CN101058612A

CN101058612A - 超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖及其制备方法

Info

Publication number: CN101058612A
Application number: CN 200610011756
Authority: CN
Inventors: 屈小中; 杨振忠
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2006-04-19
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2026-04-19
Also published as: CN100577688C

Abstract

本发明属于制备壳聚糖领域，特别涉及超支化结构的壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖及其制备方法。包括：将壳聚糖或乙二醇壳聚糖用亚硝酸或亚硝酸盐降解，降解所得产物用沉淀法或体积排除色谱法分级得到更窄分子量分布的高分子链一端端基为醛基的壳聚糖或乙二醇壳聚糖；溶解于弱酸性或中性等溶液中形成Schiff碱；利用还原剂还原Schiff碱得到超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖，结构为：其中R_i为与上述结构式中虚线部分结构相同的支链；当结构式中的R为H时为超支化壳聚糖，当结构式中的R为CH₂CH₂OH时为超支化乙二醇壳聚糖；超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖的分子量范围为≥5000Da。

Description

超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖及其制备方法

技术领域

本发明属于制备壳聚糖领域，特别涉及超支化结构的壳聚糖(Hyperbrached Chitosan)或超支化乙二醇壳聚糖(Hyperbrached Glycol Chitosan)及其制备方法。

背景技术

自1990年以来，几丁质和壳聚糖因其优越的生化性能使人们对它们的兴趣不断增加。这些性能主要表现在：生物降解特性、免疫活性、抗病毒活性和创伤修复等方面。近几年来，这类聚糖化合物在药物控释、细胞培养和组织工程等领域的研究中取得了一定成果。壳聚糖及其衍生物由于良好的物理化学性质和医药功能，在药物研究领域中得到了广泛的应用。此外，壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物，通过与DNA以静电方式作用形成壳聚糖-DNA配合物，能使DNA在体内不易被降解，而且具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点，也引起了大家的重视。

目前，对壳聚糖及其衍生物的改性主要采取对糖环上的氨基和羟基进行取代的方法，例如引入糖基、烷基、聚乙二醇等。但由于天然壳聚糖为线性大分子，所以上述改性方法不能改变其主链结构。聚合物链结构对其性质有着很大的影响，例如，研究表明支化聚乙烯基亚胺(PEI)对DNA的结合与转染能力均高于相同分子量的线性PEI，因此人工制备支化壳聚糖及其衍生物不但有利于深入研究分子链结构对其物理化学性能的影响，也有利于扩大其应用范围。韩国的Park等人和日本的Sashiwa等人分别利用壳聚糖的氨基与乳二糖酸反应制得半乳糖化壳聚糖(Galactosylated chitosan，Galactosyl chitosan)(In-Kyu Park，Jun Yang，Hwan-Jeong Jeong，Hee-Seung Bom，Ichiro Harada，Toshihiro Akaike，Su-Il Kim and Chong-Su Cho，“Galactosylated chitosan as asynthetic extracellular matrix for hepatocytes attachment”，Biomaterials，2003，24，2331-2337； Hitoshi Sashiwa，Jennifer M.Thompson，Sanjoy K.Das，YoshihiroShigemasa，Sasmita Tripathy，and RenéRoy，“Chemical Modification of Chitosan：Preparation and Lectin Binding Properties of α-Galactosyl-chitosan Conjugates.Potential Inhibitors in Acute Rejection following Xenotransplantation”，Biomacromolecules，2000，1，303-305)，但是其侧链长度很短，只有一到二个完整糖环，且结构单元与主链不同。挪威的Tmmeraas等人由亚硝酸降解不完全乙酰化的壳聚糖得到短链几丁质(乙酰化率为100％)，再利用其与高分子量壳聚糖的氨基进行反应，得到支化的壳聚糖(Kristoffer Tmmeraas，Magnus

Kjell M. Bjrn E.Christensen，Per Artursson and OlavSmidsrd，“Preparation and characterisation of chitosans with oligosaccharidebranches”，Carbohydrate Research，2002，337，2455-2462)。但是，由于高分子量几丁质不溶于水，因此他们得到的枝化壳聚糖的侧链也很短(最多6个糖环)，且侧链几丁质上的氨基由于被乙酰化而不具有反应活性。此外，用上述接枝方法对壳聚糖的改性只能得到梳状高分子结构而非超支化结构(HitoshiSashiwa，Sei-ichi Aiba，“Chemically modified chitin and chitosan as biomaterials”，Prog.Polym.Sci.，2004，29，887-908)。

