1230.1320.1190.138	0.2360.1610.1500.1640.1380.122	0.2430.1610.1280.1140.1130.109	0.2470.1450.1360.1180.1180.110	0.2080.1340.1140.1160.1150.109	0.2060.1320.1110.1210.1170.116	0.2050.1420.1210.1330.1280.124	0.2170.1270.1130.1150.1150.108	0.2110.1280.1130.1040.1080.106	0.2090.1150.1040.1100.1030.107	0.1990.1740.1170.1200.1050.105	0.2180.2080.1360.1280.1230.119	0.3230.1860.1640.1910.1340.129	0.2780.1710.1440.1380.1370.127	0.220.150.140.120.110.11
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0
第2次免疫(第14天)
																稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	21	22	23	24	25
															1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.3700.1870.1680.1730.1560.137	0.6250.3060.1830.1520.1300.126	0.3030.1550.1280.1360.1230.118	0.3390.1640.1260.1290.1210.122	0.4210.1560.1330.1220.1210.119	3.8521.8421.3370.7770.5390.546	0.5520.2040.1490.1330.1250.125	0.2700.1530.1240.1230.1240.146	2.7580.5600.2950.2040.1730.154	0.5050.1910.1440.1310.1220.115	＞4.0003.3232.2011.2120.6220.337	0.1890.1410.1120.1110.1130.113	3.5673.1843.2271.4330.7900.462	＞4.000＞4.000＞4.0002.4732.1991.296	＞4.01.871.830.730.0.
效价	0	0	0	0	0	200	0	0	50	0	400	0	400	＞1600		20
第3次免疫(第29天)
																稀释度	小鼠
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	21	22	23	24	25
															1/501/1001/2001/4001/800		3.8313.5252.3871.9101.316	3.8493.8983.3592.6461.965	3.3732.8981.3641.0190.647	3.5731.2641.0130.8300.556	2.9870.9820.6840.4730.366	2.8741.4680.9060.4930.536	2.6261.1970.6570.3970.266	3.4702.6133.1893.6663.106	3.5171.6481.5181.3151.194	1.2250.5600.3030.2910.218	3.635＞4.0003.9243.086＞4.000	0.8010.3040.2400.1740.188	3.9363.9593.9363.8743.874	3.9263.9783.8533.7653.903	＞4＞4＞4＞43.

1/1600	0.770	1.960	0.558	0.428	0.284	0.513	0.298	3.423	1.055	0.187	3.573	0.266	3.907	3.939	3.21
																效价	800	＞1600	400	400	100	200	100	＞1600	＞1600	50	＞1600	0	＞1600	＞1600	＞160
																处死(第52天)
稀释度	小鼠
																1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	21	22	23	24	25
	1/501/1001/2001/4001/8001/1600	3.5933.0711.9021.1871.1101.589	3.6233.5811.7441.5261.3411.086	2.9312.5551.4310.9870.8181.084	3.9343.4592.4181.2571.0930.771	3.865＞4.0002.6462.3782.2361.427	＞4.000＞4.000＞4.000＞4.000＞4.000＞4.000	3.7963.8733.8073.8023.8673.813	3.8433.8483.8183.8913.8333.843	3.4563.6223.6413.7423.6653.612	3.8553.9663.1843.8853.1713.055	3.7171.5243.7403.6603.7173.832	3.5342.1931.0471.0010.8560.510	3.6363.5182.8443.5483.4063.562	3.7802.6282.8293.1513.7073.780																3.783.953.143.753.623.97
效价																＞1600	＞1600	＞1600	800	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	＞1600	800	＞1600	＞1600	＞160

表8.方案2：伪免疫(PBS)，ELISA结果

第1次免疫(第0天)
															稀释度	小鼠
11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	26	27	28	30
														1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.2830.1620.1320.1280.1160.116	0.2470.1300.1200.1190.1190.121	0.6800.3100.2110.1730.1680.153	0.1580.1280.1260.1210.1160.122	0.1440.1150.1050.1110.1070.109	0.1640.1160.1070.1070.1120.110	0.1410.1140.1020.1090.1060.107	0.1600.1170.1050.1130.1060.107	0.1870.1280.1220.1140.1100.109	0.2970.2130.1970.1610.1640.131	0.4410.2580.1880.1510.1340.127	0.3200.1840.1390.1310.1280.118	0.3250.1970.1610.1360.1340.122	0.3530.2270.1460.1350.1230.121
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0
第2次免疫(第14天)
															稀释度	小鼠
11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	26	27	28	30

1/501/1001/2001/4001/8001/1600	0.1080.1540.1350.1160.1140.113	0.4420.3020.2150.1700.1600.150	0.2880.1770.1510.1430.1690.142	0.2120.1710.1780.1510.1500.143	0.2290.1620.1460.1440.1180.116	0.2490.1740.1300.1210.1300.123	0.6700.4870.3210.2480.1840.159	0.2280.1620.1360.1270.1260.122	0.2300.1800.1440.1420.1300.129	0.2450.1680.1380.1210.1360.118	0.2810.1930.1460.1330.1330.126	0.2160.1460.1130.1150.1130.112	0.2610.1790.1460.1330.1220.114	ndndndndndnd
															效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	nd
															第3次免疫(第29天)
稀释度	小鼠
															11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	26	27	28	30
	1/501/1001/2001/4001/8001/1600	0.3070.1900.1530.1280.1270.123	0.2460.1480.1270.1140.1140.117	0.3380.1610.1260.1210.1260.13	0.2460.1560.1430.1260.1230.124	0.2530.1600.1230.1130.1300.122	0.3270.3250.1960.1510.1290.116	0.7540.2690.1910.1380.1190.112	0.3560.2170.1660.1340.1260.119	0.4440.2700.1840.5400.1390.119	0.5100.1810.1540.1330.1300.141	0.4160.1780.1540.1440.1440.137	0.3240.1750.1400.1300.1240.129	0.3540.2040.1670.1430.1280.128															0.3810.2240.1570.1320.1260.129
效价															0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
处死(第52天)
															稀释度	小鼠
11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	26	27	28	30
														1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.3500.1730.1330.1490.1180.117	0.5160.2080.1700.1460.1250.120	0.4740.2380.1720.1330.1230.113	0.2880.2240.1560.1630.1590.145	0.3760.2150.1510.1770.1340.136	0.2310.1940.1490.1340.1070.123	0.5000.2860.1850.1420.1250.125	0.2790.1610.1350.1200.1140.134	0.3130.1750.1430.1350.1200.126	0.2470.1820.1460.1410.1270.127	0.2030.1460.1230.1200.1140.118	0.2010.1550.1360.1200.1150.116	0.1650.1410.1170.1190.1070.123	0.2260.1480.1280.1190.1130.119
效价	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0		0

表9.方案2：ELISA对照

稀释度		对照3	对照4	对照5	对照6
						Ag	ARFP	ARFP	ARFP	ARFP
	Ab1	血清[N° 30，TP3]	0	抗ARFP兔多克隆	血清[N° 30，TP3]
						Ab2	0	AP偶联的山羊抗小鼠Ig[G，A，M]	AP偶联的山羊抗兔IgG	AP偶联的小鼠抗人IgG
	1/501/1001/2001/4001/8001/1600		0.268＊0.1550.1350.1230.1220.135	0.1310.1290.1080.1110.1120.111	3.9263.9183.9163.7483.7333.017						0.1740.1580.1560.1550.1490.181
效价							0	0	＞1600	0

*用于确定检测阈的OD410值

表10 SEQ ID NO与本文所述序列的对应关系

SEQIDNO：	序列	说明
			1	GCC AGC CCC CTGATG G	引物
2	GCC TCG TAC ACAATA CTC G	引物
			3	GAC CGT CGA CCATGA GCA CGA ATCCTA AAC CTC AGAGGA AGA CCC CAAACG TAA	引物
4	AAG GGT ACC CGGGCT GAG CCC AGGTCC TGC CCT CGG G	引物
			5	TCA AGT CGA CCCAAA CGT AAC ACCAAC CG	引物
6	GGA AAC AGC TATGAC CAT GAT TACGCC AAG C	引物
			7	见下	编码源于登记号M62321的F蛋白质的DNA
8	见下	源于登记号M62321的F蛋白质多肽
			9	见下	Δ11截短型F蛋白质多肽；SEQ ID NO：8的截短形式
10	见下	编码本文所述研究中鉴定的Fmut8蛋白质的DNA
			11	见图1和以下	本文所述研究中鉴定的Fmut8蛋白质多肽；由SEQ ID NO：10所编码
12	见下	本文所述研究中鉴定的Fmut8Δ11多肽；SEQ ID NO：11的截短形式
			13	KLVALGINAV	HCV-1 NS3 1406-1415肽
14	VRSLVEFTCCRAGAL	F蛋白质肽F29-43
			15	SLVEFTCCRA	F蛋白质肽F31-40；位于HCV亚型1a[M62321]*的F蛋白质肽F29-43内的表位(见表3)
16	SLAEYTCCRA	位于HCV亚型2a[D00944]*

