CN101084042A - 用于兽医学和人类医学预防和治疗的新疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新疫苗、其在人类医学和兽医学中用于免疫预防和/或治疗假丝酵母属真菌病的用途及其制备方法，其中所述疫苗包含下述假丝酵母属菌株组合：a1)白假丝酵母CCM 8355，a2)光滑假丝酵母CCM 8356，a3)克鲁斯假丝酵母CCM 8357，和a4)免疫调节的痤疮丙酸杆菌菌株，以及任选的可药用赋形剂，例如载体，其中最终产物中接种剂菌株a1－a4的比例为a1∶a2∶a3∶a4＝10－20∶10－20∶10－20∶40－70。

Description

用于兽医学和人类医学预防和治疗的新疫苗
技术领域
本发明涉及新疫苗、其在兽医学和人类医学中用于免疫预防和治疗假丝酵母属真菌病的用途，及其制备方法。
背景技术
真菌病是由酵母和低等真菌造成的。约10,000个已知真菌变种中只有约300个变种是对人致病的。它们的有害效应一方面基于对活组织的直接攻击，另一方面基于产生真菌毒素及其间接效应，例如诱导变态反应。根据感染的位置，区分为全身性真菌病和浅表性真菌病。
假丝酵母属(Candida)是一种具有众多可能致病物种的不产芽孢的芽酵母属。白假丝酵母病最常见的病原体是白假丝酵母菌(C.albicans)、季也蒙假丝酵母(C.guilliermondii)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、星形假丝酵母(C.stellatoidea)、光滑假丝酵母(C. glabrata)和热带假丝酵母(C. tropicalis)。
假丝酵母属真菌病是由假丝酵母属物种(主要是白假丝酵母)引起的机会性真菌病(真菌疾病)，其可表现为皮肤病或粘膜皮肤病，特别是口腔粘膜炎(鹅口疮)、食管炎、尿布红斑或外阴阴道炎。它们还可系统性地表现为威胁生命的全身白假丝酵母病，特别是在新生儿和免疫能力被破坏的患者中。这具体发生在施用细胞抑制剂或抗生素、类固醇或激素时，或肠胃外营养、恶性病、内分泌病或免疫缺陷的情况下。最近，由假丝酵母属引起的医院真菌病发生显著增多(参见例如
Figure A20058003213900061
Figure A20058003213900062
a Slovenskáfarmacie，第LI卷，第5版，2002年9月，226-235页)，且这些真菌病是住院病人发病率的主要原因，尤其是他们死亡率的主要原因。
尽管用于治疗浅表性真菌病有大量活性物质选择，治疗全身性真菌病的可能性是非常有限的。
Figure A20058003213900071
等人，Epidemiol.Microbiol.Immunol.，52，2003，No.1，25-33页的文章总结了遗传工程在研发针对真菌感染的新治疗剂时的作用。
如上文所述，在过去几年中真菌感染的发生显著增多。这特别是由于具有被抑制的免疫体系的患者(例如移植受体、癌症和HIV患者)数量持续增多。另一方面，广谱抗真菌药的广泛使用产生大量抗性致病菌株，其进一步加重了该状况(参见例如Jarvis等人，Clinical Infectious Disease，1995，20，1526-30页；Beck-Sague等人，The Journal of Infectious Disease，1993，167，1247-51页；Gottfredson等人，Pathology，30，1998，405-418页；等人，Epidemiol.Microbiol.Immunol.，51，2002，No.3，119-124页；Rex等人，Antimicrob.Agents Chemother.，39，1995，1-8页；Kunová，Epidemiol.Microbiol.Immunol.，51，2002，No.3，131-134页)。
然而人最常见的真菌感染是阴道真菌感染。在本文中，问题在于这类感染很经常成为慢性的，并且在这些情况下局部并且大部分长时间给药的抗真菌药通常保持无效。
以免疫为基础，制备针对真菌病的治疗剂描述于Bernardis等人，Infection and Immunity，1994年2月，509-519页；Bernardis等人，Infectionand Immunity，1997年8月，3399-3404页；de Bernardis等人，Infection andImmunity，2000年6月，3297-3304页；Martinez等人，Clinical MicrobiologyReviews，1998年1月，121-141页；Polonelli等人，Med.Mycol.，2000，38，Suppl.1：281-292；Medling等人，Mycoses，1966，39，177-183页和《Candidaand Candidosis》；第二版，1988，Baillière Tindal W.B.Saunders，London中Odds F.C.
