CN101072869A - 在转基因生物中产生多不饱和长链脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在生物中产生多不饱和脂肪酸的方法，根据该方法向生物中引入编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的核酸。有利地，所述核酸序列可以任选与其他编码脂肪酸或者脂类代谢的多肽的核酸序列一起在转基因生物中表达。本发明还涉及本发明的核酸序列、含有本发明核酸序列的核酸构建体、含有本发明核酸序列和/或核酸构建体的核酸载体，和含有所述核酸序列、核酸构建体和/或载体的转基因生物。本发明还涉及根据本发明方法产生的油、脂类和/或脂肪酸，还涉及它们的用途。
Description
本发明涉及通过向生物中导入编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的核酸，在该生物中产生多不饱和脂肪酸的方法。这些核酸序列(如果合适)与其他编码脂肪酸或者脂类代谢的多肽的核酸序列一起，可以有利地在转基因生物中表达。
本发明还涉及根据本发明的核酸序列、包含根据本发明的核酸序列的核酸构建体、包含根据本发明的核酸序列和/或核酸构建体的载体和包含上述核酸序列、核酸构建体和/或载体的转基因生物。
本发明的另一部分涉及通过本发明的方法产生的油、脂类和/或脂肪酸和它们的用途。
脂肪酸和三酰甘油酯在食品工业、动物营养、化妆品和药学领域内具有多种应用。根据它们是否为游离饱和或不饱和脂肪酸或为具有含量升高的饱和或不饱和脂肪酸的三酰甘油酯，它们适合迥然不同的应用；从而，将多不饱和脂肪酸例如加入到婴儿配方中以提高营养价值。故多不饱和ω3脂肪酸和ω6脂肪酸是动物和人类营养的重要构成要素。鉴于目前人类食物的组成，向食物中添加主要发现于鱼油中的多不饱和ω3脂肪酸极为重要。因此例如将多不饱和ω3脂肪酸如二十二碳六烯酸(＝DHA，C22:6Δ4，7，10，13，16，19)或二十碳五烯酸(＝EPA，C20:5Δ5，8，11，14，17)添加至婴儿配制方中以提高营养价值。据称不饱和脂肪酸DHA对脑功能的发育和维持有积极影响。
据称多不饱和ω3脂肪酸对血液中胆固醇水平具有正面影响并且因此正面地影响心脏病的预防可能性。通过向食物中添加这些ω3脂肪酸可显著降低心脏病、中风或高血压的风险。ω3脂肪酸也正面影响与免疫性疾病如类风湿性关节炎有关的炎性过程，尤其是慢性炎性过程。因此将它们添加至食品，尤其食用性食品中或应用于药品。由于我们日常的饮食摄入，ω6脂肪酸如花生四烯酸往往不利地影响与这些风湿性疾病相关的这类功能紊乱。
ω3和ω6脂肪酸是称作类二十烷酸的组织激素如前列腺素的前体，其中这类组织激素自二高γ亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸衍生，同时ω3和ω6脂肪酸也是凝血烷和白三烯的前体，而凝血烷和白三烯衍生自花生四烯酸和二十碳五烯酸。形成自ω6脂肪酸的类二十烷酸(称作PG2系列)通常促进了炎性反应，而ω3脂肪酸来源的类二十烷酸(称作PG3系列)具有很少或没有促炎效应。
下文中多不饱和脂肪酸称作PUFA、PUFAs、LCPUFA或LCPUFAs(poly unsaturated fatty acids，PUFA，long chain polyunsaturated fatty acids，＝ LCPUFA)。
多种脂肪酸和甘油三酯主要从微生物如被孢霉属(Mortierella)和裂殖壶菌(Schizochytrium)中获得或从产油植物如大豆、油菜籽、藻类如隐甲藻属(Crypthecodinium)或褐指藻属(Phaeodactylum)中获得，其中所述多种脂肪酸和甘油三酯通常以其三酰甘油酯(＝甘油三酯＝三酰甘油)形式获得。然而这些脂肪酸和甘油三酯也能从动物如鱼中获得。游离脂肪酸有利地通过水解制备。极长链多不饱和脂肪酸例如DHA、EPA、花生四烯酸(＝ ARA，C20:4Δ5，8，11，14)、二高γ-亚麻酸(C20:3Δ8，11，14)或二十二碳五烯酸(DPA，C22:5Δ7，10，13，16，19)不能从油料作物例如油菜籽、大豆、向日葵或红花中分离。这些脂肪酸的常规天然来源是鱼如鲱鱼、鲑鱼、沙丁鱼、雄鲑、鳗鲡、鲤鱼、鳟鱼、大比目鱼、鲭鱼、梭鲈或金枪鱼和藻类。
鉴于多不饱和脂肪酸的积极特征，过去从未停止尝试获得参与合成这些脂肪酸或甘油三酯的基因以便在不饱和脂肪酸的含量经改变的多种生物中产生油。因而WO 91/13972和它的美国同族专利描述了Δ9去饱和酶。WO 93/11245要求了Δ15去饱和酶的权利并且WO 94/11516要求了Δ12去饱和酶的权利。而且其它去饱和酶在例如EP-A-0550162、WO94/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0794250、Stukey等，J.Biol.Chem.，265，1990：20144-20149、Wada等，Nature347，1990：200-203或Huang等，Lipids 34，1999：649-659中得到了描述。然而迄今多种去饱和酶的生物化学特征描述得仍不充分，因为这些酶作为膜结合蛋白严重阻碍了对它们的分离和特征描述(McKeon等，Methods in Enzymol.71，1981：12141-12147，Wang等，Plant Physiol.Biochem.，26，1988：777-792)。通常将膜结合的去饱和酶通过导入合适的生物并随后通过分析起始物质和产物而分析酶活性来表征。Δ6去饱和酶在WO 93/06712、US 5614393、US5614393、WO 96/21022、WO 00/21557和WO 99/27111中描述并且这种酶用于转基因生物中产生脂肪酸的申请在WO 98/46763、WO 98/46764和WO 98/46765中描述。在本上下文中，多种去饱和酶的表达和多不饱和脂肪酸的形成也在WO 99/64616或WO 98/46776中进行了描述和要求保护。就去饱和酶的表达效率和这种表达效率对多不饱和脂肪酸形成的影响而言，必须指出单一去饱和酶的表达如迄今所述仅仅获得了低含量的不饱和脂肪酸/脂类如γ-亚麻酸和十八碳四烯酸(stearidonic acid)。此外通常获得的是ω3和ω6脂肪酸的混合物。
尤其适合用于产生PUFA的微生物是Thraustochytrium株系或裂殖壶菌株系，藻类如三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、或隐甲藻(Crypthecodinium)种，纤毛虫例如棘尾虫属(Stylonychia)或豆形虫属(Colpidium)、真菌如被孢霉、虫霉菌属(Entomophthora)和毛霉属(Mucor)的微生物。株系的选择已经导致了所讨论的多种微生物突变株系的开发，这些突变株系产生了包括PUFA在内的一系列目标化合物。然而对株系进行突变并选择具有改善特定分子如多不饱和脂肪酸产生的株系是一个费时且困难的过程。这就是为什么只要可能就优选如上所述的重组方法的原因。然而目的多不饱和脂肪酸如DPA、EPA或ARA在以上提到的微生物的协助下仅仅可有限量地产生并且通常根据所用的微生物，这些脂肪酸作为如EPA、DPA或DHA的脂肪酸混合物获得。
备选地，精细化学品的大规模产生可以有利地在植物中实现，所述植物以这样的方式开发使得它们产生上述PUFA。尤其适于该目的的植物是含有大量脂类化合物的油料作物，如油菜籽、芸苔、亚麻子、大豆、向日葵、琉璃苣和月见草。然而，含有油或者脂类和脂肪酸的其他有用的植物也是合适的，如本发明的详细描述中提到的。通过常规育种已经开发了一系列突变植物，其产生多种目的脂类和脂肪酸、辅因子和酶。然而，提高产生某些分子的新的植物变种的选择是费时的并且如果化合物不在所述植物中天然产生，那么是困难的步骤或实际上不可能的，如对于多不饱和的C1s-、C20-和C22-脂肪酸和具有更长碳链的脂肪酸。
因此，过去不缺乏尝试得到参与脂肪酸或者甘油三酯的合成用于多种植物中产生具有修饰含量的不饱和脂肪酸的油的基因。然而，迄今不可能在植物中产生更长链的多不饱和C20-和/或C22脂肪酸，如EPA或者ARA。
然而，通过导入并表达例如去饱和酶对脂肪酸代谢途径的基因技术修饰也导致其他生物如微生物，如藻类或者真菌中生产力的仅仅相对微小的增加。一个原因可能是高度复杂的脂肪酸代谢。从而，多不饱和脂肪酸向膜脂和/或向三酰甘油酯的掺入和它们的降解和互变高度复杂并且在生物化学和特别是遗传学方面还没有完全阐明和理解。
LCPUFAs的生物合成和LCPUFAs向膜或者三酰甘油脂的掺入通过多种代谢途径发生(Abbadi等人(2001)European Journal of Lipid Science&Technology 103：106-113)。在细菌如弧菌属(Vibrio)和微藻如裂殖壶菌中，丙二酸单酰辅酶A通过产生LCPUFA的聚酮化合物合酶转化成LCPUFAs(Metz等人(2001)Science 293：290-293；WO 00/42195；WO98/27203；WO 98/55625)。在微藻如褐指藻(Phaeodactylum)和苔藓如剑叶藓(Physcomitrella)中，不饱和脂肪酸如亚油酸或者亚麻酸以它们的酰基辅酶A的形式在多个去饱和和延长步骤中转化成LCPUFAs(Zank等人(2000) Biochemical Society Transactions 28：654-658)。在哺乳动物中，DHA的生物合成除了去饱和和延长步骤外，还包括通过β氧化缩短链长。
在微生物和低等植物中，LCPUFAs仅以膜脂的形式存在，如剑叶藓和褐指藻中的情况，或者它们存在于膜脂和三酰甘油脂中，如裂殖壶菌和被孢霉属(Mortierella)的情况。LCPUFAs向脂类和油的掺入通过多种酰基转移酶和转酰基酶催化，已知酰基转移酶和转酰基酶掺入饱和和不饱和的脂肪酸(Slabas(2001)J.Plant Physiology 158：505-513；Frentzen(1998)Fett/Lipid 100：161-166；Cases等人(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：13018-13023)。酰基转移酶是已知为肯尼迪途径的酶；它们定位在内质网(下文中称作“ER”)的膜系统的细胞质边上。在实验中，从已知为“微粒体部分”的多种生物分离ER膜(Knutzon等人(1995)Plant Physiology 109：999-1006；Mishra & Kamisaka(2001)Biochemistry 355：315-322；US5968791)。微粒体部分中的这些ER结合的酰基转移酶利用酰基辅酶A作为脂肪酸的活化形式。下文中称作GPAT的甘油-3-磷酸酰基转移酶催化甘油-3-磷酸的sn-1位上酰基的掺入。1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(E.C.2.3.1.51)也称作溶血磷脂酸酰基转移酶，下文中称作LPAAT，催化溶血磷脂酸(下文中缩写为LPA)的sn-2位酰基的掺入。磷脂酸通过磷脂酸磷酸酶去磷酸化后，二酰甘油酰基转移酶(下文中称作DAGAT)催化二酰基甘油的sn-3位酰基的掺入。除了肯尼迪途径的这些酶，其他酶也涉及脂肪酸向三酰甘油脂的掺入，这些酶能够将来自膜脂的酰基掺入三酰甘油脂，如磷脂二酰甘油酰基转移酶，下文中称作PDAT，和溶血磷脂胆碱酰基转移酶，下文中称作LPCAT。
LPCAT的酶促活性已经首次在大鼠中描述(Land(1960)J.Biol.Chem.235：2233-2237)。在植物中，存在LPCAT的质体同工型(Akermoun等人(2000)Biochemical Society Transactions 28：713-715)和ER结合的同工型(Tumaney和Rajasekharan(1999)Biochimica et Biophysica Acta1439：47-56；Fraser和Stobart，Biochemical Society Transactions(2000)28：715-7718)。LPCATs参与动物和植物中多不饱和脂肪酸的生物合成和转酰基作用(Stymne和Stobart(1984)Biochem.J.223：305-314；Stymne和Stobart(1987)in′The Biochemistry of Plants：a ComprehensiveTreatise′，Vol.9(Stumpf，P.K.ed.)pp.175-214，Academic Press，NewYork)。LPCAT或者以更通常的术语，酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶(下文中称作LPLAT)在酰基辅酶A从磷脂的ATP-独立的合成中一个重要功能已经由Yamashita等人(2001)J.Biol.Chem.276：26745-26752描述。
高等植物包含多不饱和脂肪酸如亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。但花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)在所有高等植物的种子油中完全找不到或仅少量发现(E.Ucciani：Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales[New Dictionary of Vegetableoils].Technique&Documentation-Lavoisier，1995.ISBN：2-7430-0009-0)。在高等植物，优选在油料作物例如油菜籽、亚麻子、向日葵和大豆中产生LCPUFA将是有利的，因为有可能经济地获得大量高质量的LCPUFA用于食品工业、动物营养和药用目的。为实现此目标，编码LCPUFA生物合成酶的基因通过重组方法向油料作物中导入并且在其中表达这些基因是有利的。例如这些基因编码例如Δ6去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶。这些基因可有利地从产生LCPUFA并且使LCPUFA掺入膜或三酰甘油酯的微生物、动物和低等植物中分离。因此已有可能从藓类植物展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)中分离Δ6去饱和酶基因并且从展叶剑叶藓和秀丽隐杆线虫(C.elegans)中分离Δ6延伸酶基因。
包含并表达编码LCPUFA生物合成酶的基因并且由此产生LCPUFA的第一个转基因植物例如在DE-A-10219203(用于在植物中产生多不饱和脂肪酸的方法)中得到首次描述。然而这些植物仅以需要进一步优化而用于目前工厂中油料加工的量产生了LCPUFA。
为实现以这类多不饱和脂肪酸强化食物和/或饲料，用于产生尤其是在真核细胞系统内产生这类多不饱和脂肪酸的简单、廉价的方法极为需要。
因此一个目的是开发在真核生物中产生多不饱和脂肪酸的方法。该目的通过本发明的用于在生物中产生多不饱和脂肪酸的方法实现，所述方法包括下面的步骤：
a)向生物中引入至少一种核酸序列，其选自：
i)具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的序列的核酸序列，其编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽；或
ii)核酸序列，其由于遗传密码的简并性，可以衍生自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的序列；或
iii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列的衍生物，其编码的多肽具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6中显示的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6在氨基酸水平具有至少40％同源性并且具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性，并
b)培养并收获所述生物。
本发明方法中所产生的多不饱和脂肪酸有利地包含至少两个、有利地三个双键。脂肪酸特别有利地包含4或者5个双键。方法中产生的脂肪酸有利地在脂肪酸链中具有16、18、20或者22个C原子。这些脂肪酸可以作为单一产物产生或者以脂肪酸混合物存在。
用于本发明方法中的核酸序列是分离的核酸序列，其编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽。
方法中产生的多不饱和脂肪酸有利地结合膜脂类和/或三酰甘油酯，但是也可以在生物中以游离脂肪酸或与其它脂肪酸酯的结合形式出现。这里，它们可作为“纯的产物”或者有利地以多种脂肪酸的混合物或不同甘油酯的混合物的形式出现。这里，三酰甘油酯中所结合的多种脂肪酸可由具有4至6个C原子的短链脂肪酸、具有8至12个C原子的中等链脂肪酸或14至24个C原子的长链脂肪酸衍生，优选从长链脂肪酸衍生；更为优选地为长链C1s-、C20-和/或C22-脂肪酸(LCPUFAs)。
根据本发明的方法有利地产生脂肪酸酯，其具有多不饱和的C16-、C18-、C20-和/或C22-脂肪酸分子，在脂肪酸酯中具有至少两个双键。这些脂肪酸分子优选包含3、4或者5个双键并且有利地导致合成十六碳二烯酸(16:2Δ9，12)、γ-亚麻酸(＝GLA，C18:3Δ6，9，12)、十八碳四烯酸(＝SDA，C18:4Δ6，9，12，15)、二高-γ-亚麻酸(＝DGLA，20:3Δ8，11，14)、二十碳四烯酸(＝ETA，C20:4Δ5，8，11，14)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或者它们的混合物，优选导致合成EPA和/或ARA。
具有多不饱和的C16、C18、C20和/或C22脂肪酸分子的脂肪酸酯可以油或脂的形式，例如以化合物如鞘脂类、磷酸甘油酯、脂类、糖脂例如糖鞘脂类、磷脂例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或者其它脂肪酸酯例如乙酰基辅酶A酯的形式分离，其中所述的脂肪酸酯包含源于已用来制备脂肪酸酯的生物体的具有至少两个、优选三个双键的多不饱和脂肪酸。除了这些酯以外，多不饱和脂肪酸也可以作为游离的或结合于其它化合物中的脂肪酸在生物，有利地在植物中存在。通常以上提到的多种化合物(脂肪酸酯和游离脂肪酸)在生物体中以如下的大致分布出现，即以多种化合物的总体计为100％重量，甘油三酯占80至90％重量、二酰甘油占2至5％重量、单酰甘油占5至10％重量、游离脂肪酸占1至5％重量、磷脂占2至8％重量。
本发明的方法产生了LCPUFA，其中所产生的LCPUFA的含量以转基因生物，优选地以转基因植物中的总脂肪酸为基础占至少3％重量、有利地占至少5％重量，优选地占至少8％重量，尤其优选地占至少10％重量、最为优选地占至少15％重量。由于多个反应步骤在本发明的方法中通过化合物十六碳二烯酸(C16:2)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)实施，故方法的终产物例如花生四烯酸(ARA)，或二十碳五烯酸(EPA)不能作为绝对纯的产物获得；在终产物中总是出现微小痕量的前体。例如假设亚油酸和亚麻酸两者均在起始生物和起始植物中出现，则终产物如ARA和EPA作为混合物出现。以所讨论终产物的量为基础，前体应当有利地不超过20％重量、优选地不超过15％重量、尤其优选地不超过10％重量，最优选地不超过5、4、3、2、1％重量。有利地，在根据本发明的方法中，仅仅结合的或作为游离脂肪酸的ARA或仅EPA作为转基因终产物在植物中产生。如果同时产生化合物(ARA+EPA)，它们有利地以至少1∶2(EPA∶ARA)、有利地以至少1∶3、优选地以至少1∶4、尤其优选地以至少1∶5的比率得到产生。