		的F蛋白质肽F29-43内的表位(见表3)
			17	SLVEYTCCRA	位于HCV亚型3a[D17763]*的F蛋白质肽F29-43内的表位(见表3)
18	SLAEFTCCRA	位于HCV亚型4a[Y11604]*的F蛋白质肽F29-43内的表位(见表3)
			19	SLVEFTCCRA	位于HCV亚型5a[Y13184]*的F蛋白质肽F29-43内的表位(见表3)
20	SLAEFTCCRA	位于HCV亚型6a[Y12083]*的F蛋白质肽F29-43内的表位(见表3)
			21	CCRAGALDWVCARRE	F蛋白质肽F37-51
22	CRAGALDWV	F蛋白质肽F38-46；位于HCV亚型1a[M62321]*的F蛋白质肽F37-51内的表位(见表3)
			23	CCRAGALDWV	F蛋白质肽F37-46
24	CRAGAPGWV	位于HCV亚型2a[D00944]*的F蛋白质肽F37-51内的表位(见表3)
			25	CRAGAHDWV	位于HCV亚型3a[D17763]*的F蛋白质肽F37-51内的表位(见表3)
26	CRAGAPDWV	位于HCV亚型4a[Y11604]*的F蛋白质肽F37-51内的表位(见表3)
			27	CRAGALNWV	位于HCV亚型5a[Y13184]*的F蛋白质肽F37-51内的表位(见表3)
28	CRARAPGWV	位于HCV亚型6a[Y12083]*的F蛋白质肽F37-51内的表位(见表3)
			29	PVALGLAGAPQTPGV	F蚕白质肽F101-115
30	ALGLAGAPQT	F蛋白质肽F103-112；位于HCV亚型1a[M62321]*的F蛋白质肽F101-115内的表位(见表3)
			31	GLAGAPQTP	蛋白质肽F105-113
32	AGAPQTPGV	F蛋白质肽F107-115
			33	LAGAPQTPGV	F蛋白质肽F106-115
34	VPVPLGAPMT	位于HCV亚型2a[D00944]*的F蛋白质肽F101-115内的表位(见表3)
			35	APVHPGAQMT	定位于HCV亚型3a[D17763]*的F蛋白质肽F101-115内的表位(见表3)

36	ALDRLGAQMI	位于HCV亚型4a[Y11604]*的F蛋白质肽F101-115内的表位(见表3)
			37	ALGLIGAPMT	位于HCV亚型5a[Y13184]*的F蛋白质肽F101-115内的表位(见表3)
38	APGHTGAPMT	位于HCV亚型6a[Y12083]*的F蛋白质肽F101-115内的表位(见表3)
			39	MSTNPKPQRK	质谱分析的肽(见图1C)
40	VAVRSLVEFTCCR	质谱分析的肽(见图1C)
			41	AGALDWVCAR	质谱分析的肽(见图1C)
42	RGRLPSGRNLEVDVSLSPR	质谱分析的肽(见图1C)
			43	GRLPSGRNLE	质谱分析的肽(见图1C)
44	VDVSLSPRHVGPR	质谱分析的肽(见图1C)
			45	AGPGLSPGTLGPSMAMR	质谱分析的肽(见图1C)
46	DGSCLPVALGLVGAPQTPGVGR	质谱分析的肽(见图1C)
			47	AIWVRSSIPSR	质谱分析的肽(见图1C)
48	AASPTSWGTYR	质谱分析的肽(见图1C)
			49	AASPTSWGTYRSSAPPLEALPGPWR	质谱分析的肽(见图1C)
50	MASGFWR	质谱分析的肽(见图1C)
			51	VRSLVEFTCCRA	F蛋白质肽F29-40；HCV亚型1a[M62321]*
52	VRSLVEFTCCRAGALDWVCARRE	F蛋白质肽F29-51；HCV亚型1a[M62321]*
			53	SLVEFTCCRAGAL	F蛋白质肽F31-43；HCV亚型1a[M62321]*
54	SLVEFTCCRAGALDWVCARRE	F蛋白质肽F31-51；HCV亚型1a[M62321]*
			55	ARSLAEYTCCRA	F蛋白质肽F29-40；HCV亚型2a[D00944]*
56	ARSLAEYTCCRAGAP	F蛋白质肽F29-43；HCV亚型2a[D00944]*
			57	ARSLAEYTCCRAGAPGWVCARQG	F蛋白质肽F29-51；HCV亚型2a[D00944]*
58	SLAEYTCCRAGAP	F蛋白质肽F31-43；HCV亚型2a[D00944]*

59	SLAEYTCCRAGAPGWVCARQG	F蛋白质肽F31-51；HCV亚型2a[D00944]*
			60	CCRAGAPGWVCARQG	F蛋白质肽F37-51；HCV亚型2a[D00944]*
61	PVALGLAGAPQTPGV	F蛋白质肽F101-115；HCV亚型2a[D00944]*
			62	AGAPQTPGV	F蛋白质肽F107-115；HCV亚型2a[D00944]*
63	DRSLVEYTCCRA	F蛋白质肽F29-40；HCV亚型3a[D17763]*
			64	DRSLVEYTCCRAGAH	F蛋白质肽F29-43；HCV亚型3a[D17763]*
65	DRSLVEYTCCRAGAHDWVCARRV	F蛋白质肽F29-51；HCV亚型3a[D17763]*
			66	SLVEYTCCRAGAH	F蛋白质肽F31-43；HCV亚型3a[D17763]*
67	SLVEYTCCRAGAHDWVCARRV	F蛋白质肽F31-51；HCV亚型3a[D17763]*
			68	CCRAGAHDWVCARRV	F蛋白质肽F37-51；HCV亚型3a[D11763]*
69	HAAPVHPGAQMTPGG	F蛋白质肽F101-115；HCV亚型3a[D17763]*
			70	PGAQMTPGG	F蛋白质肽F107-115；HCV亚型3a[D11763]*
71	ARSLAEFTCCRA	F蛋白质肽F29-40；HCV亚型4a[Y11604]*
			72	ARSLAEFTCCRAGAP	F蛋白质肽F29-43；HCV亚型4a[Y11604]*
73	ARSLAEFTCCRAGAPDWVSARLG	F蛋白质肽F29-51；HCV亚型4a[Y11604]*
			74	SLAEFTCCRAGAP	F蛋白质肽F31-43；HCV亚型4a[Y11604]*
75	SLAEFTCCRAGAPDWVSARLG	F蛋白质肽F31-51；HCV亚型4a[Y11604]*
			76	CCRAGAPDWVSARLG	F蛋白质肽F37-51；HCV亚型4a[Y11604]*
77	PVALDRLGAQMIPAG	F蛋白质肽F101-115；HCV亚型4a[Y11604]*
			78	LGAQMIPAG	F蛋白质肽F107-115；HCV亚型4a[Y11604]*
79	VRSLVEFTCCRA	F蛋白质肽F29-40；HCV亚型5a[Y13184]*
			80	VRSLVEFTCCRAGAL	F蛋白质肽F29-43；HCV亚型5a[Y13184]*
81	VRSLVEFTCCRAGALNWVSARLG	F蛋白质肽F29-51；HCV亚型5a[Y13184]*
			82	SLVEFTCCRAGAL	F蛋白质肽F31-43；HCV亚型5a[Y13184]*
83	SLVEFTCCRAGALNWVSARL	F蛋白质肽F31-51；HCV亚型5a