因此经过一些时间，已经进行许多努力以产生针对真菌感染，特别是针对假丝酵母属感染的疫苗。途径有多种。
因此，CS 277 558描述了用于口服和/或局部治疗由酵母引起的慢性阴道炎和其他慢性粘膜炎症的疫苗，其中该疫苗还可与抗真菌药组合使用。该疫苗包含三种白假丝酵母菌株(CA 37、CA 91和CA 120)、克鲁斯假丝酵母菌株(CK 9)、光滑假丝酵母菌株(TG 15)和三个痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium aches)菌株(PA 3、PA 17和PA 530)。
RU 2185842描述了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)任选与两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)和/或乳杆菌属(Lactobacilli)菌株组合的制剂，其用于治疗特别是假丝酵母属引起的泌尿生殖感染。
US 5,578,309、US 2002/0160009A1和WO 00/52053描述了来自白假丝酵母的磷酸甘露聚糖(phosphomannan)用于治疗假丝酵母属感染的用途，尤其是单克隆抗体用于针对假丝酵母属感染的被动免疫的用途。
WO 96/07426公开了不含佐剂的疫苗，其肠内施用并含有已杀死的能够感染阴道的微生物，例如白假丝酵母、阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、阴道滴虫(Trichomonasvaginalis)或生殖器疱疹(Herpes genitalis)。
US 6,099,853特别描述了用于治疗泌尿生殖感染的配方，其为含有8到14个不同的灭活非致病性菌株的栓剂形式，所述菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、摩氏变形菌(Proteus morganii)和粪链球菌(Streptococcus faecalis)。
US 4,732,763的主旨是含有用于被动或自动免疫女性生殖道的微粒的抗体和抗原。US 5,288,639描述来自假丝酵母属的多肽序列和由此产生用于治疗和诊断真菌病(特别是假丝酵母属真菌病)的抗体的用途，所述多肽序列与其他生物的已知应激蛋白具有高度同源性。
另一方面，US 4,678,748公开了用于产生免疫生物制品的方法，所述制品用于诊断、预防和/或治疗季也蒙假丝酵母感染。
发明详述
本发明首先涉及含有下述假丝酵母属菌株组合的新疫苗：
a1)白假丝酵母CCM 8355，
a2)光滑假丝酵母CCM 8356，
a3)克鲁斯假丝酵母CCM 8357，和
a4)免疫调节的痤疮丙酸杆菌菌株，以及任选的一种或多种赋形剂如介质、填充剂或载体，其中最终产物中组分a1-a4的比例为a1∶a2∶a3∶a4＝10-20∶10-20∶10-20∶40-70。
另外，本发明涉及用于制备本发明疫苗的方法。
本发明的疫苗用于人类医学及兽医学。
根据本发明，假丝酵母属真菌病(白假丝酵母病)是指由假丝酵母属真菌引起的疾病。如上所述，其可局部或全身性发生。
因此，本发明提供用于预防和/或治疗局部、皮肤或粘膜皮肤和/或全身性白假丝酵母病的疫苗。
本文中局部白假丝酵母病可涉及生殖道、生殖泌尿道、口腔、胃肠道、乳腺、耳道或皮肤的外部粘膜。
具体的包括口腔粘膜炎(鹅口疮)、食管炎、尿布红斑、带小疱状突起的脓包病(pyodermitis pustulosa)、滤泡炎、红斑鳞屑(erythematosquamous)形式、擦烂、静脉炎、肉芽肿白假丝酵母病、肉芽肿、甲床炎、甲沟炎、candidomycetica指间糜烂、足分枝菌病(特别是腿的)、外阴阴道炎、注射后脓肿、烫伤后并发症、口角炎(传染性口角炎)、舌炎、lingua pilosa nigra、舌增生性白假丝酵母病(hyperplastic lingualcandidiasis)、口腔白斑、扁桃体白假丝酵母病、角膜炎、眼内炎、角膜溃疡、耳炎和龟头炎。
全身性白假丝酵母病(用本发明的疫苗可能对其治疗并预防)特别包括全身系统性念珠菌病、念珠菌血症、急性血源性播散白假丝酵母病、慢性播散白假丝酵母病、念珠菌性心内膜炎、念珠菌性心包炎、脓性静脉炎、念珠菌性脑膜炎、念珠菌性肺炎、念珠菌性骨髓炎、念珠菌性纵隔炎、念珠菌性关节炎、念珠菌性胃炎、念珠菌性结肠炎、间质性白假丝酵母病、腹膜炎、angiolitis、口咽和食管白假丝酵母病、肾脏白假丝酵母病、uretritis、cystitis pseudomembranacea、足菌肿、肾脓肿、念珠菌性支气管炎、念珠菌性支气管肺炎、原发支气管白假丝酵母病、原发肺白假丝酵母病、念珠菌性脑膜脑炎、脑脓肿或由播散性原发全身性白假丝酵母病引起的眼睛损伤；另外还有变态反应诱导的疾病如支气管哮喘、支气管炎、鼻炎、湿疹、农民肺以及类似的综合症。
免疫调节痤疮丙酸杆菌菌株优选为痤疮丙酸杆菌CCM7083。测试的其他免疫调节痤疮丙酸杆菌菌株为痤疮丙酸杆菌PA3和痤疮丙酸杆菌PA530。
另外，优选其中a1∶a2∶a3∶a4比例为15-20∶15-20∶15-20∶40-55或10-15∶10-15∶10-15∶55-7的疫苗。特别优选比例为a1∶a2∶a3∶a4＝10∶10∶10∶70和20∶20∶20∶40或15∶15∶15∶55。甚至更优选口服的比例a1∶a2∶a3∶a4＝10∶10∶10∶70，用于阴道施用的比例a1∶a2∶a3∶a4＝15∶15∶15∶55和直肠施用的比例a1∶a2∶a3∶a4＝20∶20∶20∶40。
根据本发明的疫苗优选每剂量含有的疫苗菌株a1到a4的总干重为2到10mg。
最终产物中甲醛总含量计优选少于0.02wt％。