另一方面，应用多官能团交联剂虽然能够对壳聚糖实行交联从而形成网状结构，但形成的凝胶在溶剂中不能溶解(J.Berger，M.Reist，J.M.Mayer，O.Felt，N.A.Peppas and R.Gurny，“Structure and interactions in covalently andionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications”，EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，57，19-34)。目前尚未发现有关制备具有超支化结构的壳聚糖或其衍生物的报道。

发明内容

本发明的目的一是提供超支化结构的壳聚糖(Hyperbrached Chitosan)或超支化乙二醇壳聚糖(Hyperbrached Glycol Chitosan)。

本发明的再一目的是提供目的一的超支化结构的壳聚糖(HyperbrachedChitosan)或超支化乙二醇壳聚糖(Hyperbrached Glycol Chitosan)的制备方法。

本发明采用线性壳聚糖(Chitosan)或乙二醇壳聚糖(Glycol Chitosan)等为原料，通过亚硝酸或亚硝酸盐降解并引入醛基端基，再进行醛基-氨基反应形成席夫(Schiff)碱，最后将Schiff碱还原为亚胺，以此在水溶液中制备具有超支化结构的壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖。本发明的特征在于利用壳聚糖或乙二醇壳聚糖降解后形成的醛基端基与壳聚糖或乙二醇壳聚糖链上的剩余氨基反应，由于降解后的壳聚糖或乙二醇壳聚糖本身同时具有氨基和单个醛基而获得具有超支化结构的聚合物。通过改变合成条件或反应组分可以控制接枝率及分子量。适用聚合物可以是完全或不完全去乙酰化的壳聚糖、乙二醇壳聚糖以及其它可用亚硝酸或亚硝酸盐降解的羟基或氨基取代的壳聚糖衍生物。由于合成过程中不对壳聚糖或乙二醇壳聚糖的氨基或羟基进行保护，因此产物本身或经简单改性后在水溶液中的溶解性良好，有利于其对DNA的包裹和通过氨基反应对聚合物进行功能化改性。

本发明的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖的结构式如下：

其中：x，y，z及x’，y’，z’为分子链中不同链段的个数，且链段呈无规排列，x，y，z的数值可以相同或不同；R＝H或CH₂CH₂OH；R_i为与上述结构式中虚线部分结构相同的支链，但不同支链的x’，y’和z’的数值可以相同或不同，以此类推构成超支化结构。当结构式中的R为H时为超支化壳聚糖，当结构式中的R为CH₂CH₂OH时为超支化乙二醇壳聚糖。超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖的分子量范围为≥5000Da，优选分子量范围为5000Da～250kDa。

本发明的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖的制备方法按下列顺序进行：

(1).将壳聚糖或乙二醇壳聚糖用亚硝酸或亚硝酸盐降解(G.GrahamAllan，Mark Peyron，“Molecular weight manipulation of chitosan I：kinetics ofdepolymerization by nitrous acid”，Carbohydrate Research，1995，277，257～272)。必要时降解所得产物可用沉淀法或体积排除色谱法分级得到更窄分子量分布的一端端基为醛基的壳聚糖或乙二醇壳聚糖(分子量分布≤1.5)。所述的壳聚糖或乙二醇壳聚糖的氨基乙酰化范围可在0～90％，乙二醇壳聚糖中的乙二醇基团的接枝率可在大于0小于等于100％。产物也可用透析-冷冻干燥法纯化。

(2).将步骤(1)所得产物以0.5～100mg/ml的浓度溶解于酸性、中性、碱性溶剂和/或缓冲液等中，待完全溶解后滴加碱或酸溶液调节pH值为3～11，在反应液中无沉淀出现的前提下尽可能控制pH值接近中性。

(3).一次或多次向步骤(2)的产物中加入总量不低于反应物中醛基摩尔数0.5倍的NaCNBH₃、NaBH₄或二者混合物(较好为NaCNBH₃)的还原试剂，在0～80℃下进行反应(一般为室温反应)。

(4).将步骤(3)得到的反应液经过透析法透析、冻干和/或经过沉淀剂沉淀、沉淀物洗涤、干燥得到超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖。必要时用色谱方法对纯化产物分级。

所述的步骤(2)反应溶液中可以加入部分带有未取代氨基的壳聚糖或乙二醇壳聚糖。

所述的沉淀剂为氨水、NaOH、KOH、NaHCO₃水溶液、水溶性醇、丙酮或它们的任意混合液等。洗涤液为上述沉淀剂或水。

用沉淀分级法或体积排除色谱法分级步骤(1)所得到的降解产物，和/或用沉淀分级法或体积排除色谱法分级步骤(4)所得到的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖，能够得到较窄分子量分布的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖(分子量分布≤2.0)。