	G	[Y13184]*
			84	CCRAGALNWVSARLG	F蛋白质肽F37-51；HCV亚型5a[Y13184]*
85	PEALGLIGAPMTPGG	F蛋白质肽F101-115；HCV亚型5a[Y13184]*
			86	IGAPMTPGG	F蛋白质肽F107-115；HCV亚型5a[Y13184]*
87	VRSLAEFTCCRA	F蛋白质肽F29-40；HCV亚型6a[Y12083]*
			88	VRSLAEFTCCRARAP	F蛋白质肽F29-43；HCV亚型6a[Y12083]*
89	VRSLAEFTCCRARAPGWVCARRG	F蛋白质肽F29-51；HCV亚型6a[Y12083]*
			90	SLAEFTCCRARAP	F蛋白质肽F31-43；HCV亚型6a[Y12083]*
91	SLAEFTCCRARAPGWVCARRG	F蛋白质肽F31-51；HCV亚型6a[Y12083]*
			92	CCRARAPGWVCARRG	F蛋白质肽F37-51；HCV亚型6a[Y12083]*
93	PAAPGHTGAPMTPGV	F蛋白质肽F101-115；HCV亚型6a[Y12083]*
			94	TGAPMTPGV	F蛋白质肽F107-115；HCV亚型6a[Y12083]*
95	VRSLVEFTCCRA	F蛋白质肽  F29-40；Fmut 8
			96	VRSLVEFTCCRAGAL	F蛋白质肽  F29-43；Fmut 8
97	VRSLVEFTCCRAGALDWVCARRG	F蛋白质肽  F29-511；Fmut 8
			98	SLVEFTCCRA	F蛋白质肽  F31-40；Fmut 8
99	SLVEFTCCRAGAL	F蛋白质肽  F31-43；Fmut 8
			100	SLVEFTCCRAGALDWVCARRG	F蛋白质肽  F31-51；Fmut 8
101	CCRAGALDWVCARRG	F蛋白质肽  F37-51；Fmut 8
			102	PVALGLVGAPQTPGV	F蛋白质肽  F101-115；Fmut 8
103	VGAPQTPGV	F蛋白质肽  F107-115；Fmut 8
			104	GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAA	源于ARFP的F29-51的核苷酸序列；HCV亚型1a
105	GCCAGATCGTTGGCGGAGTATACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACAAGGA	源于ARFP的F29-51的核苷酸序列；HCV亚型2a
			106	GACAGATCGTTGGTGGAGTATACGTGTTGCCGCGCAGGGGCCCACGATTGG	源于ARFP的F29-51的核苷酸序列；HCV亚型3a

	GTGTGCGCGCGACGCGTA
			107	GCCAGATCGTTGGCGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGATTGGGTGTGCGCGCGACTCGGA	源于ARFP的F29-51的核苷酸序列；HCV亚型4a
108	GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAAATTGGGTGTGCGCGCGACTCGGA	源于ARFP的F29-51的核苷酸序列；HCV亚型5a
			109	GTCAGATCGTTGGCGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAAGGGCCCCCGGTTGGGTGTGCGCGCGACGAGGA	源于ARFP的F29-51的核苷酸序列；HCV亚型6a
110	CCCGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTA	源于ARFP的F101-115的核苷酸序列；HCV亚型1a
			111	CCCGAGGTTCCCGTCCCTCTTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCATA	源于ARFP的F101-115的核苷酸序列；HCV亚型2a
112	CACGCGGCTCCCGTCCATCCTGGGGCCCAAATGACCCCCGGCGGA	源于ARFP的F101-115的核苷酸序列；HCV亚型3a
			113	CCCGTGGCTCTCGACCGTCTTGGGGCCCAAATGATCCCCGCGGGA	源于ARFP的F101-115的核苷酸序列；HCV亚型4a
114	CCCGAAGCTCTCGGCCTAATTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCGGA	源于ARFP的F101-115的核苷酸序列；HCV亚型5a
			115	CCCGCGGCTCCCGGCCACACTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCGTC	源于ARFP的F101-115的核苷酸序列；HCV亚型6a
116-128	见表17和18

*方括号内为GenBank登记号

**基于肽F29-43、F31-40和F37-51的重叠(分别为SEQ ID No：14、15和21)源于GenBank登记号M62321的HCV F蛋白质的核苷酸序列(484个核苷酸；SEQ ID NO：7)。星号表示插入两个核苷酸会导致移码的位置。作为翻译过程的结果，没有该插入的序列仍然可以产生F蛋白质：

ATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAAAAAA^＊＊AACAAACGTAACACCAACCGTCGCCCAC

AGGACGTCAAGTTCCCGGGTGGCGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCA

GGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAG

GTAGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCTCGTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCG

GGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCTGCGGGTGGGCGGGATGGCTCCTGTCTC

CCCGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGCAATTTGG

GTAAGGTCATCGATACCCTTACGTGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATACCGCTCG

TCGGCGCCCCTCTTGGAGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCGCATGGCGTCCGGGTTCTGGAAG

ACGGCG

源于GenBank登记号M62321的HCV F蛋白质的氨基酸序列；

基于在M62321序列的密码子11处有移码的假设(162个氨基酸；

SEQ ID NO：8)：

MSTNPKPQKKKTNVTPTVAHRTSSSRVAVRSLVEFTCCRAGALDWVCARRERLPSGRNLE

VDVSLSPRLVGPRAGPGLSPGTLGPSMAMRAAGGRDGSCLPVALGLAGAPQTPGVGRAIW

VRSSIPLRAASPTSWGTYRSSAPLLEALPGPWRMASGFWKTA

SEQ ID NO：8的Δ11截短形式

(151个氨基酸；SEQ ID NO：9)：

TNVTPTVAHRTSSSRVAVRSLVEFTCCRAGALDWVCARRERLPSGRNLEVDVSLSPRLVG

PRAGPGLSPGTLGPSMAMRAAGGRDGSCLPVALGLAGAPQTPGVGRAIWVRSSIPLRAAS

PTSWGTYRSSAPLLEALPGPWRMASGFWKTA

在本文所述研究中鉴定的Fmut8蛋白质的核苷酸序列

(486个核苷酸；SEQ ID NO：10)：

ATGAGCACGAATCCTAAACCTCAGAGGAAGACCCCAAACGTAACACCAACCGTCGCCCAC

AGGACGTCAAGTTCCCGGGTGGCGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCA

GGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAG

GTAGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCACGTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCG

GGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCTGCGGATGGGCGGGATGGCTCCTGTCTC

CCCGTGGCTCTCGGCCTAGTTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGCAATTTGG

GTAAGGTCATCGATACCCTCACGTGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATACCGCTCG

TCGGCGCCCCCCTTGGAGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCGCATGGCGTCCGGGTTCTGGAGG

ACGGCG

在本文所述研究中鉴定的Fmut8蛋白质的氨基酸序列

(162个氨基酸；SEQ ID NO：11)：

MSTNPKPQRKTPNVTPTVAHRTSSSRVAVRSLVEFTCCRAGALDWVCARRGRLPSGRNLE

VDVSLSPRHVGPRAGPGLSPGTLGPSMAMRAADGRDGSCLPVALGLVGAPQTPGVGRAIW

VRSSIPSRAASPTSWGTYRSSAPPLEALPGPWRMASGFWRTA

在本文所述研究中鉴定的Fmut8Δ11蛋白质的氨基酸序列

(151个氨基酸；SEQ ID NO：12)：

PNVTPTVAHRTSSSRVAVRSLVEFTCCRAGALDWVCARRGRLPSGRNLEVDVSLSPRHVG

PRAGPGLSPGTLGPSMAMRAADGRDGSCLPVALGLVGAPQTPGVGRAIWVRSSIPSRAAS

PTSWGTYRSSAPPLEALPGPWRMASGFWRTA

表11.在本文中描述的各种源于HCV F蛋白质的免疫原性肽/表位

来源＊	F29-40	F29-43	F29-51	F31-40	F31-43	F31-51	F37-51	F101-115	F107-115
										HCV亚型1a[M62321]	VRSLVEFTCCRA(SEQID NO：51)	VRSLVEFTCCRAGAL(SEQID NO：14)	VRSLVEFTCCRAGALDWVCARRE(SEQ IDNO：52)	SLVEFTCCRA(SEQ IDNO：15)	SLVEFTCCRAGAL(SEQ IDNO：53)	SLVEFTCCRAGALDWVCARRE(SEQID NO：54)	CCRAGALDWVCARRE(SEQ IDNO：21)	PVALGLAGAPQTPGV(SEQID NO：29)	AGAPQTPGV(SEQ IDNO：32)
HCV亚型2a[D00944]	ARSLAEYTCCRA(SEQID NO：55)	ARSLAEYTCCRAGAP(SEQID NO：56)	ARSLAEYTCCRAGAPGWVCARQG(SEQ IDNO：57)	SLAEYTCCRA(SEQ IDNO：16)	SLAEYTCCRAGAP(SEQ IDNO：58)	SLAEYTCCRAGAPGWVCARQG(SEQID NO：59)	CCRAGAPGWVCARQG(SEQ IDNO：60)	PVALGLAGAPQTPGV(SEQID NO：61)	AGAPQTPGV(SEQ IDNO：62)
										HCV亚型3a[D17763]	DRSLVEYTCCRA(SEQID NO：63)	DRSLVEYTCCRAGAH(SEQID NO：64)	DRSLVEYTCCRAGAHDWVCARRV(SEQIDNO：65)	SLVEYTCCRA(SEQ IDNO：17)	SLVEYTCCRA(SEQ IDNO：66)	SLVEYTCCRAGAHDWVCARRV(SEQID NO：67)	CCRAGAHDWVCARRV(SEQ IDNO：68)	HAAPVHPGAQMTPGG(SEQID NO：69)	PGAQMTPGG(SEQ IDNO：70)
HCV亚型4a[Y11604]	ARSLAEFTCCRA(SEQID NO：71)	ARSLAEFTCCRAGAP(SEQID NO：72)	ARSLAEFTCCRAGAPDWVSARLG(SEQ IDNO：73)	SLAEFTCCRA(SEQ IDNO：18)	SLAEFTCCRA(SEQ IDNO：74)	SLAEFTCCRAGAPDWVSARLG(SEQID NO：75 )	CCRAGAPDWVSARLG(SEQ IDNO：76)	PVALDRLGAQMIPAG(SEQID NO：77)	LGAQMIPAG(SEQ IDNO：78)
										HCV亚型5a[Y13184]	VRSLVEFTCCRA(SEQID NO：79)	VRSLVEFTCCRAGAL(SEQID NO：80)	VRSLVEFTCCRAGALNWVSARLG(SEQ IDNO：81)	SLVEFTCCRA(SEQ IDNO：19)	SLVEFTCCRA(SEQ IDNO：82)	SLVEFTCCRAGALNWVSARLG(SEQID NO：83)	CCRAGALNWVSARLG(SEQ IDNO：84)	PEALGLIGAPMTPGG(SEQID NO：85)	IGAPMTPGG(SEQ IDNO：86)
HCV亚型6a[Y12083]	VRSLAEFTCCRA(SEQID NO：87)	VRSLAEFTCCRARAP(SEQID NO：88)	VRSLAEFTCCRARAPGWVCARRG(SEQ IDNO：89)	SLAEFTCCRA(SEQ IDNO：20)	SLAEFTCCRA(SEQ IDNO：90)	SLAEFTCCRARAPGWVCARRG(SEQID NO：91)	CCRARAPGWVCARRG(SEQ IDNO：92)	PAAPGHTGAPMTPGV(SEQID NO：93)	TGAPMTPGV(SEQ IDNO：94)
										Fmut8(本文所述；SEQ IDNO：11)	VRSLVEFTCCRA(SEQID NO：95)	VRSLVEFTCCRAGAL(SEQID NO：96)	VRSLVEFTCCRAGALDWVCARRG(SEQ IDNO：97)	SLVEFTCCRA(SEQ IDNO：98)	SLVEFTCCRAGAL(SEQ IDNO：99)	SLVEFTCCRAGALDWVCARRG(SEQIDNO：100)	CCRAGALDWVCARRG(SEQ IDNO：101)	PVALGLVGAPQTPGV(SEQID NO：102)	VGAPQTPGV(SEQ IDNO：103)

*方括号内为GenBank登记号

表12.在各种HCV亚型中源于ARFP的F29-51肽的核苷酸序列

HCV亚型	F29-51
		1a(SEQ IDNO：104)	GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAA
2a(SEQ IDNO：105)	GCCAGATCGTTGGCGGAGTATACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACAAGGA
		3a(SEQ IDNO：106)	GACAGATCGTTGGTGGAGTATACGTGTTGCCGCGCAGGGGCCCACGATTGGGTGTGCGCGCGACGCGTA
4a(SEQIDNO：107)	GCCAGATCGTTGGCGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGATTGGGTGTGCGCGCGACTCGGA
		5a(SEQ IDNO：108)	GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAAATTGGGTGTGCGCGCGACTCGGA
6a(SEQ IDNO：109)	GTCAGATCGTTGGCGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAAGGGCCCCCGGTTGGGTGTGCGCGCGACGAGGA

参考序列按照表11

表13.在各种HCV亚型中源于ARFP的F101-115肽的核苷酸序列

HCV亚型	F101-115
		1a(SEQ IDNO：110)	CCCGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTA
2a(SEQ IDNO：111)	CCCGAGGTTCCCGTCCCTCTTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCATA
		3a(SEQ IDNO：112)	CACGCGGCTCCCGTCCATCCTGGGGCCCAAATGACCCCCGGCGGA
4a(SEQ IDNO：113)	CCCGTGGCTCTCGACCGTCTTGGGGCCCAAATGATCCCCGCGGGA
		5a(SEQ IDNO：114)	CCCGAAGCTCTCGGCCTAATTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCGGA
6a(SEQ IDNO：115)	CCCGCGGCTCCCGGCCACACTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCGTC

参考序列按照表11

表14.源于HCV F蛋白质跨越残基29-51区域的在本文中描述的各种免疫原性肽

HCV亚型	SEQIDNO：	F蛋白质位置
																									29	30	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50	51
		1a		V	R	S	L	V	E	F	T	C	C	R	A	G	A	L	D	W	V	C	A	R																								R	E
2a																									A	R	S	L	A	E	Y	T	C	C	R	A	G	A	P	G	W	V	C	A	R	Q	G
		3a		D	R	S	L	V	E	Y	T	C	C	R	A	G	A	H	D	W	V	C	A	R																								R	V
4a																									A	R	S	L	A	E	F	T	C	C	R	A	G	A	P	D	W	V	S	A	R	L	G
		5a		V	R	S	L	V	E	F	T	C	C	R	A	G	A	L	N	W	V	S	A	R																								L	G
6a																									V	R	S	L	A	E	F	T	C	C	R	A	R	A	P	G	W	V	C	A	R	R	G
		Fmut8＊		V	R	S	L	V	E	F	T	C	C	R	A	G	A	L	D	W	V	C	A	R																								R	G
式I																									X1	X2	X3	X4	X5	X6	X7	X8	X9	X10	X11	X12	X13	X14	X15	X16	X17	X18	X19	X20	X21	X22	X23

*源于SEQ ID NO：11

表15.源于HCV F蛋白质跨越残基101-115区域的在本文中描述的各种免疫原性肽

HCV亚型	SEQIDNO：	F蛋白质位置
																	101	102	103	104	105	106	107	108	109	110	111	112	113	114	115
		1a		P	V	A	L	G	L	A	G	A	P	Q	T	P																G	V
2a																	P	E	V	P	V	P	L	G	A	P	M	T	P	G	I
		3a		H	A	A	P	V	H	P	G	A	Q	M	T	P																G	G
4a																	P	V	A	L	D	R	L	G	A	Q	M	I	P	A	G
		5a		P	E	A	L	G	L	I	G	A	P	M	T	P																G	G
6a																	P	A	A	P	G	H	T	G	A	P	M	T	P	G	V
		Fmut8＊		P	V	A	L	G	L	V	G	A	P	Q	T	P																G	V
式II																	Z1	Z2	Z3	Z4	Z5	Z6	Z7	Z8	Z9	Z10	Z11	Z12	Z13	Z14	Z15

*源于SEQ ID NO：11

表16.本文中所鉴定各种免疫原性肽/表位的在HCV F蛋白质^＊之内的起始和终止位置

起始位置	终止位置
		29	40
29	43
		29	51
29	115
		31	40
31	43
		31	51
31	115
		37	51
37	115
		101	115
107	115

*HCV F蛋白质的实例包括源于HCV亚型1a(GenBank登记号M62321)、2a(GenBank登记号D00944)、3a(GenBank登记号D17763)、4a(GenBank登记号Y11604)、5a(GenBank登记号Y13184)、6a(GenBank登记号Y12083)和Fmut8(亚型1a；见SEQ ID NO：11)的那些。