本发明的疫苗可由本领域技术人员通过本身已知的方法(例如根据Remington’s Pharmaceutical Sciences第15版)配制为肠胃外、局部或口服的剂型。
本文中，特别优选局部、阴道或直肠施用。
本发明疫苗的剂型特别包括(硬)胶囊剂、片剂、锭剂、软锭剂、糖浆剂、口服混悬剂、口服乳剂、球剂、丸剂、直肠栓剂、阴道栓剂、阴道珠剂、针剂、预装注射器、气雾剂、吹入剂和漱口剂。
根据本发明使用的赋形剂包括例如稀释剂、载体、介质、防腐剂、着色剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、增溶剂、结网剂、溶剂、缓冲剂、胶凝剂、增稠剂、成膜剂、助流剂、润滑剂、分型剂、整流剂、吸着剂、抗氧化剂以及口味和气味校正剂。
栓剂和阴道珠剂的主要成分包括含脂质和水溶性的制剂，特别含有可可脂、硬化的脂肪、聚乙二醇6000，PEG 6000或使用的聚乙二醇或甘油明胶混合物。
特别是当配制口服剂型时，使用二氧化硅气溶胶、蔗糖、淀粉(特别是马铃薯淀粉)或至少两种上述物质的混合物作为载体/介质。
本发明的疫苗还可用于人类医学或兽医学，以预防和/或治疗局部或全身性白假丝酵母病，例如皮肤真菌病、肺真菌病、肠真菌病或深部真菌病(例如着色真菌病、足分枝菌病、瘢痕疙瘩性芽生菌病、藻菌病、芽生菌病或球孢子菌病。
由于关于抗原的广泛组成，本发明的疫苗不仅能够诱导针对同源假丝酵母属菌株的免疫，而且激发针对其他真菌病病原体的交叉反应，例如酵母样新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、霉菌样黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、密丛毛霉(Mucor plumbeus)、Mucor rouxii、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、构巢裸孢壳(Emericella nidulans)、Alternariasolani、链格孢(Alternaria alternate)、Malassezia pachydermatis、秕糠状鳞斑霉(Malassezia furfur)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和深红酵母(Rhodotorula rubra)；双态性真菌样Candida dubliniensis、解脂假丝酵母(Candida liolytica)、延沫假丝酵母(Candida zeylanoide)、Candidapelliculosa、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和季也蒙假丝酵母和皮肤真菌样Trychophyton verrucosum、Trychophyton rubrum、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、Microsporum canis和Trichophyton equinum，并且因此本发明的疫苗能够提供保护。
本发明的痤疮丙酸杆菌菌株具有显著的非特异性免疫刺激效应，并因此对特异性免疫应答的形成具有积极影响，从而引起免疫应答的整体加强。
另外，本发明的疫苗可与其他药物组合物(如抗真菌药或抗生素)组合施用。这可同时完成、以一定时间间隔连续完成或作为具体的治疗方案完成。
使用的疫苗菌株a1到a3属于假丝酵母属，菌株白假丝酵母CCM 8355(a1)、光滑假丝酵母CCM 8356(a2)和克鲁斯假丝酵母CCM 8357(a3)的培养物已由申请者在2003年1月23日根据布达佩斯条约保藏于CCM-捷克微生物保藏中心，Masaryk University，Tvrdeho 14，620 00 Brno，CzechRepublic，保藏号分别为CCM 8355、CCM 8356和CCM 8357。
另外，优选使用痤疮丙酸杆菌CCM 7083(免疫调节痤疮丙酸杆菌菌株)作为疫苗菌株a4。痤疮丙酸杆菌CCM 7083的培养物也由申请者在2003年1月23日根据布达佩斯条约保藏于CCM-捷克微生物保藏中心，Masaryk University，Tvrdeho 14，620 00 Brno，Czech Republic，保藏号为CCM 7083。
由于在本发明最优混和比例下选择假丝酵母属菌株和免疫调节痤疮丙酸杆菌菌株，本发明的疫苗对患者免疫体系具有积极影响，并可用于预防和治疗存在的局部和全身假丝酵母属真菌病。
尽管已知大量病原体假丝酵母属和丙酸杆菌属(Propionibacterium)菌株，通常除个别菌株外，它们在不同的体内动物模型中不能检测到免疫调节或免疫刺激效应。然而令人惊奇的是，本发明的疫苗菌株对免疫系统具有积极影响。
菌株进一步表征如下：
1.1假丝酵母属菌株
a)同化作用
    白假丝酵母CCM8355   克鲁斯假丝酵母CCM8357     光滑假丝酵母CCM8356
半乳糖     +   -     -
麦芽糖     +   -     -
蔗糖     +   -     -
木糖     +   -     -
侧金盏糖醇     +   -     -
柠檬酸盐     +   +     -
赤藓糖醇     +   -     -
  柠檬酸盐     +     +     -
  赤藓糖醇     +     -     -
  甘露醇     +     -     -
  山梨糖     -     -     +
  淀粉     +     -     -
  海藻糖     +     -     +
b)发酵活性
    白假丝酵母CCM8355   克鲁斯假丝酵母CCM8357     光滑假丝酵母CCM8356