所述的酸性溶剂是HCl、HBr、HI、H₂SO₄、H₂SO₃、甲酸、乙酸、苯磺酸或它们的任意混合物等。

所述的中性溶剂选自水、盐水、醇/水中的一种或一种以上的混合溶液等；所述的盐可为NaCl、KCl、NaSO₄、NaSO₃、NaCO₃、NaNO₂等无机盐或它们的任意混合物；所述的醇是甲醇、乙醇或它们的混合液。

所述的碱性溶剂是NaOH、KOH、NaHCO₃、氨水或它们的任意混合物等。

所述的缓冲液是醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、硼酸缓冲液或它们的任意混合液等。

所述的酸是HCl、HBr、HI、H₂SO₄、H₂SO₃、甲酸、乙酸、苯磺酸或它们的任意混合物等。

所述的碱性是NaOH、KOH、NaHCO₃、氨水或它们的任意混合物等。

本发明的产品及其制备方法具有如下特点：

I.实验所需设备、操作简单，反应步骤少，反应条件温和。

II.可简单地通过改变反应物浓度、组分和反应时间等来控制产品的支化率和分子量。

III.产品中仍可保留大量氨基，易于实现产品的功能化(如与DNA形成配合物)或化学改性(如四级胺化)等。

附图说明

图1.本发明实施例1的亚硝酸降解产物和超支化乙二醇壳聚糖的凝胶色谱图。

图2.本发明实施例1中经硝酸降解后得到产物的NMR图。

图3.本发明实施例3中四级胺化的超支化壳聚糖的NMR图。

具体实施方式

实施例1.超支化乙二醇壳聚糖的制备

乙二醇壳聚糖(Mw＝250kDa，GPC/光散射法)溶解于0.2M醋酸中。0～4℃并高速搅拌下加入相当于氨基摩尔数5％的NaNO₂的水溶液，在0～4℃下继续反应15小时后用3倍体积的丙酮沉淀。沉淀物用丙酮、甲醇洗涤多次后真空干燥。干燥后得到低分子量带有醛基端基的乙二醇壳聚糖，其重均分子量为5500(GPC/光散射法)，其核磁共振谱图见图2，其中化学位移5.05处的峰为醛基H。上述亚硝酸降解的低分子量乙二醇壳聚糖(Mw＝5500)溶解于0.1M醋酸水溶液(5mg/mL)，25℃室温下搅拌1小时后滴加0.1MNaOH水溶液至pH为6.5，继续搅拌2小时后加入相当于醛基摩尔数0.5倍的NaCNBH₃，25℃室温下反应24小时后再加入相同量的NaCNBH₃，继续反应48小时。期间控制pH值不高于8.0。反应溶液在水中透析48小时(更换10次)，冻干得到超支化乙二醇壳聚糖，其重均分子量为65kDa(GPC/光散射法)。原始反应物(乙二醇壳聚糖)，亚硝酸降解产物和超支化乙二醇壳聚糖的凝胶色谱图见图1。

实施例2.超支化壳聚糖的制备

50g壳聚糖溶解于1000mL5％的醋酸水溶液并冷却至0～4℃。将5gNaNO₂溶解于50mL水后滴加入上述壳聚糖溶液，0～4℃下反应9小时，加入浓NaOH水溶液至沉淀全部析出，过滤，并用甲醇和水洗涤多次，真空干燥得到的带有醛基端基的低分子量壳聚糖。低分子量壳聚糖经甲醇沉淀分级后的产物(Mw＝2300，Mw/Mn＝1.5，GPC/光散射法)溶解于0.1M醋酸(2mg/mL)，10℃下搅拌1小时后滴加0.1M NaOH水溶液至pH为5.5。继续搅拌2小时后加入相当于醛基摩尔数1.0倍的NaCNBH₃，10℃下反应24小时后再加入相同量的NaCNBH₃，继续反应72小时。期间控制pH值不高于6.5。反应液用砂芯漏斗过滤，滤液用3倍甲醇沉淀，并用甲醇、水多次洗涤。洗涤后的产物40℃下真空干燥。干燥后的产物溶解于醋酸/醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)，用Sephadex G-100凝胶色谱拄(颗粒尺寸：40～120μm，分级范围：Dextran标样1k-100kDa)分级。收集的产物由GPC/光散射法测定分子量及分子量分布，其中最初级份(约占25％总重)的分子量为32kDa，分子量分布为1.9。

