CN101052729B - 工业酵母基因的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种对工业酵母基因进行分析的方法,其包括下述步骤:(a)分析工业酵母的基因组的核苷酸序列;以及(c-1)选择编码下述氨基酸序列的工业酵母的基因,所述氨基酸序列与Saccharomyces cerevisiae基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性,或者(c-2)选择工业酵母的下述基因,所述基因由与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成。

Description

工业酵母基因的分析方法
技术领域
本发明涉及用于制备啤酒或清酒等酒精饮料以及燃料酒精等的工业酵母的基因的分析方法,特别涉及用于制造酒精饮料的酿造酵母的基因的分析方法。更具体地说,本发明涉及下述方法:在酒精饮料的制备中,将酿造酵母的DNA序列信息汇编在一个数据库中,从而选择出与增加产率和/或改进口味相关的基因,所述改进口味为例如改进所选择口味的稳定性、补强性等;涉及适于酿造的、且基因的表达得到控制的酵母的培养方法,所述酵母例如为所选择的基因受到破坏的酵母,或为所选择的基因过表达的酵母;还涉及利用所培养的酵母制备酒精饮料的方法。
背景技术
目前已经使用了工业酵母来发展燃料酒精以及啤酒或清酒等酒精饮料的制备技术。特别是在利用酿造酵母对酒精饮料所进行的制备中,在酒精饮料的产率的增加以及口味的改进(例如改进所选择口味的稳定性、补强性等)等技术方面已有长足发展。
在世界范围内,消耗最多的饮料为啤酒,在2001年,世界啤酒产量约为140,000,000kL。根据酵母以及发酵方法,啤酒大致分为3种。这三种为:天然发酵啤酒,其利用啤酒厂所存在的酵母和微生物进行发酵;淡色啤酒,其利用属于Saccharomyces cerevisiae(简写为S.cerevisiae)的上层发酵酵母在20℃至25℃的温度进行发酵,并使随后的熟化期得到缩短;以及贮藏型啤酒,其利用属于巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)的下层发酵酵母在6℃至15℃进行发酵,随后进行低温熟化。目前,在世界范围内,所制备的90%以上的啤酒为贮藏型啤酒,因此,在啤酒酿造中,用于酿造贮藏型啤酒的下层发酵酵母得到了最广泛的应用。
在所谓的发酵制备中,所述制备采用包括上述酿造酵母的微生物来进行,在该制备中,为了产物的产率得到增加并使品质得到提高,使发酵过程最佳化 以及选择有用的菌株进行培养是很重要的。
在啤酒酿造的最佳化中,已建立了下述方法:对诸如醇(例如乙醇)、酯、有机酸等酵母代谢物的量进行监测,并对温度、气流量、原料成分等进行控制。在这种情况下,酵母细胞的物质摄取和排出以及细胞中的代谢被作为一个黑盒子(black box)进行处理并且仅进行非常浅显的控制。另外,为了赋予酒精饮料以怪味,已经试图在啤酒酿造过程中抑制氧的供给量来作为控制方法的步骤。然而,在该方法中,由于氧供给不足,酵母本身的生长速率降低,可能会引起发酵延迟和/或啤酒品质被破坏等副作用。通过对发酵过程的最佳化的方法来改善啤酒产率以及品质受到限制。
另一方面,对于培养诸如有用的啤酒酵母等有用的工业酵母的方法,选择所需要的菌株的技术要远比实际的培养具有更广泛的应用。啤酒酿造本身远在巴斯德发现微生物之前就已经在进行。在啤酒酿造中,从啤酒厂所用的多种酵母菌株中选择啤酒酵母的更适宜的菌株这一过程在传统上一直在进行,但是积极地培养出带有优异特性的啤酒酵母的情况却很少见。
作为积极的培养方法的一个示例,有使用化学物质或放射线来进行人工突变的方法。然而,酿造酵母,尤其是在啤酒酿造中广泛使用的下层发酵酵母在在很多情况下为多倍体。在该情况下,除非突变发生在所有待突变的等位基因处,否则是不可能制备出所需的突变株的。因而,尽管可以在单倍体实验室酵母中诱导所需要的突变,而对于多倍体的啤酒酵母来说,该突变基本上是不可能的。
近些年来,已经尝试利用从下层发酵酵母中分离的孢子来进行突变或杂交育种等培育(例如,参见非专利文献1)。但是,下层发酵酵母为多倍体,并具有复杂的染色体结构。因此,难以分离出具有增殖能力的孢子,且几乎不可能从中获得带有优异性状的菌株。
另一方面,最近已经可以使用基因工程技术将所需基因引入酿造酵母中并使其表达,由此已可能通过利用基因功能分析的结果以及利用进行了功能分析的基因来培育带有所需性状的酵母。然而,与全部基因组序列已经得到明确鉴定的Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae;例如参见非专利文献2)相比,下层发酵酵母的基因组序列尚未被明确鉴定,对于下层发酵酵母特异性的参与针对底部发酵酵母的酿造特征的基因以及所述基因在啤酒酿造过程中的作用,目前 仅有有限的几个发现。
近些年来,以采用DNA阵列来进行转录组(transcriptome)分析,该分析中,分别将DNA片断或核苷酸寡聚物固定在固体支持物上,所述DNA片断或核苷酸寡聚物均具有结构基因的部分序列或染色体的基因间区域。例如,Olesen等人利用GeneFilters(Research Genetics Co.制造)对酿造过程中的下层发酵酵母进行了全面的基因表达分析(例如,参见非专利文献3)。然而,由于下层发酵酵母的基因组序列尚未得到明确鉴定,因而无法精确确定监测哪一个基因的表达。因而,下层发酵酵母的信息不足以应用至代谢分析、不足以培育有用的酵母、且不足以对啤酒酿造过程进行控制。
目前已经确定了100种以上的微生物的全基因组序列(例如,参见非专利文献6),这些微生物包括Saccharomyces cerevisiae、大肠杆菌(例如,参见非专利文献4),以及结核分枝杆菌(例如,参见非专利文献5)。基于所确定的DNA序列,已经在未进行遗传试验、生物化学试验或分子生物学试验的情况下鉴别出这些微生物的基因并预测出大量基因的功能。然而,对于具有高度多倍体性并具有复杂的染色体结构的诸如酿造酵母等工业酵母来说,推测其组装(连接DNA序列的操作)将非常困难。因此,对于含有两种不同类型基因组的下层发酵酵母的基因组序列来说,目前还未见报道。
在特定的酒精或酒精饮料的制备中,有增加产物中的亚硫酸盐的浓度以控制口味的技术。已知亚硫酸盐是一种具有抗氧化活性的化合物,其在食品、饮料、药品以及酒精饮料领域被广泛用作抗氧化剂。例如,当葡萄酒需要较长的熟化期时,亚硫酸盐在其品质的保持起到重要作用。还已知在啤酒酿造中,若增加产品中所包含的亚硫酸盐的浓度,则保质期会加长。因而,当产品中的亚硫酸盐含量增加时,可能使所制得的产品具有优异的口味稳定性,并具有长期的保质期。
增加产品中亚硫酸盐含量的最简单的方法使加入亚硫酸盐。在日本,在例如葡萄酒领域中,健康、劳动和保健部门允许在其中加入亚硫酸盐,该亚硫酸盐的加入量可为残留亚硫酸盐浓度不超过350ppm的程度。然而,由于在该情况下是将亚硫酸盐列入食品添加剂的目录,因而若考虑到消费者对食品添加剂持有的反对态度,则并不优选向啤酒中加入亚硫酸盐。
然而,酿造中所用酵母通过在介质中将硫酸盐还原而生成硫化氢盐以合成 诸如含硫氨基酸等含硫代谢物。亚硫酸盐为该途径中的中间代谢物。若亚硫酸盐在发酵过程中充分释放至细胞外部,则可能增加麦芽汁以及产物中的亚硫酸盐的含量。
有两种方法用以增加发酵中的麦芽汁中的亚硫酸盐浓度。一种是控制发酵过程,另一种是培育酿造酵母。对于控制发酵过程来说,发酵过程中制备的亚硫酸盐的含量与所溶解的氧浓度成反比,因而有方法试图降低所溶解的氧浓度以增加亚硫酸盐的含量,并同时抑制亚硫酸盐的氧化。但是,在该方法中,由于缺乏氧,导致酵母的生长速度受到抑制,从而具有发酵延迟以及品质遭到破坏等副作用。因而该种方法并不具有实用性。
另一方面,如上所述,已经开发出基因工程技术以用于培育酿造酵母。例如,一些报告集中于酵母的硫代谢。亚硫酸盐(SO2)为含硫氨基酸以及维生素合成中的中间产物,其通过下述通路产生:
硫酸根离子(SO4 2-)→APS(硫酸腺嘌呤)→PAPS(phosphoadenylyl sulfate)→亚硫酸根离子(SO3 2-)
其中的硫酸根离子从细胞外被纳入。其中,尝试增加参与硫酸根离子(SO4 2-)→APS(硫酸腺嘌呤)反应的MET3基因以及参与APS(硫酸腺嘌呤)→PAPS(phosphoadenylyl sulfate)的MET14基因的拷贝数目以改善酵母生成亚硫酸盐的能力(例如,参见非专利文献8)。另一实例尝试通过破坏MET10基因来抑制亚硫酸根离子的还原,以此来增加酵母所制造的亚硫酸盐的含量(例如,参见非专利文献9)。根据上述尝试,通过对MET10基因的破坏而使得所制备的亚硫酸盐的含量增加至亲株的10倍以上的水平,而另一方面,却注意到发酵延迟以及啤酒中的乙醛和1-丙醇的含量增加,这成为实际使用中的问题。
因此,尽管正在对工业酵母的培育方法进行了开发,例如利用基因工程来对酿造酵母进行培育等,但目前的现状是,由于酿造酵母的基因组信息尚不充分,因而目前尚不能对酿造酵母中涉及酿造特性的酿造酵母特异性基因进行充分选择,不能对由这些基因所编码的蛋白质的功能进行充分分析,且不能对这些关于培育的研究结果进行充分利用。
因而,目前还未建立起对下述酵母的培养方法,所述酵母具有所需的特性,不对发酵速度以及产品品质具有破坏作用;并且该类方法不仅在酿造工业中具有巨大需求,而且在利用所述酵母的工业领域也具有巨大需求。
(非专利文献1)C.Gjermansen:“通过减数分裂分离体的杂交来构建啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)的杂合酿造菌株( Construction of a hybridbrewing strain of Saccharomyces carlsbergensis by mating of meiotic segrega
(非专利文献2)A.Goffeau等:“酵母基因组目录(The Yeast GenomeDirectory)”,Nature,387卷,5至105页(1997)。
(非专利文献3)K.Olesen等:“啤酒酵母酿造酵母转录组在贮藏型啤酒的制造水平的动力学特征(The dynamics of the Saccharomyces carlsbergensis brewingyeast transcriptome during a production-scale lager beer fermentation)”,FEMS YeastResearch,2卷,563至573页(2000)。
(非专利文献4)F.R.Blattner等:“大肠杆菌K-12的全基因组序列(TheComplete Genome Sequence of Escherichia coli K-12)”,Science,277卷,1453-1462页(1997)。
(非专利文献5)S.T.Cole等;“从完全基因组序列译解结核分枝杆菌生物(Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genomesequence)”,Nature,393卷,537-544页(1998)。
(非专利文献6)国家生物工艺信息中心(The National Center for BiotechnologyInformation,)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html
(非专利文献7)Y.Tamai等:”发酵酵母、Saccharomyces cerevisiae中的两类染色体组的共存(Co-existence of two types of chromosome in the fermenting yeast,Sacchaomyces cerevisiae)”,Yeast,10卷,923-933页(1998)。
(非专利文献8)C.Korch等:Proc.Eur.Brew.Conv.Congress,Lisbon,201-208页(1991)。
(非专利文献9)J.Hansen等:“酿酒厂酵母中MET10的失活在啤酒制备过程中对SO2生成的特异性增加(Inactivation of MET 10 in brewer’s yeastspecifically increases SO2 formation during beer production)”,Nature Biotech.,14卷,1587-1591页(1996)。
(非专利文献10)T.Sijen等:“转录和转录后的基因沉默的机理关联性(Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related)”,Curr.Biol.,11卷,436-440页(2001)。
(非专利文献11)N.Goto等:“SSU1-R,葡萄酒中的一种亚硫酸盐抗性基因,是带有不同上游序列的SSU1的等位基因(SSU1-R,a sulphite resistance geneof wine yeast,is an allele of SSU1 with a different upstream sequence)”,J.Ferment.Bioeng.,86卷,427-433页(1998)。
(非专利文献12)D.Avram等:“SSU1编码一种质膜蛋白,该蛋白在赋予Saccharomyces cerevisiae以亚硫酸盐耐受性的蛋白质的网络具有重要的作用(SSU 1 encodes a plasma membrane protein with a central role in a network ofproteins conferring sulfite tolerance in Saccharomyces cerevisiae)”,J.Bacteriol.,179卷,5971-5974页(1997)。
(非专利文献13)H.Park等;“SSU 1在Saccharomyces cerevisiae中介导亚硫酸盐的流出(SSU 1 mediates sulphite efflux in Saccharomyces cerevisiae)”,Yeast,16卷,881-888页(2000)。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种对与所需酿造特征相关的基因进行分析和选择的方法,所述方法是如下实现的:制备汇编工业酵母特别是用于啤酒等酒精饮料的酿造酵母的基因组序列的数据库(下文简称为基因组DB);从数据库中选择酿造酵母所具有的基因;以及通过破坏或过表达来对所述基因进行功能分析。本发明的另一目的在于提供一种DNA阵列,该DNA阵列用于工业酵母基因的分析方法中。本发明的进一步的目的在于提供一种酵母的培育方法,所述酵母显示出与上述基因相关的酿造特性;以及提供一种制备酒精或酒精饮料的方法,该方法利用所述酵母,其产率以及品质得到提高。本发明的又一目的在于提供上述基因以及由所述基因所编码的肽。
已知被广泛用于工业目的的酿造酵母为一种多倍体,尤其是下层发酵酵母为异源多倍体,其由至少两种基因组所构成。其中的一种基因组被认为是来源于S.cerevisiae的基因组,其全部基因组序列已被明确鉴定;而另一个基因组的来源尚未得到清楚鉴定。
本发明人对下层发酵酵母的基因组序列进行了分析以找出对于优异的酿造具有必需功能的未被鉴定的基因。于是将下层发酵酵母的氨基酸序列与S.cerevisiae的已经登记的基因组数据库进行比较,以推断出由该酿造酵母中这 些基因所编码的蛋白质的功能。结果鉴定出,下层发酵酵母的基因被大致分为Sc型基因以及non-Sc型基因,所述Sc型基因与S.cerevisiae具有接近100%的氨基酸同一性,而所述non-Sc型基因表现出大约70至97%的氨基酸同一性(该数值在核苷酸水平大致相当于60至94%)。此外还鉴定出,下层发酵酵母具有复杂的染色体结构,其由Sc型染色体、non-Sc型染色体以及Sc/non-Sc型嵌合染色体所构成。下层发酵酵母的全部染色体结构如图1所示。本发明人基于本发明所鉴定出的基因组信息发现了染色体具有这种未曾预料的复杂结构,并开发出了下层发酵酵母基因的筛选方法。
更具体地说,本发明实现了对工业酵母基因进行分析的方法,所述方法包括下述步骤:
(a)分析工业酵母特别是酿造酵母之一的下层发酵酵母的基因组的核苷酸序列;以及
(c-1)选择编码下述氨基酸序列的工业酵母的基因,所述氨基酸序列与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性,或者
(c-2)选择工业酵母的下述基因,所述基因由与Saccharomyces cerevisiae中的基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成。
本发明的方法优选在步骤(a)之后、步骤(c-1)或(c-2)之前包括下述步骤:
(b)将所述基因组序列与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列进行比较。
优选地,本发明的分析方法在步骤(c-1)或(c-2)之后包括(d)对所选定的基因进行功能分析的步骤,以鉴别出该基因对酵母所赋予的酿造特性。本发明人基于上述发现进行了重复深入的研究,从而完成了本发明。
因此,本发明包括下述实施方式:
1.一种对工业酵母基因进行分析的方法,其包括下述步骤:
(a)分析工业酵母的基因组序列的核苷酸序列;以及
(c-1)选择编码下述氨基酸序列的工业酵母的基因,所述氨基酸序列与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性,或者
(c-2)选择工业酵母的下述基因,所述基因由与Saccharomyces cerevisiae中的基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所组成。
2.如实施方式1所述的分析方法,其在步骤(a)之后、步骤(c-1)或(c-2)之前包括下述步骤:
(b)将所述工业酵母的基因组序列与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列进行比较。
3.如实施方式1或2所述的分析方法,其在步骤(c-1)或(c-2)之后包括下述步骤:
(d)对所选定的基因进行功能分析。
4.如实施方式3所述的分析方法,其包括:
通过步骤(d)的功能分析对在酒精或酒精饮料的生产中与增加产率和/或提高口味相关的基因进行筛选。
5.如实施方式3或4所述的分析方法,其中所述功能分析是通过对基因进行破坏或使基因发生过表达来进行。
6.如实施方式1-5任意一项所述的分析方法,其中所述工业酵母为酿造酵母。
7.如实施方式6所述的分析方法,其中所述酿造酵母为啤酒酵母。
8.如实施方式7所述的分析方法,其中所述啤酒酵母为下层发酵酵母。
9.一种工业酵母基因,该基因编码与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%同一性的氨基酸序列,或由与Saccharomycescerevisiae的基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成,所述基因是通过实施方式1-8任意一项所述的分析方法而获得的。
10.一种基因文库,该基因文库包括工业酵母的一种或多种基因,其中的每一种基因编码与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%同一性的氨基酸序列,或由与Saccharomyces cerevisiae中的基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成,所述基因文库是通过实施方式1-8任意一项所述的分析方法而获得的。
11.如实施方式10所述的基因文库,其中所述工业酵母的基因包含于下述任一核苷酸序列、由下述任一核苷酸序列构成、或具有下述任一核苷酸序列,所述核苷酸序列选自序列号33~6236、序列号166154~166181、序列号166490~167042以及序列号173125~174603。
12.一种DNA阵列,其包含一种或多种DNA,其中的每一种DNA选自下 述组(1)至(4)中的至少一组:
(1)由工业酵母的基因组序列的开放阅读框的核苷酸序列构成的DNA,该核苷酸序列编码与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%同一性的氨基酸序列,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列或具有选自上述核苷酸序列中的连续10个以上的核苷酸的核苷酸序列构成的DNA;
(2)由工业酵母基因组序列的开放阅读框之外的核苷酸序列构成的DNA,该核苷酸序列由与Saccharomyces cerevisiae中的基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列或具有选自上述核苷酸序列中的10个以上连续核苷酸的核苷酸序列构成的DNA;
(3)具有序列号166490~167042中的任一核苷酸序列的DNA,或具有序列号167043~173124中的任一核苷酸序列的DNA;
(4)具有序列号173125~174603中的任一核苷酸序列的DNA,或具有序列号174604~190810中的任一核苷酸序列的DNA。
13.如实施方式12所述的DNA阵列,其包含的DNA中至少一种选自(1)~(4)中的每一组。
