CN101081360A - 苯二氮䓬类分子表面印迹固相萃取剂的制备方法 - Google Patents
苯二氮䓬类分子表面印迹固相萃取剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
苯二氮䓬类分子表面印迹固相萃取剂的制备方法，先将苯二氮䓬类模板分子溶解于甲醇中，再加入功能单体A(含氨基的硅氧烷)和功能单体B(含苯基的硅氧烷)，搅拌预作用得到预聚合物，向上述溶液加入四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷，搅拌均匀后再加入经甲磺酸溶液活化的硅胶粒子，加酸催化水解缩合，过滤干燥得到粗品，最后将粗品洗脱纯化。本方法制备过程简单，所制备的表面分子印迹固相萃取剂对目标分子具有选择识别性，能完全排除样品中杂质的干扰，机械强度高，物理化学性质稳定，溶胀系数小。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种苯二氮类药物的分子印迹固相萃取剂的制备方法，即结合溶胶-凝胶法和表面印迹技术，制备一种对苯二氮类药物具有选择识别性的有机-无机杂化固相萃取材料。该萃取剂应用于分离富集生物样品中的苯二氮类药物。属于分离富集及分析检测技术领域。
二、背景技术
苯二氮类药物具有镇静、催眠、松弛中枢骨骼肌作用。该药物急性中毒的临床表现主要在肌肉和中枢神经系统方面，如出现肌无力、肌张力低下、共济运动失调、发音困难、嗜睡等症状，严重中毒时表现为昏迷、瞳孔散大、呼吸抑制、休克，甚至导致死亡。因此准确快速诊断是制定有效抢救措施的关键。
国内外常用的分离富集方法，以液液萃取和固相萃取为主。液液萃取需要消耗较大量的有机溶剂，且选择性不够高，导致测定过程中杂质干扰严重，经常无法准确定性、定量。以普通的吸附材料(如C18)作为固相萃取剂对体液进行前处理，也存在选择性较差，影响后续的准确定性、定量检测等问题。
分子印迹是近年来发展起来的制备高选择吸附材料技术，它是以目标分子为模板合成聚合物的方法。由于分子印迹聚合物中存在具有与模板分子相匹配空间结构和特有识别位点的孔穴，可以把目标分子或与目标分子结构相近的某一类化合物从复杂基体中选择性地吸附。目前分子印迹技术所用的功能单体和交联剂多数为甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯等有机化合物，制备的固相萃取剂遇有机溶剂易溶胀。使用合成方法一般为本体聚合法和沉淀聚合法，许多结合位点被包裹在分子印迹聚合物的刚性结构中，导致其选择吸附目标分子的传质速率不理想，模板分子难以完全从聚合物中洗脱下来，在实际使用中发生模板分子的渗漏，严重影响微量待测物的准确定量检测。
目前，关于溶胶-凝胶-表面分子印迹聚合物的文献已有报道，但没有以苯二氮类药物为模板、并用溶胶-凝胶法制备其表面印迹聚合物相关技术的报道。表面分子印迹溶胶-凝胶材料兼顾了溶胶-凝胶和表面分子印迹二者的优点，减少了模板分子的“包埋”现象，利于模板分子的洗脱和识别，提高了模板分子的利用率。表面分子印迹溶胶-凝胶材料同时具有热稳定性好、选择性高、易亲和位点多、传质速率快等优点。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种苯二氮类分子表面印迹固相萃取剂的制备方法。该方法的优点在于：制备过程简单，所制备的表面分子印迹聚合物机械强度高，物理化学性质稳定，溶胀系数小。
本发明包括如下具体步骤：
(1)硅胶粒子的活化：取硅胶粒子加入甲磺酸溶液中恒温搅拌回流，过滤并用水洗涤至呈中性，最后干燥至恒重，得到活化硅胶。
(2)功能单体与模板分子的预作用：将苯二氮类模板分子溶解于甲醇中，再加入功能单体A(含氨基的硅氧烷)和功能单体B(含苯基的硅氧烷)，搅拌预作用得到预聚合物，其中，三种物质的摩尔比为：功能单体A∶功能单体B∶模板分子＝1∶(1～1.5)∶(0.15～0.5)。
(3)表面分子印迹聚合物的制备：以步骤(2)中所用功能单体A的体积量为准，在步骤(2)溶液中加入1～2倍体积的四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷，充分搅拌，再加入0.5～2倍功能单体A质量的经步骤(1)制得的活化硅胶，最后加入1～2倍体积的水并在pH 3～5之间催化水解缩合；充分搅拌后静置使其完全水解缩合，过滤，干燥至恒重，得到表面分子印迹聚合物粗品。
(4)模板分子的洗脱：用乙酸/甲醇、或乙酸/乙腈溶液除去模板分子，再用甲醇、乙醇、丙醇或乙腈中的一种或一种以上将表面分子印迹聚合物粗品上残留的乙酸除去，干燥，得到所需的表面分子印迹聚合物纯品——苯二氮类药物的分子印迹固相萃取剂。