表17.在各种HCV亚型中源于ARFP的F29-115肽区域的核苷酸序列

HCV亚型	SEQIDNO：	F29-115
			1a	116	GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAGGTAGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCTCGTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCTGCGGGTGGGCGGGATGGCTCCTGTCTCCCCGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTA
2a	117	GCCAGATCGTTGGCGGAGTATACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACAAGGAAGACTTCGGAGCGGTCCCAGCCACGTGGAAGGCGCCAGCCCATCCCTAAGGATCGGCGCTCCACTGGCAAATCCTGGGGAAAACCAGGATACCCCTGGCCCCTATACGGGAATGAGGGACTCGGCTGGGCAGGATGGCTCCTGTCCCCCCGAGGTTCCCGTCCCTCTTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCATA
			3a	118	GACAGATCGTTGGTGGAGTATACGTGTTGCCGCGCAGGGGCCCACGATTGGGTGTGCGCGCGACGCGTAAAACTTCTGAACGGTCACAGCCTCGCGGACGACGACAGCCTATCCCCAAGGCGCGTCGGAGCGAAGGCCGGTCCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGTAACGAGGGCTGCGGGTGGGCAGGGTGGCTCCTGTCCCCACGCGGCTCCCGTCCATCCTGGGGCCCAAATGACCCCCGGCGGA
4a	119	GCCAGATCGTTGGCGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGATTGGGTGTGCGCGCGACTCGGAAGACTTCGGAGCGGTCGCAACCTCGTGGAAGACGCCAACCTATCCCCAAGGCGCGTCGACCCGAGGGAAGGTCCTGGGCACAACCAGGATATCCATGGCCTCTTTACGGTAATGAGGGTTGTGGGTGGGCAGGATGGCTCTTGTCCCCCCGTGGCTCTCGACCGTCTTGGGGCCCAAATGATCCCCGCGGGA
			5a	120	GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAAATTGGGTGTGCGCGCGACTCGGAAGAATTCGGAACGGTCGCAACCCCGTGGACGGCGCCAGCCTATTCCCAAGGCGCGCCGACCCACGGGCCGGTCCTGGGGTCAACCCGGGTACCCTTGGCCCCTTTACGCCAATGAAGGCCTCGGGTGGGCAGGGTGGTTGCTCTCCCCCCGAAGCTCTCGGCCTAATTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCGGA
6a	121	GTCAGATCGTTGGCGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAAGGGCCCCCGGTTGGGTGTGCGCGCGACGAGGAAGACTTCTGAGCGATCCCAGCCCAGAGGCAGGCGCCAACCTATACCAAAGGCGCGCCAGCCCCAGGGCAGGCACTGGGCTCAGCCCGGATACCCTTGGCCTCTTTATGGAAGCGAAGGCTGTGGGTGGGCAGGTTGGCTCCTGTCCCCCCGCGGCTCCCGGCCACACTGGGGCCCCAATGACCCCCGGCGTC

源于根据表3亚型的GenBank登记号的序列。

表18.在各种HCV亚型中源于ARFP的F29-115肽区域的氨基酸序列

HCV亚型	SEQIDNO：	F29-115
			1a	122	VRSLVEFTCCRAGALDWVCARRERLPSGRNLEVDVSLSPRLVGPRAGPGLSPGTLGPSMAMRAAGGRDGSCLPVALGLAGAPQTPGV
2a	123	ARSLAEYTCCRAGAPGWVCARQGRLRSGPSHVEGASPSLRIGAPLANPGENQDTPGPYTGMRDSAGQDGSCPPEVPVPLGAPMTPGI
			3a	124	DRSLVEYTCCRAGAHDWVCARRVKLLNGHSLADDDSLSPRRVGAKAGPGLSPGTLGPSMVTRAAGGQGGSCPHAAPVHPGAQMTPGG
4a	125	ARSLAEFTCCRAGAPDWVCARLGRLRSGRNLVEDANLSPRRVDPREGPGHNQDIHGLFTVMRVVGGQDGSCPPVALDRLGAQMIPAG
			5a	126	VRSLVEFTCCRAGALNWVCARLGRIRNGRNPVDGASLFPRRADPRAGPGVNPGTLGPFTPMKASGGQGGCSPPEALGLIGAPMTPGG
6a	127	VRSLAEFTCCRARAPGWVCARRGRLLSDPSPEAGANLYQRRASPRAGTGLSPDTLGLFMEAKAVGGQVGSCPPAAPGHTGAPMTPGV
			Fmut8	128	VRSLVEFTCCRAGALDWVCARRGRLPSGRNLEVDVSLSPRHVGPRAGPGLSPGTLGPSMAMRAADGRDGSCLPVALGLVGAPQTPGV

源于根据表3亚型的GenBank登记号的序列；源于SEQ ID NO：11的Fmut8序列。

贯穿本申请之中，引用不同的参考文献来更充分的说明本发明相关技术领域的情况。这些参考文献所公开的内容在此通过参考并入本发明所公开内容中。

参考文献

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序列表

<110>瓦勒瑞萨欣HSJ有限合伙公司

     胡戈·苏戴恩斯

     埃米莉·贾尔伯特

     迈里亚姆·特勒施

<120>HCV F蛋白质和其用途

<130>12810.116

<150>US 60/628,549

<151>2004-11-18

<160>128

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1

gccagccccc tgatgg                                              16

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>2

gcctcgtaca caatactcg                                           19

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>3

gaccgtcgac catgagcacg aatcctaaac ctcagaggaa gaccccaaac gtaa    54

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>4

aagggtaccc gggctgagcc caggtcctgc cctcggg                          37

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>5

tcaagtcgac ccaaacgtaa caccaaccg                                   29

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>6

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag c                                31

<210>7

<211>486

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

<223>n是a，c，g，t，u，未知，其它或缺失

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>n是a，c，g，t，u，未知，其它或缺失

<400>7

atgagcacga atcctaaacc tcaaaaaaaa nnaacaaacg taacaccaac cgtcgcccac     60

aggacgtcaa gttcccgggt ggcggtcaga tcgttggtgg agtttacttg ttgccgcgca    120

ggggccctag attgggtgtg cgcgcgacga gaaagacttc cgagcggtcg caacctcgag    180

gtagacgtca gcctatcccc aaggctcgtc ggcccgaggg caggacctgg gctcagcccg    240

ggtacccttg gcccctctat ggcaatgagg gctgcgggtg ggcgggatgg ctcctgtctc    300

cccgtggctc tcggcctagc tggggcccca cagacccccg gcgtaggtcg cgcaatttgg    360

gtaaggtcat cgataccctt acgtgcggct tcgccgacct catggggtac ataccgctcg    420

tcggcgcccc tcttggaggc gctgccaggg ccctggcgca tggcgtccgg gttctggaag    480

acggcg                                                               486

<210>8

<211>162

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>8

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Lys Lys Lys Thr Asn Val Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Val Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu

            20                  25                  30

Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Arg Glu Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu Val Asp Val Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Pro Arg Leu Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro

65                  70                  75                  80

Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala Ala Gly Gly Arg Asp

                85                  90                  95

Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr

            100                 105                 110

Pro Gly Val Gly Arg Ala Ile Trp Val Arg Ser Ser Ile Pro Leu Arg

        115                 120                 125

Ala Ala Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Ser Ser Ala Pro Leu

    130                 135                 140

Leu Glu Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg Met Ala Ser Gly Phe Trp Lys

145                 150                 155                 160

Thr Ala

<210>9

<211>151

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>9

Thr Asn Val Thr Pro Thr Val Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val

1               5                   10                  15

Ala Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

            20                  25                  30

Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg Glu Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu

        35                  40                  45

Glu Val Asp Val Ser Leu Ser Pro Arg Leu Val Gly Pro Arg Ala Gly

    50                  55                  60

Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala

65                  70                  75                  80

Ala Gly Gly Arg Asp Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala

                85                  90                  95

Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val Gly Arg Ala Ile Trp Val Arg Ser

            100                 105                 110

Ser Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg

        115                 120                 125

Ser Ser Ala Pro Leu Leu Glu Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg Met Ala

    130                 135                 140

Ser Gly Phe Trp Lys Thr Ala

145                 150

<210>10

<211>486

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>10

atgagcacga atcctaaacc tcagaggaag accccaaacg taacaccaac cgtcgcccac     60

aggacgtcaa gttcccgggt ggcggtcaga tcgttggtgg agtttacttg ttgccgcgca    120

ggggccctag attgggtgtg cgcgcgacga ggaagacttc cgagcggtcg caacctcgag    180

gtagacgtca gcctatcccc aaggcacgtc ggcccgaggg caggacctgg gctcagcccg    240

ggtacccttg gcccctctat ggcaatgagg gctgcggatg ggcgggatgg ctcctgtctc    300

cccgtggctc tcggcctagt tggggcccca cagacccccg gcgtaggtcg cgcaatttgg    360

gtaaggtcat cgataccctc acgtgcggct tcgccgacct catggggtac ataccgctcg    420

tcggcgcccc ccttggaggc gctgccaggg ccctggcgca tggcgtccgg gttctggagg    480

acggcg                                                               486

<210>11

<211>162

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>11

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Pro Asn Val Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Val Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu

            20                  25                  30

Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu Val Asp Val Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Pro Arg His Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro

65                  70                  75                  80

Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala Ala Asp Gly Arg Asp

                85                  90                  95

Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Pro Gln Thr

            100                 105                 110

Pro Gly Val Gly Arg Ala Ile Trp Val Arg Ser Ser Ile Pro Ser Arg

        115                 120                 125

Ala Ala Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Ser Ser Ala Pro Pro

    130                 135                 140

Leu Glu Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg Met Ala Ser Gly Phe Trp Arg