14.如实施方式12或13所述的DNA阵列,其中(1)中的DNA包含于下述任一核苷酸序列、由下述任一核苷酸序列构成、或具有下述任一核苷酸序列,所述核苷酸序列选自序列号33~6236、序列号166154~166181、序列号6237~75336以及序列号166182~166489。
15.如实施方式12-14任意一项所述的DNA阵列,其除包含选自(1)至(4)的至少一组的DNA之外,还进一步包含下述(5)和/或(6)组中的DNA:
(5)由工业酵母基因组序列的开放阅读框的核苷酸序列构成的DNA,所述核苷酸序列编码与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有97%以上同一性的氨基酸序列,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列或具有选自上述核苷酸序列中的10个以上连续核苷酸的核苷酸序列构成的DNA;以及
(6)由工业酵母基因组序列的开放阅读框之外的核苷酸序列构成的DNA,所述核苷酸序列由与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有94%以上同一性的核苷酸序列所构成,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列或具有选自上述核苷酸序列中的10个以上连续核苷酸的核苷酸序列构成的DNA,
并任选包含下述(5′)和/或(6′)组中的DNA:
(5′)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(5)的DNA中的1个或多个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;以及
(6′)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(6)的DNA中的1个或多个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
16.如实施方式15所述的DNA阵列,其中(5)的DNA具有序列号75337~82784或序列号82785~166153中的任一核苷酸序列。
17.如实施方式12-16任意一项所述的DNA阵列,其除包含选自(1)至(4)中的至少一组DNA之外,还包含选自下述(7)至(10)中的至少一组DNA:
(7)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(1)的DNA中的1个或多个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(8)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(2)的DNA中的1个或多个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(9)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(3)的DNA中的1个或多个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,以及
(10)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(4)的DNA中的1个或多个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
18.如实施方式17所述的DNA阵列,其除包含选自(1)至(4)中的至少一组DNA之外,还包含选自下述(7-1)至(10-1)中的至少一组DNA:
(7-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(1)的DNA中的1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(8-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(2)的DNA中的1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(9-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(3)的DNA中的1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列, 以及
(10-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是包含与(4)的DNA中的1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
19.如实施方式12-18中任意一项所述的DNA阵列,其包含选自(1)至(4)的至少一组DNA、选自(7)至(10)中的至少一组DNA、(5)和/或(6)组中的DNA、以及(5′)和/或(6′)中的DNA。
20.如实施方式12-19中的任意一项所述的DNA阵列,其中所述DNA为由10-30个核苷酸构成的寡核苷酸。
21.实施方式12-20中的任意一项所述的DNA阵列用于工业酵母基因的分析方法中的应用。
22.鉴别工业酵母的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与实施方式15-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)计算与(1)至(4)的任一组的杂交率,并计算与(5)和/或(6)组的杂交率。
23.实施方式22所述的鉴别方法,其中使用实施方式19中的DNA阵列,并且
将与(1)和/或(2)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(1)至(4)的任一组的杂交率,而并非将与(7)和/或(8)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(1)至(4)的任一组的杂交率;并且
将与(5)和/或(6)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(5)和/或(6)组的任一组的杂交率,而并非将与(5′)和/或(6′)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(5)和/或(6)组的任一组的杂交率。
24.检测工业酵母基因组中的核苷酸多态性的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与实施方式17-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)选择与(7)至(10)任一组中的DNA的杂交强度高于与(1)至(4)任一组中的DNA的杂交强度的基因。
25.筛选工业酵母的有用菌株的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母菌株制备的基因组DNA与实施方式12-20中任意一项所述 的DNA阵列进行杂交;以及
(b)当所述菌株满足下述条件时,将其确定为有用的工业酵母菌株:所述菌株含有其杂交强度较与(1)至(4)任一组中的DNA的平均杂交强度高1.5倍、或是上述平均杂交强度的2/3以下的一种或多种基因。
26.筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母菌株制备的基因组DNA与实施方式12-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)筛选其杂交强度较与(1)至(4)任一组中的DNA的平均杂交强度高1.5倍、或是上述平均杂交强度的2/3以下的基因。
27.筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a-1)将由工业酵母制备的基因组DNA、cDNA或cRNA与实施方式12-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;
(a-2)与步骤(a-1)相独立地,将由其它工业酵母制备的基因组DNA、cDNA或cRNA与实施方式12-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)筛选在步骤(a-1)中与(1)至(4)中任一组的DNA的杂交强度与在步骤(a-2)中的杂交强度明显不同的基因。
28.筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a-1)将由工业酵母制备的cDNA或cRNA与实施方式12-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;
(a-2)与步骤(a-1)相独立地,将由工业酵母制备的cDNA或cRNA与实施方式12-20中任意一项所述的DNA阵列进行杂交,其中,(a-2)步骤中所述的工业酵母与(a-1)步骤中所述的工业酵母在不同的培养条件下进行培养;以及
(b)筛选在步骤(a-1)中与(1)至(4)中任一组的DNA的杂交强度与在步骤(a-2)中的杂交强度明显不同的基因。
29.由实施方式26-28任意一项所述的筛选方法获得的基因。
30.如实施方式9或29所述的基因,其特征在于当该基因在工业酵母中表达时,该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
31.一种核酸,其编码下述i)和ii)中的任意一种多肽:
i)具有由序列号3所表示的氨基酸序列的多肽,以及
ii)具有下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列为由序列号3所表示的氨基 酸序列中缺失、取代和/或添加了1个或多个氨基酸残基后的氨基酸序列;且该多肽具有下述活性,当所述基因在工业酵母中表达时,其能使该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
32.如实施方式31所述的核酸,其选自下述(a)和(b):
(a)具有由序列号1表示的核苷酸序列的核酸,以及
(b)具有核苷酸序列的核酸,该核苷酸序列在严格条件下与由序列号1表示的核苷酸序列的互补核苷酸序列进行杂交且编码具有下述活性的多肽:当所述基因在工业酵母中表达时,该多肽能使该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
33.一种重组载体,其包含实施方式9或实施方式29-30中的基因,或包含实施方式31-32所述的核酸。
34.一种转化株,其包含实施方式33中的重组载体。
35.如实施方式34所述的转化株,其为酵母属酵母。
36.下述i)和ii)中的任意一种多肽:
i)具有由序列号3表示的氨基酸序列的多肽,以及
ii)具有下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列为在序列号3表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1个或多个氨基酸残基后的序列,所述多肽具有下述活性,当所述基因在工业酵母中表达时,该多肽能使该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
37.如实施方式36所述的多肽,其由选自下述(a)和(b)的核酸所编码:
(a)具有由序列号1表示的核苷酸序列的核酸,以及
(b)具有在严格条件下与序列号1所表示的核苷酸序列的互补核苷酸序列进行杂交并编码具有下述活性的多肽的核苷酸序列的核酸,所述活性为当所述基因在工业酵母中表达时,该多肽能使该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
38.制备酒精或酒精饮料的方法,其使用实施方式34或35中的转化株。
39.适于制备酒精或酒精饮料的酵母的培育方法,其特征在于,实施方式9或实施方式29-30的基因的表达,或实施方式31-32的核酸的表达受到控制。
40.如实施方式39所述的培育方法,其中所述酵母属于酵母属。
41.酵母,其由实施方式39或40所述的培育方法获得。
42.制备酒精或酒精饮料的方法,其使用实施方式41中的酵母。
43.酒精或酒精饮料,其由实施方式42所述的制备方法所制得。
44.分析工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(c-1)选择编码下述氨基酸序列的工业酵母的基因,所述氨基酸序列与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性,或者
(c-2)选择工业酵母的下述基因,所述基因由与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成。
附图说明
图1显示下层发酵酵母的全部染色体结构。白色线条表示Sc型染色体,黑色线条表示non-Sc型染色体。椭圆形表示着丝点。罗马数字表示相应的Saccharomyces cerevisiae的染色体序号。在显示non-Sc染色体的图中,标记为黑色的部分显示为连接发生在该部分。例如,在non-ScII-non-ScIV中,显示出nonScII和nonScIV在标记为黑色的部分(300kb)的位置相连接。
图2表示3648个粘粒两端的DNA序列与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列的同一性分布,所述粘粒是由34/70菌株的基因组DNA制备的。X轴表示与Saccharomyces cerevisiae的同一性,例如,X轴的84%表示同一性大于82%但不高于84%。Y轴表示显示同一性的粘粒末端序列的数目。
图3表示粘粒的图谱示例以及鸟枪法克隆至Saccharomyces cerevisiae的基因组序列的图谱示例。(1)和(2)分别表示存在于Saccharomyces cerevisiae的染色体XVI的Watson链和Crick链上的基因。(3)和(4)分别表示插入粘粒克隆中的Sc型和non-Sc型DNA片断。(5)和(6)分别表示插入鸟枪法克隆中的Sc型和non-Sc型DNA片断。
图4表示与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列的重叠群的图谱示例。(A)为Saccharomyces cerevisiae的染色体XVI的示意性描述。在(B)图中,Saccharomyces cerevisiae的染色体XVI的857至886kb部分被放大。Y轴表示重叠群与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的同一性百分比。X轴表示重叠群相对于Saccharomyces cerevisiae基因组序列的位置。重叠群(实线)分别通过鸟枪法以及粘粒阅读用正向-反向连接子连接。
图5表示利用DNA阵列的比较基因组杂交。34/70菌株的基因组DNA与DNA阵列杂交(Affymetrix基因芯片酵母基因组S98阵列),将每一开放阅读框(ORF)的信号标准化为单倍体菌株S288C的信号,并以信号对数比(Signal LogRatio(2n))进行表示。信号对数比按照染色体XVI的基因顺序进行排列。non-Sc型基因不与该Sc型阵列进行杂交,因而,信号Log比率显示出明显变化的位置(由箭头所示)被认为是易位位点。
图6所示为由DNA阵列和PCR分析推断出的34/70菌株的染色体XVI的结构。
图7显示SSU1破坏株以及亲株(BH96)的发酵特性。a)显示酵母生长(OD600),b)显示表观浸出物的变化(w/w%),c)显示亚硫酸盐的浓度(ppm)。
图8显示SSU1过表达菌株以及亲株(BH225)的发酵特性。a)显示酵母生长(OD600),b)显示表观浸出物的变化(w/w%),c)显示亚硫酸盐的浓度(ppm)。
图9表示利用MET14过表达菌株和亲株(KN009F和FOY227)进行发酵时亚硫酸盐浓度的变化。
图10表示ScSSU1和non-ScSSU1的DNA序列。
图11表示ScMET14和non-ScMET14的DNA序列。
图12表示34/70菌株的发酵特性。a)显示酵母生长(OD600),b)显示表观浸出物的变化(w/w%)。
具体实施方式
I.对工业酵母基因进行分析的方法
本发明提供一种对工业酵母基因进行分析的方法。该方法包括下述步骤:
(c-1)选择编码下述氨基酸序列的工业酵母的基因,所述氨基酸序列与Saccharomyces cerevisiae中该基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性,或者
(c-2)选择工业酵母的下述基因,所述基因由与Saccharomyces cerevisiae中该基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成。
在一个优选的实施方式中,本发明的方法在步骤(c-1)或(c-2)前具有步骤(a)分析工业酵母的基因组的核苷酸序列。在一个优选实施方式中,本发明的方法在步骤(a)之后(如果有的话)、步骤(c-1)或(c-2)之前包括步骤(b)将所述基因组序 列与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列进行比较。
在一个优选实施方式中,本发明的分析方法在步骤(c-1)或(c-2)之后进一步包括步骤(d)对所选定的基因进行功能分析。
对于本发明中的工业酵母,例如有用于啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造酵母以及用于制备燃料酒精的酵母。更特异地,可列出Saccharomyces属等酵母,在本发明中,可以使用诸如巴斯德酵母、Weihenstephan34/70、NCYC456、NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953和NBRC1954等啤酒酵母。还可以使用Saccharomyces cerevisiae NCYC90等威士忌酵母、Kyokai葡萄酒酵母No.1、No.3和No.4等葡萄酒酵母、以及Kyokai清酒酵母No.7和No.9等日本清酒酵母等。
本发明的工业酵母优选为酿造酵母,更优选为啤酒酵母,本发明的工业酵母进一步优选为下层发酵酵母。下层发酵酵母表示用于贮藏型啤酒的酵母。诸如巴斯德酵母、Weihenstephan34/70和NCYC456等一些啤酒酵母菌株被归类为下层发酵酵母。下述实施例中使用的菌株为通常用于贮藏型啤酒的制备的下层发酵酵母中的一种。大多数下层发酵酵母似乎与34/70菌株具有相同的基因组。
当将采用本发明方法获得的基因用于进行表达控制以使得该基因在酵母中过表达和/或该基因被破坏时,也可以培养出具有优异酿造特性的酵母。相应地,采用本发明方法获得的基因、由所述基因编码的肽、使用该基因的工业酵母的培育方法、采用该培育方法获得的酵母、以及利用所述酵母来制备酒精或酒精饮料的方法也处于本发明的保护范围之内。
(A)工业酵母基因组序列的核苷酸序列分析
若目标工业酵母的基因组序列尚未确定,在步骤(a)中的“分析”可表示确定工业酵母的基因组序列。在本说明书中,所述“基因组序列”表示全部基因组序列或基因组序列的一部分。
若目标工业酵母的基因组序列已经确定,在步骤(a)中的“分析”可表示从适当的渠道(例如,从公开的可获取的数据库中)获得目标工业酵母的基因组序列的信息。
可利用常规方法来确定工业酵母的基因组序列。该方法例如包括步骤(a)从酵母中制备基因组DNA、步骤(b)从基因组DNA中制备鸟枪法文库、步骤(c)从基因组DNA中制备粘粒文库、步骤(d)由这些文库克隆制备用于确定DNA序列 的DNA片断、步骤(e)利用测序反应(sequencing reaction)确定文库DNA片断的DNA序列、以及步骤(f)将这些DNA片断的序列进行装配以构建基因组序列。为实现该目的,步骤(b)中的鸟枪法文库和步骤(c)中的粘粒文库可以两种都制备,或仅制备其中的一种。
对用于(a)至(f)的方法没有特别限定,其可根据已知方法来进行,而其优选方法分别如下所述。
(a)优选通过已知方法对基因组DNA进行诸如提取、纯化等制备,所述已知方法例如,“酵母,一种实用的方法(Yeast,a practical approach)(IRL出版社,6.2.1,228页)”以及“生物化学实验法,No.39,酵母分子遗传学实验(泰治渡岛编辑,学会出版中心,84至85页,1996)”。
利用常规方法来培养用于制备基因组DNA的酵母细胞。对于培养基,可以使用任意的天然及合成培养基,只要所述培养基含有碳源、氮源、无机盐等可被酵母代谢的物质即可,由此即可充分进行微生物的培养。例如,可以使用YPD培养基(2%(w/w)葡萄糖,1%(w/w)酵母提取物以及2%(w/w)聚胨)。对于培养方法,推荐在约℃25至35℃振摇培养过夜。
培养后,通过离心从培养液中重新获得细胞。将所得细胞沉淀以洗涤溶液进行洗涤。洗涤溶液的示例为缓冲液A(50mM磷酸钠,25mM EDTA以及1%(v/v)β-巯基乙醇,pH7.5)等。可利用基因组DNA的常规制备方法来从洗涤的细胞制备基因组DNA,其中,将细胞壁用酶解酶(Zymolyase)和SDS进行溶解,并利用酚以及酚/氯仿溶液去除蛋白质等,将基因组DNA用乙醇等进行沉淀。更特异地,例如可使用下述方法。