化学纯的多不饱和脂肪酸或脂肪酸组合物也能通过以上描述的方法合成。为达此目的，脂肪酸或脂肪酸组合物按照已知的方法如通过提取、蒸馏、结晶、层析或这些方法的组合从生物如微生物或植物或从培养基分离。这些化学纯的多不饱和脂肪酸或脂肪酸组合物有利地在食品工业、化妆品应用并且尤其在药学工业内应用。
原则上，所有生物如真菌，如被孢霉(Mortierella)或者破囊壶菌(Thraustochytrium)，酵母如酵母属(Saccharomyces)或者裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，苔藓，如剑叶藓或者角齿藓属(Ceratodon)、非人动物如隐杆线虫(Caenorhabditis)、藻类如隐甲藻或者褐指藻或者植物如双子叶植物或者单子叶植物适于作为用于本发明方法中生产的生物。有利地用于本发明方法中的生物是属于产油生物的生物，也就是说，用于产生油的生物，如真菌，如被孢霉或者破囊壶菌，藻类如隐甲藻(Crypthecodinium)或者褐指藻(Phaeodactylum)，或者植物，尤其含有大量脂类化合物的油料作物植物，如花生、油菜籽、芸苔、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花、石榴(Punica)、月见草、毛蕊花、大蓟、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲坚果、鳄梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、阿月混子、琉璃苣、树(油棕榈树、椰子树或胡桃树)或可耕种的作物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊、茄科植物例如马铃薯、烟草、茄子和番茄、蚕豆属的种、豌豆、紫花苜蓿或灌木(咖啡、可可、茶)、柳属的种和宿生牧草及饲料作物。根据本发明优选的植物是油料作物植物如花生、油菜籽、芸苔、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、金盏花、石榴、月见草、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、琉璃苣、树(油棕榈树、可可树)。尤其优选的植物是含有高C18:2和/或C18:3脂肪酸的植物，如向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫芦/南瓜、罂粟、月见草、胡桃、亚麻子、大麻或大蓟。最优选的植物是例如红花、向日葵、罂粟、月见草、胡桃、亚麻子或大麻。
因此对于本发明的上述方法而言，除了在方法步骤(a)中所导入的核酸以外，额外地向生物中导入其它编码脂肪酸或脂类代谢的酶的核酸是有利的。
脂肪酸或脂类代谢中的所有基因原则上均可在产生多不饱和脂肪酸的方法中使用，有利地与本发明的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶组合使用。选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP[＝酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基-辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶(acetylenase)、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合酶(allenoxidesynthase)、过氧化氢裂合酶或脂肪酸延伸酶的脂肪酸或脂类代谢中的基因有利地与酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶组合使用。选自Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶或Δ9延伸酶的基因尤其优选地与根据本发明方法中的发明性酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶组合使用。
由于用于本发明方法中编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的核酸的酶促活性，有利地组合编码脂肪酸或者脂类代谢的多肽的核酸序列，与Δ4、Δ5、Δ6、Δ8或者Δ5、Δ6或Δ9延伸酶活性，可以在根据本发明的方法中产生多种多不饱和脂肪酸。取决于用于本发明方法的生物，如有利地植物的选择，可以以游离或者结合形式产生多种多不饱和脂肪酸的混合物或者单独的多不饱和脂肪酸，如EPA或者ARA。取决于起始植物中占优势的脂肪酸组成(C18:2或C18:3脂肪酸)，从而得到衍生自C18:2脂肪酸的脂肪酸，如GLA、DGLA或ARA，或者衍生自C18:3脂肪酸的脂肪酸，如SDA、ETA或EPA。如果仅仅亚油酸(＝LA，C18:2Δ9，12)作为不饱和脂肪酸存在于用于该方法中的植物中，那么该方法可以仅仅提供GLA、DGLA和ARA作为产物，它们都以游离脂肪酸或者以结合形式存在。如果仅仅α-亚麻酸(＝ALA，C18:3Δ9，12，15)作为不饱和脂肪酸存在于用于方法中的植物中，如在亚麻子中的情况，那么该方法可以仅仅提供SDA、ETA和EPA作为产物，它们都以游离脂肪酸或者以结合形式存在，如上述。由于对酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶酶活性的修饰，其有利地与在合成中起作用的Δ5和Δ6去饱和酶和Δ6延伸酶、或Δ5、Δ8去饱和酶和Δ9延伸酶联合使用，或者仅与合成链的前两种基因、Δ6去饱和酶和Δ6延伸酶或Δ8去饱和酶和Δ9延伸酶联合使用，可以在以上提及的生物，有利地在以上提及的植物中以定向的方式只产生单个的产物。由于Δ6去饱和酶和Δ6延伸酶的活性，依据起始的植物和不饱和脂肪酸，形成了例如GLA和DGLA或SDA和ETA。DGLA或ETA或这些脂肪酸的混合物优选地形成。若向生物，有利地向植物中额外地导入Δ5去饱和酶，ARA或EPA额外地形成。这也适用于事先已导入Δ8去饱和酶和Δ9延伸酶的生物。
为了增加上述用于产生具有有利的升高含量的多不饱和脂肪酸的油和/或甘油三酯的方法的产率，有利地增加用于合成脂肪酸的起始物质的量；这可以例如通过向生物中引入编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的核酸来实现。这在高油酸的产油生物如油菜籽中尤其有利。因为这些生物仅仅具有低水平亚油酸(Mikoklajczak等人，Journal of the American OilChemical Society，38，1961，678-681)，使用Δ12去饱和酶用于产生起始物质亚油酸的用途是有利的。
用于根据本发明方法中的核酸有利地来自植物如藻类，如等鞭金藻属(Isochrysis)或隐甲藻属、藻类/硅藻如褐指藻属、藓类如剑叶藓属或角齿藓属、或者高等植物如报春花科(Primulaceae)例如Aleuritia、Calendulastellata、刺状骨籽菊(Osteospermum spinescens)或Osteospermumhyoseroides、微生物如真菌例如曲霉属(Aspergillus)、破囊壶菌属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或被孢霉属，酵母或动物如线虫例如隐杆线虫、昆虫、或人。所述核酸有利地来自真菌、动物，或者来自植物，如藻类或藓类，优选来自线虫，如隐杆线虫。
本发明的方法有利地使用上述核酸序列或者它们的衍生物或者同源物，所述衍生物或同源物编码的多肽保持野生型核酸序列编码的蛋白质的酶促活性。这些序列独自或者与编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的核酸序列组合克隆到表达构建体中并用于导入生物并在该生物中表达。这些表达构建体使得可能最佳合成在根据本发明的方法中产生的多不饱和脂肪酸。
在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括获得细胞或完整生物的步骤，其中所述的细胞或完整生物包含方法中所用的核酸序列，这些细胞和/或生物在所述的方法中由本发明编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的核酸序列、如上所述的基因构建体或载体，单独地或与编码脂肪酸或脂类代谢的蛋白质的核酸序列组合而转化。在一个更优选的实施方案中，所述方法进一步包括从培养物中获得精细化学品的步骤。培养物可采用例如发酵培养物的形式例如在培养微生物如被孢霉、酵母或破囊壶菌的情况下或采用植物的温室培养物或田间生长培养物形式。由此所产生的细胞或生物有利地是产油生物的细胞如油料作物例如花生、油菜籽、芸苔、亚麻子、大麻、花生、大豆、红花、大麻、向日葵或琉璃苣的细胞。
在为植物细胞、植物组织或植物器官的情况下，“生长”理解为意指例如在营养培养基内或培养基上培养、或完整植物在基底物上或基底物内的培养例如在水培、盆栽培养料内或在可耕地上的培养。
为了本发明目的，“转基因的”或“重组的”意指例如核酸序列、表达盒(＝基因构建体)或包含本发明核酸序列的载体或由本发明的核酸序列、表达盒或载体所转化的生物，所有那些构建通过重组方法产生，其中
a)本发明的核酸序列，或
b)有效地连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或
c)a)和b)
不处于它们天然的遗传环境中或已经通过重组方法修饰，对这种修饰而言可采取例如一个或多个核苷酸残基的替代、添加、缺失、倒位或插入的形式。
将天然遗传环境理解为意指原始生物中的天然基因组或染色体基因座或在基因组文库中的存在。在为基因组文库的情况下，优选地保留，至少部分保留所述核酸序列的天然遗传环境。所述环境位于所述核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp、优选地至少500bp、尤其优选地至少1000bp、最为优选地至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与相应的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶基因的天然存在的组合-当经过非天然、合成的(“人工的”)方法例如通过诱变处理修饰后变成了转基因的表达盒。合适的方法在美国5.565.350或WO00/15815中进行了描述。
用于本发明目的的转基因生物或转基因植物因此理解为意指上述方法中所用的核酸不处于它们在生物的基因组中的天然基因座处，对这类核酸而言可同源或异源性地表达。然而如所提及，转基因也意指即便本发明的核酸处于生物基因组中它们的天然位置上，这种序列相对于天然序列已经过了修饰，和/或天然序列的调节序列已经过了修饰。转基因优选地理解为意指本发明的核酸在基因组内非天然基因座处的表达，即发生了这种核酸的同源表达，或优选地异源表达。优选的转基因生物是真菌如被孢霉或者植物如油料作物。
生物或宿主生物对于本发明方法中所用的核酸、表达盒或载体而言原则上是能够有利地合成脂肪酸尤其不饱和脂肪酸和/或适用于表达重组基因的所有生物。可提到例子是植物如拟南芥、菊科植物例如金盏花或作物植物如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉、亚麻、油菜籽、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆；微生物如真菌例如被孢霉属、水霉属或腐霉属；细菌如埃希氏菌属；酵母如酵母属、蓝细菌属、纤毛虫属，藻类；或原生动物如甲藻例如隐甲藻。优选的生物是那些能够天然合成大量油的生物，如真菌如高山被孢霉(MortiereHa alpina)、Pythium insidiosum或植物如大豆、油菜籽、椰子、油棕榈、红花、亚麻、大麻、金盏花、蓖麻油植物、花生、可可豆或向日葵，或者酵母如酿酒酵母，并且尤其优选大豆、亚麻、油菜籽、红花、向日葵、金盏花、被孢霉或酿酒酵母。除了以上提到的转基因生物以外，宿主生物原则上还可以是转基因动物，有利地为非人类的动物例如秀丽隐杆线虫。
可利用的宿主细胞进一步在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中详述。
可使用的表达株系如那些具有较低蛋白酶活性的株系在Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，California(1990)119-128中描述。
包含本发明方法中所合成的多不饱和脂肪酸的转基因植物能够有利地直接销售而无需分离所合成的油、脂类或脂肪酸。本发明方法的植物理解如下：完整植物和植物的所有组织、植物器官或植物部分如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、所收获的材料、植物组织、可繁殖的组织和来自实际转基因植物的细胞培养物和/或可用于产生转基因植物的细胞培养物。在本上下文中，种子包含种子的所有部分如种皮、表皮细胞、种子细胞、胚乳或胚组织。然而，本发明方法中所产生的化合物也可以油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸的形式从生物，有利地从植物中分离。由所述方法产生的多不饱和脂肪酸可通过从所生长的作物中或从田野中收获这类生物获得。这可通过对植物部分优选对植物种子的压榨或提取实现。在本上下文中，油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸通过公知的冷敲打(cold-beating)或冷榨可获得而在压榨期间无需加热。为了更容易地破裂植物部分尤其种子，它们事先经过粉碎、蒸热或烘烤。随后经如此方式预处理的种子可压榨或用溶剂如温己烷提取。然后去除溶剂。在为微生物时，微生物在收获后例如可直接提取而无需进一步的加工步骤或在破裂后经技术人员所熟悉的多种方法提取。按照这种方式，可分离所述方法产生的超过96％的化合物。此后所得到的产物经过进一步加工即精制。在该方法中，例如植物黏液和悬浮物首先去除。众知的所谓脱泥可通过酶或例如通过加入酸如磷酸而化学-物理性地完成。此后游离脂肪酸用碱例如氢氧化钠溶液处理去除。得到的产物用水彻底洗涤以去除产物中残留的碱，然后干燥。为了除去产物中残留的色素，利用滤土或活性碳漂白产物。最后例如利用蒸汽使产物脱臭。
通过该方法所产生的PUFA或LCPUFA有利地是C18、C20或C22脂肪酸分子，这些脂肪酸分子具有至少两个双键，优选地具有三、四、五或六个双键。这些C18、C20或C22脂肪酸分子可以以油、脂类或游离脂肪酸的形式从生物中分离。合适的生物是例如以上提到的那些生物。优选的生物是转基因植物。
因此本发明的一个实施方案是通过以上描述的方法产生的油、脂类或脂肪酸或它们的级分，尤其优选含有PUFA并且来自转基因植物的油、脂类或脂肪酸组合物。
本发明的另一实施方案是油、脂类、脂肪酸和/或脂肪酸组合物在制备饲料、食品、化妆品或药品中的用途。
术语“油”、“脂类”或“脂肪”理解为意指包含不饱和的、饱和的，优选地已酯化的脂肪酸的脂肪酸混合物。油、脂类或脂肪优选地具有较高多不饱和的游离脂肪酸或有利地具有较高酯化的脂肪酸，特别是亚油酸、γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十二碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。酯化的不饱和脂肪酸的量优选地占约30％含量，50％的含量更为优选，60％、70％、80％或更高的含量最优选。脂肪酸的含量例如可在脂肪酸经酯转换转化为甲酯后通过气相层析测定。油、脂类或脂肪可包含多种其它饱和或不饱和的脂肪酸例如金盏花素酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸等。在油或脂肪中的多种脂肪酸含量可变化，这尤其取决于起始生物。
在方法中所产生的有利地具有至少两个双键的多不饱和脂肪酸如上所述是例如鞘脂类、磷酸甘油酯、脂类、糖脂、磷脂、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其它脂肪酸酯。
从通过本发明方法制备的有利地具有至少两个双键的多不饱和脂肪酸开始，所存在的多不饱和脂肪酸经碱例如KOH或NaOH水溶液处理，或者有利地于存在醇例如甲醇或乙醇时经酸水解，或者经酶切割释放并且通过例如相分离及随后例如H2SO4的酸化作用而分离。这类脂肪酸也可无需以上描述的加工步骤直接释放。
方法中所用的核酸在导入生物体，有利地导入植物细胞或植物后，可以在单独的质粒中存在或者可以整合入宿主细胞的基因组内。在整合入基因组内的情况下，整合可以是随机的或可通过重组实现，从而所导入的拷贝替代了原来的基因，由此细胞产生的目的化合物是被调节的，或整合可通过运用基因反式而实现，从而这种基因有效地与功能性表达单元连接，其中这个表达单元包含至少一段确保基因表达的序列和至少一段确保功能性转录的基因多聚腺苷酸化的序列。这类核酸通过多重表达盒或构建体有利地向生物中导入以便多重平行表达，有利地向植物中导入以便基因的多重平行种子特异性的表达。
藓类和藻类是唯一已知的产生大量多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的植物系统。藓类在膜脂中包含PUFA；而藻类、与藻类有关的生物及少数真菌也在三酰甘油酯的级分中聚集了大量的PUFA。这是为什么从三酰甘油酯级分中聚集PUFA的株系所分离的核酸分子尤其有利地用于本发明方法并且因此用于修饰宿主中脂类和PUFA产生系统的原因，特别是修饰植物中如油料作物例如油菜籽、卡诺拉油菜、亚麻籽、大麻、大豆、向日葵和琉璃苣中的脂类和PUFA产生系统的原因。因此这类核酸分子可有利地用于本发明的方法。
有利地用于本发明酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的底物是C16-、C18-、C20-或C22-脂肪酸。
为产生本发明的长链PUFA，多不饱和C16或C18脂肪酸首先必须通过去饱和酶的酶活性去饱和并且接下来通过延伸酶延伸至少两个碳原子。在一次延伸循环后，延伸酶的酶活性产生了C18或C20脂肪酸并且经过两或三轮延伸循环后，产生了C22或C24脂肪酸。本发明方法中所用的去饱和酶和延伸酶的活性优选地产生C18、C20和/或C22脂肪酸，在脂肪酸分子中有利地具有至少两个双键，优选地具有三、四或五个双键，尤其优选地产生C20和/或C22脂肪酸，在脂肪酸分子中具有至少两个双键，优选地具有三、四或五个双键。在第一次去饱和和延伸发生后，可发生进一步的去饱和步骤例如在Δ5位置处的去饱和。尤其优选的本发明方法的产物是二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。在脂肪酸分子中具有至少两个双键的C18脂肪酸可以以游离脂肪酸的形式或以酯的形式如磷脂类、糖脂类、鞘脂类、磷酸甘油酯、单酰甘油酯、二酰甘油酯或三酰甘油酯通过本发明的酶活性加以延伸。
脂肪酸、油、脂类或脂肪在有利使用的植物中优选的生物合成部位例如通常是种子或种子的细胞层，因此对方法中所用的核酸进行种子特异性表达是有意义的。然而显然脂肪酸、油或脂类的生物合成并非限定于种子组织中，同时也可在植物的所有其它部分例如在表皮细胞或在块茎中以组织特异性方式进行。
由于本发明编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的核酸的利用，与不重组地含有这种核酸的生物的野生型比较，方法中产生的多不饱和脂肪酸的量可增加至少10％，优选地至少15％，尤其优选地至少20％，非常尤其优选地至少50％，最优选至少100％。
原则上，可以两种不同方式增加在方法所用的生物中由本发明方法产生的多不饱和脂肪酸。