145                 150                 155                 160

Thr Ala

<210>12

<211>151

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>12

Pro Asn Val Thr Pro Thr Val Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val

1               5                   10                  15

Ala Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

            20                  25                  30

Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu

        35                  40                  45

Glu Val Asp Val Ser Leu Ser Pro Arg His Val Gly Pro Arg Ala Gly

    50                  55                  60

Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala

65                  70                  75                  80

Ala Asp Gly Arg Asp Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Val

                85                  90                  95

Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val Gly Arg Ala Ile Trp Val Arg Ser

            100                 105                 110

Ser Ile Pro Ser Arg Ala Ala Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg

        115                 120                 125

Ser Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg Met Ala

    130                 135                 140

Ser Gly Phe Trp Arg Thr Ala

145                 150

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>13

Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val

1               5                   10

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>14

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

1               5                   10                  15

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>15

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>16

Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>17

Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>18

Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>19

<21l>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>19

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>20

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>20

Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>21

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>21

Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg Glu

1               5                   10                  15

<210>22

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>22

Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val

1               5

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>23

Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val

1               5                   10

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>24

Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val

1               5

<210>25

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>25

Cys Arg Ala Gly Ala His Asp Trp Val

1               5

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>26

Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val

1               5

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>27

Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asn Trp Val

1               5

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>28

Cys Arg Ala Arg Ala Pro Gly Trp Val

1               5

<210>29

<211>5

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>29

Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5                   10                  15

<210>30

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>30

Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr

1               5                   10

<210>31

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>31

Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro

1               5

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>32

Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5

<210>33

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>33

Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5                   10

<210>34

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>34

Val Pro Val Pro Leu Gly Ala Pro Met Thr

1               5                   10

<210>35

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>35

Ala Pro Val His Pro Gly Ala Gln Met Thr

1               5                   10

<210>36

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>36

Ala Leu Asp Arg Leu Gly Ala Gln Met Ile

1               5                   10

<210>37

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>37

Ala Leu Gly Leu Ile Gly Ala Pro Met Thr

1               5                   10

<210>38

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>38

Ala Pro Gly His Thr Gly Ala Pro Met Thr

1               5                   10

<210>39

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>39

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys

1               5                   10

<210>40

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>40

Val Ala Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg

1               5                   10

<210>41

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>41

Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg

1               5                   10

<210>42

<211>19

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>42

Arg Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu Val Asp Val Ser Leu

1               5                   10                  15

Ser Pro Arg

<210>43

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>43

Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu

1               5                   10

<210>44

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>44

Val Asp Val Ser Leu Ser Pro Arg His Val Gly Pro Arg

1               5                   10

<210>45

<211>17

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>45

Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met

1               5                   10                  15

Arg

<210>46

<211>22

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>46

Asp Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Pro Gln

1               5                   10                  15

Thr Pro Gly Val Gly Arg

            20

<210>47

<211>11

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>47

Ala Ile Trp Val Arg Ser Ser Ile Pro Ser Arg

1               5                   10

<210>48

<211>11

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>48

Ala Ala Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg

1               5                   10

<210>49

<211>25

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>49

Ala Ala Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Ser Ser Ala Pro Pro

1               5                   10                  15

Leu Glu Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg

            20                  25

<210>50

<211>7

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>50

Met Ala Ser Gly Phe Trp Arg

1               5

<210>51

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>51

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>52

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>52

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Glu

            20

<210>53

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>53

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

1               5                   10

<210>54

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>54

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val

1               5                   10                  15

Cys Ala Arg Arg Glu

            20

<210>55

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>55

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>56

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>56

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro

1               5                   10                  15

<210>57

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>57

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Gln Gly

            20

<210>58

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>58

Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro

1               5                   10

<210>59

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>59

Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val

1               5                   10                  15

Cys Ala Arg Gln Gly

            20

<210>60

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>60

Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Gln Gly

1               5                   10                  15

<210>61

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>61

Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5                   10                  15

<210>62

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>62

Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5

<210>63

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>63

Asp Arg Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>64

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>64

Asp Arg Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala His

1               5                   10                  15

<210>65

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>65

Asp Arg Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala His Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Val

            20

<210>66

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>66

Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala His

1               5                   10

<210>67

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>67

Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala His Asp Trp Val

1               5                   10                  15

Cys Ala Arg Arg Val

            20

<210>68

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>68

Cys Cys Arg Ala Gly Ala His Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg Val

1               5                   10                  15

<210>69

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>69

His Ala Ala Pro Val His Pro Gly Ala Gln Met Thr Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

<210>70

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>70

Pro Gly Ala Gln Met Thr Pro Gly Gly

1               5

<210>71

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>71

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>72

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>72

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro

1               5                   10                  15

<210>73

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>73

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Ser Ala Arg Leu Gly

            20

<210>74

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>74

Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro

1               5                   10

<210>75

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>75

Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys  Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val

1               5                    10                  15

Ser Ala Arg Leu Gly

            20

<210>76

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>76

Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val Ser Ala Arg Leu Gly

1               5                   10                  15

<210>77

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>77

Pro Val Ala Leu Asp Arg Leu Gly Ala Gln Met Ile Pro Ala Gly

1               5                   10                  15

<210>78

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>78

Leu Gly Ala Gln Met Ile Pro Ala Gly

1               5

<210>79

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>79

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>80

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>80

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

1               5                   10                  15

<210>81

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>81

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asn

1               5                   10                  15

Trp Val Ser Ala Arg Leu Gly

            20

<210>82

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>82

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

1               5                   10

<210>83

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>83

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asn Trp Val

1               5                   10                  15

Ser Ala Arg Leu Gly

            20

<210>84

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>84

Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asn Trp Val Ser Ala Arg Leu Gly

1               5                   10                  15

<210>85

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>85

Pro Glu Ala Leu Gly Leu Ile Gly Ala Pro Met Thr Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

<210>86

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>86

Ile Gly Ala Pro Met Thr Pro Gly Gly

1               5

<210>87

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>87

Val Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>88

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>88

Val Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Arg Ala Pro

1               5                   10                  15

<210>89

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>89

Val Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Arg Ala Pro Gly

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly

            20

<210>90

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>90

Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Arg Ala Pro

1               5                   10

<210>91

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>91

Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Arg Ala Pro Gly Trp Val

1               5                   10                  15

Cys Ala Arg Arg Gly

            20

<210>92

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>92

Cys Cys Arg Ala Arg Ala Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly

1               5                   10                  15

<210>93

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>93

Pro Ala Ala Pro Gly His Thr Gly Ala Pro Met Thr Pro Gly Val

1               5                   10                  15

<210>94

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>94

Thr Gly Ala Pro Met Thr Pro Gly Val

1               5

<210>95

<211>12

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>95

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>96

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>96

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

1               5                   10                  15

<210>97

<211>23

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>97

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly

            20

<210>98

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>98

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala

1               5                   10

<210>99

<211>13

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>99

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu

1               5                   10

<210>100

<211>21

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>100

Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val

1               5                   10                  15

Cys Ala Arg Arg Gly

            20

<210>101

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>101

Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly

1               5                   10                  15

<210>102

<211>15

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>102

Pro Val Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5                   10                  15