    半乳糖     -   -     -
    麦芽糖     +   -     -
c)菌株的进一步表征
    白假丝酵母CCM8355   克鲁斯假丝酵母CCM8357   光滑假丝酵母CCM8356
  厚壁孢子形成假菌丝体形成     ++   -+   -
  放线酮抗性     +   -   -
  (放线酮)NaIO4     +   -   +
  对pH1.55的耐性对pH1.4的耐性     ++   +- -
  在McConkey琼脂上生长 - + +
  血清型     A   未定义   未定义
所有选择的假丝酵母属菌株在37℃生长并抗氯化钠和硼酸。菌株不产生节孢子或荚膜、色素、酚氧化酶或蛋白水解酶。
丙酸杆菌属菌株
检测
  痤疮丙酸杆菌CCM7083
消化果糖消化半乳糖消化葡萄糖   --+
明胶的水解   -
乳的凝固   -
硝酸盐的减少   +
选择的丙酸杆菌属菌株为过氧化氢酶阳性(即其产生过氧化氢酶)、青霉素敏感并产生吲哚。该菌株不运动并且不消化乳糖或麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、水杨苷、海藻糖或七叶苷。该菌株不产生卵磷脂酶或脂肪酶、脲酶或色素。也未观察到乳的预消化。
图1-3显示4个疫苗菌株的PCR特性。
另外，本发明涉及用于制备本发明疫苗的方法，其包括下列步骤：
1)独立培养疫苗菌株a1到a4并分离细胞物质；
2)通过甲醛灭活假丝酵母属菌株a1到a3；
3)热灭活痤疮丙酸杆菌菌株a4；
4)独立冻干菌株a1到a4；以及
5)将疫苗菌株与任选的一种或多种赋形剂、载体、介质混和；以及
6)任选地配制剂型。
其他可能用于灭活疫苗菌株的方法为(特别是)化学(如用β-丙醇酸内酯)灭活。
在优选的本发明方法中，在步骤1)中，假丝酵母属菌株a1到a3在好气条件下，分别在葡萄糖蛋白胨琼脂上23到27℃独立培养48到72小时，或在沙氏琼脂上35到39℃培养22到27小时，然后用注射用无菌水洗涤并在三个冻融循环中裂解。
在另一优选的本发明方法中，在步骤1)中，假丝酵母属菌株a1到a3在好气条件下，分别在沙氏培养基上在37℃培养24到48小时。
随后使用300kDa截断的超滤药筒分离细菌细胞，并用无菌生理盐水重复洗涤并以4,500g(例如Jouan KR 22，5,000转/分钟)离心纯化。然后用注射用无菌水洗涤分离的细菌细胞并在三个冻融循环(至少-20℃)中裂解。除通过冻融循环裂解疫苗菌株a1到a3外，可通过超声方法进行裂解。
在另一优选的本发明方法中，在步骤1)中，痤疮丙酸杆菌菌株a4分别在血琼脂、含血的强化梭菌琼脂或VL琼脂上，在严格缺氧条件下35到39℃独立培养46到50小时，分离并随后用注射用无菌水洗涤并在2到8℃裂解并抽提22到26小时，并在步骤3)中过以至少24小时的间隔三次加热至56到62℃一个小时以将其灭活。
在另一优选的本发明方法中，在步骤1)中，痤疮丙酸杆菌菌株a4在强化梭菌培养基上，在严格缺氧，静态条件下35到39℃培养46到50小时，使用300kDa截断的超滤药筒分离细菌物质。然后用生理盐水重复洗涤并以4,500g(例如Jouan KR 22，5,000转/分钟)离心纯化，随后在2到8℃用注射用无菌水裂解并抽提22到26小时。在步骤3)中以至少24小时的间隔三次加热至56到62℃一个小时以将其灭活。
在特别优选的本发明方法中，在步骤1)中，在发酵罐/生物反应器中分别培养(优选连续地)菌株a1到a4并随后分离。本发明可使用的生物反应器为例如APPLIKON ADI，270升。
本文优选假丝酵母属菌株a1到a3在无菌液体沙氏培养基中、好气条件、0.1-0.2bar、15-20％O2、pH 5.6到7.2、23到27℃下以40-50转/分钟培养16到24小时。
反应器/发酵罐中用于痤疮丙酸杆菌菌株a4的优选培养条件包括：好气条件、0.1-0.2bar、以约10升/分钟添加N∶CO2(1∶2)混合物、最大1％O2、pH 6.4到7.2、35到39℃下在液体改良的强化梭菌培养基中以40到50转/分钟培养15到17小时的时间。
如果培养在发酵罐/生物反应器中进行，细胞物质的分离优选以3,600g到5,300g的工业超速离心或超滤完成。
其他用于灭活疫苗的可能方法为(特别是)化学灭活，例如用β-丙醇酸内酯。
如从动物模型和人类医学中地应用实例可以清楚看到的，本发明提供高效疫苗，而且其易于肠胃外用(非必需)施用。
生产和应用实施例
生产实施例1：生产口服的疫苗
使用沙氏琼脂来培养假丝酵母属菌株a1到a3，所述琼脂已在80到100kPa的超压下灭菌20到30分钟。将pH调节至6.0到6.9后，将琼脂倒进皮氏培养皿中并在相同条件下再灭菌一次。检查含有固化培养基的皮氏培养皿的无菌性并用单个假丝酵母属菌株a1到a3分别接种。为此，使用冻干物或新鲜接种，将其分布于培养基表面，然后在好气条件，常压及90-98％的大气湿度下，23到27℃培养48到72小时直到获得最佳生长(在Br中使用分光计在605 nm处通过OD-测量确定)。然后用注射用无菌水从培养基表面收获培养物并在三次冻融循环中裂解(至少-20℃)。加入甲醛水溶液灭活获得的裂解液。最终产物的总甲醛含量低少于0.02wt％。检测无菌性后，将灭活的假丝酵母属菌株裂解液冷冻干燥48小时直到残余的水含量优选小于3％。
使用强化梭菌琼脂用于培养痤疮丙酸杆菌疫苗菌株。将培养基在高压灭菌器中以80到100kPa的超压灭菌20到30分钟。将pH调节至6.6到7.0后，将培养基倒进玻璃皮氏培养皿中并在相同条件下再灭菌一次。检查固化培养基的无菌性并用痤疮丙酸杆菌疫苗菌株培养物接种。将疫苗菌株分布于培养基表面，然后在严格缺氧条件下35到39℃培养46到50小时，直到生长达到最佳。然后在最高抗原产量状态(在Br中使用分光计在605nm处通过OD-测量确定)下使用注射用无菌水收获培养物，并在2到8℃抽提22到26小时。通过以至少24小时的间隔三次加热至56到62℃一个小时灭活获得的细胞物质。检测无菌性后，将灭活的细胞物质冷冻干燥48小时直到残余的水含量优选小于3％。