有利地，多不饱和脂肪酸库和/或由方法产生的酯化多不饱和脂肪酸含量可有利地扩大。转基因生物中酯化的多不饱和脂肪酸库通过本发明方法有利地扩大。
若微生物如酵母例如酵母属或裂殖酵母属、真菌如被孢霉属、曲霉属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或破囊壶菌属、藻类如等鞭金藻属、褐指藻属或隐甲藻属作为本发明方法中的生物使用，它们有利地通过发酵以技术人员熟悉的方式生长或者培养。
微生物一般在液体培养基中生长，其中所述培养基通常含有糖形式的碳源、有机氮源形式的氮源如酵母提取物或盐如硫酸铵、微量元素如铁、锰和镁盐和根据需要含有维生素，该培养基的温度在0℃和100℃之间，优选地在10℃和60℃之间，同时通氧。液体培养基的pH可保持恒定，即在培养期间受到调节，或不保持恒定。培养物可以分批式、半分批式或连续地生长。营养物可在发酵开始时提供或半连续或连续性地提供。所产生的多不饱和脂肪酸可从如上描述的生物中通过技术人员所知的方法例如提取、蒸馏、结晶、根据需要以盐沉淀和/或层析分离。为此目的，可有利地事先破裂生物体。
若宿主生物为微生物，本发明的方法有利地在0℃和95℃之间，优选地在10℃和85℃间，尤其优选地在15℃和75℃间，非常尤其优选地在15℃和45℃间实施。
将本发明方法中pH值优选地维持在pH 4和12之间、优选地维持在pH 6和9之间、尤其优选地维持在pH 7和8之间。
本发明的方法可分批式、半分批式或连续地操作。对已知培养方法的综述可在Chmiel的教材(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to Bioprocesstechnology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))中或在Storhas的教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors andperipheral equipment](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中找到。
预备使用的培养基必须符合所讨论的株系的需要。用于各种微生物的培养基的描述可在教材″Manual of Methods für Genaeral Bacteriology″ofthe American Society for Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981)中找到。
如以上描述，根据本发明的可使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖如单糖、二糖或多糖。极好碳源的例子是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖还可以复杂的化合物如糖蜜或其它来自糖蜜三糖化(raffination)的副产物加入培养基。添加多种碳源的混合物也是有利的。其它可能的碳源是油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和/或可可脂、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸、醇和/或多元醇例如甘油、甲醇和/或乙醇和/或有机酸例如乙酸和/或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的例子包括液体或气体形式的氨或者铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复杂氮源例如玉米浆、大豆粕、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏和其它等。氮源可单独地或作为混合物使用。
可在培养基中存在的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
含无机硫的化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物或有机硫化合物如硫醇和硫醇类可以用作硫源以产生含硫的精细化学品，特别是甲硫氨酸。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐可用作磷源。
鳌合剂可加入培养基以维持溶液中的金属离子。尤其合适的鳌合剂包括二羟基酚如邻苯二酚或原儿茶酸盐和有机酸如柠檬酸。
本发明使用的用于培养微生物的发酵培养基通常也含有其它生长因子如维生素或生长促进剂，包括例如生物素、核黄素、维生素B1、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐经常来自复杂的培养基成分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。更有可能向培养基中加入合适的前体。培养基化合物的明确组分很大程度取决于特定的实验并且单独取决于每个特定的情况。优化培养基的信息可在教材″Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach″(Editors P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp.53-73，ISBN 0 19 963577 3)中找到。生长培养基例如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等也可从商业供应商处获得。
所有培养基的成分均经加热(1.5巴，121℃20分钟)或过滤灭菌法灭菌。各成分可共同或根据需要分别灭菌。培养基的所有成分可在培养开始时存在或根据需要连续或分批式加入。
培养温度通常在15℃和45℃之间，优选地从25℃至40℃，并且可维持恒定或可在实验期间变动。培养基的pH应该处于5至8.5之间，优选地在7.0附近。用于培养的pH在培养期间可通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸控制。起泡可使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇脂控制。为维持质粒的稳定性，可向培养基中加入合适的具有选择效应的物质如抗生素。需氧条件通过向培养基中导入氧或含氧的气体混合物例如环境空气维持。持续培养直至最大限度地形成目的产物。这个目标通常在10至160小时内达到。
以如此方式所获的发酵培养液，尤其那些含有多不饱和脂肪酸的培养液通常含有7.5至25％重量的干物质。
这种发酵培养液随后可经过进一步加工。生物量根据需要可通过分离法例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合从发酵液中完全或部分地移出或完全滞留在所述的培养液中。生物量有利地在分离后进行加工。
然而，发酵液也可使用已知的方法例如在旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器的辅助下通过反向渗透或通过纳米过滤加以增稠或浓缩而无需分离细胞。最终这种浓缩的发酵液可经加工以获得存在其中的脂肪酸。
术语“产生”或“生产量(productivity)”在本领域内为公知并且包含在某一时间段内和在某一发酵体积内形成的发酵产物(式I化合物)的浓度(例如kg产物每小时每升)。术语“产生效率”包含为获得某一产量所需的时间(如细胞需要用于建立精细化学品的某种流通量速率的时间)。术语产量或产物/碳产量为本领域公知并且包含将碳源转化为产物(即精细化学品)的效率。例如通常将产量表述为每公斤碳源kg产物。通过增加化合物的产量或产生，增加了在某一培养基中经预定时间段所获得这种化合物的分子的量。术语“生物合成”或“生物合成途径”为本领域所知并且包含例如在多步骤且受强烈调控的过程中通过细胞从中间体开始合成化合物，优选地合成有机化合物。术语“分解代谢或分解代谢的途径”为本领域所知并且包含例如在多步骤且受强烈调控的过程中由细胞切割化合物，优选地切割有机化合物以产生分解代谢产物(以更为通俗的术语描述，较小的或复杂度较低的分子)。术语代谢为本领域所知并且包含生物中发生的全部生物化学反应。某种化合物的代谢(例如脂肪酸的代谢)因此包含与这种化合物有关的细胞中该化合物全部的生物合成途径、修饰途径和分解途径。
所述方法中所获的脂肪酸也适合作为化学合成其它目的的产物的原料。例如它们可单独或彼此联合地用于制备药物、食品、动物饲料或化妆品。
本发明还涉及经分离的编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的核酸序列，所述酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性特异转化在脂肪酸分子中具有至少一个双键的C16-、C18-、C20-和C22脂肪酸，其中所述核酸序列是选自以下的序列：
a) 具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的序列的核酸序列，
b) 核酸序列，其由于遗传密码的简并性，可以衍生自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的编码序列，
c) SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列的衍生物，其编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的多肽并且与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6在氨基酸水平具有至少40％同源性并且具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性。
上述核酸序列有利地来自真核生物，特别优选来自Ostreococcus tauri或Mantoniella squamata。
将用于该方法中的编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质或者编码脂肪酸或者脂类代谢的蛋白质的核酸序列有利地导入表达盒(＝核酸构建体)，其使得可能在生物中，有利地在植物或者微生物中表达所述核酸。
为了导入方法中所用的核酸，用于方法中的核酸有利地通过众知的方式扩增和连接。优选地遵循用于Pfu DNA聚合酶或Pfu/TaqDNA聚合酶混合物的方案的程序。引物在考虑所要扩增的序列后选择。引物应当以如此方式有利地选择以便扩增物包含从起始密码子至终止密码子的完整编码序列。扩增物在扩增后便利地加以分析。例如凝胶电泳分离可以实施，然后进行定量和定性分析。此后扩增物可按照标准规程纯化(如Qiagen)。而后一份经纯化的扩增物在随后的克隆步骤中使用。合适的克隆载体通常为技术人员所知。这类载体特别包括那些能够在微生物系统中复制的载体，即那些确保在酵母或真菌中有效克隆和同时有可能稳定转化植物的主要载体。那些特别可提及的载体是适用于T-DNA介导的转化的多种二元和共整合的载体系统。这类载体系统通常以其包含至少为农杆菌介导的转染所需的vir基因和T-DNA分界序列(T-DNA边界)为特征。这类载体系统还有利地包含其它顺式调节区域，如启动子和终止子序列和/或选择标记，其中已合适转化的生物通过选择标记可以鉴定。在共整合载体系统的情况下，vir基因和T-DNA序列在相同载体中排列，而二元系统至少以两个载体为基础，其中一个载体携带了vir基因但没有T-DNA，同时第二个载体携带了T-DNA而无vir基因。因此所提及的后一种载体相对较小，容易在大肠杆菌(E.coli)中和农杆菌中操作和复制。这类双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明，Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA优选使用。双元载体和它们的用途的综述可在Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451中找到。为了制备载体，载体首先以限制性核酸内切酶线性化并且然后按照合适的方式进行酶修饰。此后纯化载体并且将一份纯化的载体用于克隆步骤。在克隆步骤中，使用连接酶将已经酶切割并且根据需要已纯化的扩增物与已按类似方式制备的载体片段克隆。在本上下文中，具体的核酸构建体、或载体或质粒构建体可具有一个或超过一个的编码性基因片段。将编码性基因片段在这些构建体中优选地与调节性序列有效连接。调节性序列尤其包括植物序列，如以上提到的启动子和终止子序列。这类构建体可在微生物，特别在大肠杆菌和根癌农杆菌中于选择性条件下稳定增殖并且有可能向植物或微生物中转移异源DNA。
方法中所用的核酸、发明性核酸和核酸构建体可有利地使用克隆载体向生物如微生物中或有利地向植物中导入，并且因此用于转化植物，如那些在《Plant Molecular Biology and Biotechnology》(1993年佛罗里达CRCPress出版社Boca Raton)第6/7章第71-119页；1993年Academic Press出版社Kung和R.Wu编辑的《Transgenic plants》第1卷《Engineering andUtilization》第15-38页F.F.White的Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；1993年Academic Press出版社Kung和R.Wu编辑的《Transgenic plants》第1卷《Engineering and Utilization》第128-143中B.Jen es等，Techniques for Gene Transfer；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225中发表和引用的植物。因此方法中所用的核酸、发明性核酸和核酸构建体和/或载体可用于重组性修饰广泛类型的生物，有利地修饰植物，因此经重组性修饰的植物成为更好和/或更高效的PUFA生产者。
根据本发明的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶蛋白质可以通过一系列机理直接影响油料作物植物或者微生物中精细化学品的产率、生产和/或生产效率。酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶蛋白质或者基因和酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶的基因组合的数目或活性可以增加，从而从头产生更大量的生产的化合物，因为在导入所述基因前，生物以前缺少该生物合成和能力。这类似地适用于与脂肪酸和脂类代谢中的其它去饱和酶或延伸酶或其它酶的组合。利用多种趋异的序列即在DNA水平不同的序列在本上下文中也是有利的，或者利用基因表达的启动子也是有利的，其中所述的启动子可使不同基因的表达随时间过程不同，例如与种子或贮油组织成熟程度相关。
由于单独或者与生物或者细胞中其他基因组合，向生物或细胞中导入一种酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶基因或者一些酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶基因，不但有可能增加指向终产物的生物合成流，而且还有可能增加或产生全新的相应三酰甘油酯的组合物。同样，可增加其它基因的数量或活性，其中所述的其它基因参与为一种或多种精细化学品(例如，脂肪酸、油、极性和中性脂类)的生物合成所需的营养物的输入，由此增加这些前体、辅因子或中间体在细胞中或贮存区室中的浓度，从而如以下描述可进一步增强细胞产生PUFA的能力。通过优化参与这类化合物生物合成的一种或多种酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶的活性或增加其数目，或通过破坏参与这些化合物降解的一种或多种去饱和酶的活性，有可能在生物中，有利地植物中强化脂肪酸和脂类分子的产量、生产和/或生产效率。
本发明方法中所用的经分离的核酸分子编码这样的蛋白质或其部分，其中所述蛋白质或单个蛋白质或其部分包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有足够的同源性，从而该蛋白质或者其部分保留了酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性。该核酸分子编码的蛋白质或者其部分优选地保留了其基本酶活性和参与生物中、有利地植物中细胞膜或者脂质体的生物合成或者分子跨这些膜转运所需的化合物的代谢的能力。有利地，所述核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有至少约40％、优选至少约60％、特别优选至少约70％、80％或者90％并且最优选至少约95％、96％、97％、98％、99％或者更高同源性。对于本发明，将同源性或者同源的理解为分别指同一性或者同一的。
酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的基本酶活性理解为指它们与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列编码的蛋白质/酶和它们的衍生物相比，保留了至少10％，优选至少20％，特别优选至少30％，非常特别优选至少40％的酶活性，并且从而可以参与生物中，有利地植物细胞中的脂肪酸合成或者跨膜转运所需的化合物的代谢，指在至少两个，有利地三、四或者五个位置具有双键的去饱和的C16-、C18-、C20-或C24碳链。
有利地用于该方法中的核酸来自真菌或植物，如藻类或者苔藓，如剑叶藓属、破囊壶菌属、Phytophtora、角齿藓属、等鞭金藻(Isochrysis)、Aleurita、Muscarioides、被孢霉属(Mortierella)、Borago、Phaeodactylum、隐甲藻属(Crypthecodinium)或者来自线虫如隐杆线虫，特别来自属和种：展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)、致病疫霉、角齿藓(Ceratodonpurpureus)、球等鞭金藻(Isocrydid galbana)、Aleurita farinosa、Muscarioides viallii，高山被孢霉(Mortierella alpine)、琉璃苣(Boragoofficinalis)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)或尤其有利地来自Ostreococcus tauri或Mantoniella squamata。
备选地，所使用的编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的经分离的核酸序列能够与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核酸序列例如在严格条件下杂交。
方法中所用的核酸序列有利地导入所述生物中，导入表达盒中，其中所述的表达盒有可能在生物如微生物或植物中表达这种核酸。