在上述方法中，步骤(1)中，硅胶粒子采用球型或无定型；甲磺酸溶液的质量分数一般为10％～90％；恒温搅拌回流的具体操作为：恒温100～120℃下搅拌回流8～12小时；干燥一般是在60～80℃真空条件下干燥至恒重。
步骤(2)中，苯二氮类模板分子可以是苯二氮类物质中的任意一种，如艾司唑仑、安定、阿普唑仑、咪达唑仑或三唑仑等；甲醇至少是分析纯；功能单体A(含氨基的硅氧烷)一般采用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷等，功能单体B(含苯基的硅氧烷)一般采用苯基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷等，；搅拌预作用的时间一般为0.5～1小时。
步骤(3)中，调节pH一般采用HCl或H2SO4等；水解缩合一般在常温下进行；干燥一般采用90～110℃真空干燥。
步骤(4)中，干燥一般是在60～80℃条件下真空干燥。
本发明方法具有如下的优点和效果：该方法既可用于无定型硅胶的修饰又可用于球型硅胶的修饰，且制备的表面分子印迹聚合物的粒径均匀，吸附过程中不易产生碎片，在室温下对目标物质分子的选择性吸附，即使在强极性的水-甲醇混合液中对目标分子仍然具有较好的选择吸附分离能力。在实际应用中，与普通的固相萃取、液液萃取等方法相比，该方法制备的固相萃取剂对目标分子具有更好的选择吸附性，能完全排除生物样品中杂质的干扰。
四、附图说明
图1是实施例1合成的固相萃取剂放大500倍的SEM图。
图2是实施例1合成的固相萃取剂放大3000倍的SEM图。
图3是实施例1合成的固相萃取剂的热失重曲线。
图4是实施例2合成的固相萃取剂、C18固相萃取剂和甲醇液液萃取处理样品的HPLC谱图。
五、具体实施方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1
取0.19g艾司唑仑溶解于5mL甲醇中，再加入1mL γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，1.1mL苯基三甲氧基硅烷，搅拌约0.5小时，加入2mL四乙氧基硅烷，然后搅拌5分钟，加入0.5g活化硅胶(无定型，粒径19～37μm)，最后加入1mL水并用盐酸调节pH至3催化水解缩合。待上述混合液搅拌充分后，静置使其完全水解缩合约24小时，之后过滤，100℃真空干燥至恒重。用乙酸/甲醇(1∶9，V/V)溶液索氏抽提除去模板分子，再用甲醇将表面分子印迹聚合物上残留的乙酸除去，最后，80℃真空干燥后备用。
图1和2分别是实施例1合成的固相萃取剂放大500倍和放大3000倍的SEM图。从图中可以看出，该固相萃取剂呈多孔状结构，这有利于缩短固相萃取剂识别目标分子的时间。
图3是实施例1合成的固相萃取剂的热失重曲线。在测试范围内(30～1000℃)该表面分子印迹聚合物总失重仅16％，特别是在100～400℃范围内失重低于3％，显现出很好的耐热性能。
用上述方法制得的固相萃取剂进行吸附实验，实验过程为：称取100mg实施例1的产品，装到一根空的固相萃取柱中(SUPELCO，内径0.4 cm)，得到固相萃取柱(MIP-SPE柱)，5*1mL甲醇活化，5*1mL甲醇/水1∶9(V/V)平衡。2mL浓度均为1μg/mL的艾司唑仑、阿普唑仑、安定的甲醇/水1∶9(V/V)溶液装载，3mL水溶液洗涤，2mL甲醇洗脱，直接用HPLC检测。结果表明，MIP-SPE能够100％的吸附溶液中的艾司唑仑、阿普唑仑、安定分子。本发明制备了一种对苯二氮类药物有富集效果的表面分子印迹固相萃取剂。
实施例2
取0.62g艾司唑仑溶解于15mL甲醇中，再加入1mL γ-氨基丙基三甲氧基硅烷，0.8mL苯基三甲氧基硅烷，搅拌约1小时，加入4mL四甲氧基硅烷，然后搅拌5分钟，加入1.8g活化硅胶(球型，粒径为5～10μm)，最后加入1mL水并用盐酸调节pH至4催化水解缩合。待上述混合液搅拌充分后，静置使其完全水解缩合约12小时，之后过滤，90℃真空干燥8小时。用乙酸/乙腈(1∶9，V/V)溶液索氏抽提除去模板分子，再用甲醇将表面分子印迹聚合物上残留的乙酸除去，最后，60℃真空干燥后备用。
用上述方法制得的微球固相萃取剂处理生物样品，实验过程为：取1ml含艾司唑仑2μg/ml的血浆分别过实施例2合成的固相萃取剂-SPE柱和C18-SPE柱，然后用3ml的水淋洗后，再用2ml的甲醇洗脱，洗脱接收液直接用HPLC测定其浓度。为了与固相萃取比较，我们用2ml甲醇萃取1ml血浆样品中艾司唑仑分子，经0.45μm滤膜过滤后用HPLC测量其浓度。色谱图如图4所示。