冷冻干燥后，将菌株混和于载体或另一合适的介质中，使得最终产物以a1∶a2∶a3∶a4＝10∶10∶10∶70的比例含有菌株，所述携带者由气溶胶、蔗糖和马铃薯淀粉组成。
以该方法获得的混合物填入(硬)胶囊用于口服，每个胶囊含有2mg疫苗菌株和248mg载体/介质。检查最终产物的微生物纯度、残余水含量、可溶性和甲醛含量。
在小鼠实验应用中，疫苗诱导了强特异性体液和细胞免疫应答，如下文例证。
生产实施例2：生产经阴道施用的疫苗
待使用的菌株以实施例1所述方法培养。
冷冻干燥后，将菌株与熔化的可可脂混和，以使最终产物以a1∶a2∶a3∶a4＝15∶15∶15∶55的比例含有菌株，并以已知方式产生阴道栓剂。
阴道栓剂含有6mg疫苗菌株(干重)和3g可可脂(或其他基质)。
检查最终产物的微生物纯度、可溶性和甲醛含量。
在小鼠实验应用中也引起了实施例1所示的性质。
生产实施例3：生产经直肠施用的疫苗
待使用的菌株以实施例1所述方法培养。冷冻干燥后，将菌株与熔化的可可脂混和，以使最终产物以a1∶a2∶a3∶a4＝20∶20∶20∶40的比例含有菌株，并以已知方式产生直肠栓剂。
直肠栓剂含有10mg疫苗菌株(干重)和3g可可脂(或其他常规基质)。
检查最终产物的微生物纯度、可溶性和甲醛含量。
在小鼠实验应用中也引起了实施例1和2所示的性质。
生产实施例4：使用发酵技术生产疫苗
为了大规模(分别为250和200升)培养本发明的假丝酵母属和痤疮丙酸杆菌菌株，使用具有可控培养条件的特殊生物反应器，例如APPLIKON ADI，270升。
本发明的假丝酵母属疫苗菌株在pH5.8到7.2的无菌改良的沙氏培养基中分别培养。为了接种培养基，使用新制备的各个假丝酵母属菌株培养物。在受控的温度23到27℃，好气条件下培养菌株16到24小时，直至达到最佳生长(在Br中使用分光计在605nm处通过OD-测量确定)。
通过工业超速离心或超滤完成细胞物质的分离。
其他的步骤与实施例1到3描述的使用琼脂的静态法相同。
痤疮丙酸杆菌菌株也在生物反应器中，在pH6.4到7.2的无菌液体改良的Reinforced Clostridial培养基中培养。为了接种培养基，使用新制备的痤疮丙酸杆菌菌株。在受控的温度35到30℃及严格缺氧条件下培养菌株15到17小时。通过工业超速离心或超滤完成细胞物质的分离。
其他的步骤与实施例1到3描述的使用琼脂的静态法相同。
小鼠模型中的效力
实施例1：本发明疫苗的免疫刺激活性
与未接种对照实验室动物相比，如下研究对用痤疮丙酸杆菌CCM7083、光滑假丝酵母CCM 8356、白假丝酵母CCM 8355和克鲁斯假丝酵母CCM 8357接种的实验室小鼠肝和脾重量和总重量，以说明疫苗的免疫调节活性。
接种：剂量为0.5ml，含有0.75mg痤疮丙酸杆菌菌株CCM 7083、0.25mg光滑假丝酵母菌株CCM 8356、0.25mg白假丝酵母菌株CCM 8355和0.25mg克鲁斯假丝酵母菌株CCM 8357。
给药途径：腹膜内
动物物种：雌性白色实验室小鼠(HAN:ICR杂种)
数目：110
重量：平均30g(84日龄小鼠)
接种组中的动物数：11
对照组中的动物数：11
方法：以0、15、30、45和60天的常规间隔处死并解剖一组接种的和一组未接种(对照)的小鼠。分别测量肝重量、脾重量和总重量。给药后60天结束实验。与未接种的实验室小鼠相比，6周后接种的小鼠应恢复正常。
对小鼠施用痤疮丙酸杆菌菌株、光滑假丝酵母菌株、白假丝酵母菌株和克鲁斯假丝酵母菌株后，接种的小鼠与没有接受本发明菌株剂量的对照小鼠相比显示显著的肝和脾重量提高(见表1，下文)，从而证明本发明疫苗的免疫调节活性。
肝在施用菌株后第30天恢复其正常大小，脾约为第45天。
表1：实施例1结果概述
施用后天数   肝   脾 总重量(g)
  接种小鼠   对照小鼠   接种小鼠 对照小鼠 接种小鼠 对照小鼠
  0(给药前)   -   -   - - - -
  第15天   +   -   + - - -
  第30天   -   -   + - - -
  第45天   -   -   - - - -
  第60天   -   -   - - - -
说明：+与对照动物相比，器官重量显著提高
-与对照动物相比，器官重量无显著提高
实施例2：使用生产实施例1的制剂的攻击测试
方法：使用四十只重量为15到18g的C3H/HeJ小鼠用于测试。小鼠分为以下四个测试组：
-第1对照组——10只小鼠——无接种，无攻击
-第2对照组——10只小鼠以0.5ml剂量口服(每只小鼠一剂为0.5ml，含有1.5mg溶解地测试菌株——0.75mg痤疮丙酸杆菌菌株、0.25mg白假丝酵母菌株、0.25mg光滑假丝酵母菌株和0.25mg克鲁斯假丝酵母菌株)下列本发明用于人的胶囊(即CANDIVAC胶囊根据习惯应用于人，生产实施例1)的制剂来免疫。在第0、7和14天对该组动物施用疫苗。最后一剂后二十四小时，对动物皮下施用0.2ml剂量的含有1.5×104.0细菌(100 MLD50)的攻击细菌菌株土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)。
-第3组10只小鼠——与第2组相同，然而疫苗以0.5ml的剂量腹膜内施用。
-第4组10只小鼠——对照组，只以1.5×104.0(100 MLD50)的剂量施用攻击细菌土拉热弗朗西丝氏菌。
用土拉热弗朗西丝氏菌攻击后，监控所有动物28天，并记录测试小鼠的发病率和死亡率。