为达到此目的，将编码本发明酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶的核酸序列与有利地用于增强基因表达的一个或多个调节信号有效地连接。这类调节序列用于使基因和蛋白质特异性表达。根据宿主生物，这可以意味例如仅在导入已经发生后才表达和/或过表达这种基因，或立即表达和/或过表达这种基因。例如这些调节序列采取了诱导物或阻抑物结合的序列形式，因此控制这种核酸的表达。除了这些新的调节序列以外或作为这些序列的替代，这些序列的天然调节元件仍可在实际的结构基因之前存在并且根据需要可以如此方式加以遗传性修饰从而消除了它们的天然调节能力而且增强这些基因的表达。然而这种表达盒(＝表达构建体＝基因构建体)也可以更为简单地构建，也就是说在核酸序列或其衍生物的前面未插入额外的调节信号而且并不除去天然启动子和其调节功能。作为替代，天然调节序列已经以如此方式突变从而调节不再发生和/或增强了基因的表达。这些经修饰的启动子也可本身以部分序列的形式位于天然基因前(＝用于本发明核酸序列的一部分的启动子)以增强活性。而且这种基因构建体也可有利地包含与启动子有效连接的一个或多个称作增强子的序列，而这有可能增强核酸序列的表达。额外有利的序列如其它调节元件或终止子序列也可在DNA序列的3′端插入。酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶和Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶和/或有利的使用的Δ8去饱和酶和/或Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ9延伸酶基因可在表达盒(＝基因构建体)中存在单个或多个拷贝。优选地，仅仅这些基因的单个拷贝存在于每种表达盒中。这种基因构建体或这类基因构建体可在宿主生物中共同表达。在本上下文中，基因构建体可插入在一种或多种载体中并且在细胞中以游离的形式存在，或插入基因组中。当待表达的基因共同存在于一个基因构建体中时，其他基因在宿主基因组中的插入是有利的。
在本上下文中，调节序列或调节因子如上所述可优选地积极影响所导入基因的基因表达，从而增强基因表达。因此调节元件的增强过程可通过使用强转录信号如启动子和/或增强子有利地在转录水平上发生。此外例如通过改善mRNA的稳定性，经增强的翻译同样是可能的。
本发明的另一实施方案是一种或多种基因构建体，其含有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5定义的一种或多种序列或者其衍生物，并且其编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6中显示的多肽。上述酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶有利地导致细胞的甘油一酯、二酯和三酯库和辅酶A/脂肪酸酯库之间脂肪酸的替换，所述底物有利地具有1、2、3、4或者5个双键并且在脂肪酸分子中有利地具有16、18、20、22或24个碳原子。同样的应用于它们的同源物、衍生物或者类似物，它们有效连接有利地用于增强基因表达的一种或多种调节信号。
用于新方法的有利的调节序列在例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL的启动子中存在并且有利地在革兰氏阴性细菌中应用。其它有利的调节序列是例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或者植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或者泛蛋白或菜豆蛋白启动子中存在。可诱导启动子在本上下文中同样是有利的如在EP-A-0 388 186(苯磺酰胺可诱导)、Gatz等，Plant J.2，1992：397-404(四环素可诱导)、EP-A-0 335 528(脱落酸可诱导)或WO 93/21334(乙醇或环己醇可诱导)中的启动子。其它合适的植物启动子是马铃薯胞质FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸酰氨基转移酶启动子(Genbank AccessionNo.U87999)或在EP-A-0 249 676中所描述的结节特异性启动子。尤其有利的启动子是有可能使得在参与脂肪酸生物合成的组织中表达的启动子。种子特异性的启动子如所描述的USP启动子非常尤其有利，并且其它启动子如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白启动子同样如此。进一步更有利的启动子是种子特异性启动子，这种启动子能用于单子叶或双子叶植物并且在US 5,608,152(油菜籽的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(拟南芥的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(菜豆的菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(芸苔的Bce4启动子)、Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：233-239(来自豆科植物的LeB4启动子)中描述，这些启动子适于双子叶植物。适于单子叶植物的启动子是例如大麦lpt-2或lpt-1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、大麦醇溶蛋白启动子和WO 99/16890中所描述的其它合适启动子。
原则上，对于新方法可使用所有天然启动子及其调节序列，如那些如上提及的天然启动子及其调节序列。也可有利地使用合成启动子，可组合或者单独地使用，尤其当这类合成启动子介导了种子特异性表达时，如那些WO 99/16890中所描述的启动子。
为了取得特别高的PUFA含量，尤其在转基因植物中，PUFA生物合成基因应当有利地在油料作物中以种子特异性的方式表达。为实现此目的，可使用种子特异性启动子或在胚和/或在胚乳中活跃的那些启动子。原则上，种子特异性启动子既可从双子叶植物也可从单子叶植物中分离。如下列出了有利地优选的启动子：USP(未知种子蛋白质)和豌豆球蛋白(豌豆((Vicia faba))[Bumlein等，Mol.Gen Genet.，1991，225(3)]，油菜籽蛋白(油菜籽)[US 5,608,152]、酰基载体蛋白(油菜籽)[US 5,315,001和WO 92/18634]、油质蛋白(拟南芥)[WO 98/45461和WO 93/20216]、菜豆蛋白(菜豆)[US 5,504,200]、Bce4[WO 91/13980]、豆球蛋白B4(LegB4启动子)[Bumlein等，Plant J.，2，2，1992 233-9]，Lpt2和lpt1(大麦)[WO 95/15389和WO95/23230]、来自稻、玉米和小麦的种子特异性启动子[WO 99/16890]、Amy32b、Amy 6-6和aleurain[US 5,677,474]、Bce4(油菜籽)[US 5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP 571 741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP 06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO 98/08962]、异柠檬酸裂合酶(油菜籽)[US 5,689,0401或α淀粉酶(大麦)[EP 781 849]。
植物的基因表达也可通过化学可诱导启动子促进(见于综述Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。在需要以时间特异性方式进行基因表达时，这种化学可诱导启动子尤其合适。此类启动子的例子是水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、四环素可诱导启动子(Gatz等(1992)Plant J.2，397-404)和乙醇可诱导启动子。
为确保这类生物合成基因经多个世代后仍然稳定地在转基因植物中整合，编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、有利地Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、和/或Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ9延伸酶和并且用于方法中的每种核酸应当在一个独立的启动子，优选地在不同于其它启动子的启动子控制下表达，因为重复序列基序可导致T-DNA不稳定或导致重组事件。在本上下文中，表达盒有利地按如此方式构建从而启动子后是适宜的切割位点，这个切割位点有利地位于多位点接头中以便插入将要表达的核酸，并且根据需要使终止子序列位于这个多位点接头的后面。上述的这种序列重复多次，优选地重复三、四或五次，由此多达五个基因可在一个构建体中组合并导入转基因植物中以便表达。这种序列有利地重复了多至三次。为了表达核酸序列，核酸序列通过例如多位点接头中的合适切割位点在启动子后面插入。每种核酸序列有利地具有自身的启动子并且根据需要具有自身的终止子序列。然而仍然可在启动子后面并且根据需要在终止子序列前插入多个核酸序列。这里表达盒中所插入核酸的插入位点或其序列并不特别重要，也就是说核酸序列可在表达盒中最先的位置或最末的位置插入而不显著地影响这种核酸序列的表达。
不同的启动子例如USP、LegB4或DC3启动子和不同的终止子序列可有利地在表达盒中使用。然而也可在表达盒中只使用一种类型的启动子。但是这可能导致不为所需的重组事件。
如以上所述，已导入基因的转录应当通过位于已导入的生物合成基因3，端的合适终止子序列有利地终止(在终止密码子之后)。在本上下文中，可使用序列的例子是OCS 1终止子序列。如同启动子的情况，对每个基因应该使用不同的终止子序列。
如以上所述，基因构建体还可包含欲导入生物体的其它基因。向宿主生物中导入并且因此表达调节基因如诱导物、阻抑物或酶基因是可能并且有利的，其中这些诱导物、阻抑物或酶因其活性参与了生物合成途径中一种或多种基因的调节。这类调节基因可为异源或同源。而且脂肪酸或脂类代谢中的其它生物合成基因可在核酸构建体或基因构建体中有利地存在；然而这些基因还可以位于一种或多种其它核酸构建体中。有利地使用的脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因是选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP[＝酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶或它们组合的基因。尤其有利的核酸序列是脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因，这些生物合成基因选自：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶或Δ9延伸酶基因。
在本上下文中，以上提到的去饱和酶可与其它延伸酶和去饱和酶组合在本发明的表达盒中克隆并在农杆菌属协助下转化植物。
这里调节序列或调节因子可如以上所述优选地积极影响已导入基因的表达，并且因此增强了已导入基因的表达。因此，调节元件的增强可通过使用强转录信号例如启动子和/或“增强子”有利地在转录水平发生。此外，例如通过改善mRNA稳定性同样可增强翻译。原则上，这类表达盒可直接用于导入植物或导入载体。
这些有利的载体优选地表达载体包含用于方法中并且编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的核酸，或包含核酸的核酸构建体，其中所述核酸单独使用或者与脂肪酸或脂类代谢中的其它生物合成基因如Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ9延伸酶组合使用。如在本上下文中所用，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够运输与这种核酸分子所结合的其它核酸。载体的一个类型是“质粒”，即额外的DNA片段可加以连入的环状双链DNA环。载体的另一个类型是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组。某些载体能够在已导入这些载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它载体当向宿主细胞导入时有利地在宿主细胞的基因组内整合并且因此随宿主基因组一起复制。而且某些载体能够控制与这些载体有效连接的基因的表达。这些载体在本上下文中称为“表达载体”。通常适用于重组DNA技术的表达载体采用了质粒的形式。在本说明书中由于质粒是最常用的载体形式，故“质粒”和“载体”可互换使用。然而本发明还将覆盖具有类似功能的其它形式的表达载体如病毒载体。术语“载体”还将包含技术人员已知的其它载体如噬菌体、病毒如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线形或环形DNA。
有利地在方法中使用的重组表达载体包含具有宿主细胞中适于所用核酸表达的形式的如下所述核酸或以上提及的基因构建体，即所述重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞所选择的一种或多种调节序列，其中这种调节序列有效地与将要表达的核酸序列连接。在重组表达载体中，“有效连接的”意指将目的核苷酸序列与调节序列以如此方式连接即有可能使这种核苷酸序列表达并且它们彼此连接而使这两类序列(例如在体外转录/翻译系统中，或如果载体导入了宿主细胞，在宿主细胞中)都执行了属于各序列的预期功能。术语“调节序列”旨在包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这些调节序列在例如Goeddel：GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)一书中描述或参见：Gruber和Crosby，Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnolgy，CRC Press，Boca Raton，Florida，Glick和Thompson编著，Chapter 7，89-108，包括其中引用的参考文献。调节序列包含那些在多种类型的宿主细胞中控制核苷酸序列组成型表达的调节序列和那些控制核苷酸序列仅仅在特定的宿主细胞中于特定条件下直接表达的调节序列。技术人员知道表达载体的设计可依赖多种因素如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质的目的表达水平及其它因素。
所用的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和延伸酶。为方便起见，载体构建的中间步骤常在微生物中实施，因此这样设计是有利的。例如酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶基因可使用载体按照如WO98/01572中所描述的转化方法在细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌细胞(见Romanos，M.A.等(1992)“Foreign geneexpression in yeast：a review”，Yeast 8：423-488：van den Hondel、C.A.M.J.J.等.(1991)“Heterologous gene expression in filamentous fungi”，in：More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页：Academic Press：San Diego：和van den Hondel、C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)”Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics ofFungi，Peberdy，J.F.等编辑，第1-28页Cambridge University Press：Cambridge)、藻类(Falciatore等，1999，Marine Biotechnology.1，3：239-251)、多种类型的纤毛虫：Holotrichia，缘毛亚纲(Peritrichia)，旋毛亚纲(Spirotrichia)，吸管亚纲(Suctoria)，四膜虫(Tetrahymena)，草履虫(Paramecium)，豆形虫(colpidium)，瞬目虫(Glaucoma)，匙口虫(Platyophrya)，Potomacus，Cohnilembus，游仆虫(Euplotes)，Engelmaniella和stylonychia(Stylonychia)，尤其是Stylonychia lemnae并且优选地在多细胞植物的细胞中(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)Plant Cell Rep.：583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，CPress，Boca Raton，Florida，Chapter 6/7，pp.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，Ed.：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225(并且其中所应用的参考文献))表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中详细讨论。作为备选，重组表达载体可例如使用T7-启动子调节序列和T7-聚合酶体外转录和翻译。
在大多数情况下，原核生物中蛋白质的表达涉及使用包含控制融合或非融合蛋白质表达的组成型或可诱导启动子的载体。典型的融合表达载体尤其为pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A分别与重组靶蛋白融合。
合适的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其为pTrc(Amann等(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(1990年加利福尼亚圣迭哥Academic Press出版社《Methods in Enzymology》185的Studier等《GeneExpression Technology》第60-89页)。靶基因自pTrc载体的表达是基于宿主RNA聚合酶自杂合trp-lac融合启动子的转录。靶基因自pET 11d载体的表达是基于经共表达的病毒RNA聚合酶(T7-gn1)所介导的T7-gn10-lac融合启动子的转录，这种病毒RNA聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)的定居λ-原噬菌体提供，其中所述定居λ-原噬菌体携带了受lacUV 5启动子转录控制的T7 gn1基因。
其它适用于原核生物的载体为技术人员所知，这类载体是例如大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt1 1或pBdCI，链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌属中的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌属中的pSA77或pAJ667。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于酿酒酵母中表达的载体的例子包含pYeDesaturasec1(Baldari等.(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。用于构建适用于其它真菌如丝状真菌的载体和构建方法包含在1991年剑桥大学的剑桥大学出版社J.F.Peberdy等编辑的《Applied Molecular Genetics of fungi》第1-28页，van den Hondel、C.A.M.J.J；和Pun，P.J.的“Gene transfer systems and vector developmentfor filamentous fungi”中或在《More Gene Manipulations in Fungi》[圣迭哥Academic Press出版社J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页]中所详细描述的那些载体和方法。其它合适的酵母载体为例如pAG-1、YEp6、YEp13和pEMBLYe23。