以缓冲液A洗涤培养细胞并将其重悬,然后向混合物中加入5至10mg的酶解酶100T(生化学Kogyo),并在25℃至40℃轻摇混合物30分钟至2小时。摇动后,加入诸如缓冲液B(0.2M Tris-HCl,80mM EDTA以及1%SDS,pH9.5)等含有SDS的缓冲液,将混合物于60℃至70℃保持30分钟以裂解细胞。随后,将细胞溶解产物置于冰上冷却,与5M的醋酸钾进行混合,并使之于冰上进一步保持60分钟。将所得溶液离心(例如,在15℃以5,000g离心10分钟),获取上清液。向上清液中加入同等体积的乙醇,沉淀DNA,然后立即将混合物离心(例如,在15℃以5,000g离心10分钟)以获得DNA。将所得沉淀以70%(v/v)乙醇进行洗涤,自然干燥,并溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA, pH8.0)等溶液中,以获得粗品基因组DNA溶液。向粗品基因组DNA溶液中加入氯化铯和双苯酰亚胺并使之溶解,将混合溶液进行超速离心分离(例如,在25℃以100,000g离心17小时),用UV线进行照射,以使DNA条带具有可视性并获取较低的条带。通过下述方法除去双苯酰亚胺:利用以氯化铯溶液饱和的异丙醇来抽提还原的DNA溶液,然后向所得的水性层中加入4倍体积的0.3M醋酸钠并随后进行混合,将DNA以乙醇进行沉淀,通过离心获得。获得的DNA以RNase进行处理,并以酚/氯仿进行抽提,然后通过再次以乙醇沉淀来将DNA从所得的的水性层中进行纯化。将通过离心重新获得的该沉淀用70%(v/v)的乙醇进行洗涤,自然干燥,并溶解于TE缓冲液中,以制备基因组DNA溶液。
(b)鸟枪法文库制备
作为利用上述(a)中制备的酵母的基因组DNA来制备基因组DNA文库的方法,可以使用“分子克隆操作手册(第三版,2001年)”(下文中简称为分子克隆,第三版)中所述的方法,关于特别适用于确定基因组序列的鸟枪法文库的制备方法,例如可使用下述方法。
将TE缓冲液加入至(a)中制备的基因组DNA中,并利用Hydroshear(GeneMachines制)等将基因组DNA片断化。利用DNA纯化试剂盒(BluntingKit)(TAKARA BIO INC..制)等将基因组片断末端平头化,然后利用琼脂糖凝胶电泳进行分离。随后,从凝胶上切下约为1.5至2.5kb的基因组片断,向凝胶中加入MG-洗脱缓冲液(0.5mol/L醋酸铵,10mmol/L醋酸镁,1mmol/L EDTA以及0.1%SDS)等DNA洗脱缓冲液,然后在25至40℃振摇过夜以洗脱DNA。将DNA以酚/氯仿进行处理,并用乙醇沉淀,以获得基因组文库插入物。将上述所有插入物与诸如pUC 18SmaI/BAP(Amersham Biosciences公司制)等适宜的载体于10℃至20℃下用T4连接酶(TAKARA BIO INC..制)进行连接,连接进行20至50小时。所述连接反应产物以乙醇进行沉淀,并将所得重组载体DNA溶解于适量的TE缓冲液中。通过电穿孔等方法,将重组载体DNA转化至诸如ElectroCell DH5α菌株(TAKARA BIO INC..制)等大肠杆菌中。推荐采用所附操作手册中提及的条件进行电穿孔。
利用适宜的选择性培养基来选择插入有包含基因组DNA片断的重组载体的转化株。例如,当利用pUC18SmaI/BAP作为载体时,若在30至37℃培养过夜,则所述转化株在下述培养基上形成白色菌落,因而容易进行选择;所述培 养基为含有约0.01至0.1mg/mL氨苄青霉素、约0.1mg/mL的X-gal以及约1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的LB平板培养基(含有1.6%琼脂的LB培养基(10g/L的细菌用胰蛋白胨,5g/L的酵母提取物以及10g/L氯化钠,pH7.0))。将所述转化株以384孔滴定板于30至37℃在含有约0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行过夜培养,向其中加入与加入其中的LB同等体积的50%的甘油水溶液,搅动所得混合物,以获得甘油存储液(stock)。通常将甘油存储液保存于约-80℃。
(c)粘粒文库的制备
将(a)中制备的基因组DNA利用诸如Sau3AI(TAKARA BIO INC..制)等适宜的限制性酶进行部分消化。可以将以Sau3AI消化的DNA片断插入至Super CosI载体(Stratagene制)等质粒载体的BamHI位点。可根据所附的方案来进行以限制性酶的处理以及连接处理。将采用所述方法获得的连接产物利用例如GigapackIII Gold(Stratagene制)并按照所附的实验操作手册进行操作,对其进行包装(packaging),将其引入诸如XL 1-Blue MR菌株(Stratagene制)等大肠杆菌中。使其铺展在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上并于约30至37℃过夜孵育,以获得转化株。将所得转化株利用96孔滴定板在约30至37℃以含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基进行过夜培养,向其中加入与加入其中的LB同等体积的50%的甘油水溶液,搅动所得混合物,以获得甘油存储液(stock)。通常将甘油存储液保存于约-80℃。
(d)用于确定DNA序列的DNA片断的制备
可主要利用基因组鸟枪法来确定工业酵母的基因组序列。可利用上述(b)中制备的鸟枪法文库进行PCR来制备用于确定DNA序列的DNA片断。特异性地,利用复制子(replicator,Gene Solution制)将基因组鸟枪法文库克隆接种至384孔滴定板,向每孔加入约50μl的含有氨苄青霉素的LB培养基,然后在约30至37℃在不振摇的条件下培养过夜。将培养物利用复制子(Gene Solution制)等转移至384孔反应板(AB Gene制),向每孔加入约10μl的PCR反应溶液(TaKaRa Ex Taq,TAKARA BIO INC.制),然后按照Makino等人(DNA Research,第5卷,1至9页(1998))的方案或类似的方案使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems制)等进行PCR,由此进行插入片断的扩增。
利用PCR产品的纯化试剂盒(Amersham Bioscience制)等除去过量的引物以 及核苷酸,利用该样品作为模板进行测序反应(sequence reaction)。
基因组序列的确定也可以通过制备并使用粘粒文库来进行。可利用下述方法来利用(c)的粘粒文库制备粘粒DNA。也即,将源自粘粒文库的克隆接种至96孔板中,向每孔中加入1.0mL含有氨苄青霉素的适宜培养基,该适宜培养基例如为2×YT培养基(1.6%细菌用胰蛋白胨,1%酵母提取物以及0.5%氯化钠,pH7.0),并在约30至37℃振荡培养过夜。可利用KURABO PI-1100DNA自动分析系统(KURABO制)按照KURABO的手册等从该培养物中制备粘粒DNA,所制得的粘粒DNA可被用作测序反应的模板。
(e)测序反应
可利用市售的测序试剂盒等来进行测序反应。本发明中的优选测序示例如下所述。
可如下制备测序反应混合物。将上述(d)中制备的PCR产物或粘粒DNA与约2μl的DYEnamic ET末端测序试剂盒(DYEnamic ETTerminator SequencingKit,Amersham Bioscience制)以及适宜的引物相混合,以获得约8μl的反应混合物。利用M13正向(M13-21)引物以及M13反向(M13RV)引物(Takara Bio制)等来进行源自鸟枪法DNA的PCR产物的测序反应,而对于粘粒DNA,利用SS-cosF.1(序列号7)等正向引物以及SS-cos R.1(序列号8)等反向引物来进行反应。引物以及DNA片断的量分别为1至4pmole以及约50至200ng。
可利用反应溶液和GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosciences制)来进行50至70个循环的染料终止子测序反应(dye terminator sequence reaction)。当使用DYEnamic ET Terminator Sequencing试剂盒等市售的试剂盒时,循环参数参照所附的手册。样品的纯化采用MultiScreen HV板(Millipore制)等按照Millipore的手册来进行。将纯化的反应产物以乙醇沉淀,干燥所得沉淀物,并贮藏于约4℃的暗处。利用MegaBACE1000测序系统(Amersham Bioscience制)以及ABIPRISM 3700 DNA分析仪(Applied Biosystems制)等市售的测序仪以及分析仪等按照所附的手册来对干燥的产物进行分析。
(f)利用装配的方式构建基因组序列(确定多序列DNA片断的顺序的方法)
可利用上述(e)中获得的DNA片断的序列信息来构建基因组DNA。构建基因组DNA序列的所有操作可利用平台来进行。可利用phred(华盛顿大学)等软件来进行碱基识别,载体序列的masking可利用Cross Match(华盛顿大学) 等软件来进行,装配可利用Phrap(华盛顿大学)等软件来进行。由装配所获得的重叠群(contig)可利用consed、graphical editor(华盛顿大学)等进行分析。从碱基识别到装配的一系列工作可利用consed所附的script即bloc utilizing phredPhrap来进行(A series of works from base call to assembly can be carried out en,a scriptattached to the consed)。
(B)工业酵母与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列的比较
(A)中获得的基因组序列与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列的比较可任意采用对两个序列进行比较的方法。其可包括(g)制备比较数据库,所述数据库中汇编有粘粒和鸟枪法克隆以及重叠群两末端的每一DNA序列与Saccharomyces cerevisiae的基因组序列的比较数据,在Saccharomyces cerevisiae基因组序列上它们的图谱。
诸如下层发酵酵母(S.pastorianus)等广泛使用的工业酵母被认为是Saccharomyces cerevisiae的天然杂种及其密切相关种(例如S.bayanus)“Int.J.Syst.Bacteriol.35卷,508-511页(1985)”。由此,对由(e)中制备的粘粒克隆的两末端的DNA序列通过同源搜索计算法进行与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的同源搜索,由此可确定每一DNA序列与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的同源性区域以及同一性,因此可制备数据库。
Scerevisiae基因组序列可由公开的数据库获得,该数据库例如为Saccharomyces     基    因    组    数    据    库    (SGD: http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/),两个氨基酸或两个核酸序列之间的同一性百分比可通过视觉检测以及数学计算来确定,或更优选地,可通过利用计算机程序比较序列信息来完成该比较。作为示例,优选的计算机程序为遗传学计算机组(GCG;麦迪逊,WI)威斯康星数据包10.0版程序′GAP′(Devereux等,1984,Nucl.Acids Res.12:387)。′GAP′程序的优选缺省参数包括:(1)核苷酸的一元比较矩阵(数值1表示同一,数值0表示不同一)的GCG应用,以及Gribskov和Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986的加权的氨基酸比较矩阵,其在Schwartz and Dayhoff,eds.,AtlasofPolypeptide Sequence and Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353-358,1979中有所描述;以及其它可比较的比较矩阵;(2)在氨基酸序列上的每一缺口减去(penalty)30,每一缺口的每一符号再减去1,或者在核苷酸序列上的每一缺口减去50,每一缺口的每一符号再 减去3;(3)末端缺口无需减去处理;以及(4)长缺口没有最大减去值。也可使用本领于技术人员所公知的进行序列比较的其它程序,该其它程序例如可为:BLASTN程序2.0.9版,可 通 过 国 家 医 药 图 书 馆 网 站ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi进行使用;或者为WU-BLAST2.0计算法。WU-BLAST2.0的标准缺省参数设置在下述互联网上有所描述:sapiens.wustl.edu/blast/blast/#Features。此外,BLAST计算法使用BLOSUM62氨基酸评分矩阵,其它可用的参数如下所示:(A)包括对具有低组成复杂性的检测序列(query sequence)的遮蔽片断(mask segments)的筛选(通过Wootton和Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry,1993);也可参照Wootton andFederhen,1996,序列数据库中的组分偏移区域的分析(Analysis ofcompositionally biased regions in sequence databases),Methods Enzymol.266:554-71);以及(B)用于报告与数据库序列相匹配的统计学差异性阈值,或E-score(所期待的匹配可能性仅根据Karlin和Altschul的随机模型(1990)通过偶然发现;如果匹配所致的统计学差异大于该E-score阈值,则不报告为匹配);优选的E-score阈值的数值为0.5,或为增加优选性,该数值为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75或1e-100。
图2所示为粘粒DNA序列相对于Saccharomyces cerevisiae基因组DNA序列的同一性百分比分布图的示例。粘粒的DNA序列大致被分为与Saccharomycescerevisiae基因组序列具有多于94%的同一性的DNA序列组以及与Saccharomyces cerevisiae基因组序列具有大约84%的同一性的DNA序列组。相应地,将与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有多于94%的同一性的DNA序列组命名为源自Saccharomyces cerevisiae的Sc-型DNA序列。而将具有94%以下的同一性、优选具有60至94%同一性的DNA序列命名为源自与Saccharomyces cerevisiae密切相关的non-Sc型DNA序列。将具有Sc型和non-Sc型DNA序列分别命名为Sc型基因或non-Sc型基因。
类似地,制得(e)中制备的鸟枪法克隆的两末端DNA序列与Saccharomycescerevisiae基因组DNA序列的比较数据库。根据由所制得的比较数据库获得的信息,在Saccharomyces cerevisiae基因组序列上进行粘粒克隆和鸟枪法克隆的定位(例如,参照图3)。也进行(f)中制备的重叠群的DNA序列与Saccharomyces cerevisiae基因组DNA序列的比较数据库的制备及定位。定位技术几乎与上述相同,但对于由相同的粘粒和鸟枪法克隆通过成对的正向-反向DNA序列进行连接的重叠群,这些重叠群是相连接的(例如,参照图4)。
(C)
(C-1)选择编码下述氨基酸序列的工业酵母的基因,所述氨基酸序列与Saccharomyces cerevisiae基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性,以及
(C-2)选择工业酵母的下述基因,所述基因由与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成。
选择编码与Saccharomyces cerevisiae基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性的氨基酸序列的下层发酵酵母的基因的阶段可以包括(h)鉴定ORF(开放阅读框)和功能认定的步骤。
(h)ORF的鉴定及其功能认定
对在(f)中装配的DNA序列中的ORF进行鉴定。优选示例特别如下所述。对于由起始密码子和终止密码子所确定的一定长度的DNA序列(例如不少于150个碱基),可利用程序来进行DNA序列中所存在的ORF的鉴定,所述程序例如为ORF发现程序(http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)等,其用于鉴定6种包括互补序列的阅读框。
对于由所鉴定的ORF编码的蛋白质的功能认定,可利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等进行同源性搜索来认定,所述同源性为相对于S.cerevisiae的ORF氨基酸序列的同源性,该Saccharomyces cerevisiae的 ORF 氨 基 酸 序 列 已 经 由 Saccharomyces 基 因 组 数 据 库 (SGD: http://genome-www.stanford.edu/ Saccharomyces/)进行登记和公开。如果需要,可以利用基于DNA阵列的对比基因组杂交以及PCR来分析工业酵母的染色体结构。在本说明书的实施例8中,利用含有已知的Saccharomyces cerevisiae核苷酸序列的DNA探针的DNA阵列来分析S.pastorianus菌株34/70的染色体结构。
利用QuiagenGenomicTip100/G(#10243)以及QiagenGenomic DNABufferSet(#19060)按照试剂盒所附的手册来制备酵母基因组DNA。将所得DNA(例如10μg)按照Winzeler等人(Science,volume281,pages1194-1197(1998))的方法以Dnase I(Invitrogen制)进行消化,利用末端转移酶(Roche制)进行生物素化,杂交 至DNA阵列(Affymetrix基因芯片酵母基因组S98阵列)。所述DNA阵列包含已知的Saccharomyces cerevisiae核苷酸序列的DNA探针。DNA阵列的杂交和信号强度的检测利用Affymetrix制造的基因芯片分析基本系统和分析软件(Microarray Suite5.0)来进行。
利用分析软件(Microarray Suite5.0)将与酿造酵母的DNA杂交的每一探针的信号归一化(normalized)为单倍体实验室酵母菌株S288C的信号,并表示为信号的对数比(
Figure S05837204120070429D00024144125QIETU
)。利用电子数据表程序(Microsoft Excel2000)将信号的对数比按照每一染色体的基因顺序排列,并以棒图表示该信号的对数比(例如,参照图5)。non-Sc型基因不与Saccharomyces cerevisiae阵列杂交,因而,Sc型基因的剂量影响信号的对数比,并且信号的对数比出现明显变化的点被认为是Sc型和non-Sc型染色体的易位位点。
可利用PCR来确认嵌合染色体结构,其中将源自酿造酵母的基因组DNA用作模板,将Sc型和non-Sc型鸟枪法序列用作引物。
可利用Takara PCR Thermal Cycler SP按照所附的手册并使用所附的TakaraLA TaqTM和缓冲液来进行PCR。
关于PCR的结果,通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳已经证实,例如,某一长度的DNA片断自酿造酵母中得到扩增。当将实验室菌株Saccharomyces cerevisiae的基因组DNA用作PCR的模板时,未检测到DNA片断的扩增。若进一步证实DNA片断的两末端DNA序列自酿造酵母中得到扩增,则其与通过鸟枪法确定的基因组序列相一致。并可确认,在该区域内发生了Sc型和non-Sc型染色体的易位,由此形成嵌合染色体。
作为选择,可以选择由与Saccharomyces cerevisiae中该基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列构成的工业酵母基因。在核苷酸水平具有60至94%的同一性相当于在氨基酸水平具有大约70至97%的同一性。在non-Sc型染色体的开放阅读框以外的一些核苷酸序列可能与Sc型的染色体的相应序列具有低于60%的同一性。
(D)所选择基因的功能性分析
进一步,可任选对所选择的基因进行功能性分析。例如,基因的功能性分析可包括下述步骤:(i)基因的选择,(i’)基因的克隆,(j)通过基因破坏进行基因的功能性分析、或者(k)通过基因过表达进行基因的功能性分析。
(i)基因的选择
用于选择功能性基因的方法没有特别限定。优选方法例如为采用上述(h)中获得的功能认定的方法以及使用下述的DNA阵列的方法。