结果：与未接种对照小鼠(100％死亡)相比，根据生产实施例1的根据习惯应用于人的CANDIVA胶囊显著提高小鼠口服施用(80％小鼠存活)和腹膜内注射施用(90％小鼠存活)后的存活率，并因此提供了保护。
结果在下文表2中总结。
表2：攻击测试的结果
  组编号     小鼠数量     接种   攻击土拉热弗朗西丝氏菌   存活小鼠数量(pc/％)   死亡小鼠数量(pc/％) 死亡率
1 10 - -   10 pc(100％)   0 pc(0％) 无死亡
2 10     0.5ml口服 100 MLD50   8 pc(80％)   2 pc(20％) 感染后第12天和第13天小鼠死亡
3 10     0.5ml腹膜内 100 MLD50   9 pc(90％)   1 pc(10％) 感染后第13天小鼠死亡
4 10 - 100 MLD50   0 pc(0％)   10 pc(100％) 感染后第7天和第11天之间死亡
实施例3：本发明疫苗的出芽转化测试
测试方法：在测试的第0、7和14天对BALB/c小鼠腹膜注射和皮下施用对应于本发明用于人的口服胶囊(即CANDIVAC caps.ad us.hum.，生产实施例1)的配方的制剂。对照组使用缓冲盐水。
施用最后一剂后24小时、48小时、72小时、5天和7天处死部分动物。从获得的脾制备细胞悬液并稀释为4×106细胞每ml培养基的浓度。用移液管将20μl该细胞悬液和50μl促有丝分裂剂移至测试试剂盒的孔中。使用2μl/1ml培养基浓度的ConA和20μl/1ml培养基浓度的LPS(脂多糖)。使用100μl/1ml培养基浓度的疫苗CANDIVAC的特异抗原。细胞和促有丝分裂剂在37℃、5％CO2中孵育67小时。然后加入50μg标记的胸苷(每孔1μCi)。将测试平板在37℃、5％CO2和100％大气湿度下再孵育5小时。通过harvester Flow收集细胞后，将细胞转移进含有闪烁液的小瓶中，使用Rackbeta计算机测量放射性(β-辐射)并以cpm表达。
结果：疫苗CANDIVAC的两种给药途径都在几乎所有的时间段中增强细胞增殖，只有在口服给药后第7天，细胞增殖没有统计学显著的提高。
表3：施用本发明疫苗后脾细胞出芽转化的测试结果
体外刺激   培养基(PBS)     ConA5 μg/ml  LPS20μg/ml CANDIVAC100 ConA 5μg/ml
  口服   腹膜注射   口服   腹膜注射  口服   腹膜注射 口服     腹膜注射
第1天   3.18**   2.77**   0.97   1.77**  2.53**   0.52** 5.86**     4.24**
第2天   1.89*   3.84**   1.23*   0.85*  1.27   0.57* 4.94**     5.32*
第3天   2.67**   2.78**   0.71   0.39  1.63**   0.65* 2.33**     7.44**
第4天   1.27   3.24*   0.72*   0.59*  1.34*   0.79 2.35**     8.53**
第5天   1.87*   3.36   0.83   0.74  2.80**   0.54** 0.57     7.80**
**p＜0.01，*p＜0.05
表3显示脾细胞(称为培养基)的基底淋巴组织增生和用ConA、LPS和本发明疫苗体外刺激后的脾细胞增殖。结果以接种的小鼠和对照小鼠细胞的转化指数、淋巴组织增生比例的形式表明。
在动物模型(小鼠)中确定本发明疫苗中各个本发明菌株(白假丝酵母(CCM 8355)、光滑假丝酵母(CCM 8356)、克鲁斯假丝酵母(CCM 8357)和痤疮丙酸杆菌(CCM 7083))的比例
测试方法
使用不同比例的本发明假丝酵母属菌株和丙酸杆菌属菌株制备疫苗。
将不同比例的5mg疫苗菌株干物质溶于1ml PBS pH7.2中。
对重量为16至20g的雌性杂种SPF-ICR小鼠腹膜内施用以这种方式制备的疫苗组合物(5只小鼠，每只0.2ml)。
10天后，用氯仿处死动物并解剖。
测定肝和脾重量的提高并组织学验证。腹腔施用PBS的2只小鼠组作为对照组。重量提高的结果使用非参数U检验统计学评价。
通过石蜡法和苏木精-伊红染色进行肝和脾的组织学检查。
接种后14天，以每只小鼠104.0活假丝酵母属细胞的白假丝酵母总剂量，通过静脉内施用活白假丝酵母的方法攻击每组中的三只剩余的接种动物和3只未接种对照动物。攻击实验后四周，处死所有的测试动物(接种的和未接种的小鼠)并检查活的白假丝酵母菌株细胞。
只有当不能从肾中分离白假丝酵母菌株并培养时，才认为疫苗具有保护性。
表4：疫苗菌株白假丝酵母(CCM 8355)、光滑假丝酵母(CCM 8356)、克鲁斯假丝酵母(CCM 8357)和痤疮丙酸杆菌(CCM 7083)(CA＝a1，CG＝a2，CK＝a3，PA＝a4)的比例对其产生的疫苗的保护活性和安全性的影响
疫苗组成 统计学显著的(p≤0.05)重量提高 组织学免疫调节效应   疫苗针对白假丝酵母的保护活性 安全性 结果
肝     脾   肝     脾
  1.a1∶a2∶a3∶a4＝10-20∶10-20∶10-20∶40-70 + + + + + 安全 一致
  2.a1∶a2∶a3∶a4＝15-20∶15-20∶15-20∶40-55 + + + + + 安全 一致
  3.a1∶a2∶a3∶a4＝10-15∶10-15∶10-15∶55-70 + + + + + 安全 一致
  4.a1∶a2∶a3∶a4＝10∶10∶10∶70 + + + + + 安全 一致
  5.a1∶a2∶a3∶a4＝15∶15∶15∶55 + + + + + 安全 一致