<210>103

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>103

Val Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

1               5

<210>104

<211>69

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>104

gtcagatcgt tggtggagtt tacttgttgc cgcgcagggg ccctagattg ggtgtgcgcg   60

cgacgagaa                                                           69

<210>105

<211>69

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>105

gccagatcgt tggcggagta tacttgttgc cgcgcagggg ccccaggttg ggtgtgcgcg   60

cgacaagga                                                           69

<210>106

<211>69

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>106

gacagatcgt tggtggagta tacgtgttgc cgcgcagggg cccacgattg ggtgtgcgcg   60

cgacgcgta                                                           69

<210>107

<211>69

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>107

gccagatcgt tggcggagtt tacttgttgc cgcgcagggg ccccagattg ggtgtgcgcg   60

cgactcgga                                                           69

<210>108

<211>69

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>108

gtcagatcgt tggtggagtttacttgttgc cgcgcagggg ccctaaattg ggtgtgcgcg    60

cgactcgga                                                           69

<210>109

<211>69

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>109

gtcagatcgt tggcggagtt tacttgttgc cgcgcaaggg cccccggttg ggtgtgcgcg    60

cgacgagga                                                            69

<210>110

<211>45

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>110

cccgtggctc tcggcctagc tggggcccca cagacccccg gcgta                    45

<210>111

<211>45

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>111

cccgaggttc ccgtccctct tggggcccca atgacccccg gcata                    45

<210>112

<211>45

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>112

cacgcggctc ccgtccatcc tggggcccaa atgacccccg gcgga                    45

<210>113

<211>45

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>113

cccgtggctc tcgaccgtct tggggcccaa atgatccccg cggga                    45

<210>114

<211>45

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>114

cccgaagctc tcggcctaat tggggcccca atgacccccg gcgga                    45

<210>115

<211>45

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>115

cccgcggctc ccggccacac tggggcccca atgacccccg gcgtc                    45

<210>116

<211>261

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>116

gtcagatcgt tggtggagtt tacttgttgc cgcgcagggg ccctagattg ggtgtgcgcg     60

cgacgagaaa gacttccgag cggtcgcaac ctcgaggtag acgtcagcct atccccaagg    120

ctcgtcggcc cgagggcagg acctgggctc agcccgggta cccttggccc ctctatggca    180

atgagggctg cgggtgggcg ggatggctcc tgtctccccg tggctctcgg cctagctggg    240

gccccacaga cccccggcgta                                               261

<210>117

<211>261

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>117

gccagatcgt tggcggagta tacttgttgc cgcgcagggg ccccaggttg ggtgtgcgcg     60

cgacaaggaa gacttcggag cggtcccagc cacgtggaag gcgccagccc atccctaagg    120

atcggcgctc cactggcaaa tcctggggaa aaccaggata cccctggccc ctatacggga    180

atgagggact cggctgggca ggatggctcc tgtccccccg aggttcccgt ccctcttggg    240

gccccaatga cccccggcat a                                              261

<210>118

<211>261

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>118

Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly

1               5                   10                  15

Ala Gly Thr Ala Thr Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Gly

            20                  25                  30

Cys Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Gly Ala Thr

        35                  40                  45

Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys

    50                  55                  60

Gly Cys Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala

65                  70                  75                  80

Cys Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Gly Cys Gly

                85                  90                  95

Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Thr

            100                 105                 110

Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Gly

        115                 120                 125

Ala Gly Cys Gly Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr

    130                 135                 140

Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala

145                 150                 155                 160

Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Cys Cys Cys  Cys ThrCys Thr Ala Thr

                165                 170                 175

Gly Gly Thr Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly

            180                 185                 190

Gly Gly Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr

        195                 200                 205

Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Cys Ala Cys Gly Cys Gly Gly Cys

    210                 215                 220

Thr Cys Cys Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly

225                 230                 235                 240

Gly Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly

                245                 250                 255

Gly Cys Gly Gly Ala

            260

<210>119

<211>261

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>119

gccagatcgt tggcggagtt tacttgttgc cgcgcagggg ccccagattg ggtgtgcgcg     60

cgactcggaa gacttcggag cggtcgcaac ctcgtggaag acgccaacct atccccaagg    120

cgcgtcgacc cgagggaagg tcctgggcac aaccaggata tccatggcct ctttacggta    180

atgagggttg tgggtgggca ggatggctct tgtccccccg tggctctcga ccgtcttggg    240

gcccaaatga tccccgcggg a                                              261

<210>120

<211>261

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>120

gtcagatcgt tggtggagtt tacttgttgc cgcgcagggg ccctaaattg ggtgtgcgcg     60

cgactcggaa gaattcggaa cggtcgcaac cccgtggacg gcgccagcct attcccaagg    120

cgcgccgacc cacgggccgg tcctggggtc aacccgggta cccttggccc ctttacgcca    180

atgaaggcct cgggtgggca gggtggttgc tctccccccg aagctctcgg cctaattggg    240

gccccaatga cccccggcgg a                                              261

<210>121

<211>261

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>121

gtcagatcgt tggcggagtt tacttgttgc cgcgcaaggg cccccggttg ggtgtgcgcg     60

cgacgaggaa gacttctgag cgatcccagc ccagaggcag gcgccaacct ataccaaagg    120

cgcgccagcc ccagggcagg cactgggctc agcccggata cccttggcct ctttatggaa    180

gcgaaggctg tgggtgggca ggttggctcc tgtccccccg cggctcccgg ccacactggg    240

gccccaatga cccccggcgt c                                              261

<210>122

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>122

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Glu Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu

            20                  25                  30

Val Asp Val Ser Leu Ser Pro Arg Leu Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro

        35                  40                  45

Gly LeH Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala Ala

    50                  55                  60

Gly Gly Arg Asp Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala Gly

65                  70                  75                  80

Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

                85

<210>123

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>123

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Gln Gly Arg Leu Arg Ser Gly Pro Ser His Val

            20                  25                  30

Glu Gly Ala Ser Pro Ser Leu Arg Ile Gly Ala Pro Leu Ala Asn Pro

        35                  40                  45

Gly Glu Asn Gln Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Thr Gly Met Arg Asp Ser

    50                  55                  60

Ala Gly Gln Asp Gly Ser Cys Pro Pro Glu Val Pro Val Pro Leu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Pro Met Thr Pro Gly Ile

                85

<210>124

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>124

Asp Arg Ser Leu Val Glu Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala His Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Val Lys Leu Leu Asn Gly His Ser Leu Ala

            20                  25                  30

Asp Asp Asp Ser Leu Ser Pro Arg Arg Val Gly Ala Lys Ala Gly Pro

        35                  40                  45

Gly Leu Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Val Thr Arg Ala Ala

    50                  55                  60

Gly Gly Gln Gly Gly Ser Cys Pro His Ala Ala Pro Val His Pro Gly

65                  70                  75                  80

Ala Gln Met Thr Pro Gly Gly

                85

<210>125

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>125

Ala Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Leu Gly Arg Leu Arg Ser Gly Arg Asn Leu Val

            20                  25                  30

Glu Asp Ala Asn Leu Ser Pro Arg Arg Val Asp Pro Arg Glu Gly Pro

        35                  40                  45

Gly His Asn Gln Asp Ile His Gly Leu Phe Thr Val Met Arg Val Val

    50                  55                  60

Gly Gly Gln Asp Gly Ser Cys Pro Pro Val Ala Leu Asp Arg Leu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Gln Met Ile Pro Ala Gly

                85

<210>126

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>126

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asn

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Leu Gly Arg Ile Arg Asn Gly Arg Asn Pro Val

            20                  25                  30

Asp Gly Ala Ser Leu Phe Pro Arg Arg Ala Asp Pro Arg Ala Gly Pro

        35                  40                  45

Gly Val Asn Pro Gly Thr Leu Gly Pro Phe Thr Pro Met Lys Ala Ser

    50                  55                  60

Gly Gly Gln Gly Gly Cys Ser Pro Pro Glu Ala Leu Gly Leu Ile Gly

65                  70                  75                  80

Ala Pro Met Thr Pro Gly Gly

                85

<210>127

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>127

Val Arg Ser Leu Ala Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Arg Ala Pro Gly

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly Arg Leu Leu Ser Asp Pro Ser Pro Glu

            20                  25                  30

Ala Gly Ala Asn Leu Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Pro Arg Ala Gly Thr

        35                  40                  45

Gly Leu Ser Pro Asp Thr Leu Gly Leu Phe Met Glu Ala Lys Ala Val

    50                  55                  60

Gly Gly Gln Val Gly Ser Cys Pro Pro Ala Ala Pro Gly His Thr Gly

65                  70                  75                  80

Ala Pro Met Thr Pro Gly Val

                85

<210>128

<211>87

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>128

Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp

1               5                   10                  15

Trp Val Cys Ala Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu

            20                  25                  30

Val Asp Val Ser Leu Ser Pro Arg His Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro

        35                  40                  45

Gly Leu Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala Ala

    50                  55                  60

Asp Gly Arg Asp Gly Ser Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Val Gly

65                  70                  75                  80

Ala Pro Gln Thr Pro Gly Val

                85

Claims (69)

1.一种源于HCV F蛋白质的分离的免疫原性多肽，条件是所述多肽不是列于SEQ ID NO：8的全长HCV F蛋白质，进一步的条件是所述HCVF蛋白质源于不同于HCV-1b的HCV亚型。

2.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述HCV F蛋白质源于选自HCV-1a、HCV-2a、HCV-3a、HCV-4a、HCV-5a和HCV-6a的HCV亚型。

3.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽由表16中定义的在所述HCV F蛋白质内的起始和终止位置所定义。

4.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述的肽选自：

(a)包含选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列的多肽；和/或

(b)(a)的功能性变体或片段，其中所述功能性变体或片段具有免疫相关活性。

5.根据权利要求2的分离的多肽，其中所述的免疫相关活性选自：

(i)诱导抗HCV的免疫应答；

(ii)诱导T细胞裂解活性；

(iii)结合人白细胞抗原(HLA)或MHC I类分子；

(iv)与来自HCV感染对象的血清的免疫反应性；

(v)改变细胞因子或趋化因子的表达或生产；和

(vi)(i)至(v)的任何组合。

6.根据权利要求3的分离的多肽，其中所述HLA分子是HLA-A分子。

7.根据权利要求4的分离的多肽，其中所述HLA-A分子是HLA-A*0201分子。

8.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽长度为50个氨基酸或更短。

9.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽基本由选自SEQ IDNO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列组成。