作为备选，酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶可在昆虫细胞中用杆状病毒载体表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包含pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170：31-39)。
以上提到的载体仅概略回顾了可能适合的载体。其它的质粒为技术人员所知并且在例如《Cloning vector》(1985年阿姆斯特旦-纽约-牛津Elsevier出版社，Pouwels，P.H.等编辑，ISBN 0 444 904018)中描述。对于其它合适用于原核及真核细胞的表达系统，见2001年纽约冷泉港ColdSpring Harbor Laboratory出版社，Sambrook和Russell的《MolecularCloning：A Laboratory Manual》第三版第16和第17章中的描述。
在方法的又一个实施方案中，酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、去饱和酶和/或延伸酶可在单细胞植物细胞(如藻类)中表达，参见Falciatore等，1999，Marine Biotechnology 1(3)：239-251及其中引用的参考文献，并且可在高等植物的植物细胞中表达(如种子植物例如耕作作物)。植物表达载体的例子包括在1992年Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和1984年Bevan，M.W.，Nucl.Acids Res.12：8711-8721；在1993年Academic Press出版社Kung和R.Wu编辑的《(Transgenic Plants：第1卷Engineering and Utilization》第15-38页的Vectors for Gene Transfer in Higher Plants中所详细描述的那些植物表达载体。
植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中控制基因表达并且有效连接的调节序列，如此使每一种序列能够实现它的功能，例如多聚腺苷酸化信号的转录终止功能。优选的多聚腺苷酸化信号是衍生自根癌农杆菌T-DNA如Ti质粒pTiACH5(1984年Gielen等，EMBO J.3期，835等)的基因3的那些多聚腺苷酸化信号，其中已知基因3是章鱼氨酸合酶，或者是那些多聚腺苷酸化信号的等同物，但是所有其它在植物中具有功能性活性的终止子序列同样合适。
由于植物基因表达通常不限于在转录水平，植物表达盒优选地包含其它有效连接的序列如翻译增强子例如超驱动序列，所述的超驱动序列增强烟草花叶病毒5’-非翻译前导序列，这种前导序列提高了蛋白质/RNA比(Gallie等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。
如以上所述，待表达基因必须有效地与合适启动子连接，其中这种启动子引发基因以正确的时间过程或以细胞或组织特异性方式表达。可使用的启动子是组成型启动子(Benfey等，EMBO J.8(1989)2195-2202)，例如那些衍生自植物病毒如35S CaMV(Franck等，Cell 21(1980)285-294)、19S CaMV(也见US 5352605和WO 84/02913)的启动子或植物启动子如在US 4,962,028中所描述小Rubisco亚单位的启动子。
用于在植物基因表达盒中有效连接的其它优选的序列是靶向序列，其中这种靶向序列为基因产物向该基因产物对应的细胞区室中例如向液泡、细胞核、所有类型质体如造粉体、叶绿体、色质体、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室中导入所需(综述见Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423和其中引用的参考文献)。
如以上所述，植物基因表达还可以通过化学可诱导启动子(见Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108的综述)实现。当希望基因表达需以时间特异性方式发生时，化学可诱导启动子尤其适合。这类启动子的例子是水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、四环素可诱导启动子(Gatz等(1992)Plant J.2，397-404)和乙醇可诱导启动子。
对生物性或非生物应激条件反应的启动子如病原诱导的PRP1基因启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、热诱导的番茄hsp80启动子(US 5,187,267)、冷冻诱导的马铃薯α淀粉酶启动子(WO96/12814)或外伤诱导的pinII启动子(EP-A-0 375 091)同样适合。
那些在进行脂肪酸、脂类和油生物合成的组织和器官中，在种子细胞如胚乳细胞和发育胚的细胞中引起基因表达的启动子尤其有利。这类合适的启动子是油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆的USP启动子(Baeumlein等，Mol Gengenet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔属的Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性表达的启动子。合适启动子是大麦的lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中所描述来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁的kasirin基因或黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子。
因为质体是合成脂类生物合成的前体和某些终产物的区室，同样尤其适合的其它启动子是那些引起质体特异性表达的启动子。合适的启动子是病毒RNA聚合酶启动子，在WO 95/16783和WO 97/06250中描述以及来自拟南芥的clpP启动子，在WO 99/46394中描述。
引起方法中所用的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的多重平行表达可能尤为所需。这类表达盒可通过同时转化多种单独的表达构建体，或优选地通过在一个载体构建体上组合多种表达盒而产生。同样在每一情况下多种载体可以用多种表达盒转化然后向宿主细胞转移。
载体DNA可通过常规的转化或转染技术向原核和真核细胞内导入。术语“转化”和“转染”、接合和转导如在本上下文中所用，旨在包含本领域众知的用于向宿主细胞内导入外源核酸(如DNA)的多种方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。适用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的方法可在Sambrook和Russell(2001年纽约冷泉港ColdSpring Harbor Laboratory出版社《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》第三版)和其它的实验室教材如1995年新泽西Totowa的HumanaPress出版社《Methods in Molecular Biology》第44卷Gartland和Davey编辑的《Agrobacterium protocols》中找到。
适于摄入本发明的核酸、本发明的基因产物或本发明的载体的宿主细胞是所有原核或真核生物。有利使用的宿主生物是微生物如真菌或酵母或者植物细胞，优选植物或其部分。优选使用真菌、酵母或植物，尤其优选使用植物，非常尤其优选使用具有高脂类化合物的植物如油料作物，例如油菜籽、月见草、大麻、大蓟、花生、卡诺拉油菜、亚麻子、大豆、红花、向日葵、琉璃苣，或植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊，茄科植物如马铃薯、烟草、茄和番茄、豌豆属的种、豌豆、紫花苜蓿，灌木植物(咖啡、可可、茶)，柳属的种、树(油棕榈，椰子)和宿生牧草及饲料作物。本发明尤其优选的植物是油料作物如大豆、花生、油菜籽、卡诺拉油菜、亚麻子、大麻、月见草、向日葵、红花、树(油棕榈、椰子)。
本发明还涉及上述分离的核酸序列，其编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述核酸序列编码的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶特异转化在脂肪酸分子中具有至少一个双键的C16-、C18-、C20-和C22脂肪酸。
有利的分离的核酸序列是选自如下的序列：
d) 具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示序列的核酸序列，
e)核酸序列，其由于遗传密码的简并性，可以衍生自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的编码序列，
f) SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列的衍生物，其编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的多肽并且与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列在氨基酸水平具有至少40％同源性并且具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性。
根据本发明的上述核酸序列来自能够合成PUFAs的生物如动物、纤毛虫、真菌、植物，如藻类或者甲藻。根据本发明的核酸序列优选来自Ostreococcus tauri或Mantonella squamata。
在有利的实施方案中，用于本上下文中的术语“核酸(分子)”额外包含编码基因区3’末端和5’末端的非翻译序列：编码区的5’末端上游序列的至少500，优选200，特别优选100个核苷酸和编码基因区3’末端下游序列的至少100，优选50，特别优选20个核苷酸。“分离的”核酸分子与该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子分离。“分离的”核酸优选地没有该核酸所来自的生物的基因组DNA中该核酸天然侧翼的序列(例如，位于该核酸的5’和3’末端的序列)。在多种实施方案中，分离的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶分子可以包含例如少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在所述核酸所来自的细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子的侧翼。
用于方法中的核酸分子，例如，具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸分子或者其部分可以用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息分离。而且，例如，可以借助比较算法，在DNA或者氨基酸水平上鉴定同源序列或者同源的保守序列区。它们可以用作标准杂交技术中(如Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001中描述的技术)的杂交探针用于分离可以用于该方法中的其他核酸序列。此外，包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的完整序列或者其部分的核酸分子可以通过聚合酶链式反应分离，基于该序列或者其部分使用寡核苷酸引物(例如，通过聚合酶链式反应，使用基于该相同序列产生的寡核苷酸引物可以分离包含完整序列或者其部分的核酸分子)。例如mRNA可从细胞中分离(如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)和通过逆转录酶获得cDNA(例如可以用从Gibco/BRL，Bethesda，MD获得的莫洛尼MLV逆转录酶或可以用从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL获得的AMV逆转录酶)。用于聚合酶链反应扩增的合成寡核苷酸引物可基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核酸序列之一或者SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中详述的氨基酸序列产生。本发明的核酸可使用cDNA或备选地使用基因组DNA作为模板并且使用合适的寡核苷酸引物通过标准PCR扩增技术扩增。所扩增的核酸因此可向合适的载体克隆并且通过DNA序列分析表征。
以序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的方式使用的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶核酸序列的同源物指例如，等位基因变体，其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或者它们的同源物、衍生物或者其类似物或者部分具有至少约40到60％，优选至少约60到70％，更优选至少约70到80％、80到90％或90到95％甚至更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％或者更高同源性。还包含分离的核酸分子，其核酸序列例如在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列之一或者其部分杂交。等位基因变体包含特定功能变体，其可以通过从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中详述的序列缺失、插入或者替代核苷酸得到，然而，意在基本上保持所得蛋白质的酶促活性。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的同源物也指例如编码和非编码DNA序列的细菌、真菌和植物同源物、截短的序列、单链DNA或者RNA。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的同源物也指衍生物，如启动子变体。详述的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸交换、通过插入和/或缺失来修饰，然而，启动子的功能性或者活性不受到不利的影响。还可能的是启动子序列的修饰增强它们的活性或者它们被更具活性的启动子，包括来自异源生物的那些启动子完全置换。
将编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性并且参与脂类和脂肪酸、PUFA辅因子和酶的代谢或参与亲脂化合物跨膜运输的以上提及的核酸在本发明的方法中使用，以便在转基因生物有利地在植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、亚麻属的种例如亚麻子或亚麻，芸苔属的种例如油菜籽、芸苔和芜箐、胡椒、向日葵、琉璃苣、月见草和万寿菊，茄科的植物例如马铃薯、烟草、茄和番茄，豌豆属的种，豌豆，木薯，紫花苜蓿，灌木植物(咖啡、可可、茶)，柳属的种，树(油棕榈、椰子)和宿生牧草和饲料作物中调节PUFA的产生，所述的调节为直接调节(例如当脂肪酸生物合成蛋白质过表达或优化表达对经修饰的生物中脂肪酸的产量、生产和/或生产效率有直接影响时)和/或具有间接影响，然而这种间接效果无论如何总是引起了PUFA产量、生产和/或生产效率的增强或所不需的化合物的减少(例如当调节细胞中脂类和脂肪酸、辅因子和酶的代谢引起了所需化合物的产量、生产和/或生产效率的改变或细胞中目的化合物组成的改变，而这反过来又可影响一种或多种脂肪酸时)。
多种前体分子和生物合成酶的组合导致了多种脂肪酸分子的产生，这决定性地影响了脂类组成，因为多不饱和脂肪酸(＝PUFA)不仅掺入三酰甘油酯而且也掺入膜脂类。
脂类合成可划分为两个阶段：脂肪酸的合成和它们与sn-甘油-3-磷酸的结合及极性首基的添加或修饰。通常用于膜中的脂类包含磷脂类、糖脂类、鞘脂类和磷酸甘油酯。脂肪酸的合成始于通过乙酰基辅酶A羧化酶将乙酰基辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A或通过乙酰基转酰基酶将乙酰基辅酶A转化为乙酰基ACP。这两种产物分子在缩合反应后共同形成了乙酰乙酰基ACP，这种分子经一系列缩合、还原和脱水反应转化，因而获得了具有所需链长度的饱和脂肪酸分子。从这些分子产生不饱和脂肪酸的过程由特异性去饱和酶通过分子氧有氧性地催化，或者无氧性地催化(关于在微生物中合成脂肪酸，见F.C.Neidhardt等(1996)E.coli and Salmonella.ASM Press：Washington，D.C.第612-636页和其中所引用的参考文献；Lengeler等(Ed.)(1999)Biology of Procaryotes.Thieme：Stuttgart，New York和其中的参考文献及Magnuson，K.，等(1993)MicrobiologicalReviews 57：522-542和其中的参考文献)。为进一步实施延伸步骤，所得的与磷脂结合的脂肪酸必须返回至脂肪酸辅酶A酯库。本发明酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶实施此步骤。而且这些酶能够将已延伸的脂肪酸从辅酶A酯再次转移至磷脂。根据需要可以重复这种反应顺序(见图4)。
用于生物合成PUFA的前体的例子是油酸、亚油酸和亚麻酸。必须将C18碳的脂肪酸延伸至C20和C22以获得二十和二十二链型的脂肪酸。在方法中所用的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的帮助下，优选组合去饱和酶如Δ4、Δ5、Δ6和Δ8去饱和酶和/或Δ5、Δ6、Δ9延伸酶，可以产生和提取花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸和多种其他长链PUFA并且可在涉及食品、饲料、化妆品或药品方面的多种用途中应用。使用上述酶，可能优选产生制备脂肪酸分子中具有至少两个双键，有利地具有至少三、四、五或六个双键的C18、C20和/或C22脂肪酸，有利地制备在脂肪酸分子中具有三个、四个或五个双键的C20和/或C22脂肪酸。去饱和可在延伸所讨论的脂肪酸之前或之后发生。这是为什么去饱和酶活性的产物和其它可能的去饱和延伸步骤的产物产生了具有更高去饱和程度的优选PUFA的原因，包括将C20至C22脂肪酸进一步延伸为如γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸的脂肪酸。本发明方法中所用的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的底物是C16、C18、C20或C22脂肪酸例如棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、二十碳四烯酸或十八碳四烯酸。优选的底物是亚油酸、γ-亚麻酸和/或α-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。脂肪酸中具有至少二个双键的C18、C20或C22脂肪酸在本发明的方法中以游离脂肪酸形式或以其酯形式如以其甘油酯形式获得。