本发明的一个目的是对工业酵母中的下述基因进行鉴定,所述基因在酒精或酒精饮料的生产中与增加产率或改善口味相关。Saccharomyces cerevisiae的全基因组序列已经得到鉴定,且Saccharomyces cerevisiae中的每一基因的功能也已经得到鉴定。如在步骤(h)中所述,由non-Sc型基因编码的蛋白的功能可通过同源搜索得到认定。选择下述non-Sc型基因作为功能性分析中的目标基因,该non-Sc型基因由上述认定结果预计具有有用的活性,即,其在酒精或酒精饮料的生产中与增加产率或改善口味相关。
例如,已知SSU1基因和MET14基因分别具有亚硫酸盐转运活性以及腺苷酰硫酸激酶(adenylsulfate kinase)。已知这两种基因在稳定啤酒口味方面均起到重要作用。在下述实施例7的表2中列出了用Sc基因的鉴定分析得出的其它已知在制备啤酒的步骤中具有某些作用的基因。然而,这些基因并不能充分发挥出足以制造口味好的啤酒的活性。因此,毫无限制地,为了从工业酵母中鉴别出在酒精或酒精饮料的生产中与增加产率或改善口味相关的基因,可以选择与Sc型基因相对应的non-Sc型基因。
作为选择,利用DNA阵列的方法例如为:进行基因表达分析以鉴别在某些情况下具有典型表达特性的基因,或进行比较基因组杂交以鉴别具有不同拷贝数目或不同DNA序列的基因,所述不同拷贝数目或不同DNA序列是通过检测探针的信号强度的差别来进行的。
(i’)基因的克隆
上述(i)中所选择的基因可按照例如“分子克隆,第三版”中所述的常规方法从下层发酵酵母中获得。也即,合成具有与该基因相毗连的序列的寡核苷酸,利用由下层发酵酵母制备的基因组DNA作为模板进行常规PCR克隆方法,由此可分离并获得所选择的基因。可以列出如此获得的DNA序列,该序列例如为序列号1。
当将所述基因命名为例如基因(1)时,基因(1)或用于通过PCR法扩增基因(1)的引物也可利用多核苷酸合成仪基于上述序列信息进行合成。
此外,在本说明书中,基因(1)不仅被定义为表示与基因(1)具有相同DNA 序列的DNA片断,还表示在严格条件下与上述基因进行杂交的DNA片断。
在严格条件下进行杂交的DNA片断表示的是利用含有上述鉴别的基因(1)序列的DNA片断作为探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹杂交法等方法获得的DNA片断。
术语“在严格条件下”是指两个核酸片断可在中度严格条件下或高度严格条件下进行杂交。技术人员可以容易地选择适宜的中度严格条件或高度严格条件。
对于影响杂交条件的选择以及对设计出适宜的条件进行指导的基本参数,在下述文献中有所描述:Sambrook,Fritsch,and Maniatis(2001,分子克隆操作手册,第三版,冷泉港实验室印刷社,冷泉港,纽约,第6和第7章;以及分子生物学实验指南,1995,Ausubel等,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,2.10部分以及6.3-6.4部分),并且本领域技术人员根据例如DNA的长度和/或碱基组成可以容易地确定这些基本参数。
所获得的中度严格条件的一种方式是:使用预洗液,其含有5xSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0),杂交缓冲液,其含有约50%甲酰胺、6xSSC,且杂交温度约为40-55℃(或其它类似的杂交溶液,例如含有约50%甲酰胺、杂交温度约为42℃的杂交液),洗涤条件约为60℃以0.5xSSC、0.1%SDS进行。优选地,中度严格条件可包括在约50℃和2XSSC中的杂交。
高度严格条件也可基于待杂交的DNA的长度等因素进行适宜选择。通常,该类条件包括在相对于中度严格条件为更高温度和/或更低盐浓度下进行杂交和/或洗涤(例如,在约65℃、6XSCC-0.2XSSC,优选6XSCC,更优选2XSSC进一步优选0.2XSSC)。例如,高度严格条件可以包括如上所述的杂交,并在约68℃下进行洗涤,以及0.2xSSC和0.1%SDS。在杂交和洗涤缓冲液中,可以使用SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4、以及1.25mM EDTA,pH7.4)来代替SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠),在杂交完成后洗涤15分钟。
应当理解,可以根据需要采用本领域技术人员公知且于下文进一步描述的控制杂交反应和双链稳定性的基本原则(例如,参见Sambrook等人,2001)对洗涤温度和洗涤盐浓度进行调节以达到所需的严格程度。当使核酸与未知的目标核酸进行杂交时,假设杂交长度为杂交核酸的长度。当已知序列的核酸发生杂 交时,可通过对核酸序列进行比对并鉴别出最佳序列互补性的一个或多个区域,以确定杂交长度。
当杂交物(hybrids)预计长度小于50个碱基对时,杂交温度应为5至25℃,优选为小于杂交物的解链温度(Tm)的5至10℃,其中Tm以下述等式来确定。对于长度小于18个碱基对的杂交物,Tm(℃)=2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对于长度大于18个碱基对的杂交物,Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-0.63(%甲酰胺-(500/N),其中N为杂交的碱基数目,[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的浓度([Na+]for1xSSC=0.165M)。优选地,每一个杂交核酸的长度为不少于15个核苷酸(或更优选为至少18个核苷酸、或至少20个核苷酸、或至少25个核苷酸、或至少30个核苷酸、或至少40个核苷酸,或者最优选为至少50个核苷酸),或其与本发明的核酸的长度中的至少25%(更优选至少50%、或至少60%、或至少70%,最优选至少80%)进行杂交,或其与进行杂交的本发明的核酸具有至少60%(更优选至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97.5%、或至少99%,并且最优选至少99.5%)的序列同一性,其中所述序列同一性是通过比对时对杂交核酸序列的比较而得,从而使重合与同一性达到最大化并使上述详述的序列缺口最小化。
所述杂交可按照“分子克隆,第三版”、“分子生物学实验方法,John Wiley&Sons(1987-1997)(下文简写为分子生物学实验方法)、“DNA克隆1:核心技术,实用方法(practical approach),第三版,牛津大学(1995)”等中的方法来进行。
更特异地,可以利用(g)中获得的比较数据库并基于同源性和位置信息等重新获得含有全长度的上述基因(1)的鸟枪法克隆。当鸟枪法文库中没有包含全长度的该基因的克隆时,通过PCR方法来制备编码全长度的该基因的DNA片断。例如,利用由序列号13和序列号14等表示的合成DNA引物对来获得含有上述基因的DNA片断。类似地,利用基于SGD的公开信息而设计的引物对,并利用Saccharomyces cerevisiae或下层发酵酵母的基因组DNA作为模板来进行PCR,从而制备全长度的与non-Sc型基因相对应的Sc型基因。例如,使用合成的寡核苷酸序列号15和NO:16作为引物对,可以获得含有Sc型基因的DNA片断。
利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)等将上述制备的Sc型或non-Sc型DNA片断插入至例如该试剂盒所匹配的pCR2.1-TOPO载体中,由此可制备分别含有具 有Sc型基因的DNA片断的以及含有具有non-Sc型基因的DNA片断的重组载体TOPO/Sc基因以及TOPO/non-Sc基因。可通过Sanger的方法“F.Sanger,Science,214卷,1215页,1981”来确认Sc型和non-Sc型DNA片断的DNA序列。
(j)通过基因破坏进行的功能性分析
可通过例如基因破坏来进行所选定的non-Sc基因的功能性分析。可通过任意已知的方法来由基因破坏进行功能性分析。在本说明书中,“基因破坏的方法”包括使基因的至少部分功能发生停止、阻碍、抑制或削弱,包括基因删除、通过反义核甘酸对基因的阻碍、以及RNAi的方法等。例如,我们将对non-Sc型SSU1基因进行解释,该基因在本发明中已经得到鉴定。
根据文献“Goldstein等人,Yeast,15卷,1541页(1999)”中的方法,可利用PCR来制备基因破坏的DNA片断,其中采用含有抗药性基因(例如pFA6a(G418r)、pAG25(natl))的质粒作为模板。作为PCR所用的引物对,可以采用non-ScSSU1_for(序列号17)/non-ScSSU1_rv(序列号18)等用于non-ScSSU1破坏。而对于Sc SSU1破坏,则可以采用ScSSU1_for(序列号19)/ScSSU1_rv(序列号20)。对于non-Sc型基因破坏,也可以使用pPGAPAUR(AUR1-C)等质粒以及non-ScSSU1_for+pGAPAUR(序列号21)/non-ScSSU1_rv+AURI-C(序列号22)等引物对。
利用以上述方法制备的用于基因破坏的DNA片断来转化工业酵母。该转化例如可以按照日本专利公开公报No.07/303,475中所提及的方法来进行。此外,用于转化株的选择的药物浓度可以通过观察用作宿主的酵母的敏感性来适宜确定。
对于此处所制备的转化株,利用Southern分析法来确认是否将每一抗药性基因引入以及所述基因是否被破坏。更特异地,首先采用适宜的限制性酶来对从亲株提取的基因组DNA以及转化株进行消化,从而区分出Sc以及non-Sc型基因(例如,在37℃进行18小时),然后用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离并使之转移至膜上。随后,按照例如Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham)的方案使其与对Sc型或non-Sc型基因特异的探针于55℃进行18小时的杂交,并通过CDP-Star来对信号进行检测。(i’)中获得的基因的功能可如下进行研究:利用亲株和上述(j)中制备的non-Sc SSU1破坏体来进行发酵试验,并比较其发酵 特性。发酵试验例如可使用麦芽汁在下述条件下进行。
最初提取物:约10至15%
发酵等级:1至3升
溶解氧浓度:约8至10ppm
发酵温度:约15℃
酵母添加量:约4至6g湿酵母细胞/L
周期性地对麦芽汁进行取样,并监测细胞生长(OD600)、表观浸出物,然后分析与(i′)中获得的基因的功能相关的物质等的浓度。
例如,当(i′)中获得的基因的功能与亚硫酸盐的释放有关,则发酵过程中对麦芽汁中的亚硫酸盐的浓度进行分析。通过下述方式进行亚硫酸盐的定量分析:通过在酸性条件下进行蒸馏将亚硫酸盐捕获至双氧水溶液中,然后以碱进行滴定(日本酿造协会,BCOJ啤酒分析推荐方法)。
作为在酒精或酒精饮料的制造中与增加产率和/或改善口味有关的有用的候选基因,我们可以选择通过基因破坏而达到的使细胞生长、表观浸出物、和/或与基因的功能相关的物质的浓度实质上发生变化的基因,特别是与基因的功能相关的物质的浓度变化很重要,应该对其进行监测。
“与基因的功能相关的物质”包括亚硫酸盐、乙醇、酯、燃料酒精等,但不限于此。对于被认为对制造适口的啤酒具有副性作用的物质,也可以作为分析的目标,该类物质包括联乙酰以及酚化合物等。
(k)通过基因过表达进行基因的功能性分析
作为选择,可通过基因的过表达来进行基因的功能性分析。
利用源自(i’)中制备的质粒TOPO/non-Sc基因的适当的限制性酶对含有全长non-Sc型基因的DNA片断进行处理。将该DNA片断插入至例如pNI-NUT等的用于基因表达的载体的克隆位点,以构建non-Sc型基因过表达的载体(pYI-non-Sc型基因)。载体pNI-NUT具有URA3作为同源重组位点,并具有诺尔斯菌素抗性基因(natl)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)作为选择性标记物。另一方面,过表达Sc型基因(pNI-Sc型基因)的载体具有上述pYI-non-Sc型基因被相应的Sc型基因所取代的结构。对于此处所引入的Sc型或non-Sc型基因的过表达,其可由诸如甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)等组成性表达基因的启动子和终止子来驱动。
利用按上述方法制造的过表达载体来转化工业酵母。所述转化可按照日本专利公开公报No.07/303,475中提及的方法来进行,并使用适宜的选择性培养基来对转化株进行选择。可利用RT-PCR方法等来确认过表达。总RNA的提取可以利用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)等按照试剂盒所附的“从酵母中分离总RNA”的操作手册来进行。对于Ssul基因,例如,可以分别使用ScSSU1_for331(序列号23)/ScSSU1_982rv(序列号24)以及non-Sc-SSU1_for329(序列号25)/non-Sc-SSU1_981rv(序列号26)作为特定的引物对以扩增Sc和non-ScSSU1基因。
为扩增诸如PDA1等组成性表达基因作为内标,可将PDA1_for1(序列号27)/PDA1_730rv(序列号28)等用作特定的引物对。将PCR产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分离并以溴乙啶染色进行检测。通过对PCR产物的量进行比较以确定转化株中所述基因的过表达情况。
(i′)所获得的基因的功能性分析可通过利用上述(k)中的亲株和过表达株的发酵试验来进行。发酵试验可采用(j)中所述的条件来进行。
按照与(j)中相同的方法,周期性地对麦芽汁进行取样,并监测细胞生长(OD600)、表观浸出物,然后分析与(i′)中获得的基因的功能相关的物质等的浓度。
作为在酒精或酒精饮料的制造中与增加产率和/或改善口味有关的有用的候选基因,我们可以选择通过基因过表达而达到的使细胞生长、表观浸出物、和/或与基因的功能相关的物质的浓度实质上发生变化的基因。特别是与基因的功能相关的物质的浓度变化很重要,应该对其进行监测。
(E)基因和基因文库
本发明还提供通过本发明分析方法所得到的基因。本发明的基因包括编码蛋白的ORF核苷酸,也包括非编码区域的核苷酸。非编码区域的核苷酸可以包括诸如启动子、增强子、沉默子、终止子等调节区域,这些区域对于基因表达的调节很重要。
特异地,本发明的一个实施方式涉及下述基因,其为工业酵母中编码与Saccharomyces cerevisiae中该基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性的氨基酸序列的基因,或由与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成的基因。
本发明还提供一种基因文库,其包含上述工业酵母中的一种或多种基因。
优选地,所述工业酵母包含下述核苷酸序列、由下述核苷酸序列组成、或具有下述核苷酸序列中的任一核苷酸序列,所述核苷酸序列选自序列号33-6236,序列号166154-166181,序列号166490-167042以及序列号173125-174603。
序列号33-6236表示的non-Sc型ORF的6204个DNA的序列,其可优选地用作微阵列的探针。
序列号166154-166181表示的34/70菌株的线粒体ORF的28个DNA的序列,其可优选地用作微阵列的探针。
序列号166490-167042表示的553个DNA的序列,它们还没有被鉴定为上述non-Sc ORF,但通过NCBI-BlastX同源性搜索发现其与Saccharomycescerevisiae的蛋白具有显著相似性。
序列号173125-174603表示的1479个DNA序列的ORF,如上所述,它们还没有被鉴定,但通过NCBI-BlastP同源性搜索发现其与Saccharomycescerevisiae的蛋白具有显著相似性。
本发明的基因还包括天然基因的突变体,其可包括在一个或多个核苷酸序列和/或氨基酸序列上所进行的一些修饰。本发明的基因将在本说明书的第IV部分进行详细描述。
本发明的“基因”和“基因文库”不仅可以包括化学物质形式的基因,还包括记录在计算机可读记录介质或记忆装置中的核苷酸序列信息的形式。因此,对本发明的“基因”或“基因文库”的核苷酸序列信息进行存取和/或利用也包含在本发明的范围之内。
所述“计算机可读记录介质或记忆装置”包括可通过计算机读出或获取的任意记录介质或记忆装置。其可包括:软盘、硬盘、磁带等磁性记录介质;CD-ROM,CD-R,CD-RW,DVD-ROM,DVD-RAM和DVD-RW等光记录介质;RAM和ROM等电子记录介质;以及上述种类的混合(例如,MO等磁性/光记录介质),但并不限于此。
II.DNA阵列
本发明DNA阵列的实施方式
本发明还提供用于基因分析方法的DNA阵列。可利用本发明的DNA阵列进行分析的“基因”可包括工业酵母的基因组DNA,cDNA或cRNA等。本发明的DNA阵列还可在用于分析DNA和蛋白质之间的结合的ChIP(染色质免疫沉 淀)芯片方法中使用。
本发明的DNA阵列包含基于经本发明鉴定的non-Sc基因的核苷酸序列的一种或多种DNA的一种或多种探针。在本发明中,有时将固定于DNA阵列上的DNA寡聚物或cDNA称作“探针”。
优选地,本发明的DNA阵列包含一种或多种DNA,其中每一种DNA选自组(1)至(4)中的至少一组:
(1)由工业酵母基因组序列的开放阅读框的核苷酸序列构成的DNA,其编码与Saccharomyces cerevisiae基因所编码的氨基酸序列具有70至97%的同一性的氨基酸序列,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,或为选自上述核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列;
(2)由工业酵母基因组序列的开放阅读框之外的核苷酸序列构成的DNA,其由与Saccharomyces cerevisiae基因的核苷酸序列具有60至94%同一性的核苷酸序列所构成,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,或为选自上述核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列;
(3)具有序列号166490~167042中的任一核苷酸序列的DNA,或具有序列号167043~173124中的任一核苷酸序列的DNA;
(4)具有序列号173125~174603中的任一核苷酸序列的DNA,或具有序列号174604~190810中的任一核苷酸序列的DNA。
在本发明的一个优选实施方式中,所述DNA阵列所包含的DNA中至少一种选自(1)至(4)中的每一组。
在本发明的一个优选实施方式中,(1)中的DNA包含下述核苷酸序列、由下述核苷酸序列构成、或具有下述任一核苷酸序列,所述核苷酸序列选自序列号33~6236、序列号166154~166181、序列号6237~75336以及序列号166182~166489。
序列号33~6236相当于编码本发明的non-Sc蛋白的ORF。这些序列可被固定于DNA阵列作为cDNA探针。序列号6237~75336为选自序列号33~6236中的每一个的约25个连续核苷酸的短链核苷酸序列。序列号166182~166489表示于序列号166154~166181的DNA序列的寡核苷酸序列。
在本说明书中,来自酵母的ORF序列可以包括内含子。这种内含子序列可由本领域技术人员容易地鉴别。因而,术语“包含于”表示DNA阵列上的DNA
术语“具有(″have(has)″或″having″)”表示本发明的核苷酸序列可以包括实质上不影响本发明DNA的功能的额外序列。例如,编码ORF的DNA可以包括额外的信号序列或标签序列,从而能促进ORF编码的蛋白质的分泌和/或纯化。可选择地,寡核苷酸可以在其末端包括额外的一个或几个不影响寡核苷酸的杂交特异性的核苷酸序列。
SEQ ID Nos.167043-173124表示基于序列号166490-167042的DNA序列的寡核苷酸。SEQ ID Nos.174604-190810表示基于序列号173125-174603的DNA序列的寡核苷酸。这些序列可固定于DNA阵列作为寡核苷酸探针。
本发明DNA阵列的另一实施方式除包含选自(1)至(4)的DNA组中的至少一组DNA之外,还进一步包含下述(5)和/或(6)组中的DNA:
(5)由工业酵母基因组序列的开放阅读框的核苷酸序列构成的DNA,其编码与Saccharomyces cerevisiae中该基因所编码的氨基酸序列具有97%以上的同一性的氨基酸序列,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,或为选自上述核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列;以及
(6)由工业酵母基因组序列的开放阅读框之外的核苷酸序列构成的DNA,其由与Saccharomyces cerevisiae中该基因的核苷酸序列具有94%以上同一性的核苷酸序列所构成,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,或为选自上述核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。
(5)的DNA相当于Sc基因的ORF,(6)的DNA相当于Sc基因的非编码区域。除含有(1)至(4)的DNA组中的任意一组DNA之外还包含(5)和/或(6)的DNA的DNA阵列例如在鉴别工业酵母的方法中是有用的。