实施例3.四级胺化的超支化壳聚糖的制备

5g壳聚糖溶解于50mL0.2M的醋酸水溶液并冷却至0～4℃。将0.15gNaNO₂溶解于1mL水后滴加入上述壳聚糖溶液，0～4℃下反应15小时，加入浓NaOH至沉淀全部析出，过滤、并用甲醇和水洗涤多次，真空干燥得到的带有醛基端基的低分子量壳聚糖(Mw＝3700，GPC/光散射法)。得到的低分子量壳聚糖溶解于0.1M醋酸(2mg/mL)，60℃下搅拌1小时后滴加0.1MNaOH水溶液至pH为5.0。继续搅拌2小时后加入相当于醛基摩尔数2.0倍的NaCNBH₃，60℃下反应72小时。期间控制pH值不高于6.0。反应结束后向反应液中加入浓氨水至pH值8.5，将所得沉淀物过滤后用甲醇、稀氨水、水多次洗涤，真空干燥。所得产物的分子量为48kDa，分子量分布2.0(GPC/光散射法)。将干燥后的产物(超支化壳聚糖)分散于含有2mg/mLNaI的N甲基吡咯烷酮和饱和NaOH的乙醇溶液(5∶1v/v)中，氮气保护下加入3倍于超支化壳聚糖氨基摩尔数的碘甲烷(CH₃I)，36℃下反应6小时后得到亮棕黄色溶液。向溶液中倒入不少于3倍体积的乙醚，分离沉淀并用乙醚多次洗涤，洗涤后的沉淀物可溶解于水或稀酸。该产物所含碘离子经氯离子置换后得到稳定的四级胺化超支化壳聚糖。所得产物的四级胺化率为66％(NMR法，见图3)。

Claims

1.一种超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖，其特征是，所述的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖结构式为：

其中：R_i为与结构式中

结构相同的支链；x，y，z及x’，y’，z’为分子链中不同链段的个数，且链段呈无规排列，x，y，z的数值相同或不同；R＝H或CH₂CH₂OH；R_i支链中的x’，y’和z’链段的个数相同或不同；

当结构式中的R为H时为超支化壳聚糖，当结构式中的R为CH₂CH₂OH时为超支化乙二醇壳聚糖；超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖的分子量为≥5000Da。

2.根据权利要求1所述的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖，其特征是：所述的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖分子量为5000Da～250kDa。

3.根据权利要求1或2所述的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖，其特征是：所述的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖分子量分布≤2.0。

4.根据权利要求1～3任一项所述的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖的制备方法，其特征是，该方法按下列顺序进行：

(1).将壳聚糖或乙二醇壳聚糖用亚硝酸或亚硝酸盐降解，得到高分子链一端端基为醛基的壳聚糖或乙二醇壳聚糖；壳聚糖或乙二醇壳聚糖的氨基乙酰化范围在0～90％；

(2).将步骤(1)所得产物以0.5～100mg/ml的浓度溶解于酸性、中性、碱性溶剂和/或缓冲液中，待完全溶解后滴加碱或酸溶液调节pH值为3～11，在反应液中无沉淀出现的前提下控制pH值接近中性；

(3).一次或多次向步骤(2)的产物中加入总量不低于反应物中醛基摩尔数0.5倍的NaCNBH₃、NaBH₄或二者混合物的还原试剂，在0～80℃下进行反应；

(4).将步骤(3)得到的反应液经过透析法透析、冻干和/或经过沉淀剂沉淀、沉淀物洗涤、干燥得到超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的步骤(2)反应溶液中加入部分带有未取代氨基的壳聚糖或乙二醇壳聚糖。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的沉淀剂为氨水、NaOH、KOH、NaHCO₃水溶液、水溶性醇、丙酮或它们的混合液；洗涤液为上述沉淀剂或水。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是：用沉淀分级法或体积排除色谱法分级步骤(1)所得到的高分子链一端端基为醛基的壳聚糖或乙二醇壳聚糖降解产物，和/或用沉淀分级法或体积排除色谱法分级步骤(4)所得到的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖，能够得到分子量分布≤2.0的超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的酸性溶剂是HCl、HBr、HI、H₂SO₄、H₂SO₃、甲酸、乙酸、苯磺酸或它们的任意混合物；

所述的中性溶剂选自水、盐水、醇/水中的一种或一种以上的混合溶液；

所述的碱性溶剂是NaOH、KOH、NaHCO₃、氨水或它们的任意混合物；

所述的缓冲液是醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸缓冲液或它们的任意混合液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是：所述的盐是NaCl、KCl、NaSO₄、NaSO₃、NaCO₃、NaNO₂无机盐或它们的任意混合物；所述的醇是甲醇、乙醇或它们的混合液。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的酸是HCl、HBr、HI、H₂SO₄、H₂SO₃、甲酸、乙酸、苯磺酸或它们的任意混合物；

所述的碱性是NaOH、KOH、NaHCO₃、氨水或它们的任意混合物。