将术语“甘油酯”理解为意指用一、二或三个羧基所酯化的甘油(单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油)。将“甘油酯”理解为意指多种甘油酯的混合物。甘油酯或甘油酯的混合物可以包含其它添加物例如游离脂肪酸、抗氧化剂、蛋白质、糖类、维生素和/或其它物质。
为了本发明方法的目的，也将“甘油酯”理解为意指甘油衍生物。除以上所描述的脂肪酸甘油酯以外，这些甘油衍生物还包括甘油磷脂和甘油糖脂。可在本上下文中提到的优选的例子为甘油磷脂如卵磷脂(磷脂酰胆碱)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和烷基酰基甘油磷脂。
而且随后脂肪酸必须易位至不同的修饰位点并且掺入三酰甘油酯贮藏脂。脂类合成的又一个重要步骤是例如通过甘油脂肪酸酰基转移酶将脂肪酸转移至极性首基(见Frentzen，1998，Lipid，100(4-5)：161-166)。
关于植物脂肪酸生物合成、去饱和、脂类新陈代谢和脂类化合物的膜运输、β氧化、脂肪酸修饰和辅因子、三酰甘油酯贮藏和三酰甘油酯组装的出版物，包括其中的参考文献参见如下文章：1997年JK Setlow编辑的《Genetic Engeneering》19第149-166页Kinney；Ohlrogge和Browse，1995，Plant Cell 7：957-970；Shanklin和Cahoon，1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.49：611-641；1996年JK Setlow编辑的《GeneticEngeneering》18第111-13页Voelker；Gerhardt，1992，Prog.Lipid R.31：397-417；Gühnemann-Schfer和Kindl，1995，Biochim.Biophys Acta1256：181-186；Kunau等，1995，Prog.Lipid Res.34：267-342；Rockville美国植物生理学学会1993年Murata和Somerville编辑的《Biochemistryand Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants》第150-158页Stymne等；Murphy和Ross 1998，Plant Journal.13(1)：1-16。
方法中所产生的PUFA包含高等动物不再能自身合成(以足够量)并且因此必须摄入(额外量)的一组分子，虽然这类PUFA易于由其它生物例如细菌合成。
对于本发明，术语“酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶”包含参与磷脂结合的脂肪酸向辅酶A-酯库转移或者反之亦然的蛋白质，和它们的同源物、衍生物或类似物。用于本发明目的的磷脂理解为指磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇，有利地磷脂酰胆碱。对于本发明，术语酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶核酸序列包含编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶，尤其酰基辅酶A：溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶并且可以包含编码区和如果合适，合适的5’-和3’非翻译序列区的核酸序列。
在另一实施方案中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的本发明的核酸分子的衍生物编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的完整氨基酸序列具有至少40％，有利地具有约50到60％，优选具有至少约60到70％和更优选地具有至少约70到80％、80至90％、90至95％以及最为优选地具有至少约96％、97％、98％、99％或更高同源性(同一性)的蛋白质。计算了涵盖整个氨基酸或核酸序列区域的同源性。作为GCG软件包[Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]的部分的PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，5 1989：151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))用于序列比对。使用BestFit程序和如下设置：缺口权重：8，长度权重：2确定了如以上以百分率所显示的覆盖全序列的序列同源性值。
此外，本发明包含由于遗传密码简并性与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5(和其部分)中显示的核苷酸序列之一不同并且从而编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列编码相同酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的核酸分子。
除了SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶核苷酸序列，技术人员将认识到引起酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的氨基酸序列改变的DNA序列多态性可在群体中存在。酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶基因中的这类遗传多态性可因为天然变异在群体中的个体之间存在。这些天然变体通常在酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的核苷酸序列中产生1至5％的变异。本发明将包含每一种和每一个这些核苷酸变异以及所导致的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶中氨基酸多态性，它们是天然变异的结果并且不改变酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的功能活性。
有利于本发明方法的核酸分子由于与本文公开的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶核酸的同源性，可以遵循标准杂交技术，使用这些酶的核酸序列或其部分为杂交探针在严格杂交条件下分离。例如本上下文中可使用这样的经分离的核酸分子，其中所述核酸分子长至少15个核苷酸并且与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸分子在严格条件下杂交。具有至少25、50、100、200或更多个核苷酸的核酸也可以使用。如本上下文中所用的“在严格条件下杂交”用以描述杂交和洗涤条件，通常彼此具有至少60％同源性的核苷酸序列在这样的条件下可保持相互杂交。优选的杂交条件是这样：彼此具有至少约65％，优选至少约70％和尤其优选至少75％或更高同源性的序列间通常保持相互杂交。这些严格条件为技术人员所知并且在1989年N.Y.的John Wiley & Sons出版社的《Current Protocols in Molecular Biology》第6.3.1-6.3.6中描述。一个优选的非限制性严格杂交条件的例子是在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝ SSC)中约45℃时杂交，然后是一个或多个于0.2×SSC、0.1％SDS中50至65℃的洗涤步骤。技术人员知道根据核酸类型和例如当存在有机溶剂时，温度和缓冲液浓度在杂交条件中是不同的。在“标准杂交条件”下，例如根据核酸类型，杂交温度在0.1至5×SSC(pH 7.2)浓度的缓冲水溶液中处于42℃和58℃之间。如果在以上提到的缓冲液中存在有机溶剂例如50％甲酰胺，标准条件下的杂交温度是大约42℃。对于DNA：DNA杂交体的杂交条件例如是优选地0.1×SSC和20℃至45℃，优选地为30℃至45℃。例如DNA：RNA杂交体的杂交条件是优选地0.1×SSC和30℃至55℃，优选地为45℃至55℃杂交。以上提到的杂交温度通过长约100 bp(＝碱基对)并且G+C含量为50％的核酸在无甲酰胺的情况下测定。技术人员以上面提到的教材或基于如2001年Cold Spring Harbor Laboratory出版社Sambrook和Rusell的《Molecular Cloning》；1985年牛津的牛津大学出版社中IRL Press出版社Hames和Higgins编辑《Nucliec AcidHybridization：A Practical Approach》；1991年牛津的牛津大学出版社中IRL Press出版社Brown编辑的《Essential Molecular Biology：A PracticalApproach》所述知道如何确定所需的杂交条件。
为了确定两个氨基酸序列(如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6序列中的一个序列)或两种核酸序列(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5)的同源性(＝同一性)百分数，将序列书写为使一个序列处于另一个序列下以便优化比较(例如可向一个蛋白质序列或一个核酸序列中导入缺口以便产生与另一个蛋白质或另一个核酸的最优比对)。然后比较相应氨基酸位置上或相应核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。如果一个序列的某个位置由另一个序列相应位置的相同氨基酸残基或相同核苷酸占据，则在此位置上这些分子同源(即氨基酸或核酸“同源性”如在本发明中所用对应于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列间的同源性百分数是两个序列间所共有的相同位置数目的函数(即同源性％＝相同的位置数目/总位置数目×100)。因此将术语“同源性”和“同一性”视为同义。使用上面提到的程序或者算法。
编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的蛋白质序列同源的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的经分离核酸分子可通过在/向SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸的替代、添加或缺失而产生，从而将一个或多个氨基酸的替代、添加或缺失导入/到所编码的蛋白质中。序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5之一中的突变可通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变导入。优选对所预测的一个或多个非必需氨基酸残基进行保守性氨基酸替代。在“保守性氨基酸替代”中，氨基酸残基由具有类似侧链的另一种氨基酸残基替代。本领域中具有类似侧链的氨基酸残基家族已经得到定义。这些家族包含具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶中所预测的非必需氨基酸残基由来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基优选地替换。在另一个实施方案中，这种突变可备选地在编码酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的完整序列或其部分中随机导入，如通过饱和诱变导入，并且将由此所得的突变体筛选本文描述的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性以便鉴定保留了酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的突变体。在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列之一经过诱变后，这种诱变后序列所编码的蛋白质可重组表达，并且所编码蛋白质的活性可经例如本文中所描述的试验测定。
本发明通过以下实施例更详细地说明，这不得解释为作为限制性的说明。本专利申请中所引用的参考文献、专利申请、专利和已公开的专利申请的全部内容此处引用作为参考。
实施例
实施例1：一般方法
a)通用克隆方法
克隆方法例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、核酸转移至硝酸纤维素膜和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞和酵母细胞、细菌培养和重组DNA的序列分析按照Sambrook和Russell(2001)(Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)或Kaiser，Michaelis and Mitchell(1994)“Methods in Yeast Genetics”(Cold SpringHarbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-451-3)所描述实施。
b)化学品
除非在文中另外指出，使用的化学品以分析级质量从Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)获得。使用来自Milli-Q-Wassersystem水纯化系统(Millipore，Eschborn)的纯的无致热原的水(下文中称作H2O)制备溶液。从AGS(Heidelberg)、Amersham(Brunswick)、Biometra(Gttingen)、Roche(Mannheim)、Genomed(Bad Oeynhausen)、New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison、Wisconsin、USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Amsterdam，Netherlands)得到限制性内切核酸酶、DNA修饰酶和分子生物学试剂盒。除非另外指出，按照生产商的使用说明书使用它们。
实施例2：从Ostreococcus tauri克隆酰基转移酶基因
在以前从秀丽隐杆线虫(WO 2004/76617)分离的LPCAT的蛋白质序列中搜索保守区鉴定了具有Ostreococcus序列数据库(基因组序列)中对应的基序的序列(见图1)。该序列具有如下的：
| 基因名称 | SEQ ID No.： | 氨基酸 |
| OtLPCAT | 2 | 239 |
编码该蛋白质的基因如下克隆：
将处于稳定期的40ml Ostreococcus tauri培养物离心，重悬浮在100μl双蒸水中并在-20℃保存。用PCR方法扩增对应的基因组DNA。以这样的方式选择对应的引物对使得它们含有5’端的前20个核苷酸和3’端的后20个核苷酸(包括终止密码子)并且在5’端额外含有酵母共有序列用于高度有效的翻译(Kozak(1986)Cell 44：283-292)。
使用下面的引物：
5`-119-Ot-LPCAT： ATG CTG GTC GCG CGC GTC CGA GC
3`-120-Ot-LPCAT-XhoI： ACTCGA GTC ACG AGT TGT TCACGA GGC
使用的引物的位置在图1中显示。
在每种情况下用1μl解冻的细胞、200μM dNTPs、2.5 U Taq聚合酶和100 pmol每种引物在50μl总体积中进行OtLPCAT DNA的扩增。PCR条件如下：首先在95℃变性5分钟，接着是30个循环的：94℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 2分钟，和72℃ 10分钟的最后延伸步骤。
实施例3：用于在酵母中异源表达OtLPCAT的表达质粒的克隆
以这样的方式选择引物对使得它们含有用于高效翻译的与起始密码子相邻的酵母共有序列(Kozak(1986)Cell 44：283-292)。在每种情况下用1μlcDNA，200μM dNTPs，2.5 U Advantage聚合酶和100 pmol每种引物在50μl的总体积中进行OtLPCAT的扩增。PCR条件如下：首先在95℃变性5分钟，接着是30个循环的：94℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 2分钟，和72℃ 10分钟的最后延伸步骤。
下面的寡核苷酸用于PCR反应中以克隆用于在酵母中异源表达的序列：
| 基因名称 | 引物序列 |
| OtLPCAT(SEQ ID No.1) | F：5’-accatgctggtcgcgcgcgtccgR：5’-tcacgagttgttcacgaggc |
*F＝正向引物，R＝反向引物
按照生产商的使用说明，用酵母表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)在21℃将PCR产物温育30分钟。通过T突出端和拓扑异构酶活性(Invitrogen)将PCR产物连接到载体中。温育后，转化大肠杆菌DH5α细胞。通过PCR鉴定合适的克隆，通过Qiagen DNAeasy试剂盒分离质粒DNA并通过测序验证。所得质粒pYES2.1-OtLPCAT的序列在SEQ ID No.7中显示。然后将正确序列通过电穿孔(1500 V)转化到酵母菌株INVSc1(Invitrogen)中。作为对照，平行地转化空白载体pYES2.1。之后，将酵母平板接种到补加2％葡萄糖的撤除尿嘧啶的完全最小培养基上。能够在没有尿嘧啶的培养基中生长的细胞从而包含对应的质粒pYES2.1或者OtLPCAT的pYES2.1。选择后，在每种情况下选择两种转化体用于进一步的功能表达。
实施例4：为了植物中的种子特异性表达克隆OELPCAT表达质粒
为了转化植物，产生基于pSUN-USP的载体。
pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P.等人(1994).PlantMol.Biol. 25：989-994)。通过向pSUN300中插入USP启动子作为EcoRI片段，从pSUN300得到pSUN-USP。该UPS启动子对应于核苷酸1-684(Genbank Accession X56240)，其中USP基因的非编码区的部分存在于启动子中。大小为684个碱基对的启动子片段通过商业途径可获得的T7标准引物(Stratagene)并且借助合成的引物通过PCR反应按照下面的标准方法扩增。
(5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’).