在一个优选实施方式中,(5)的DNA具有与编码本发明的non-Sc蛋白的ORF相对应的序列号75337~82784,or序列号82785~166153,序列号75337~82784中的任一核苷酸序列。
在一个优选实施方式中,DNA阵列包含选自组(1)和/或组(2)的DNA,同时包含选自组(5)和/或组(6)的DNA。将样品与DNA探针(1)的杂交强度和样品与DNA探针(5)中相应的DNA探针的杂交强度相比较。类似地,将样品与DNA探针(2)的杂交强度和样品与DNA探针(6)的杂交强度相比较。
任选地,本发明该实施方式的DNA阵列可以进一步包含下述(5′)和/或(6′)组中的DNA:
(5′)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(5)的DNA具有1个或多个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;以及
(6′)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(6)的DNA具有1个或多个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
如上所述,(5)的DNA相当于Sc基因的ORF,(6)的DNA相当于Sc基因的非编码区域。(5′)和(6′)的DNA相对于(5)和(6)的DNA分别具有一个或多个碱基的错配,优选具有1个碱基的错配。总体说来,在DNA阵列杂交试验中,样品DNA对具有一个或多个碱基错配的探针具有不同的杂交强度。在一个优选的实施方式中,如果样品DNA与(5)(或(6))的DNA探针发生杂交而不与相应的(5′)(或(6′))的DNA探针发生杂交,可以确定该样品DNA对于Sc型基因的(5)(或(6))的DNA探针是阳性的。反之,如果样品DNA与(5)(或(6))的DNA探针发生杂交并且与相应的(5′)(或(6′))的DNA探针发生杂交,可以确定该样品DNA对于Sc型基因的(5)(或(6))的DNA探针是假阳性的。
相应地,(5′)和/或(6′)的DNA可被任意用作本发明DNA阵列的DNA探针,以用于确定和证实样品与(5)和/或(6)的DNA的杂交特异性。
本发明DNA阵列的又一方面除包含选自(1)至(4)的DNA组中的至少一组DNA之外,还包含选自下述(7)至(10)中的至少一种DNA:
(7)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(1)的DNA具有1个或多个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(8)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(2)的DNA具有1个或多个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(9)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(3)的DNA具有1个或多个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,以及
(10)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(4)的DNA具有1个或多个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
总体来说,在DNA阵列杂交试验中,样品DNA对具有一个或多个碱基错配的探针具有不同的杂交强度。因而,该类DNA阵列对于检测工业酵母基因组的核苷酸多态性是有用的。其还可用于筛选有用的工业酵母菌株或筛选其自身 的有用的基因的方法中。
在一个优选的实施方式中,(7)至(10)的DNA仅包含有一个碱基的错配。也就是说,(7)至(10)的DNA分别为下述的(7-1)至(10-1)的DNA。
(7-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(1)的DNA具有1个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(8-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(2)的DNA具有1个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(9-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(3)的DNA具有1个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,以及
(10-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列包含与(4)的DNA具有1个碱基的错配,或为与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
优选地,一个碱基的错配位于每个DNA的中央或靠近中央。
本发明DNA阵列的最优选实施方案之一包含选自(1)至(4)中的至少一组DNA(优选(1)和/或(2)组)中的任意一组DNA、包含选自(7)至(10)中的至少一组(优选(7)和/或(8)组)中的DNA、包含(5)和/或(6)组中的DNA以及(5′)和/或(6′)组中的DNA。本实施方式的DNA阵列在本发明的鉴别工业酵母的方法中是特别有用的,并且在本说明书下文讨论的通过基于DNA阵列的比较基因组杂交来对工业酵母的染色体结构进行分析的方法中也是有用的。优选地,至少一组DNA选自(7)至(10),并且(5′)和/或(6′)的DNA仅有一个碱基错配。
与本发明的DNA阵列相连接的探针可以为cDNA探针或寡聚核苷酸。cDNA探针的长度没有特别限定,优选为不长于1000个碱基。寡聚核苷酸探针的长度在5至50个核苷酸的范围内,优选为10-30个核苷酸。
本发明DNA阵列的制备
本发明的DNA阵列可以基于上述(f)中获得的ORF和/或非编码区域(两个ORF之间的基因间DNA序列)进行制备。其示例包括下述DNA阵列:其含有固相支持物,至少一种含有上述(f)中获得的DNA序列的多聚核苷酸固定于其上。
本发明的DNA阵列包括本领域技术人员已知的基底,例如DNA微阵列、DNA芯片、多聚核苷酸阵列以及DNA膜阵列(macroarray)等,其包含固相支持物以及与固相支持物的表面相附着的多个片断化的多聚核苷酸。作为附着于固相支持物的多聚核苷酸或寡聚核苷酸,可以使用在上述(f)和(h)中获得的本发明 的多聚核苷酸或寡聚核苷酸。
下述的分析可通过将多聚核苷酸或寡聚核苷酸以高密度附着于所述固相支持物来有效进行,尽管高附着密度并非总是必须的。诸如阵列机器人等用于取得高密度效果的仪器可从TAKARA BIO INC.(GMS417阵列仪)进行商购,可使用这种商购获得的仪器。也可通过照相平板印刷技术法等将本发明的寡聚核苷酸直接合成于固相支持物上(Nat.Genet.21,20-24(1999))。在该方法中,首先将具有可通过光照射除去的保护基团的连接子(linker)附着于盖玻片等固相支持物上。然后通过掩模(光刻掩模)用光对其进行照射,使的附着部位中仅一定的位置能得到照射。然后,将具有可通过光照射除去的保护基团的寡聚核苷酸加入到该位置。由此使得以核苷酸进行的连接反应仅发生在照射位置。
通过重复该过程,可分别在各位置合成各自具有所需序列且彼此互不相同的寡聚核苷酸。通常,可合成含有10至30个核苷酸长度的寡聚核苷酸。
作为选择,也可以使用基于由工业酵母获得的mRNA的核苷酸序列通过任意已知的常规方法制得的cDNA探针。cDNA探针制备完成后,将其固定至DNA阵列上。制备cDNA以及将cDNA探针固定至DNA阵列上的常规实例如″Sciencevolume270,467-470页(1995)″中所述。
用于制备DNA阵列的方法并无特殊限制,其可通过已知方式来进行,下文对其优选方法分别进行描述。
(1)DNA阵列的制备
(1)-1固相支持物
其表面可附着有多聚核苷酸或其片断的任意材料均可用作本发明中的固相支持物。对于用作固相支持物的材料及形状并无特殊限制,而其中优选的材料为一些树脂状物质,例如聚碳酸酯、塑料等,将其制成盘状或膜状的固态物质。
(1)-2寡聚核苷酸的选择
在本发明中,固定于DNA阵列盘的寡聚核苷酸的示例如下所示。基于上述(h)中获得ORF的DNA序列和/或由上述(h)所推断出的基因间DNA序列,可以利用诸如(Affymetrix)技术等某一探针制造方法来设计针对酿造酵母的基因组序列的独特的、完全互补探针(PM探针;完全互补探针(Perfect MatchProbe))。
寡聚核苷酸探针的长度为约5至约100个核苷酸,优选为约5至约80个核苷酸,更优选为约5至约60个核苷酸,进一步优选为约5至约50个核苷酸,更进一步优选为约5至约45个核苷酸,再进一步优选为约10至约40个核苷酸,最优选为约10至约30个核苷酸。
特别优选的阵列含有长度为约20至约25个寡核苷酸的探针。所述阵列可以含有多于10个寡聚核苷酸的探针、优选多于50个寡聚核苷酸的探针、更优选多于100个寡聚核苷酸的探针、最有选多于1000个寡聚核苷酸的探针,所述寡聚核苷酸的探针对每一目的基因具有特异性(所述阵列指的是利用诸如 (Affymetrix)技术等用于探针制造的某一方法固定有制造的寡聚核苷酸探针的DNA阵列)。在一个优选实施方式中,所述阵列针对每一基因包含至少10个不同的寡聚核苷酸探针。在另一优选实施方式中,所述阵列中与每一基因互补的寡聚核苷酸具有20个或更少个。
如上所述,诸如下层发酵酵母(S.pastorianus)等广泛使用的工业酵母被认为是Saccharomyces cerevisiae与其密切关联的种(例如S.bayanus)的天然杂种。因此下层发酵酵母具有至少两种DNA序列彼此类似的不同基因。因此,优选除去与多于一种的基因的转录产物发生杂交的探针。可以除去任意的与其它任意基因相似的探针,并利用诸如(Affymetrix)技术等探针制备的某一方法来制备针对所述基因的探针组。
该阵列可以进一步包含错配对照探针。当存在有该类错配对照探针时,定量步骤中可以包含对每一寡聚核苷酸探针及其相应的错配对照探针之间的杂交信号强度的差别所进行的计算。所述定量可以进一步包含对每一寡聚核苷酸探针及其相应的错配控制探针之间的杂交信号强度的平均差别所进行的计算。术语错配探针指的是将其序列特意选择为与特定目标序列未进行完全互补的探针。通常对于在高密度阵列上的每一错配(MM)对照,存在有与该相同的特定目标序列具有完全互补性的相应的完全互补(PM)探针。该错配可以含有一个或多个碱基,优选为一个碱基。
尽管错配可以位于错配探针的任意位置,但相对不优选末端错配,这是由于末端错配通常不易抑制目标序列的杂交。在一优选实施方式中,所述错配位于探针的中部或靠近探针的中部,由此使得错配在最佳的杂交条件下更容易使目标序列的双链不稳定。优选地,所述错配为腺嘌呤(A)变为胸腺嘧啶(T)以及胸 腺嘧啶(T)变为腺嘌呤(A),或者鸟嘌呤(G)变为胞嘧啶(C)或胞嘧啶(C)变为鸟嘌呤(G)。
这些寡聚核苷酸的核苷酸数目并无限制,优选为10至30个核苷酸。可以针对每一基因座的3’引物侧为每一基因座设计8-51个探针,这是由于针对每一基因座使用的探针组可以在检测和数据分析中提供冗余性(redundancy)、可以减少偶然发生的交叉杂交所致的潜在的混淆效果,且为获得定量信息,所有探针无需杂交同一性。
为进一步增加检测的敏感性和特异性,可由密切相关的错配探针(MM探针)对每一PM探针进行设计,所述MM探针除了在错配碱基即碱基13有所差别外,其余均相同。用于本发明的寡聚核苷酸的优选长度为25个碱基,但并不特别限于该长度的寡聚核苷酸。优选地,所述错配为腺嘌呤(A)变为胸腺嘧啶(T)以及胸腺嘧啶(T)变为腺嘌呤(A),或者鸟嘌呤(G)变为胞嘧啶(C)或胞嘧啶(C)变为鸟嘌呤(G)。
(1)-3将寡聚核苷酸附着于固相支持物上
将寡聚核苷酸附着于固相支持物的方法并无特殊限定,可以根据已知方式来进行该方法,而优选方法如下所述。例如,可利用诸如
Figure S05837204120070429D00038150052QIETU
技术等某一方法将按照上述((1)-2)中设计的所有的PM和MM探针附着于固相支持物的表面,以制备DNA阵列。
用于DNA微阵列分析的方法并无特殊限制,其优选方法如下所述,即,以基因表达分析来鉴定在某些情况下表现出特征性的表达特性的基因、对工业菌株进行鉴定、鉴别核苷酸的多态性以及选择用于功能性分析的基因的示例如下所述。
III.使用DNA阵列的分析方法
本发明的阵列可用于对工业酵母的基因组DNA、cDNA或cRNA进行分析的多种方法中。所述分析方法例如包括:1)确定non-Sc型的每一基因的表达的方法;2)对工业酵母进行鉴定的方法;3)对工业酵母基因组的核苷酸多态性进行检测的方法;4)对工业酵母的有用菌株进行筛选的方法;以及5)对工业酵母的基因进行筛选的方法。
(m)基因表达分析
工业酵母的基因表达分析可利用按上述(1)中描述的方法制备的本发明的 DNA阵列来进行。通过培养基的变化以及利用DNA阵列环境的变化可以鉴别高诱导性基因以及高减并性基因(highly reducible gene)。利用DNA阵列还可对发酵中的啤酒发酵酵母的特异性基因进行鉴别。但并不限于上述示例。
基因表达分析包括工业酵母的培养、mRNA的制备、标记的cRNA(或cDNA)的合成、杂交、以及数据分析。对于基因表达的方法并无特别限定,其每一个的优选方法如下所述。
(m)-1在多种条件下培养工业酵母
可以在多种条件下对工业酵母进行培养以使之用于任意目的。例如,用于鉴定对培养基组分的变化发生反应的基因的培养可按下述方法进行。工业酵母可在富锌培养基(例如LZMM培养基+40μM硫酸锌)中于30℃振摇培养过夜。LZMM培养基含有0.17%酵母氮源w/o氨基酸(DIFCO制)、0.5%硫酸铵、20mM柠檬酸钠(pH4.2)、125μM MnCl2、10μM FeCl2、2%麦芽糖、10mM EDTA(pH8.0)等。收集细胞并以无菌蒸馏水洗涤三次。将光学密度(OD600)为0.25等的适量细胞接种至:1)乏锌培养基(LZMM培养基)等、2)富锌培养基(LZMM培养基+40μM硫酸锌)等、3)氧化应激培养基(LZMM+40μM硫酸锌+2mM H2O2)等、4)碳饥饿培养基(从上述LZMM培养基去除麦芽糖+40μM硫酸锌)等。细胞在30℃生长6小时然后收集,用于RNA制备。从在啤酒发酵条件下进行发酵的发酵管中取出的细胞可被用于下述实验。
(m)-2mRNA的制备
每种细胞中的总RNA的制备可利用
Figure S05837204120070429D000391
Mini Kit(QIAGEN制)等按照操作手册来进行。每种总RNA中的Poly(A)+mRNA的制备可利用OligotexDirect mRNA试剂盒(QIAGEN制)等按照操作手册来进行。用于制备mRNA的方法没有特别限制,该方法可以按照已知手段来进行。
(m)-3标记cRNA的合成
标记cRNA的合成可利用BioArray HighYield RNA Transcript LabelingKit(Affymetrix制)等按照操作手册来进行。可使用生物素作为标记物。用于合成标记cRNA的方法没有特别限定,该方法可以按照已知手段来进行。
(m)-4杂交
将5μg的生物素标记cRNA、1.7μl的3nM对照寡聚核苷酸B2(Affymetrix制)、5μl的20X真核细胞杂交对照(Affymetrix制)、1μl的10mg/ml鲱精 DNA(Affymetrix制)、1μl的50mg/ml乙酰化BSA(Affymetrix制)、50μl的2X杂交缓冲液(Affymetrix制)与水(Affymetrix制)进行混合,以使终体积为100μl,并按照Affymetrix的技术手册杂交至DNA阵列。杂交16小时后,移出杂交混合物(cocktail),以
Figure S05837204120070429D000401
Fludics Station(Affymetrix制)等洗涤DNA阵列,然后以抗生蛋白链菌素藻红蛋白即,Streptavidin Phycoerythrin(300μl的2X MES染色缓冲液(Affymetrix制)、24μl的50mg/ml乙酰化BSA(Affymetrix制)、6μl的1mg/ml Streptavidin Phycoerythrin(Affymetrix制)、270μl的DI水(Affymetrix制))按照Affymetrix的技术手册来进行染色。用于杂交的方法没有特别限定,该方法可以按照已知手段来进行。
(m)-5数据分析
DNA阵列的数据分析可利用商购软件(例如,GCOS(Affymetrix制基因芯片操作软件;Silicon Genetics制GeneSpring;TAKARA BIO INC.制ImaGene;FujiPhoto Film制Array Gauge;Amersham Pharmacia Biotech制ImageQuant;等等)按照技术手册来进行。可对具有特征性表达特性的基因进行鉴别和选择以进行功能分析。
此外,所鉴定的基因可被用作确定酵母细胞状况的基因标记物。特定基因表达水平的波动可将培养时间曲线中获得的核酸分子作为来自酿造酵母的核酸分子来进行监测。可通过分析波动来确定最佳培养条件。酿造酵母在总基因水平的表达特性(即,在由基因组编码的大量基因中被表达的基因及其表达比率)可利用具有从酵母的基因组序列确定的多种基因的序列的核酸分子来确定。因此,能够对由基因组序列确定的基因的表达水平进行分析,反过来,能够将酵母生物状态视作全基因水平的表达模式。
作为基因表达分析的结果,将在某一条件下表现出差异性表达的一组基因作为进一步进行功能性分析的目标基因。“某一条件”可以包括诸如温度、pH或渗透压等环境变化以及培养基组分的变化,但并不限于此。作为对在某一条件下表现出差异性表达的基因的筛选方法,例如可选择根据环境变化可识别出基因表达的明显变化的基因。“明显变化”优选意味着高至1.5倍或低至2/3或更低,更优选意味着高至2倍或低至1/2或更低,进一步优选意味着高至3倍或低至1/3或更低,但并不限于此。
用于对数据进行分析的方法并无特别限制,所述方法可以按照已知手段来 进行。
比较杂交分析
本发明的DNA阵列也可用于以基因组DNA、cDNA或cRNA作为杂交模板的比较杂交分析中。
(n)工业酵母的鉴定
本发明的一个实施方式包括对工业酵母进行鉴定的方法,所述方法包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与本发明的DNA阵列进行杂交;以及
(b)计算与(1)至(4)的任一组中的DNA的杂交率,并计算与(5)和/和(6)组中的DNA的杂交率。
为实现本实施方式的目的,优选所使用的DNA阵列除包含选自(1)至(4)的DNA组中的任意一种DNA之外,优选进一步包含(5)和/或(6)组中的DNA(方式15或16)。
优选对与(1)中的DNA的杂交强度和与(5)中的DNA的杂交强度进行比较。或者,对与(2)中的DNA的杂交强度和与(6)中的DNA的杂交强度进行比较。
本发明的DNA阵列可任选包含分别与(5)和/或(6)中和/或(1)和/或(2)中的DNA具有一个或多个错配的(5’)和/或(6’)和/或(7)和/或(8)的DNA。(5’)和/或(6’)和/或(7)和/或(8)的DNA可任选被用作本发明DNA阵列的DNA探针,以确定或证实样品分别与(5)和/或(6)中和/或(1)和/或(2)中的DNA的杂交特异性。
特异地,在本发明的一个优选方式中,所述DNA阵列包含:选自(1)至(4)(优选为(1)和/或(2))的DNA组中的至少一组DNA、选自(7)至(10)(优选为(7)和/或(8))中的至少一组DNA、(5)和/或(6)中的DNA、以及(5’)和/或(6’)中的DNA。在使用上述DNA阵列的方法中,将与(1)和/或(2)中的DNA杂交的基因的百分比确定为与(1)至(4)中任意一组中的DNA的杂交率,而并非将与(7)和/或(8)中的DNA杂交的基因的百分比确定为与(1)至(4)中任意一组的DNA的杂交率;将与(5)和/或(6)中的DNA杂交的基因的百分比确定为与(5)和/或(6)中任意一项的杂交率,而并非将与(5’)和/或(6’)中的DNA杂交的基因的百分比确定为与(5)和/或(6)中任意一项的杂交率。
可以利用上述DNA阵列对工业酵母进行鉴定。可如上所述制备酵母基因组并与DNA阵列进行杂交。利用Affymetrix制的基因芯片分析基础系统以及分析 软件(GCOS;基因芯片操作软件1.0)对阵列的信号强度进行检测。计算出与工业酵母的DNA发生杂交的探针的百分比。由计算结果评估出衍生DNA阵列中DNA探针的菌株(例如34/70)与受试菌株之间的同一性。
工业酵母菌株可基于同一性进行鉴定。若工业酵母菌株在DNA阵列上与non-Sc基因和Sc基因的杂交百分比与另一菌株类似,则可将该工业酵母菌株被鉴定为所述另一菌株的类似菌株。
(o)核苷酸多态性的检测
本发明的一个实施方式涉及对工业酵母基因组中的核苷酸多态性进行检测的方法,所述方法包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与本发明中的DNA阵列进行杂交;以及
(b)选择对(7)至(10)任一组中的DNA的杂交强度高于对(1)至(4)任一组中的DNA的杂交强度的基因。