  6.a1∶a2∶a3∶a4＝20∶20∶20∶40 + + + + + 安全 一致
  7.a1∶a2∶a3∶a4＝5∶5∶5∶85 + + + + - 安全 不一致
  8.a1∶a2∶a3∶a4＝1∶1∶1∶97 + + + + - 安全 不一致
  9.a1∶a2∶a3∶a4＝25∶25∶25∶25 - + - + - 安全 不一致
  10.a1∶a2∶a3∶a4＝30∶30∶30∶10 - - - - - 安全 不一致
表4中的结果显示关于疫苗保护活性和安全性的最佳结果在根据本发明的4种疫苗菌株(白假丝酵母CCM 8355＝a1；光滑假丝酵母CCM8356＝a2；克鲁斯假丝酵母CCM 8357＝a3；痤疮丙酸杆菌CCM 7083＝a4)的比例如下时获得：
1.a1∶a2∶a3∶a4＝10-20∶10-20∶10-20∶40-70
2.a1∶a2∶a3∶a4＝15 20∶15-20∶15-20∶40-55
3.a1∶a2∶a3∶a4＝10-15∶10-15∶10-15∶55-70
4.a1∶a2∶a3∶a4＝10∶10∶10∶70
5.a1∶a2∶a3∶a4＝15∶15∶15∶55
6.a1∶a2∶a3∶a4＝20∶20∶20∶40
在用活假丝酵母属菌株进行的攻击测定中，疫苗组合物7、8、9和10未显示保护活性。
由于痤疮丙酸杆菌的数量多，组合物7和8显示非特异性免疫。不能获得对假丝酵母属的特异性保护。
组合物9和10显示为不足以产生非特异性及特异性免疫的形式。
证实由白假丝酵母(CCM 8355)菌株、光滑假丝酵母(CCM 8356)菌株、克鲁斯假丝酵母(CCM 8357)菌株和痤疮丙酸杆菌(CCM 7083)菌株制备的本发明疫苗在女性中的保护活性
表5a)阴道施用
治疗结果 患者数 ％     观察期(月)
    平均     范围
    优秀     6     54.5     9.7     2-13
    良好     3     27.3     11.3     10-12
    满意     0     0     -     -
    无效     2     18.2     12.0     12
    总计     11     100.0     -     -
表5b)口服
治疗结果 患者数 ％     观察期(月)
    平均     范围
  优秀     24     58.5     10.2     7-16
  良好     9     21.9     11.0     7-16
  满意     4     9.8     7.0     -
  无效     4     9.8     7.3     2-11
  总计     41     100.0     -     -
表5c)阴道和口服同时施用
治疗结果 患者数 ％     观察期(月)
    平均     范围
    优秀     5     35.7     8.6     6-11
    良好     5     35.7     14.0     12-18
    满意     2     14.3     7.0     5-9
    无效     2     14.3     6.0     3-9
    总计     14     100.0     -     -
以上显示的结果说明本发明的疫苗在大部分患者中提供了出色的保护活性，尤为重要的是，由于假丝酵母属感染(其常常具有漫长的过程)的难以解决的性质，其可成为全身性的并因此非常难以治疗。
医学应用实施例
应用实施例1：阴道栓剂
34岁女性在去游泳池游泳后患炎性阴道炎(搔痒、灼热、分泌物)，推测由真菌引起。用生产实施例2的假丝酵母属栓剂进行治疗——在连续的5天中每晚使用一个阴道栓剂。1天后，症状稍有改善，4天后，患者症状解除。
应用实施例2：阴道栓剂
47岁女性患者在施用抗生素后反复患真菌性阴道炎。在连续5天中用7个生产实施例2的假丝酵母属疫苗治疗(夜间，阴道)，结果在2天后有所改善，5天后患者症状解除。由于希望用抗生素进一步治疗，该女性分别在4周和8周后施用7颗胶囊的另一疗程。在10周后施用的抗生素未引起阴道炎复发。
应用实施例3：直肠栓剂
24岁患者患有痔引起的严重病症。尽管进行了硬化疗法，他仍然患有由肛门区搔痒和灼热引起的病症，提示在直肠中存在真菌。2-3天后，用10个生产实施例3的直肠栓剂进行治疗(连续10天，夜间，直肠)引起病症的明显改善，所述改善在6周后仍存在。
应用实施例4：口服胶囊
由于白血球减少，61岁老年患者患鹅口疮——由于反复使用，两性霉素B(amphothericin B)几乎无效。施用5个生产实施例1的假丝酵母属疫苗胶囊5天后，引起症状改善。4周和8周后，再施用2周期(各为5天)使病症保持在患者可接受的水平，虽然基本疾病仍然存在。
应用实施例5：胶囊
72岁老年女性患者持续患有胃肠道的意外症状，如排便不规律、腹泻、胃肠气胀和不适。由医学观点排除了严重的器官紊乱，看来可能在肠中存在真菌。在一个周期后，用生产实施例1的假丝酵母胶囊进行三个月的治疗(在每个月开始的连续10天，在早晨每天施用一个胶囊)，引起明显改善，3个周期后症状几乎消失。
兽医学应用实施例
此外，本发明的疫苗在兽医学中也可使用并且有效。其应用会特别有利于小动物，例如猫和犬。
如上文陈述及应用实施例，本发明由此提供高效并易于应用的用于在兽医学和人类医学中免疫预防和治疗假丝酵母属真菌病的疫苗。在人类医学中，本发明的疫苗可经口、肠胃外以及局部(特别是阴道和直肠)施用。在这种情况下，优选经口、阴道和直肠施用。此外，在兽医学中本发明的疫苗可消化道外、局部或经口施用。
因此，本发明提供易于使用和耐受良好的疫苗，所述疫苗用于在人类医学和兽医学中有效地免疫预防和治疗假丝酵母属真菌病。此外，由于优选的经口和局部施用，排除了可能的过敏性反应或过敏性样反应。