图4是实施例2合成的固相萃取剂、C18和甲醇液液萃取处理样品后，进样HPLC的谱图对比图。从上到下依次为实施例2合成的固相萃取剂处理后进样；经C18固相萃取剂处理后进样；经甲醇液液萃取后直接进样。经MIP-SPE柱处理的艾司唑仑回收率约为98.7％。实验表明，MIP-SPE柱对其底物有较好的分离和富集效果，在利用高效液相色谱进行检测时能达到基线分离，可以快速、定性、定量地检测生物样品中此类药物。
实施例3
取0.27g安定溶解于15mL甲醇中，再加入1mL γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，1mL苯基三乙氧基硅烷，搅拌约0.5小时，加入4mL四乙氧基硅烷，然后搅拌5分钟，加入1.8g活化硅胶(球型，粒径为5～10μm)，最后加入2mL水并用盐酸调节pH至5催化水解缩合。待上述混合液搅拌充分后，静置使其完全水解缩合约24小时，之后过滤，110℃真空干燥8小时。用乙酸/甲醇(1∶9，V/V)溶液索氏抽提除去模板分子，再用甲醇/乙醇将表面分子印迹聚合物上残留的乙酸除去，最后，80℃真空干燥后备用。
为了证明制得的微球固相萃取剂对模板分子具有选择吸附性，特做以下实验：将2mL精确配制的10mg/mL的安定甲醇水(1∶9，V/V)溶液和20mg上述方法制得的微球固相萃取剂放入10mL的磨口锥形瓶中，在25℃下摇床振荡约6小时，在取上清夜用0.45μm的滤膜过滤，并用HPLC检测溶液浓度。实验表明，此微球固相萃取剂静态吸附分配系数(KD＝目标物在聚合物上的浓度/目标物在溶液中的浓度)达到344.4；其印迹因子(I＝KDi/KDn；KDi是印迹微球静态吸附分配系数，KDn是非印迹微球静态吸附分配系数)为6.1。
Claims (5)
1、一种苯二氮类分子表面印迹固相萃取剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)硅胶粒子的活化：取硅胶粒子加入甲磺酸溶液中恒温搅拌回流，过滤并用水洗涤至呈中性，最后干燥至恒重，得到活化硅胶；
(2)功能单体与模板分子的预作用：将苯二氮类模板分子溶解于甲醇中，再加入功能单体A和功能单体B，搅拌预作用得到预聚合物，其中，三种物质的摩尔比为：功能单体A∶功能单体B∶模板分子＝1∶1～1.5∶0.15～0.5；功能单体A为含氨基的硅氧烷，功能单体B为含苯基的硅氧烷；
(3)表面分子印迹聚合物的制备：以步骤(2)中所用功能单体A的体积量为准，在步骤(2)溶液中加入1～2倍体积的四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷，充分搅拌，再加入0.5～2倍功能单体A质量的经步骤(1)制得的活化硅胶，最后加入1～2倍体积的水并在pH3～5之间催化水解缩合；充分搅拌后静置使其完全水解缩合，过滤，干燥至恒重，得到表面分子印迹聚合物粗品；
(4)模板分子的洗脱：用乙酸/甲醇、或乙酸/乙腈溶液除去模板分子，再用甲醇、乙醇、丙醇或乙腈中的一种或一种以上将表面分子印迹聚合物粗品上残留的乙酸除去，干燥，得到所需的表面分子印迹聚合物纯品——苯二氮类药物的分子表面印迹固相萃取剂。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，硅胶粒子采用球型或无定型；甲磺酸溶液的质量分数为10％-90％；恒温搅拌回流的具体操作为：恒温100～120℃下搅拌回流8～12小时；干燥是在60～80℃真空条件下干燥至恒重。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，苯二氮类模板分子采用艾司唑仑、安定、阿普唑仑、咪达唑仑或三唑仑；甲醇至少是分析纯；功能单体A采用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷或γ-氨基丙基三甲氧基硅烷；功能单体B采用苯基三甲氧基硅烷或苯基三乙氧基硅烷；搅拌预作用的时间为0.5～1小时。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，调节pH采用HCl或H2SO4；水解缩合在常温下进行；干燥采用90～110℃真空干燥。
5、如权利要求1～4任一权利要求所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，干燥采用60～80℃条件下真空干燥。
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