为实现本实施方式的目的,优选所使用的DNA阵列除包含选自(1)至(4)的DNA组中的任意一种DNA之外,还进一步包含选自(7)至(10)任意一组中DNA的DNA(方式17-19)。
可以通过与上述DNA阵列的比较基因组杂交来检测工业酵母的核苷酸多态性。对于本实施方式,阵列上的探针优选为寡聚核苷酸探针。
作为说明性示例,每一探针的寡聚核苷酸组由与34/70菌株序列相同的完全互补(PM)寡聚核苷酸和在例如寡聚核苷酸的中央位置具有一个碱基错配的错配核苷酸(MM)组成。可以由基因在MM中的信号强度高于(例如,大于5倍)在PM中的信号强度来检测核苷酸的多态性。
含有一个或多个错配的基因可以作为用于进行进一步功能性分析的目标基因的优选候选物。
(p)有用的酵母菌株及基因的选择
本发明的一个实施方式包括筛选工业酵母的有用菌株的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与本发明的DNA阵列进行杂交;以及
(b)当所述菌株满足下述条件时,将其确定为有用的工业酵母菌株:所述菌株含有1种以上的、优选2种以上的杂交强度较(1)至(4)任一组中的DNA的平 均杂交强度高1.5倍、或为上述平均杂交强度的2/3以下的基因。
可以选择杂交强度与其它基因具有显著差异的基因组DNA的基因作为用于进行进一步功能性分析的有用基因的候选物。因此,可以选择含有1种以上、优选2种以上该类基因的工业酵母菌株作为有用菌株的候选物。优选地,该类基因的杂交强度与其它基因的杂交强度具有显著差别,更优选地,其杂交强度较(1)和/或(2)中的DNA的平均杂交强度高1.5倍、或为上述平均杂交强度的2/3以下。更优选地,所述杂交强度的差别为高于2倍或为1/2以下,进一步优选为高于3倍或为1/3以下,但是并不限于此。
本发明进一步的实施方式为筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母菌株制备的基因组DNA与本发明的DNA阵列进行杂交;以及
(b)筛选杂交强度较(1)至(4)任一组中的DNA的平均杂交强度高1.5倍、或为上述平均杂交强度的2/3以下的基因。
本发明的另一实施方式为筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a-1)将由工业酵母制备的基因组DNA、cDNA或cRNA与本发明的DNA阵列进行杂交;
(a-2)与步骤(a-1)相独立地,将由用于制备DNA阵列的工业酵母菌株所制备的基因组DNA、cDNA或cRNA与本发明的DNA阵列进行杂交;以及
(b)选择在步骤(a-1)中对(1)至(4)中的任一DNA的杂交强度与在步骤(a-2)中的杂交强度明显不同的基因。
上述筛选方法能够在菌株间选择与DNA阵列的杂交强度不同的基因。由比较基因组杂交分析的结果,具有表现出低信号强度的探针组的基因可能会丢失,或与用作阵列的探针的菌株(例如34/70)具有不同的序列。与之相对,具有表现出高信号强度的探针组的基因的拷贝数目可能会很高。例如,对于一个基因来说,在步骤(a-1)中表现出相对于步骤(a-2)中用于制备DNA阵列的菌株为2倍高的杂交强度的基因可能具有2个以上该基因的拷贝。
本发明的又一实施方式涉及筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a-1)将由工业酵母制备的cDNA或cRNA与本发明的DNA阵列进行杂交;
(a-2)与步骤(a-1)相独立地,将由另外的工业酵母制备的cDNA或cRNA与方式10-19中任意一项所述的DNA阵列进行杂交,其中(a-2)步骤中所述的工业 酵母与(a-1)步骤中所述的工业酵母在不同的培养条件下进行培养;以及
(b)筛选在步骤(a-1)中对(1)至(4)中的任一DNA的杂交强度与在步骤(a-2)中的杂交强度明显不同的基因。
上述筛选方法能够选择基因表达可由于培养条件的不同而发生改变的基因。“在不同条件下培养的工业酵母”例如包括在不同培养基中或不同温度下培养的酵母,或在酒精或酒精饮料的制备过程中的连续取样样品。
通过本发明的多种筛选方法获得的基因可用于进一步进行功能性分析,这是由于杂交强度的不同可归因于菌株间发酵特性的不同。通过上述方法检测出具有核苷酸多态性的基因也可选择用于功能性分析。
作为另一替代方式,本发明的DNA阵列可用于通过基于DNA阵列的比较基因组杂交来分析工业酵母的染色体结构。下面的描述为采用DNA阵列进行染色体结构分析的一个示例。
酵母基因组DNA是利用Quiagen Genomic Tip100/G(#10243)和QiagenGenomic DNA Buffer Set(#19060)按照试剂盒所附的手册来进行制备的。按照Winzeler等(Science,281卷,1194-1197页(1998))中的方法将DNA(10μg)以DNaseI(Invitrogen制)进行消化,利用末端转移酶(Roche制)进行生物素化,并杂交至DNA阵列(Affymetrix基因芯片酵母基因组S98阵列)。本发明的DNA阵列可以包括来自non-Sc型基因的(1)至(4)以及(7)至(10)中的任意一种DNA,并包括来自Sc型基因的(5)和/或(6)和/或(5’)和/或(6’)中的任意一种DNA。利用Affymetrix制的基因芯片分析基础系统和分析软件(GCOS;基因芯片操作软件1.0)来进行DNA阵列的杂交以及信号强度的检测。
利用电子制表软件程序(Microsoft Excel2000)将与酿造酵母的DNA杂交的探针的信号按照每一染色体中的基因序列进行排列,并将信号以棒图显示。Sc型基因不与non-Sc型DNA探针杂交(即(1)至(4)的DNA)。反过来,non-Sc型基因不与Sc型DNA探针杂交(即(5)和/或(6)的DNA)。因而,Sc型DNA和/或non-Sc型DNA的基因量对信号有影响,信号表现出明显变化的点被认为是Sc型和non-Sc型染色体的易位位点。在一个优选的实施方式中,与(1)至(4)中的任意一个的DNA的杂交可通过与(1)和/或(2)的DNA的杂交来确定,而不通过与(7)和/或(8)的DNA的杂交来确定;与(5)和/或(6)的DNA的杂交可通过通过与(5)和/或(6)的DNA的杂交来确定,而不通过与(5’)和/或(6’)的DNA的杂交来确定。
IV.基因和多肽
本发明进一步提供通过本发明的分析方法和筛选方法获得的non-Sc型基因。优选地,本发明的基因在酒精或酒精饮料的生产中与增加产率和/或提高口味相关。例如,本发明的基因的优选特征在于,当该基因在工业酵母中表达时,该酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度有所增加。
本发明还提供由所述基因编码的多肽或蛋白质。本发明的多肽可通过已知常规方法获得,所述方法包括利用遗传工程对基因进行表达、或通过多肽合成技术进行制备等。
本发明的基因可以包括ORF以及非编码区域(非ORF区域)。“基因”包括DNA,cDNA,mRNA,cRNA,但不限于此。本发明的基因可通过任意已知的常规方法来制备,例如,通过cDNA文库的筛选、或通过多核苷酸合成技术来进行制备。在本说明书中,术语“核酸”与“基因”可互换使用。在下文的说明中,将“DNA”解释为基因的示例。
对于可通过本发明方法获得的DNA,可以举出:上述获得的含有non-Sc型基因的DNA序列的DNA、在严格条件下与所述DNA杂交的DNA、以及编码实质上具有相同生物学活性的蛋白质的DNA。
由本发明方法获得的DNA非限制性地包括单链和双链DNA。与上述获得的含有non-Sc型基因的DNA序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA例如包括由所述基因编码的蛋白的密码子发生简并性的突变体。简并性突变体表示,尽管其与本发明所选择的non-Sc型DNA序列不同,但由于密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的多聚核苷酸片断。
作为示例,本发明的基因包括编码下述i)和ii)中的任意一种多肽的核酸:
i)具有由序列号3所表示的氨基酸序列的多肽,以及
ii)具有下述氨基酸序列的多肽:所述氨基酸序列为由序列号3所表示的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代和/或在由序列号3所表示的氨基酸序列中插入1个或多个氨基酸残基而成的序列,
当所述基因在工业酵母中表达时,该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
更优选地,本发明的核酸选自下述(a)和(b):
(a)具有序列号1所表示的核苷酸序列的核酸,以及
(b)具有在严格条件下与由序列号1所表示的核苷酸序列具有互补性的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列的核酸,该核酸编码具有下述活性的多肽:当所述基因在工业酵母中表达时,该工业酵母的培养基中的亚硫酸盐浓度增高。
其特异性示例为具有序列号1所示序列的DNA、在严格条件下与所述DNA进行杂交的DNA等。在严格条件下杂交的DNA表示通过克隆杂交方法、噬菌斑杂交方法、以及southern印迹杂交方法等利用带有上述鉴定的non-Sc型序列的DNA片断作为探针来制备的DNA。适宜的严格条件可如上述进行选择。
可按照“分子克隆第三版”,“分子生物学实验方法”,“DNA克隆1:核心技术,实验方法,第二版,牛津大学(1995)”等中的方法来进行杂交。
可杂交的DNA的特异性示例为与序列号1所示的DNA序列具有至少不低于60%的同一性的DNA,优选为与序列号1所示的DNA序列具有不低于80%的同一性的DNA,更优选为与序列号1所示的DNA序列具有不低于95%的同一性的DNA,所述同一性是利用FASTA,BLAST,Smith-Waterman“Meth.Enzym.,164卷,765页(1988)”等的同源性搜索软件在缺省设置(起始设置)下的参数来进行计算而确定的。
由本发明的筛选方法获得的DNA的示例为编码含有序列号3所示的氨基酸序列的多肽的DNA,或在严格条件下与所述DNA杂交的DNA。
由本发明的筛选方法获得的DNA所编码的多肽的示例为由上述获得的含有ORF的DNA序列的DNA编码的多肽以及由在严格条件下与所述DNA杂交的DNA编码的多肽、或者为含有序列号3所示的氨基酸序列的多肽。
进一步地,具有由所述氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代和/或在所述氨基酸序列中插入1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列的多肽以及与所述多肽实质上具有相同生物活性的多肽也包含在本发明的范围内。所述“与所述多肽实质上具有相同生物活性”表示与缺失、取代或插入前的多肽所具有的酶活性或功能所代表的活性具有相同的活性。所述多肽可通过“分子克隆第三版”,“分子生物学实验方法”,“Nuc.Acids.Res.,10卷,6487页(1982)”,“Proc.Natl.Acad.Sic.USA,79卷,6409页(1982)”,“Gene,34卷,315页(1985)”,“Nuc.Acids.Res.,13卷,4431页(1985)”,“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82卷,488页(1985)”中的定位突变的引入来进行制备。例如,可以通过在编码含有序列号3或4所示的氨基酸序列的多肽的DNA中引入定位突变来进行制备。对 缺失和/或取代和/或插入的氨基酸残基的数目没有特别限制,该数目在能够通过诸如上述定位突变等已知方法进行缺失和/或取代和/或插入的范围内,为1至几十,优选为1至20,更优选为1至10,进一步优选为1至5。
具有由本发明的多肽的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代和/或在所述氨基酸序列中插入1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列的多肽表示在该氨基酸序列的任意一个或多个位点的一个或多个氨基酸残基发生一个或多个缺失和/或取代和/或插入。这些缺失和/或取代和/或插入可以同时发生,并且取代或插入的氨基酸残基可以为天然存在型氨基酸残基,也可为非天然存在型氨基酸残基。天然型氨基酸残基的示例有L-丙氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-谷氨酰胺,L-谷氨酸,甘氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-蛋氨酸,L-苯丙氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸,L-色氨酸,L-酪氨酸,L-缬氨酸和L-半胱氨酸等。
下面将示出能够彼此取代的氨基酸残基。同一组中的氨基酸残基能够彼此取代(保守取代)。
组A:亮氨酸,异亮氨酸,正亮氨酸,缬氨酸,正缬氨酸,丙氨酸,2-氨基丁酸,蛋氨酸,O-甲基丝氨酸,叔丁基甘氨酸,叔丁基丙氨酸以及环己基丙氨酸。
组B:天冬氨酸,谷氨酸,异天冬氨酸,异谷氨酸,2-氨基己二酸和2-氨基辛二酸。
组C:天冬酰胺和谷胺酰胺。
组D:赖氨酸,精氨酸,鸟氨酸,2,4-二氨基丁酸和2,3-二氨基丙酸。
组E:脯氨酸,3-羟基脯氨酸和4-羟基脯氨酸。
组F:丝氨酸,苏氨酸和高丝氨酸。
组G:苯丙氨酸和酪氨酸。
为了使所得突变多肽具有与突变前的多肽具有实质上相同的活性,优选突变的氨基酸序列与突变前的氨基酸序列具有具有至少不低于60%的同一性,通常更优选具有不低于80%的同一性,或特别优选具有不低于95%的同一性,所述同一性是利用BLAST和FASTA等分析软件在缺省设置(起始设置)参数来进行计算而确定的。两个氨基酸序列间的同一性可如上确定。
可以通过诸如Fmoc法(芴基甲氧基羰基法),tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成方法来制备本发明的多肽。进一步还可以使用Advanced ChemTech, Perkin-Elmer,Pharmacia,Protein TechnologyInstrument,Synthecell-Vega,PerSeptive,Shimadzu等制备的肽合成仪来进行化学合成。
当使用本发明的方法时,可以确定工业酵母的基因组序列、鉴别工业酵母的有用基因、并确定所述基因的功能。许多情况下当工业酵母的基因在工业上有用、并且当所述基因基于所确定的功能进行鉴定时,酵母的特性得到阐明,并且可获得工业酵母用于酿造的珍贵信息。例如,当工业酵母为酿造酵母时,则鉴定出在酒精或酒精饮料中与提高产率和改善口味相关的基因,如果所述基因不利于提高产率或改善口味,则通过基因破坏或反义方法或RNAi方法(例如参见非专利文献10)抑制该基因的表达;因此可培养具有优异的酿造特性的酵母。如果所述基因在增加产率、改善口味等方面具有优异特性,则例如基因可在酵母中过表达;由此可培养在工业上有用的具有优异酿造特性的酿造酵母。
由本发明方法获得的基因用于培养有用的酵母的示例如下所述。
如上所述,当产物中的亚硫酸盐的浓度增加,则可以制备具有优异口味稳定性的产品。因此,如果通过本发明方法筛选方法获得的基因具有使亚硫酸盐产生并流出的作用,则可以培养转化株并使所述基因表达,进而使产物中的亚硫酸盐浓度得到提高,所以使产物具有优异的口味稳定性。
已知下层发酵酵母将硫酸根离子(SO4 2-)运送至细胞外并还原为亚硫酸根离子(SO3 2-)。然而,亚硫酸盐抑制甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性,并降低胞内ATP的浓度,因此,酵母具有放出亚硫酸盐以使得细胞内不会蓄积过量亚硫酸盐的功能。SSU1已经得到分离,其显示出补足亚硫酸盐敏感性的突变(例如参见非专利文献11)SSU1基因产品含有485个氨基酸残基,结构分析结果表明其为9-10次跨膜结构域的运输子(例如,参见非专利文献12)。进一步地,作为采用SSU1过表达菌株的试验结果,已经证实了SSU1基因产品影响亚硫酸盐的释放(例如,参见非专利文献13)。
下层发酵酵母通常具有很高的亚硫酸盐产生能力,而上层发酵酵母几乎不产生亚硫酸盐。通过采用本发明的筛选方法,除能够选择存在于上层发酵酵母和下层发酵酵母中的ScSSU1基因外,还能够选择对下层发酵酵母特异性的non-ScSSU1基因。
non-ScSSU1基因4得到强化的酵母的培育方法在下文的实施例中进行详细描述。
V.重组载体、转化株以及其它实施方式
本发明进一步包括下述实施方式:
含有本发明基因的重组载体。
含有所述重组载体的转化株。所述转化株优选为Saccharomyces属酵母。
制备酒精或酒精饮料的方法,所述方法使用本发明的转化株。优选地,本发明的方法可以包含在含糖培养基中培养本发明的转化株。所述含糖培养基优选选自由麦芽汁、葡萄汁、稻米汁以及葡萄糖浆和/或麦芽糖浆组成的组中。
适于制备酒精或酒精饮料的酵母的培养方法,该方法的特征在于,控制本发明的基因或核酸的表达。优选所述酵母属于genus Saccharomyces。
通过本发明培育方法获得的酵母。
用于制备酒精或酒精饮料的方法,该方法使用本发明的酵母。
一种酒精或酒精饮料,其通过本发明的制备方法进行制备。
对于将通过本发明的筛选方法所选择的基因引入作为宿主的酵母并无特别限制,只要所述酵母可用于酿造即可,也可使用目前广泛用作酿造酵母的任意酵母,所述酵母例如为包括NCYC456,NBRC1951,NBRC1952,NBRC1953和NBRC1954的啤酒酵母、威士忌酵母(例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90)、葡萄酒酵母(例如葡萄酒酵母Kyokai No.1,No.3,No.4等)、以及清酒酵母(例如清酒酵母Kyokai No.7,No.9等)。
对于将基因引入上述宿主的载体并无特别限制,只要其为能够在酵母中表达基因的载体即可,可以使用多拷贝质粒(Yep型)、单拷贝质粒(Ycp型)染色体DNA-整合质粒(YIp型)。Yep质粒的代表为YEp51(J.R.Broach,et al.,Experimental Manipulation of Gene Expression,Academic Press,New York,83,1983)等;YCp质粒的代表为YCp50(M.D.Rose,et al.,Gene,60卷,237页,1987)等;YIp质粒的代表为YIp5(K.Struhl,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76卷,1035页,1979)等。这些之列已经投入市场并可容易地获得。
上述载体可以具有用于控制酵母中基因表达的其它序列,所述基因例如为启动子、操纵子、增强子、沉默子、核糖体结合序列、终止子等。对于用于基因的组成性表达的启动子和终止子,可以使用任意的组合,只要其在酿造酵母中能够发挥作用并与产物中的亚硫酸盐浓度无关即可。例如对于启动子,可以使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)基因的启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的 启动子等。这些启动子为已知启动子,例如,PGK1基因在诸如M.F.Tuite,et al.,EMBO J.,1卷,603页(1982)等公知文献中被详细述及,并且可以很容易地获得。
用于调节所引入的基因的表达的上述其它序列不必由载体特别提供,只要通过本发明筛选方法获得的DNA中包含它们即可。当上述其它序列并未包含在所述DNA中时,优选单独制备该其它序列并将其连接到所述DNA上。或者,即使在需要高表达水平或需要对表达进行特异性调节时,也可将其它适于该目的的序列连接到所述DNA上。
将上述载体转化至宿主中的方法可以按照已知方法来进行。例如,可是用下述方法:电穿孔法“Meth.Enzym.,194卷,182页(1991)”,原生质球法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75卷,1929页(1978)”,醋酸锂法“J.Bacteriology,153卷,163页(1983)”,“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75卷,1929页(1978)”中所提及的方法等。
更特异地,在标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering,1卷,Plenum Press,New York,117(1979)”等)对宿主进行培养,以使600nm处的吸光值为1至6。离心收集细胞,进行洗涤,并以约1M至2M浓度的碱金属离子或优选锂离子进行预处理。将细胞在30℃温育60分钟后,再与待引入的DNA(约1至20μg)一起于30℃温育60分钟。加入聚乙二醇或优选加入约4000道尔顿的聚乙二醇,使其终浓度为约20%至50%。当于30℃温育30分钟后,在约42℃对细胞进行5分钟的热处理。优选地,将细胞悬液以标准酵母营养培养基进行洗涤并置于预先确定量的新鲜标准酵母营养培养基中,然后于30℃温育约1小时。温育后,铺展到适宜的选择性培养板上。
除上述方法外,还可参考常规克隆技术“分子克隆第三版”,“酵母遗传学方法实验室手册(冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY)”等。