10.根据权利要求1至7中任一项的多肽，其中所述多肽是重组体。

11.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述多肽的制备物，其中所述制备物基本没有除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质。

12.根据权利要求9的制备物，其中所述除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质是HCV核心蛋白质。

13.一种分离的HCV F蛋白质肽表位，其中所述肽表位具有免疫相关活性，条件是所述肽表位不是列于SEQ ID NO：8的全长HCV F蛋白质。

14.根据权利要求11的分离的肽表位，其中所述免疫相关活性选自：

(i)诱导抗HCV的免疫应答；

(ii)诱导T细胞裂解活性；

(iii)结合人白细胞抗原(HLA)或者MHC I类分子；

(iv)与来自HCV感染对象的血清的免疫反应性；

(v)改变细胞因子或趋化因子表达或生产；和

(vi)(i)至(v)的任何组合。

15.根据权利要求11的分离的肽表位，其基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的8至约50个连续氨基酸所组成。

16.根据权利要求13的分离的肽表位，其基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的8至约15个连续氨基酸所组成。

17.根据权利要求14的分离的肽表位，其基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的9、10或15个连续氨基酸所组成。

18.根据权利要求11的分离的肽表位，所述表位包含选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列。

19.根据权利要求16的分离的肽表位，其基本上由选自SEQ ID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列所组成。

20.一种包含根据权利要求1至8中任一项的分离多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位、以及药用可接受载体的药物组合物。

21.根据权利要求20的药物组合物，其还包含佐剂。

22.一种包含根据权利要求1至8中任一项的分离多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位、以及佐剂的药物组合物。

23.一种包含根据权利要求1至8中任一项的分离多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位、以及MHC分子的药物组合物。

24.根据权利要求20的药物组合物，其还包含MHC分子。

25.一种包含两个或更多MHC肽复合单体的多聚体的组合物，每个所述单体包含根据权利要求1至8中任一项的多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位以及MHC分子。

26.根据权利要求25的组合物，其中所述MHC分子包含MHC I类重链或其融合蛋白以及β2微球蛋白或其融合蛋白。

27.根据权利要求25的组合物，其中所述单体通过多价实体被连在一起成为所述多聚体。

28.根据权利要求27的组合物，其中所述单体通过选自生物素-亲和素相互作用、生物素-链亲和素相互作用、卷曲螺旋结构域相互作用、以及脂质体-单体交联的相互作用与所述多价实体结合。

29.根据权利要求20的药物组合物，其还包含不同于所述分离多肽的第二多肽，其中所述第二多肽能够诱导HCV免疫应答。

30.根据权利要求29的药物组合物，其中所述第二多肽是另外的HCV多肽。

31.一种能够特异性结合根据权利要求1至8中任一项的多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位的抗体。

32.一种编码根据权利要求1至8中任一项的多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位的分离的核酸。

33.根据权利要求32的分离的核酸，其中该核酸包含能够编码选自SEQID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的核苷酸序列的片段。

34.根据权利要求32的分离的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列。

35.根据权利要求32的分离的核酸，其中该核酸包含能够编码选自SEQID NO：9、11、12和/或122至128的氨基酸序列的核苷酸序列。

36.根据权利要求32的分离的核酸，其中该核酸包含能够编码选自SEQID NO：9、11、12、14至38、51至103和/或122至128的氨基酸序列的核苷酸序列。

37.一种包含与转录调节序列可操作性连接的权利要求32至36中任一项所述核酸的载体。

38.一种用权利要求37的载体转化或者转染的宿主细胞。

39.一种生产根据权利要求1至8中任一项的多肽或者根据权利要求11至19中任一项的肽表位的方法，所述方法包括在允许所述多肽或肽表位表达的条件下培养权利要求38的宿主细胞。

40.根据权利要求39的方法，其中所述方法导致不产生或者基本不产生除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质。

41.根据权利要求40的方法，其中所述除HCV F蛋白质以外的HCV蛋白质是HCV核心蛋白质。

42.根据权利要求39的方法，其还包括回收产生的所述多肽或肽表位。

43.预防或治疗动物中HCV感染、或者用于在动物中诱导抗HCV免疫学或保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述动物施用选自权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、权利要求20至30中任一项所述药物组合物、和/或权利要求37所述载体的药剂。

44.根据权利要求43的方法，其中所述动物是哺乳动物。

45.根据权利要求44的方法，其中所述哺乳动物是人。

46.根据权利要求45的方法，其中所述的人还具有HIV感染。

47.选自权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、权利要求20至30中任一项所述药物组合物、和/或权利要求37所述载体的药剂在制备药物中的应用。

48.选自权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、权利要求20至30中任一项所述药物组合物、和/或权利要求37所述载体的药剂在预防或治疗HCV感染、或者用于诱导抗HCV免疫学或保护性免疫应答中的应用。

49.选自权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、权利要求20至30中任一项所述药物组合物、和/或权利要求37所述载体的配制物在制备预防或治疗HCV感染、或者用于诱导抗HCV免疫学或保护性免疫应答的药物中的应用。

50.一种商业包装物，其包含选自权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、权利要求20至30中任一项所述药物组合物、和/或权利要求37所述载体的药剂，以及用于预防或治疗HCV感染和/或用于诱导抗HCV免疫学或保护性免疫应答的使用说明。

51.一种检测或者诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括用权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、或其任何组合来分析所述动物的生物学样本。

52.一种检测或者定量动物的生物学样本中HCV的方法，所述方法包括用权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、或其任何组合来分析所述生物学样本。

53.根据权利要求51或52的方法，其中所述生物学样本是所述动物的组织或者体液。

54.一种检测或诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括：

(a)将所述动物的生物学样本与权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、或其任何组合相接触；和

(b)确定所述生物学样本的成分与所述多肽或者肽表位的结合；其中所述结合指示HCV感染。

55.一种检测或定量动物的生物学样本中HCV的方法，所述方法包括：

(a)将所述生物学样本与权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求9或10所述制备物、权利要求11至19中任一项所述肽表位、或其任何组合相接触；和

(b)确定所述生物学样本的成分与所述多肽或者肽表位的结合；其中所述结合指示在所述样本中HCV的存在或者量。

56.一种检测或诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括用权利要求31的抗体分析所述动物的生物学样本。

57.一种检测或定量动物的生物学样本中HCV的方法，所述方法包括用权利要求31的抗体分析所述生物学样本。

58.一种检测或诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括用权利要求20的组合物分析所述动物的生物学样本。

59.一种检测或定量动物的生物学样本中HCV的方法，所述方法包括用权利要求20的组合物分析所述生物学样本。

60.权利要求1至8中任一项的多肽、权利要求9或10的制备物、权利要求11至19中任一项的肽表位、或其任何组合用于体外诊断、检测或定量生物学样本中HCV的应用。

61.包含权利要求1至8中任一项所述多肽或者权利要求11至19中任一项所述肽表位、以及MHC分子的复合物用于标记、检测或分离T细胞的应用。

62.包含权利要求1至8中任一项所述多肽或者权利要求11至19中任一项所述肽表位、以及MHC分子的复合物用于检测、选择、分选或鉴定T细胞表位和/或氨基酸序列的应用。

63.根据权利要求20至30中任一项的组合物，其中所述组合物是免疫原性或者疫苗组合物。

64.一种包含与基底结合的权利要求1至8中任一项所述多肽、权利要求11至19中任一项所述肽表位、或者两者都包含的多肽微阵列。

65.根据权利要求64的多肽微阵列，其还包含与所述基底结合的MHC分子。

66.一种包含与基底结合的权利要求31所述抗体的多肽微阵列。

67.一种包含与基底结合的MHC复合物的多肽微阵列，所述复合物包含权利要求1至8中任一项的多肽或者权利要求11至19中任一项的肽表位以及MHC分子。

68.一种检测或者诊断动物中HCV感染的方法，所述方法包括：

(a)将所述动物的生物学样本与权利要求64至67中任一项的多肽微阵列相接触；和

(b)确定所述生物学样本的成分与所述多肽微阵列的结合；其中所述结合指示HCV感染。

69.一种包含选自权利要求1至8中任一项的多肽、权利要求11至19中任一项的肽表位、权利要求31的抗体和/或权利要求64至67中任一项的多肽微阵列、以及用于检测和/或诊断HCV感染的使用说明的商业包装物。

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