将PCR片段用EcoRI/SalI再次切割并导入具有OCS终止子的载体pSUN300中。多聚腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼碱合成酶基因(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H.等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1(6)：499-511)。这得到名为pSUN-USP的质粒。使用该构建体转化拟南芥、油菜、烟草和亚麻子。
为了将Ot-LPCAT克隆到pSUN-USP，使用下面的引物对，在编码序列的5’和3’端插入NotI限制性位点：
pSUN-OtLPCAT
正向：5‘-GCGGCCGCACCATGCTGGTCGCGCGCGTCCG
反向：3‘-GCGGCCGCTCACGAGTTGTTCACGAGGC
PCR混合物(50μl)的组成：
5.00μl模板cDNA
5.00μl10 x缓冲液(Advantage聚合酶)+25 mM MgCl2
5.00μl 2mM dNTP
1.25μl每种引物(10pmol/μl)
0.50μl Advantage聚合酶
PCR反应条件：
退火温度：55℃下1分钟
变性温度：94℃下1分钟
延伸温度：72℃下2分钟
循环数：35
将PCR产物在37℃与限制酶NotI温育16小时。以相同的方式温育植物表达载体pSUN300-USP。之后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和7624 bp载体并切除对应的DNA片段。通过Qiagen凝胶纯化试剂盒按照生产商的使用说明书纯化DNA片段。之后，连接载体和PCR产物。来自Roche的Rapid Ligation试剂盒用于该目的。通过测序验证所得质粒pSUN-OtLPCAT。
实施例5：OtLPCAT的功能表征
在酵母中表达OtLPCAT并喂饲多种脂肪酸后测定OtLPCAT活性(表2)。
因为OtLPCAT表达应该导致酰基底物的有效取代，因此额外制备包含来自展叶剑叶藓的Δ6去饱和酶(PpD6)和Δ6延伸酶(PSE1)(见DE 102 19203)的可读框的双构建体pESCLeu-PpD6-PSE1并将其与空白载体pYES2.1或载体pYES2.1-OtLPCAT一起转化。构建体pESCLeu-PpD6-PSE1的克隆可以见WO 2004/076617，将其内容明确引入本文。
用于测定生物的脂肪酸组成的分析技术是技术人员已知的并且包括光谱法、薄层层析、多种类型的染色方法、酶学和微生物学方法和分析层析，如高效液相层析(见例如，Ullman，Encyclopedia of Industrial Chemistry，Vol.A2，p.89-90 and p.443-613，VCH Weinheim(1985)；Fallon，A.，等人，(1987)“Applications of HPLC in Biochemistry“in：LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.17；Rehm等人(1993)Biotechnology，Vol.3，Chapter III：“Product recovery andpurification“，p.469-714，VCH Weinheim；Belter，P.A.，等人(1988)Bio-separations：downstream processing for Biotechnology，John Wiley andSons；Kennedy，J.F.，and Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes forbiological Materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.，and Henry，J.D.(1988)Biochemical Separations，in：Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，Vol.B3；Chapter 11，p.1-27，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.(1989)Separation and purification techniques inbiotechnology，Noyes Publications)。
对于OtLPCAT表达，在每种情况下将补充2％(w/v)棉子糖但是没有尿嘧啶和亮氨酸的2ml CMdum液体培养基的预培养物首先接种选择的转化体并在30℃和200rpm下温育2天。然后将补充2％棉子糖，1％(v/v)Tergitol NP-40和250μM亚油酸(18:2Δ9，12)或亚麻酸(18:3Δ9，12，15)的5ml CMdum液体培养基(没有尿嘧啶和亮氨酸)接种所述预培养物到OD600为0.08。通过加入2％(w/v)半乳糖在OD600为0.2-0.4下诱导表达。在20℃下继续温育培养物48小时。
通过离心(100 x g，10min，20℃)收获主要培养物的酵母细胞并用100mM NaHCO3，pH 8.0洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。以酵母细胞沉淀物开始，通过酸性甲醇分解制备脂肪酸甲酯(FAMEs)。为此，将细胞沉淀物在80℃与2ml 1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧基丙烷在80℃温育1小时。用石油醚(PE)萃取FAMEs两次。为了除去非衍生的脂肪酸，将有机相在每种情况下用2ml 100 mM NaHCO3，pH 8.0和2ml蒸馏水洗涤一次。之后，将PE相用Na2SO4干燥，氩气下蒸发并用100μl PE吸收。样品在装备火焰电离检测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪中的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)上分离。GLC分析的条件如下：烘箱温度编程为从50℃到250℃，增量为5℃/min，和最后在250℃下(保持)10分钟。
通过比较保留时间与对应的脂肪酸标准品(Sigma)来鉴定信号。该方法例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等人，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等人，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等人，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述。
图2A显示了已经用质粒pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1转化的酵母将喂饲的脂肪酸18:2Δ9，12转化成20:3Δ8，11，14。相比，图2B显示了酵母中的转化，该酵母除了质粒pESCLeu-PpD6-PSE1外，还包含质粒pYES2.1-OtLPCAT。在所有转基因酵母中检测到大量的喂饲底物。两种转基因酵母都揭示了18:3Δ6，9，12和20:3Δ 8，11，14的合成，它们是Δ-6去饱和酶和Δ-6延伸酶反应的产物。这意味着功能地表达基因PpD6和PSE1。
在用载体pESCLeu-PpD6-PSE1和pYes2.1转化的对照酵母中，通过PSE1延长18:3Δ6，9，12得到的20:3Δ8，11，14的含量比额外表达OtLPCAT的酵母中的明显更低。实际上，由于OtLPCAT的额外表达，18:3Δ6，9，12的延伸提高150％(图2B)。该LCPUFA含量的显著增加可以仅仅如下解释：外源喂饲的脂肪酸(18:2Δ9，12)首先掺入到磷脂中，在磷脂中，它被Δ6去饱和酶去饱和得到18:3Δ6，9，12。仅仅在用酰基辅酶A库再平衡后，18:3Δ6，9，12才可能通过延伸酶延长得到20:3Δ8，11，14-CoA，然后被再掺入到脂类中。OtLPCAT能够高度有效地反转化Δ6-去饱和的酰基(其被掺入到磷脂中)成为CoA-硫酯。结果，喂饲的脂肪酸18:2Δ9，12的延伸也提高(图2B)。
实施例6：从Mantoniella squamata克隆酰基转移酶基因
通过在以前从秀丽隐杆线虫(WO 2004/76617)分离的LPCAT的蛋白质序列中搜索保守区鉴定了具有Mantoniella序列数据库中对应的基序的序列(见图1)。该序列如下：
| 基因名称 | SEQ ID No. | 氨基酸 |
| MsLPCAT112 | 4 | 233 |
| MsLPCAT118 | 6 | 272 |
编码这些蛋白质的基因如下克隆：
在f/2培养基(Guillard，R.R.L.(1975)Culture of phytoplankton forfeeding marine invertebrates.In Culture of Marine Invertebrate Animals(Eds.Smith，W.L.and Chanley，M.H.)，Plenum Press，New York，pp29-60)中以80 E/cm2的光密度生长Mantoniella squamata的2升培养物14天。离心细胞后，借助来自Qiagen(Valencia，CA，US)的RNAeasy试剂盒分离RNA。用Marathon cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)反转录mRNA，并根据生产商的使用说明书连接接头。然后将cDNA文库用于PCR以通过5’-和3’-RACE(cDNA末端的快速扩增)克隆表达质粒。
通过PCR扩增对应的基因组DNA。以这样的方式选择对应的引物对使得它们含有5’末端的前20个核苷酸和3’末端的后20个核苷酸(包括终止密码子)和额外地5’端用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak(1986)Cell44：283-292)。
使用下面的引物：
5`-112-MA-LPCAT-BamHI： AGG ATC CAT GTC TTT TTA CCTCGT CAC CTT CAC C
3`-113-MA-LPCAT_XhoI： ACT CGA GTC ACG AGT ACT TGACAA GGC
用于Mantoniella squamata LPCAT的较短形式和
5`-118-MA-LPCAT：ATG TCG AGG TCG ACG GTA TCG AT
3`-113-MA-LPCAT_XhoI：ACT CGA GTC ACG AGT ACT TGACAA GGC
用于Mantoniella squamata LPCAT的较长形式。
使用的引物的位置在图1中显示。
在每种情况下用1μl解冻的细胞、200μM dNTPs、2.5 U Taq聚合酶和100 pmol每种引物在50μl的总体积中进行MsLPCAT DNA的扩增。PCR条件如下：首先在95℃变性5分钟，接着是30个循环的：94℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 2分钟，和72℃ 10分钟的最后延伸步骤。
实施例7：为了在酵母中异源表达MsLPCAT的目的克隆表达质粒
以这样的方式选择对应的引物对使得它们含有用于高效翻译的与起始密码子相邻的酵母共有序列(Kozak(1986)Cell 44：283-292)。在每种情况下用1μl cDNA，200μM dNTPs，2.5 U Advantage聚合酶和100 pmol每种引物在50μl的总体积中进行MsLPCATs的扩增。PCR条件如下：首先在95℃变性5分钟，接着是30个循环的：94℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 2分钟，和72℃ 10分钟的最后延伸步骤。
下面的寡核苷酸用于PCR反应中以克隆用于在酵母中异源表达的序列：
| 基因名称 | 引物序列 |
| MsLPCAT112(SEQ ID No.3) | F：5’-accatgtctttttacctcgtcacR：5’-tcacgagtacttgacaaggc |
| MsLPCAT118(SEQ ID No.5) | F：5’-accatgtcgaggtcgacggtatcR：5’-tcacgagtacttgacaaggc |
*F＝正向引物，R＝反向引物
按照生产商的使用说明，用酵母表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)在21℃将PCR产物温育30分钟。通过T突出端和拓扑异构酶活性(Invitrogen)将PCR产物连接到载体中。温育后，转化大肠杆菌DH5α细胞。通过PCR鉴定合适的克隆，通过Qiagen DNAeasy试剂盒分离质粒DNA并通过测序验证。所得质粒pYES2.1-MsLPCAT112和pYES2.1-MsLPCAT118的序列分别在SEQ ID No.8和9中显示。然后将正确序列通过电穿孔(1500 V)转化到酵母菌株INVSc1(Invitrogen)中。作为对照，平行地转化空白载体pYES2.1。之后，将酵母平板接种到补加2％葡萄糖的撤除尿嘧啶的完全最小培养基上。能够在没有尿嘧啶的培养基中生长的细胞从而包含对应的质粒pYES2.1、pYES2.1-MsLPCAT112和pYES2.1-MsLPCAT118。选择后，在每种情况下选择两种转化体用于进一步的功能表达。
实施例8：为了在植物中种子特异性表达的目的克隆表达质粒
为了转化植物，产生基于pSUN-USP的另一质粒(见实施例4)。为此，在编码序列的5’和3’端引入NotI限制性位点，使用下面的引物对：
pSUN-MsLPCAT112
正向：5‘-GCGGCCGCACCATGTCTTTTTACCTCGTCAC
反向：3‘-GCGGCCGCTCACGAGTACTTGACAAGGC
pSUN-MsLPCAT118
正向：5‘-GCGGCCGCACCATGTCGAGGTCGACGGTATC
反向：3‘-GCGGCCGCTCACGAGTACTTGACAAGGC
PCR混合物(50μl)的组成：
5.00μl模板cDNA
5.00μl 10 x缓冲液(Advantage聚合酶)+25 mM MgCl2
5.00μl 2mM dNTP
1.25μl每种引物(10pmol/μl)
0.50μl Advantage聚合酶(Clontech)
PCR反应条件：
退火温度：55℃下1分钟
变性温度：94℃下1分钟
延伸温度：72℃下2分钟
循环数：35
将PCR产物在37℃与限制酶NotI温育16小时。以相同的方式温育植物表达载体pSUN300-USP。之后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和7624 bp载体并切除对应的DNA片段。通过Qiagen凝胶纯化试剂盒按照生产商的使用说明书纯化DNA片段。之后，连接载体和PCR产物。来自Roche的Rapid Ligation试剂盒用于该目的。通过测序验证所得质粒pSUN-MsLPCAT112和pSUN-MsLPCAT118。
实施例9：MsLPCATs的功能表征
在酵母中表达MsLPCATs并喂饲多种脂肪酸后测定MsLPCATs的活性(图3A、B和C)。如实施例5，将构建体pESCLeu-PpD6-PSE1与空白载体pYES2.1或者质粒pYES2.1-MsLPCAT112或pYES2.1-MsLPCAT118一起再次导入酵母中。
如实施例5关于OtLPCAT描述的实现MsLPCATs的表达。
图3A显示了通过用质粒pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1转化的酵母将喂饲的脂肪酸18:2Δ9，12向20:3Δ8，11，14的转化。图3B显示了酵母中的转化，该酵母除了质粒pESCLeu-PpD6-PSE1外还包含质粒pYES2.1-MsLPCAT112。图3C描述了用质粒pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1-MsLPCAT118转化的酵母的脂肪酸谱。在所有转基因酵母中大量检测到喂饲的底物亚油酸(18:2)。所有转基因酵母都揭示了18:3Δ6，9，12和20:3Δ8，11，14的合成，它们是Δ6去饱和酶和Δ6延伸酶反应的产物。这表示基因PpD6和Pse1功能地表达。
在用载体pESCLeu-PpD6-PSE1/pYes2.1转化的对照酵母中，20:3Δ8，11，14(18:3Δ6，9，12通过PSE1延伸得到)的含量比额外表达两种MsLPCATs之一的酵母中的含量明显更低。实际上，由于MsLPCAT的额外表达，18:3Δ6，9，12的延伸分别提高了70％(MsLPCAT112)和160％(MsLPCAT118)(图3B，C)。该LCPUFA含量的显著增加仅仅可以如下解释：外源喂饲的脂肪酸(18:2Δ9，12)首先掺入到磷脂中，在磷脂中，它被Δ6去饱和酶去饱和得到18:3Δ6，9，12。仅仅在用酰基辅酶A库再平衡后，18:3Δ6，9，12才可能通过延伸酶延长得到20:3Δ8，11，14-CoA，然后被再掺入到脂类中。MsLPCATs能够高度有效地反转化Δ6-去饱和的酰基成为CoA-硫酯。结果，喂饲的脂肪酸18:2Δ9，12的延伸也提高了(图3B，C)。
实施例10：植物转化和PUFA特异性酰基转移酶在植物中的表达
LCPUFA特异性酰基转移酶在转基因植物中的表达有利地用于增加这些植物中LCPUFA的含量。为此，将根据本发明的酰基转移酶cDNA克隆到双元载体(见实施例4和8)中并通过农杆菌介导的DNA转移转移到拟南芥、欧洲油菜和亚麻(Linum usitatissimum)中。酰基转移酶cDNA的表达处于种子特异性USP启动子的控制下(双元质粒pSUN300-USP的构建，见实施例4)。
在该上下文中特别优选的是这样的植物，其已经表达合成LCPUFAs所需的去饱和酶和延伸酶并且产生少量这些LCPUFAs。此类植物为例如已经在DE 102 19 203中描述的植物，它们包含Δ6去饱和酶、Δ6延伸酶和Δ5去饱和酶的功能基因并且产生少量ARA和EPA。
将所得的具有酰基转移酶基因的双元载体转化到根癌农杆菌中(Hfgen和Willmitzer(1988)Nucl.Acids Res.16：9877)。通过floral-dip方法(Clough和Bent(1998)Plant Journal 16：735-743)完成拟南芥的转化，通过烟草叶节与转化的根癌农杆菌细胞的共培养转化烟草(N.tabacum)，通过下胚轴段与转化的根癌农杆菌细胞的共培养转化亚麻和油菜。合适的方法是技术人员已知的。
通过RNA印迹分析分析转基因拟南芥、烟草、油菜和亚麻植物中酰基转移酶基因的表达。通过种子油中PUFA的含量分析所选的植物。
使用标准转化和再生技术可以完成植物的农杆菌介导的转化(Gelvin，Stanton B.，Schilperoort，Robert A.，Plant Molecular Biology Manual，第二版，Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995，in Sect.，Ringbuc ZentraleSignatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，Bernard R.，Thompson，John E.，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，B.Raton：CRC Press，1993，360 p.，ISBN 0-8493-5164-2)。
例如，通过子叶或者下胚轴转化可以转化油菜(Moloney等人(1989)Plant Cell Report 8：238-242；De Block等人(1989)Plant Physiol.91：694-701)。抗生素用于选择农杆菌和植物的用途取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。通过使用卡那霉素作为选择植物标记进行油菜的选择。例如使用Mlynarova等人(1994)Plant Cell Report 13：282-285描述的技术可以完成亚麻中农杆菌介导的基因转移。
使用如EP-A-O 0424047(Pioneer Hi-Bred International)或EP-A-O 0397687，US 5,376,543、US 5,169,770(University Toledo)中描述的技术可以进行大豆的转化。使用微粒轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或者通过碳酸硅纤维技术进行植物转化例如由Freeling和Walbot″Themaize handbook″(1993)ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag New York描述。
为了检测植物中的脂肪酸，如Cahoon等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)：12935-12940，和Browse等人(1986)AnalyticBiochemistry 152：141-145描述的从植物材料提取植物脂类。Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology，Ayr/Scotland：Oily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie，William W.，Gas Chromatographyand Lipids.A Practical Guide-Ayr，Scotland：Oily Press，1989，Repr.1992，IX，307 pages(Oily Press Lipid Library；1)；Progress in LipidResearch，Oxford：Pergamon Press，1(1952)-16(1977)以标题：Progressin the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN描述了定性和定量脂类或者脂肪酸分析。
从而，例如，通过脂肪酸甲酯(＝FAME)、气液色谱/质谱法(＝GC-MS)或者薄层层析(TLC)可以分析脂肪酸或者三酰基甘油(＝TAG，括号中显示缩写)。
通过使用标准分析方法如GC、GC-MS或TLC，通过分析重组生物可以得到脂肪酸产物的存在的明确检测，所述方法如在一些场合下由Christie和其中的参考文献(1997，在：Advances on Lipid Methodology，Fourth Edition：Christie，Oily Press，Dundee，119-169；1998，Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren [Gaschromatography/mass spectrometric methods]，Lipide 33：343-353)描述。
待分析的植物材料可以通过超声处理、在玻璃碾磨机中碾磨、液氮和碾磨或者通过其他适用的方法破坏。破坏后，必须将材料离心。将沉淀物重悬浮在蒸馏水中，在100℃加热10分钟，冰上冷却并再次离心，然后在90℃下具有2％二甲氧基丙烷的甲醇中的0.5M硫酸中萃取，其得到水解的油和脂类化合物，这得到转甲基的脂类。用石油醚萃取这些脂肪酸甲酯并最后使用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25μm，0.32mm)在170℃到240℃的温度梯度下20分钟和240℃下5分钟进行GC分析。必须使用从商业途径(例如，Sigma)可以得到的标准品定义所得脂肪酸甲酯的身份。
对于不能得到标准品的脂肪酸的情况，可以通过衍生，然后通过GC-MS分析阐明身份。例如，用4，4-二甲氧基唑啉衍生物衍生后，进行通过GC-MS对具有三键的脂肪酸的检测(Christie，1998，见上文)。
植物中的脂肪酸分析
从植物种子提取总脂肪酸并通过气相色谱分析。
将种子用甲醇中的1％甲醇钠吸收并在室温温育20分钟(约22℃)。用NaCl洗涤后，用0.3ml庚烷吸收FAME。
在装备火焰电离检测器的Hewlett Packard 6850气相层析仪中ZEBRON-ZB-Wax毛细管柱(30m，0.32mm，0.25μm；Phenomenex)上分离样品。烘箱温度编程为70℃(保持1分钟)到200℃，增量为20℃/分钟，然后以5℃/分钟的增量升温到250℃(保持5分钟)，最后以5℃/分钟的增量升温到260℃。使用的载体气体为氮(70℃下4.5ml/分钟)。通过与FAME标准品(SIGMA)的保留时间比较鉴定脂肪酸。