对于转化的选择性标记物,在酿造酵母中不能使用营养缺陷型标记物,因而,可使用G 418-抗性基因(G 418r),铜抗性基因(CUP 1)“M.Karin,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81卷,337页,(1984)”,浅蓝菌素-抗性基因(fas2m,PDR 4)“Atsushi Inogoshi,et al.,Seikagaku,64卷,660页,(1992)”,“M.Hussain,et al.,Gene,101卷,149页,(1991)”等。
本发明的酿造酵母在生长和发酵能力上与亲株并无区别。相应地,用于制备的物质、设备、制备控制等也可与常规方法完全相同,这对本发明是很重要的方面。然而,不用说,如果需要,发酵时期等条件可随不同情况而变化。例 如,当发酵酵母释放亚硫酸盐的能力得到强化并使用该酵母来制备酒精饮料时,产物中仅亚硫酸盐的含量发生变化,与使用亲株相比,在酵母的生长和发酵能力方面都没有区别。相应地,用于制备的物质、设备、制备控制等可与常规方法完全相同,在生产酒精饮料的费用方面无需提高,而该酒精饮料的亚硫酸盐含量得到提高,口味得到改善。
实施例
以下述实施例对本发明进行详细说明,但本发明并不限于下述实施例。
(实施例1)巴斯德酵母Weihenstephan34/70(下文简称为34/70菌株)的染色体DNA的制备
利用“Yeast,a practical approach(IRL Press)6.2.1(228-229页)”所提及的方法并对其进行部分改良来进行染色体DNA的制备。于30℃将细胞接种于200mL的YPD培养基(2%葡萄糖,1%酵母提取物以及2%聚胨)中并使之生长,直至培养物于660nm的吸光率为4。离心收集细胞,以缓冲液A(50mM磷酸钠,25mMEDTA以及1%(v/v)β-巯基乙醇;pH7.5)进行洗涤,并重悬于25mL的缓冲液A中。向其中加入7mg的酶解酶100T(Seikagaku Kogyo)并将混合物于37℃温和振摇60分钟。向其中加入25mL的缓冲液B(0.2M Tris-HCl,80mM EDTA和1%SDS;pH9.5),然后将混合物置于65℃保持30分钟,在冰上冷却,与12mL的5M醋酸钾相混合,进一步置于冰上保持60分钟。将所得溶液在15℃于5,000g离心10分钟。向所得上清液中加入相同体积的乙醇以沉淀DNA,然后立即将混合物在15℃于5,000g离心10分钟以收集沉淀物。将所得沉淀物以70%(v/v)乙醇洗涤,进行自然干燥,然后溶解于5mL的TE缓冲液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA;pH8.0)中,以得到粗品DNA溶液。向3.5mL该粗品DNA溶液中加入氯化铯(4.06g)和840μg的二苯甲亚胺(bisbenzimide)(Hoechst33258)并使之溶解,将混合物在25℃于100,000g离心分离17小时,然后暴露于UV光下,使DNA条带可见,由此收集较低层的条带。将所收集的DNA溶液采用以氯化铯溶液饱和的异丙醇进行萃取从而除去二苯甲亚胺(Hoechst33258)。向所收集的水性层中加入4倍体积的0.3M醋酸钠,然后进行混合。接下来向其中加入3倍体积的乙醇以沉淀DNA,然后将DNA离心分离。将所获得的DNA溶解于含有75μg/mL的Rnase的TE缓冲液中,于37℃保持5分钟,然后以酚/氯仿提 取3次,将水性层进一步以乙醇进行沉淀。将离心获得的沉淀物以70%(v/v)乙醇进行洗涤,自然干燥,溶解于TE缓冲液中,以制备染色体DNA溶液。
(实施例2)鸟枪法文库的制备
将实施例1中制备的34/70菌株的基因组溶液的浓度用TE缓冲液调节为1mg/mL。取0.1mL该溶液用Hydroshear(manufactured by GeneMachines;speed:6;cycle:20)进行处理,使基因组DNA片断化。利用DNA平端试剂盒(TAKARABIOINC.制)将基因组片断平端化,以0.8%琼脂糖凝胶电泳进行分离。将1.5至2.5kb的基因组片断从凝胶上切离,洗脱出DNA。将洗脱出的DNA以酚/氯仿进行处理,并以乙醇进行沉淀,得到基因组文库插入物(insert)。将上述所有插入物与0.5μg的pUC 18SmaI/BAP(Amersham Biosciences制)利用T4连接酶(TAKARABIO INC.制)于15℃连接15小时。
将连接反应的产物用乙醇进行沉淀并溶解于10μL的TE缓冲液中。利用电穿孔法在所附操作手册所提及的条件下将连接溶液(1μL)插入至40μL的大肠杆菌(Escherichia coli)Electro细胞DH5α(TAKARA BIO INC.制)中。将所得产物铺展到含有1.6%琼脂糖的LB平板培养基上(LB培养基(1%细菌用胰蛋白胨,0.5%酵母提取物以及1%氯化钠;pH 7.0))并于37℃温育过夜,该培养基中含有0.1mg/mL的氨苄青霉素、0.1mg/mL的X-gal、以及1mmol/L的异丙醇-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。
将由上述平板培养基上形成的克隆所获得的转化株于加入了含有0.1mg/mL氨苄青霉素的50μL LB培养基的384-孔滴定板上在不振摇的条件下在37℃过夜培养。然后向其中加入50uL的50%甘油水溶液,随后进行搅拌,将所得混合物用作甘油贮藏母液。
(实施例3)粘粒文库的制备
将约0.1mg的由实施例1中获得的基因组DNA以Sau3AI(TAKARA BIOINC.制)部分消化。按照操作手册将该片断插入至Super Cos I载体(Stratagene制)的BamHI位点。将利用该方法制备的连接产物利用Gigapack III Gold(Stratagene制)进行包装(packaging)并按照操作手册引入至Escherichia coli XL 1-Blue MR菌株(Stratagene制)中。将其铺展到含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基上 并于37℃培养过夜。将所得转化株利用96孔滴定板在含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基(每孔50μL)于37℃培养过夜,然后向其中加入50μL的50%甘油溶液,随后进行搅拌,将所得混合物用作甘油贮藏母液。
(实施例4)DNA序列的确定
(4-1)DNA片断的制备
主要利用基因组鸟枪法来确定34/70菌株的基因组序列。欲利用该方法确定DNA序列的DNA片断由上述实施例2中制备的鸟枪法文库通过PCR法进行制备。更特异地说,利用复制因子(replicator,Gene Solution制)将来源于基因组鸟枪法文库的克隆接种至384孔滴定培养板上并在不振摇的条件下于37℃过夜培养,所述培养板的每孔中加入了50μL含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基。利用复制因子(replicator,Gene Solution制)将培养液体转移至含有10μL的PCR用反应混合物(TaKaRa Ex Taq,TAKARA BIO INC.制)的384孔反应板(AB Gene制)上,按照Makino等“DNA Research,5卷,1至9页(1998)”的实验方案利用GeneAmpPCR系统9700(Applied Biosystems制)进行PCR,以扩增插入的片断。随后,利用PCR产物纯化试剂盒(Amersham Bioscience制)除去过量的引物和核苷酸,利用该样品作为模板,进行测序反应。
利用下述方法制备来自上述实施例3的粘粒文库的DNA片断。即,将来自粘粒文库的克隆接种至96孔板的每一孔中,并于30℃振摇培养过夜,所述96孔板的每一孔中加入了1.0mL含有50μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基(1.6%细菌用胰蛋白胨,0.1%酵母提取物和0.5%氯化钠;pH7.0)。利用KURABOPI-1100自动DNA分离系统(KURABO制)按照KURABO的手册由所述培养物制备质粒DNA,并将其用作测序反应的模板。
(4-2)测序反应
如下制备测序反应混合物。将上述(4-1)中制备的PCR产物或粘粒DNA与约2μl的DYEnamic ET末端测序试剂盒(Amersham Bioscience制)以及适宜的引物进行混合,以得到8μl的反应混合物。对于来自鸟枪法DNA的PCR产物的测序反应,使用M13正向(M13-21)引物和M13反向(M13RV)引物(Takara Bio制);而对于粘粒DNA,使用正向引物SS-cos F.1(序列号7)和反向引物SS-cos R.1(序列号8)。引物和DNA片断的量分别为3.2pmol和50至200ng。所述反应溶液 利用GeneAmp PCR系统9700进行60个循环的染色末端测序反应(dye terminatorsequence reaction)。循环参数依照DYEnamic ET末端测序试剂盒所附的手册中的参数。样品纯化利用Multi Screen HV板(Millipore制)按照Millipore的操作手册来进行。将纯化的反应物贮藏于4℃的暗处。利用Mega BACE1000测序系统(Amersham Bioscience制)和ABI PRISM3700DNA分析仪(Applied Biosystems制)按照所附的操作手册对纯化的反应物进行分析。将由Mega BACE1000测序系统得到的332,592个序列和由3700DNA分析仪得到的13,461个序列的数据转移至server Enterprise6500(Sun Microsystems制)并保存。346,053个序列的数据相当于约7倍的基因组尺寸。
本实施例的中的PCR所用的引物列表如表3所示。
(实施例5)装配(确定多序列DNA片断的顺序的步骤)
由上述实施例4中获得的346,053个序列的DNA片断的序列信息构件基因组DNA序列的所有工作采用平台来进行。利用phred(华盛顿大学)来进行碱基识别,载体序列的masking利用Cross Match(华盛顿大学)来进行,装配利用Phrap(华盛顿大学)来进行。作为装配结果所获得的重叠群(contig)利用graphical editor consed(华盛顿大学)来进行分析。从碱基识别到装配的一系列工作一起利用consed所附的script phredPhrap来进行。
(实施例6)与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的比较数据库的制备
S.pastorianus被认为是Saccharomyces cerevisiae和与其密切相关种的天然杂种“Int.J.Syst.Bacteriol.35卷,508-511页(1985)”。因此,利用同源性搜索运算法对(4-2)中获得的粘粒DNA克隆的两末端DNA序列(含有10,044个碱基)进行与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的同源性搜索,由此确定每一DNA序列与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的同源性区域的比对结果及其同一性,以制备数据库。粘粒DNA序列与相应的Saccharomyces cerevisiae的基因组DNA序列的同一性分布如表2所示。粘粒DNA序列大致被分为与Saccharomycescerevisiae基因组DNA序列具有不低于94%同一性的DNA序列组以及与Saccharomyces cerevisiae基因组DNA序列大约为84%同一性的DNA序列组。将具有不低于94%同一性的DNA序列组称为来自Saccharomyces cerevisiae的 Sc型DNA序列,而将具有大约84%同一性的DNA序列称为来自密切相关种的基因组的non-Sc型DNA序列。类似地,制备(4-2)中获得的鸟枪法克隆两末端的DNA序列与Saccharomyces cerevisiae基因组DNA序列的比较数据库(Table1)。表1示出了3,648-粘粒克隆两末端DNA序列与Saccharomyces cerevisiae基因组DNA序列间的比较数据的示例。该表中示出了进行DNA序列确定的质粒的正向序列与反向序列与Saccharomyces cerevisiae的每一基因组DNA序列的同源性区域和同一性。
表1
Figure S05837204120070429D000551
基于由所制备的比较数据库的信息,进行Saccharomyces cerevisiae基因组序列的粘粒克隆和鸟枪法克隆的作图(图3)。此外,制备实施例5中获得的重叠群DNA序列与Saccharomyces cerevisiae基因组序列的比较数据库(表1),然后进行作图。尽管作图方式几乎与上述方法相同,如果质粒和鸟枪法克隆中的正向序列和反向序列存在于不同的重叠群中,则这些重叠群通过正向—反向连接进行收集(图4)。
(实施例7)ORF功能的鉴定和认定(assignment)
对实施例5中装配的DNA序列中的ORF(开放阅读框)进行鉴定。下面特示出其实例。利用一个已知的ORF发现程序(http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)来进行对实施例5中装配的DNA序列中的ORF(开放阅读框)的鉴定。在包括其互补序列的从启动密码子到终止密码子的不少于150个碱基长度的序列中,针对6种阅读框的ORF进行鉴定。所提取的ORF的功能的分配通过与 Saccharomyces cerevisiae的ORF的氨基酸序列进行同源性搜索来进行,所述Saccharomyces cerevisiae的ORF已经于SGD进行登记并已公开。表2为显示Saccharomyces cerevisiae中与non-Sc基因组中存在的ORF的功能认定结果相应的ORF的名称的示例。由该表左侧依次示出酿造酵母中存在的ORF的名称,多聚核苷酸中的ORF长度,多肽中的ORF的长度,由同源性搜索确定的Saccharomyces cerevisiae中的ORF的名称,同一性,基因的相符合的长度(coincided length)和功能。
(表2)
ORF名称 ORF长度(bp) ORF长度(aa) 同源基因名称 同一性(%) 相符合的长度(coincided length) (aa) 功能
nonSc-ATF2 1638 545 ATF2 71 535 酵O-乙酰转移除
nonSc-THB 1305 434 THB 94 431 转录激活因子
nonSc-FUS3 435 144 FUS3 90 139 MAP激酶
nonSc-LV5 1188 395 ILV5 97 395 乙酮醇酸还原异构酶
nonSc-MET2 1461 486 MET2 93 486 高丝氨酸O-乙酰转移酶
nonSc-MET10 3108 1035 MET10 87 1035 亚硫酸盐还原酶(NADPH)
nonSc-MET14 609 202 MET14 97 202 腺苷酰硫酸激酶
nonSc-MET16 786 261 MET16 92 261 磷酸腺苷酰硫酸还原酶
nonSc-TPI1 747 248 TPI1 96 248 磷酸丙糖异构酶
nonSc-MET3 1536 511 MET3 94 511 硫酸腺苷酰转移酶
nonSc-MET10 3108 1035 MET10 87 1035 亚硫酸盐还原酶
nonSc-SAM1 1149 382 SAM1 97 382 甲硫氨酸腺苷基转移酶
nonSc-SSU1 1377 458 SSU1 78 457 亚硫酸盐运输子
(实施例8)通过基于DNA阵列的比较基因组杂交和PCR对染色体结构进行的分析
利用Qiagen Genomic Tip100/G(#10243:Qiagen制)和Qiagen Genomic DNABuffer Set(#19060:Qiagen制)按照试剂盒所附的操作手册来从酵母中制备基因组DNA。将DNA(10μg)以DNase I(Invitrogen制)按照Winzeler等“Science,281卷,1194至1197页(1998)”的方法进行消化,利用末端转移酶(Roche制)进行生物素化,杂交至DNA阵列(Affymetrix基因芯片酵母基因组S98阵列,Affymetrix制)。利用Affymetrix制的基因芯片分析基础系统进行杂交以及阵列信号强度的检测。
利用分析软件(Microarray Suite5.0,Affymetrix制)将与34/70菌株的DNA杂交的每一探针的信号归一化至单倍体实验室酵母菌株S288C的信号,并表示为信号的对数比(2n)。利用电子数据表程序(Microsoft Exce1 2000)将信号的对数比按照每一染色体的基因顺序排列,并如图5所示以棒图表示该信号的对数比。non-Sc型基因不与Saccharomyces cerevisiae阵列杂交,因而,Sc型基因的剂量影响信号的对数比,并且信号的对数比出现明显变化的点被认为是Sc型和 non-Sc型染色体的易位位点。
基于由鸟枪法确定的34/70菌株的基因组序列,通过PCR确认嵌合染色体结构,其中对两对引物进行设计,使之所具有的DNA序列中,一侧为Sc型,而另一侧为non-Sc型(XVI-1(L)cer-95894(序列号9)/XVI-1(R)non-Sc-106302rv(序列号10)和XVI-2(L)cer-859737(序列号11)/XVI-2(R)non-Sc-864595rv(序列号12)),并将来自34/70菌株的基因组DNA用作模板。下面示出染色体XVI易位的两个示例。
利用Takara LA TaqTM及其所附的缓冲液按照所附操作手册通过Takara PCRThermal Cycler SP来进行PCR。
作为PCR的结果,通过0.8%琼脂糖凝胶电泳已经证实,预定长度的DNA片断自34/70菌株中得到扩增,而当将实验室菌株Saccharomyces cerevisiae的基因组DNA用作PCR的模板时,未检测到DNA片断的扩增。当进一步证实了DNA片断的两末端DNA序列自34/70菌株中得到扩增,则其与通过鸟枪法确定的基因组序列相一致,并确认到在该区域内发生了Sc型和non-Sc型染色体的易位。
如图6所示,由上述结果可判断出,在染色体XVI中至少存在两种染色体。利用同样的技术,可确认Sc染色体和non-Sc染色体(或其相反方面)之间的连接,或换言之,被推测存在嵌合染色体的区域得到确认到。在34/70菌株的全部染色体的至少13个位置确认到该Sc染色体和non-Sc染色体的嵌合染色体结构(图1)。作为基因组分析的结果,已经发现下层发酵酵母的染色体结构非常复杂,在34/70菌株中有至少37种染色体。
(实施例9)34/70菌株的SSU1基因的克隆
利用实施例6中获得的比较数据库来得到含有non-ScSSU1基因的鸟枪法克隆。有含有约2.4kb片断的SSS103_G08,所述片断具有non-ScSSU1ORF的全长片断,其中鸟枪法克隆的正向和反向序列与Saccharomyces cerevisiae的正向和反向序列的同一性分别为62.9%和82.9%。
SSS103-G08由基因组DNA文库中选择,然后通过PCR制备non-ScSSU1的全长序列。将 SacI-non-Sc-SSU1_for1(序列号13)和Bg1II-non-Sc-SSU1_rv1460(序列号14)的合成DNA用作引物。作为该组合的结 果,non-ScSSU1的碱基数1至1460得到扩增,从而获得约1.5kb的SacI-Bg1II片断。
对于ScSSU1基因,使用基于SGD的信息设计的引物对,以34/70菌株的基因组DNA作为模板,通过PCR获得其全长基因。SacI-ScSSU1_for1(序列号15)和Bg1II-ScSSU1_rv1406(序列号16)的合成DNA被用作引物。作为该组合的结果,ScSSU1基因的碱基数1至1406得到扩增,得到约1.4kb的SacI-Bg1II片断。
将如上获得的ScSSU1和non-ScSSU1基因利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)插入至试剂盒所附的pCR2.1-TOPO载体中,并分别将其命名为TOPO/ScSSU1和TOPO/non-ScSSU1。利用Sanger“F.Sanger,Science,214卷,1215页,1981”的方法来确认所得的ScSSU1和non-ScSSU1基因的序列(图10)。
(实施例10)每一SSU1基因的破坏
根据文献“Goldstein等,Yeast,15卷,1541页(1999)”中所提及的方法,利用含有抗药性标记物(pFA6a(G418r),pAG25(nat1))的质粒作为模板,通过PCR来制备用于基因破坏的DNA片断。作为PCR的引物,对于non-ScSSU1基因的破坏,使用non-Sc-SSU1_for(序列号17)/non-Sc-SSU1_rv(序列号18);而对于ScSSU1基因的破坏,使用ScSSU1_for(序列号19)/ScSSU1_rv(序列号20)。对于non-ScSSU1基因的破坏,进一步使用质粒pPGAPAUR(AUR1-C)和引物non-Sc-SSU1_for+pGAPAUR(序列号21)/non-Sc-SSU1_rv+AURI-C(序列号22)。同样地,对于ScSSU1和non-ScSSU1基因的破坏,分别制备两种和三种的DNA片断。
利用上述方法中制备的用于基因破坏的DNA片断来转化下层发酵酵母BH96。利用日本专利公开公报No.H07/303,475中所提及的方法来进行转化,药物的浓度为:遗传霉素为300mg/L,诺尔丝菌素为50mg/L,金担子素A为1mg/L。