Claims (28)

1.包含下述假丝酵母属菌株组合的疫苗：
a1)白假丝酵母CCM 8355，
a2)光滑假丝酵母CCM 8356，
a3)克鲁斯假丝酵母CCM 8357，和
a4)免疫调节的痤疮丙酸杆菌菌株，以及任选的一种或多种赋形剂，其中最终产物中组分a1-a4的比例是a1∶a2∶a3∶a4为10-20∶10-20∶10-20∶40-70。
2.根据权利要求1的疫苗，其中免疫调节痤疮丙酸杆菌菌株(a4)为痤疮丙酸杆菌CCM7083。
3.根据权利要求1或2的疫苗，其中a1∶a2∶a3∶a4的比例为15-20∶15-20∶15-20∶40-55。
4.根据权利要求1或2的疫苗，其中a1∶a2∶a3∶a4的比例为10-15∶10-15∶10-15∶55-70。
5.根据前述任一项权利要求的疫苗，其中所有疫苗菌株a1到a4的总干重为每待施用剂量2到10mg。
6.根据前述任一项权利要求的疫苗，其中最终产物中总甲醛含量低于0.02wt％。
7.根据前述任一项权利要求的疫苗，其肠胃外、口或局部施用。
8.根据权利要求7的疫苗，其局部、阴道或直肠施用。
9.根据权利要求7的口服疫苗，其中a1∶a2∶a3∶a4的比例为10∶10∶10∶70。
10.根据权利要求7的阴道施用的疫苗，其中a1∶a2∶a3∶a4的比例为15∶15∶15∶55。
11.根据权利要求7的直肠施用的疫苗，其中a1∶a2∶a3∶a4的比例为20∶20∶20∶40。
12.根据前述任一项权利要求的疫苗，其配制为胶囊剂、片剂、锭剂、软锭剂、糖浆剂、口服混悬剂、口服乳剂、球剂、丸剂、栓剂、阴道珠剂、针剂、预装注射器、气雾剂、吹入剂或漱口剂。
13.根据前述任一项权利要求的疫苗，其用于预防和/或治疗局部、皮肤或粘膜皮肤和/或全身性白假丝酵母病。
14.根据权利要求13的疫苗，其中局部白假丝酵母病影响生殖道、生殖泌尿道、口腔、胃肠道、乳腺、耳道或皮肤的外部粘膜。
15.根据权利要求14的疫苗，其用于预防和/或治疗口腔粘膜炎(鹅口疮)、食管炎、尿布红斑或外阴阴道炎。
16.根据权利要求13的疫苗，其中全身性白假丝酵母病选自全身性系统念珠菌病、念珠菌血症、急性血源性播散白假丝酵母病、慢性播散白假丝酵母病、念珠菌性心内膜炎、念珠菌性心包炎、脓性静脉炎、念珠菌性脑膜炎、念珠菌性肺炎、念珠菌性骨髓炎、念珠菌性纵隔炎、念珠菌性关节炎、口咽和食管白假丝酵母病。
17.根据权利要求1到16任一项的疫苗，其用于兽医学。
18.根据权利要求1到16任一项的疫苗，其用于人类医学。
19.用于制备根据权利要求1到18任一项的疫苗的方法，其包括
1)  独立培养疫苗菌株a1到a4；
2)  通过甲醛灭活假丝酵母属菌株a1到a3；
3)  热灭活丙酸杆菌属菌株a4；
4)  冻干灭活的菌株；以及
5)  将疫苗菌株与任选的一种或多种赋形剂混和，得到a1∶a2∶a3∶a4的比例为10-20∶10-20∶10-20∶40-70的最终产物。
20.根据权利要求19的方法，其中所有疫苗菌株的总干重为每剂量2到10mg。
21.根据权利要求19或20的方法，其中最终产物中甲醛含量低于0.02wt％。
22.根据权利要求19到21任一项的方法，其中在步骤1)中，假丝酵母属菌株a1到a3在葡萄糖蛋白胨琼脂或沙氏琼脂上，好气条件、常压及90到98％大气湿度下，23到27℃培养48到72小时或35到39℃培养22到27小时，然后用注射用无菌水洗涤并在三个冻融循环中裂解。
23.根据权利要求19到21任一项的方法，其中在步骤1)中，假丝酵母属菌株a1到a3在沙氏培养基上，好气条件下37℃培养24到48小时，随后使用300kDa截断的超滤药筒分离细胞，然后用无菌生理盐水重复洗涤并以4,500g离心纯化，之后用注射用无菌水洗涤并在三个冻融循环中裂解细菌细胞。
24.根据权利要求19到23任一项的方法，其中在步骤1)中，痤疮丙酸杆菌菌株a4在血琼脂、含血的强化梭菌琼脂或VL琼脂上，在严格缺氧条件、常压及90到98％的大气湿度下，35到39℃培养46到50小时，随后用无菌蒸馏水裂解细菌，并在2到8℃抽提22到26小时，并且在步骤3)中以至少24小时的间隔三次将细菌物质加热至56到62℃一个小时以将其灭活。
25.根据权利要求19到23任一项的方法，其中在步骤1)中，痤疮丙酸杆菌菌株a4在强化梭菌培养基上，在严格缺氧条件及静态条件下，35到39℃培养46到50小时，使用300kDa截断的超滤药筒分离细菌细胞，然后用无菌生理盐水重复洗涤并以4,500g离心纯化，随后用无菌蒸馏水裂解细菌并在2到8℃抽提22到26小时，并且在步骤3)中以至少24小时的间隔三次将细菌物质加热至56到62℃一个小时以将其灭活。
26.根据权利要求19到25任一项的方法，其中疫苗菌株a1到a4在发酵罐中大规模培养。
27.根据权利要求26的方法，其中在步骤1)中，假丝酵母属菌株a1到a3在pH5.6到7.2的沙氏培养基中，23到27℃温度下40到50转/分钟培养16到24小时，培养条件为通入滤过大气，压力为0.1到0.2bar表压力，具有15到20％溶解氧的好气条件，并通过3,600到5,300g的工业超速离心、300kDa截断的超滤药筒超滤或其组合来分离菌株。
28.根据权利要求26或27的方法，其中在步骤1)中，痤疮丙酸杆菌菌株a4在pH6.4到7.2的强化梭菌培养基中，35到39℃下以40到50转/分钟培养15到17小时，培养条件为每分钟通入10升滤过的N∶CO2(1∶2)混合物、0.1-0.2bar表压力、最大1％溶解氧的严格缺氧条件，并通过3,600g到5,300g的工业超速离心、300kDa截断的超滤药筒超滤或其组合来分离菌株。
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