从这里给出的工作，可以如图4中所示得到酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的功能。从而，如下给出LCPUFAs自身的生物合成途径。
去饱和酶催化双键向脂类偶联的脂肪酸(sn2-酰基-磷脂酰胆碱)的导入，而延伸酶仅仅催化辅酶-A-酯化的脂肪酸(酰基-辅酶A)的延伸。根据该机制，去饱和酶和延伸酶的备选效果需要酰基底物在磷脂和酰基辅酶A之间的连续交换，从而存在额外的将酰基底物转化成每种情况所需的底物形式，即脂类(对于去饱和酶)或者辅酶A-硫酯(对于延伸酶)的活性。通过LCPUFA特异性酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶使得酰基辅酶A和磷脂之间的交换成为可能。
等价方案
本文描述的本发明的特定实施方案的许多等价方案可以由技术人员鉴定或发现，仅仅导致常规实验。这些等价方案意在专利权利要求的范围内。
附图描述
图1：OtLPCAT、MsLPCAT和CeLPCAT的氨基酸序列比对。
图2：用18:2Δ9，12喂饲后，用质粒pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1(A)，或pLEU-PSE1(Pp)_d6Des(Pp)和pYES2.1-OtLPCAT(B)转化的酵母的脂肪酸分析。
图3：用18:2Δ9，12喂饲后，用质粒pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1(A)、pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1-MsLPCAT112(B)或者pESCLeu-PpD6-PSE1和pYES2.1-MsLPCAT112(C)转化的酵母的脂肪酸分析。
图4：LCPUFAs的生物合成途径。
<110>巴斯福植物科学有限公司
<120>在转基因生物中产生多不饱和长链脂肪酸的方法
<130>B 7768
<150>DE 10 2004 062 294.9
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cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 2340
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 2400
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 2460
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 2520
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 2580
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 2640
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 2700
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 2760
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagcgctta 2820
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 2880
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 2940
gcctccattc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 3000
agtttgcgca acgttgttgg cattgctaca ggcatcgtgg tgtcactctc gtcgtttggt 3060
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 3120
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 3180
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 3240
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 3300
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata gtgtatcaca tagcagaact 3360
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 3420
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 3480
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 3540
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaatg ggtaataact 3600
gatataatta aattgaagct ctaatttgtg agtttagtat acatgcattt acttataata 3660
cagtttttta gttttgctgg ccgcatcttc tcaaatatgc ttcccagcct gcttttctgt 3720
aacgttcacc ctctacctta gcatcccttc cctttgcaaa tagtcctctt ccaacaataa 3780
taatgtcaga tcctgtagag accacatcat ccacggttct atactgttga cccaatgcgt 3840
ctcccttgtc atctaaaccc acaccgggtg tcataatcaa ccaatcgtaa ccttcatctc 3900
ttccacccat gtctctttga gcaataaagc cgataacaaa atctttgtcg ctcttcgcaa 3960
tgtcaacagt acccttagta tattctccag tagataggga gcccttgcat gacaattctg 4020
ctaacatcaa aaggcctcta ggttcctttg ttacttcttc tgccgcctgc ttcaaaccgc 4080
taacaatacc tgggcccacc acaccgtgtg cattcgtaat gtctgcccat tctgctattc 4140
tgtatacacc cgcagagtac tgcaatttga ctgtattacc aatgtcagca aattttctgt 4200
cttcgaagag taaaaaattg tacttggcgg ataatgcctt tagcggctta actgtgccct 4260
ccatggaaaa atcagtcaag atatccacat gtgtttttag taaacaaatt ttgggaccta 4320
atgcttcaac taactccagt aattccttgg tggtacgaac atccaatgaa gcacacaagt 4380
ttgtttgctt ttcgtgcatg atattaaata gcttggcagc aacaggacta ggatgagtag 4440
cagcacgttc cttatatgta gctttcgaca tgatttatct tcgtttcctg caggtttttg 4500
ttctgtgcag ttgggttaag aatactgggc aatttcatgt ttcttcaaca ctacatatgc 4560
gtatatatac caatctaagt ctgtgctcct tccttcgttc ttccttctgt tcggagatta 4620
ccgaatcaaa aaaatttcaa agaaaccgaa atcaaaaaaa agaataaaaa aaaaatgatg 4680
aattgaattg aaaagctagc ttatcgatga taagctgtca aagatgagaa ttaattccac 4740
ggactataga ctatactaga tactccgtct actgtacgat acacttccgc tcaggtcctt 4800
gtcctttaac gaggccttac cactcttttg ttactctatt gatccagctc agcaaaggca 4860
gtgtgatcta agattctatc ttcgcgatgt agtaaaacta gctagaccga gaaagagact 4920
agaaatgcaa aaggcacttc tacaatggct gccatcatta ttatccgatg tgacgctgca 4980
gcttctcaat gatattcgaa tacgctttga ggagatacag cctaatatcc gacaaactgt 5040
tttacagatt tacgatcgta cttgttaccc atcattgaat tttgaacatc cgaacctggg 5100
agttttccct gaaacagata gtatatttga acctgtataa taatatatag tctagcgctt 5160
tacggaagac aatgtatgta tttcggttcc tggagaaact attgcatcta ttgcataggt 5220
aatcttgcac gtcgcatccc cggttcattt tctgcgtttc catcttgcac ttcaatagca 5280
tatctttgtt aacgaagcat ctgtgcttca ttttgtagaa caaaaatgca acgcgagagc 5340
gctaattttt caaacaaaga atctgagctg catttttaca gaacagaaat gcaacgcgaa 5400
agcgctattt taccaacgaa gaatctgtgc ttcatttttg taaaacaaaa atgcaacgcg 5460
acgagagcgc taatttttca aacaaagaat ctgagctgca tttttacaga acagaaatgc 5520
aacgcgagag cgctatttta ccaacaaaga atctatactt cttttttgtt ctacaaaaat 5580
gcatcccgag agcgctattt ttctaacaaa gcatcttaga ttactttttt tctcctttgt 5640
gcgctctata atgcagtctc ttgataactt tttgcactgt aggtccgtta aggttagaag 5700
aaggctactt tggtgtctat tttctcttcc ataaaaaaag cctgactcca cttcccgcgt 5760
ttactgatta ctagcgaagc tgcgggtgca ttttttcaag ataaaggcat ccccgattat 5820
attctatacc gatgtggatt gcgcatactt tgtgaacaga aagtgatagc gttgatgatt 5880
cttcattggt cagaaaatta tgaacggttt cttctatttt gtctctatat actacgtata 5940
ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta tgaatagttc ttactacaat 6000
ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa atgtagaggt cgagtttaga 6060
tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat agggatatag cacagagata 6120
tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg gtattcgcaa tgggaagctc 6180
caccccggtt gataatcaga aaagccccaa aaacaggaag attgtataag caaatattta 6240
aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt 6300
ttttaacgaa tagcccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat 6360
agggttgagt gttgttccag tttccaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 6420
cgtcaaaggg cgaaaaaggg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 6480
atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcagtaaat cggaagggta aacggatgcc 6540
cccatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 6600
gaaaggagcg ggggctaggg cggtgggaag tgtaggggtc acgctgggcg taaccaccac 6660
acccgccgcg cttaatgggg cgctacaggg cgcgtgggga tgatccacta gt 6712
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物5’-119-Ot-LPCAT
<400>10
atgctggtcg cgcgcgtccg agc 23
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物3’-120-Ot-LPCAT-XhoI
<400>11
actcgagtca cgagttgttc acgaggc 27
<210>12
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物5’-112-MA-LPCAT-BamHI
<400>12
aggatccatg tctttttacc tcgtcacctt cacc 34
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物3’-113-MA-LPCAT_XhoI
<400>13
actcgagtca cgagtacttg acaaggc 27
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物5’-118-MA-LPCAT
<400>14
atgtcgaggt cgacggtatc gat 23
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物OtLPCAT-forward
<400>15
accatgctgg tcgcgcgcgt ccg 23
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物OtLPCAT-reverse
<400>16
tcacgagttg ttcacgaggc 20
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物PSUN-OtLPCAT-正向
<400>17
gcggccgcac catgctggtc gcgcgcgtcc g 31
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物PSUN-OtLPCAT-反向
<400>18
gcggccgctc acgagttgtt cacgaggc 28
<210>19
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T7标准引物
<400>19
gtcgacccgc ggactagtgg gccctctaga cccgggggat ccggatctgc tggctatgaa 60
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>20
accatgtctt tttacctcgt cac 23
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>21
tcacgagtac ttgacaaggc 20
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>22
accatgtcga ggtcgacggt atc 23
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>23
tcacgagtac ttgacaaggc 20
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物PSUN-MsLPCAT112-正向
<400>24
gcggccgcac catgtctttt tacctcgtca c 31
<210>25
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物PSUN-MsLPCAT112-反向
<400>25
gcggccgctc acgagtactt gacaaggc 28
<210>26
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物PSUN-MsLPCAT118-正向
<400>26
gcggccgcac catgtcgagg tcgacggtat c 31
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物PSUN-MsLPCAT118-反向
<400>27
gcggccgctc acgagtactt gacaaggc 28
Claims (23)
1.分离的核酸序列，其编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中该核酸序列编码的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶特异转化在脂肪酸分子中具有至少一个双键的C16-、C18-、C20-或C22-脂肪酸，并且其中该核酸序列选自：
a)具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示序列的核酸序列，
b)核酸序列，其由于遗传密码的简并性，可以衍生自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的编码序列，和
c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列的衍生物，其编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的多肽并且与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6在氨基酸水平具有至少40％同源性并且具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性。
2.根据权利要求1的分离的核酸序列，其中该序列来自真核生物。
3.由根据权利要求1或者2的分离的核酸序列编码的氨基酸序列。
4.含有根据权利要求1或者2的分离的核酸序列的基因构建体，其中该核酸有效连接一个或多个调节信号。
5.根据权利要求4的基因构建体，其中该核酸构建体含有脂肪酸或者脂类代谢的额外的生物合成基因，其选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP[＝酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。
6.根据权利要求4或者5的基因构建体，其中所述核酸构建体含有脂肪酸或者脂类代谢的额外的生物合成基因，其选自Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶或Δ9延伸酶基因。
7.载体，其含有根据权利要求1或者2的核酸或者根据权利要求4到6任一项的基因构建体。
8.转基因非人生物，其含有至少一个根据权利要求1或者2的核酸、根据权利要求4到6任一项的基因构建体或者根据权利要求7的载体。
9.根据权利要求8的转基因非人生物，其中所述生物是微生物、非人动物或者植物。
10.根据权利要求8或者9的转基因非人生物，其中所述生物是植物。
11.在生物中产生多不饱和脂肪酸的方法，其包括下面的步骤：
a)向生物中导入至少一个选自如下的核酸序列：
i)具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示序列的核酸序列，其编码具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽；或者
ii)核酸序列，其由于遗传密码的简并性，可以衍生自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的编码序列，或
iii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列的衍生物，其编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的多肽并且与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6在氨基酸水平具有至少40％同源性并且具有等同的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性，
b)培养并收获所述生物。
12.根据权利要求11的方法，其中除了步骤a)中提到的核酸序列外，还向生物中导入编码脂肪酸或者脂类代谢的多肽的其他核酸序列，所述多肽选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP[＝酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。
13.根据权利要求11或12的方法，其中除了权利要求11的步骤a)中提到的核酸序列和如果合适，权利要求12中提到的核酸序列外，还向生物中导入编码选自Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶或Δ9延伸酶的多肽的核酸序列。
14.根据权利要求11到13任一项的方法，其中C16-、C18-、C20-或C22-脂肪酸用作酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶的底物。
15.根据权利要求11到14任一项的方法，其中从生物以油、脂类或者游离脂肪酸的形式分离多不饱和脂肪酸。
16.根据权利要求11到15任一项的方法，其中在方法中产生的多不饱和脂肪酸是在分子中具有至少两个双键的C18-、C20-或C22-脂肪酸。
17.根据权利要求11到16任一项的方法，其中在方法中产生选自二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的多不饱和脂肪酸。
18.根据权利要求11到17任一项的方法，其中所述生物是微生物、非人动物或者植物。
19.根据权利要求11到18任一项的方法，其中所述生物是转基因植物。
20.根据权利要求11到19任一项的方法，其中所述转基因植物是油料作物植物。
21.通过权利要求11到20任一项的方法产生的油、脂类或者脂肪酸或者其级分。
22.油、脂类或者脂肪酸组合物，其包含通过根据权利要求11到20任一项的方法产生的多不饱和脂肪酸并且来自转基因植物。
23.通过根据权利要求11到20任一项的方法产生的油、脂类或者脂肪酸或者根据权利要求22的油、脂类或者脂肪酸组合物在饲料、食品、化妆品或者药物中的用途。
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