对于所制备的转化株,利用Southern分析来确认基因破坏。首先,将由亲株和破坏株中分离的基因组DNA以限制性酶进行处理(于37℃或18小时),其中使用NcoI来确认ScSSU1基因的破坏,使用HindIII来确认non-ScSSU1基因的破坏;然后以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离,转移至膜上。随后,利用对ScSSU1或non-ScSSU1特异性的探针通过Alkphos直接标记试剂(Amersham)的 方案来进行杂交(于55℃进行18小时),利用CDP-Star对信号进行检测。
基因破坏得到确认的每一菌株被命名如下。
Sc-1(ScSSU1/Scssu1::G418r)
Sc-2(Scssu1::G418r/Scssu1::nat1)
non-Sc-1(non-ScSSU1/non-ScSSU1/non-Scssu1::G418r)
non-Sc-2(non-ScSSU1/non-Scssu1::G418r/non-Scssu1::nat1)
non-Sc-3
(non-Scssu1::G418r/non-Scssu1::nat1/non-Scssu1::AUR1-C)
(实施例11)发酵试验中亚硫酸盐生成的定量分析
在下述条件下利用亲株和实施例10中制备的Sc-1至non-Sc-3破坏株的发酵实验。
最初提取物:12.75%
发酵等级:2升
溶解氧浓度:约9ppm
发酵温度:15℃
投放量:10g湿酵母细胞/2L麦芽汁
周期性地对麦芽汁进行取样,并监测细胞生长(OD600)(图7-(a))、表观浸出物(图7-(b))以及亚硫酸盐浓度(图7-(c))。麦芽汁中的亚硫酸盐的定量分析按下述方法进行:通过在酸性条件下蒸馏的方式将亚硫酸盐捕获至双氧水溶液中,然后以碱进行滴定(日本酿造协会,BCOJ啤酒分析推荐方法)。
作为结果,ScSSU1破坏株的麦芽汁中的亚硫酸盐产量几乎与亲株中的相同,而non-ScSSU1破坏株中的亚硫酸盐却有显著降低。这说明下层发酵酵母特异性的non-ScSSU1基因对麦芽汁中的亚硫酸盐产量具有很大贡献。
同时,non-ScSSU1破坏株的生长率以及提取物消耗率(extract-consuming rate)都有显著降低,这说明细胞中过量的亚硫酸盐导致细胞生长受到抑制。
(实施例12)每一SSU1基因的过表达
由实施例9中提及的质粒TOPO/non-ScSSU1,通过以限制性酶(SacI-BglII)进行处理来获得含有全长non-ScSSU1ORF的约1.5kb的片断。然后将该片断插 入至以限制性酶(SacI-Bg1II)进行了类似处理的质粒pNI-NUT中以构建non-ScSSU1过表达载体pYI-non-ScSSU1。载体pNI-NUT含有URA3作为同源重组位点,并以诺尔丝菌素抗性基因(nat1)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)作为选择性标记物。另一方面,ScSSU1过表达载体pNI-ScSSU1具有下述结构:上述pYI-non-ScSSU1的non-ScSSU1基因被来自Saccharomyces cerevisiae的约2kb的SSU1-R所取代“J.Ferment.Bioeng.,86卷,427页(1998)”。对于每一SSU1基因的过表达,使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)的启动子和终止子。
将下部发酵酵母BH225以上述制备的过表达载体进行转化。利用日本专利公开公报No.H07/303,475中提及的方法进行转化,并以含有50mg/L诺尔丝菌素的YPD平板培养基进行选择。利用RT-PCR来确认过表达。总RNA的提取使用RNeasy小试剂盒(Qiagen)按照试剂盒所附的“从酵母中提取总RNA”的操作手册来进行。采用ScSSU1_for331(序列号23)/ScSSU1_982rv(序列号24)作 为 ScSSU1 特 异 性 引 物;采 用 non-ScSSU1_for329(序 列 号25)/non-ScSSU1981rv(序列号26)作为non-ScSSU1特异性引物;采用PDA1_for1(序列号27)/PDA1_730rv(序列号28)作为用作内标的组成性表达基因PDA1的特异性引物。将PCR产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分离,以溴乙啶溶液进行染色,以PDA1的信号值对每一SSU1基因的转化株的信号值进行归一化,并与亲株的信号值进行比较。所确认的过表达菌株同样被命名为ScSSU1过表达菌株和non-ScSSU1过表达菌株。
(实施例13)发酵试验中亚硫酸盐生成的定量分析
在下述条件下利用亲株和实施例12中制备的SSU1过表达菌株进行发酵实验。
最初提取物:12.83%
发酵等级:2升
溶解氧浓度:约9ppm
发酵温度:12℃
投放量:10g湿酵母细胞/2L麦芽汁
与实施例11中相同,周期性地对麦芽汁进行取样,并监测细胞生长(OD600)(图8-(a))、表观浸出物(图8-(b))以及亚硫酸盐浓度(图8-(c))。对于亚硫酸盐产生 量,与亲株中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为12ppm)相比,Sc SSU1过表达菌株中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为19ppm)仅有少量提高,而non-Sc SSU1过表达菌株中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为45ppm)有明显提高。同时,亲株和过表达菌株的生长率以及提取物消耗率未发生变化。
由上述结果可知,通过使本发明所示的编码下部发酵酵母特异性的亚硫酸盐释放泵的基因过表达,可以增加啤酒中的亚硫酸盐浓度而不会改变发酵过程和发酵周期。其结果,现在可以制备具有优异的口味稳定性和更长的保质期的酒精饮料。
(实施例14)34/70菌株的MET14基因的克隆
由实施例6中获得的比较数据库中得到non-Sc MET14基因的DNA序列。获得含有约1.9kb(全长)的non-Sc MET14基因的鸟枪法克隆SSS 134_021,其正向和反向DNA序列与Saccharomyces cerevisiae的正向和反向DNA序列的同一性分别为79.0%和56.0%。
由鸟枪法文库中选择鸟枪法克隆134_021,利用PCR获得全长non-ScMET14基因。作为引物对,使用表3所示的SacI-nonSc-MET14_for-21(序列号29)和BamHI-nonSc-MET14_rv618(序列号30)的合成DNA。作为使用该引物对的结果,获得含有SacI和BamHI限制性位点的non-Sc MET14基因(约0.6kb)。
(表3)
Figure S05837204120070429D000621
对于Sc MET14基因,使用基于SGD的信息设计的引物对,以34/70菌株的基因组DNA作为模板,通过PCR获得其全长基因。SacI-ScMET14_for(序列号31)和BamHI-ScMET14_rv(序列号32)的合成DNA被用作引物。作为使用该引物对的结果,获得含有SacI和BamHI限制性位点的Sc MET14基因(约0.6kb)。
将如上获得的Sc MET14和non-Sc MET14基因利用TA克隆试剂盒(Invitrogen制)插入至试剂盒所附的pCR2.1-TOPO载体中,并分别将其命名为TOPO/ScMET14和TOPO/nonSc-MET14。
所得Sc MET14和non-Sc MET14基因的DNA序列通过Sanger“Science,214卷,1215页(1981)”(图11)的方法进行检测。
(实施例15)Sc SSU1过表达菌株中每一MET14基因的过表达
将实施例14中提及的含有Sc MET14或non-Sc MET14的约0.6kb的片断插入至表达载体pUP3GLP(日本专利公开公报No.2000/316,559)的多克隆位点以构建过表达载体pUP3Sc MET14和pUP3nonSc-MET14,其中每一基因在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和终止子的控制下进行表达。另一方面,将上部发酵酵母KN009F菌株以实施例12中提及的Sc SSU1过表达载体pNI-SSU1进行转化以制备FOY227菌株,该菌株为Sc SSU1过表达菌株。将FOY227菌株以上述 pUP3ScMET14和pUP3nonSc-MET14进行转化以制备FOY306菌株和FOY307菌株,上述菌株分别过表达Sc MET14和non-Sc MET14,并过表达Sc SSU1。
(实施例16)发酵试验中亚硫酸盐生成的定量分析
在下述条件下利用实施例15中制备的菌株;Sc SSU1过表达菌株FOY227菌株、FOY227菌株中Sc MET14过表达的FOY306菌株、FOY227菌株中non-ScMET14过表达的FOY307菌株、以及亲株KN009F。
最初提取物:12.84%
发酵等级:1.5升
溶解氧浓度:约9ppm
发酵温度:任何情况下均为25℃
投放量:7.5g湿酵母细胞/1.5L麦芽汁
与实施例11中相同,周期性地对麦芽汁进行取样,并监测细胞生长(OD600)、表观浸出物以及亚硫酸盐浓度。上述菌株中,酵母生长以及提取物消耗量未见差别。然而,对于亚硫酸盐产生量,如图9所示,与亲株KN009F中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为0.32ppm)相比,Sc SSU1过表达菌株FOY227中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为3.4ppm)以及Sc MET14和Sc SSU1过表达菌株FOY306中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为6.4ppm)仅有少量提高,而non-ScMET14和Sc SSU1过表达菌株FOY307中所产生的亚硫酸盐(发酵结束时为16.6ppm)有明显提高。
由上述结果可发现,本发明所示的编码下部发酵酵母特异性的腺苷酰硫酸激酶(adenylyl sulfate kinase)的基因的过表达可有效增加啤酒中的亚硫酸盐浓度而不会改变发酵过程和发酵时期。其结果,现在可以制备具有优异的口味稳定性和更长的保质期的酒精饮料。
(实施例17)下层发酵酵母DNA阵列的制备
下层发酵酵母的DNA阵列基于上述(h)中获得的ORF的DNA序列信息以及位于由34/70菌株的全基因组序列推断出的ORF之间的基因间DNA序列进行制备。
DNA阵列的制备
基于来自下述三组的DNA序列信息,利用
Figure S05837204120070429D000641
(Affymetrix)技术设计针对下层发酵酵母的全基因组序列为特异性的PM探针(完全匹配探针;25个碱基长);(1)来自34/70菌株的全基因组序列的15712个区域,(2)403个Saccharomyces cerevisiae ORF,其由来自SGD的序列号190811至191213所表示,且未被鉴别为34/70菌株中的Sc型ORF,(3)用作内标的基因的64个DNA序列,其由序列号195588至195651表示。
为获得定量的和可重复的信息,对(1)和(2)的每一区域设计8至11个探针,对(3)的每一区域设计20至51个探针。为了进一步增加检测的敏感性和特异性,还设计错配探针(MM探针),该探针除具有一个错配碱基外,其余序列与PM探针相同,所述错配碱基替换了中央位置的互补碱基(即,碱基13)(腺嘌呤(A)变为胸腺嘧啶(T)以及胸腺嘧啶(T)变为腺嘌呤(A),或者鸟嘌呤(G)变为胞嘧啶(C)或胞嘧啶(C)变为鸟嘌呤(G))。
将所有设计的PM和MM探针利用
Figure 2005800372041100002S05837204120070429D00038150052QIETU
技术进行合成和包装(Affymetrix制)以制备DNA阵列。
组(1)由下述组成:
A)由序列号33至6236所示的non-Sc型ORF的6204个DNA序列。
B)由序列号75337至82784所示的Sc型ORF的7448个DNA序列。
C)由序列号166154至166181所示的来自34/70菌株的线粒体ORF的28个DNA序列。
D)由序列号166490至167042所示的553个DNA序列,所述序列经鉴别并非为上述ORF,但利用NCBI-BlastX同源搜索发现其与Saccharomycescerevisiae的蛋白具有显著相似性(E值<=10e-7)。
E)由序列号173125至174603所示的1479个DNA序列,所述序列经鉴别并非为上述的A)或B),但利用NCBI-BlastP同源搜索发现其与Saccharomycescerevisiae的蛋白具有显著相似性(E值<=10e-7)。
E值为表示偶然在一数据库中找到检测序列(query sequence)的可能性的期望值。例如,E值为10表示可偶然发现10个序列。E值越小,偶然找到该序列的可能性越小,因此表示数据库中所找到的序列与所要查询序列之间的相似性越明显。
作为通过NCBI-BLAST等同源搜索所得到结果的E值为小于10-7,优选为 小于10-10,更优选为小于10-20时,该E值可为显著。当通过同源性搜索其与ORF的DNA具有最小值时,可确定其功能。
组(2)由下述组成:
YBL108C-A,YBR074W,YFL061W,YIL165C,YGR291C,YJR052W,YDR223W,YAL025C,YAR073W,YFFL057C,YLL015W,YJR105W,YLR299C-A,YNR073C,YDL246C,YHL049C,YAR010C,YKL096W,YBL026W,YMR230W,YAL037C-A,YAL037C-B,YAL037W,YAL063C-A,YAL064C-A,YAL064W,YAL065C,YAL068W-A,YAL069W,YAR009C,YAR020C,YAR042W,YAR047C,YAR053W,YAR060C,YAR061W,YAR062W,YBL027W,YBL040C,YBL068W-A,YBL101W-B,YBL109W,YBL112C,YBR092C,YBR191W-A,YBR219C,YCL019W,YCL029C,YCL065W,YCL066W,YCL068C,YCL069W,YCL073C,YCL074W,YCL075W,YCL076W,YCR035C,YCR036W,YCR038W-A,YCR101C,YCR104W,YCR105W,YCR106W,YCR107W,YCR108C,YDL003W,YDL037C,YDL064W,YDL073W,YDL094C,YDL095W,YDL096C,YDL136W,YDL143W,YDL152W,YDL191W,YDL200C,YDL201W,YDL247W-A,YDL248W,YDR014W,YDR015C,YDR034C-D,YDR039C,YDR045C,YDR098C-B,YDR160W,YDR210C-D,YDR210W-B,YDR215C,YDR225W,YDR261C-D,YDR261W-B,YDR292C,YDR302W,YDR304C,YDR305C,YDR342C,YDR344C,YDR364C,YDR365W-B,YDR427W,YDR433W,YDR471W,YDR510C-A,YDR543C,YDR544C,YEL012W,YEL075W-A,YER039C-A,YER046W-A,YER056C-A,YER060W-A,YER074W,YER138C,YER187W,YER188C-A,YER190C-A,YFL002W-A,YFL014W,YFL019C,YFL020C,YFL030W,YFL031W,YFL051C,YFL052W,YFL053W,YFL054C,YFL055W,YFL056C,YFL063W,YFL065C,YFL066C,YFL067W,YFR012W-A,YGL028C,YGL041C,YGL052W,YGL210W-A,YGL259W,YGL262W,YGL263W,YGR034W,YGR038C-B,YGR089W,YGR107W,YGR109W-A,YIL082W-A,YGR122C-A,YGR146C,YGR148C,YGR161W-B,YGR182C,YGR183C,YGR271C-A,YGR290W,YGR295C,YHL009W-A,YHL009W-B,YHL015W-A,YHL046W-A,YHL047C,YHL048C-A,YHL048W,YHR032C-A,YHR032W-A,YHR039C-A,YHR043C,YHR070C-A,YHR071C-A,YHR071W,YHR141C,YHR165W-A,YHR179W, YHR180C-B,YHR180W-A,YHR182W,YHR193C,YHR193C-A,YHR207C,YHR211W,YHR213W-A,YHR216W,YHR217C,YHR218W-A,YIL029C,YIL052C,YIL069C,YIL148W,YIL171W,YIL174W,YIL176C,YIR018C-A,YIR041W,YIR042C,YIR043C,YIR044C,YJL012C-A,YJL014W,YJL062W-A,YJL136C,YJL175W,YJL222W-B,YJR024C,YJR027W,YJR032W,YJR053W,YJR054W,YJR094W-A,YJR107W,YJR110W,YJR111C,YJR140W-A,YJR151C,YJR152W,YJR153W,YJR154W,YJR155W,YJR162C,YKL018W,YKL020C,YKL044W,YKL224C,YKL225W,YKR012C,YKR013W,YKR017C,YKR018C,YKR019C,YKR020W,YKR035C,YKR036C,YKR040C,YKR041W,YKR042W,YKR052C,YKR053C,YKR057W,YKR062W,YKR094C,YKR102W,YKR103W,YKR104W,YLL014W,YLL030C,YLL037W,YLL038C,YLL043W,YLL065W,YLR029C,YLR030W,YLR062C,YLR098C,YLR099W-A,YLR107W,YLR139C,YLR140W,YLR142W,YLR144C,YLR145W,YLR154C-G,YLR154W-A,YLR154W-B,YLR154W-C,YLR154W-E,YLR154W-F,YLR155C,YLR156W,YLR157C-B,YLR157W-C,YLR162W,YLR205C,YLR207W,YLR209C,YLR227W-B,YLR236C,YLR237W,YLR238W,YLR245C,YLR251W,YLR271W,YLR278C,YLR287C-A,YLR305C,YLR306W,YLR311C,YLR317W,YLR338W,YLR344W,YLR345W,YLR354C,YLR364W,YLR380W,YLR401C,YLR402W,YLR410W-B,YLR411W,YLR412C-A,YLR412W,YLR413W,YLR448W,YLR460C,YLR461W,YLR463C,YLR465C,YML003W,YML039W,YML073C,YMR087W,YMR143W,YMR175W-A,YMR247W-A,YMR268W-A,YMR324C,YMR325W,YNL020C,YNL035C,YNL054W-B,YNL243W,YNR034W-A,YNR075C-A,YNR077C,YOL038C-A,YOL053W,YOL101C,YOL103W-B,YOL162W,YOL163W,YOL164W,YOL164W-A,YOL165C,YOL166C,YOL166W-A,YOR050C,YOR096W,YOR101W,YOR192C-B,YOR192C-C,YOR225W,YOR235W,YOR343W-B,YOR366W,YOR381W-A,YOR382W,YOR383C,YOR384W,YOR385W,YOR386W,YOR387C,YOR389W,YPL003W,YPL019C,YPL023C,YPL036W,YPL048W,YPL055C,YPL060C-A,YPL175W,YPL194W,YPL197C,YPL257W-B,YPR002C-A,YPR008W,YPR014C,YPR028W,YPR043W,YPR048W,YPR087W,YPR094W,YPR108W,YPR137C-B,YPR161C, YPR162C,YPR163C,YPR164W,YPR165W,YPR166C,YPR167C,YPR168W,YPR169W,YPR169W-A,YPR170C,YPR170W-A,YPR171W,YPR172W,YPR173C,YPR174C,YPR175W,YPR176C,YPR177C,YPR178W,YPR179C,YPR180W,YPR181C,YPR182W,YPR183W,YPR184W,YPR185W,YPR186C,YPR187W,YPR188C,YPR189W,and YPR190C
组(3)由下述组成(基因库序号No.):
AFFX-BioB-5_at(J04423.1),AFFX-BioB-M_at(J04423.1),AFFX-BioB-3_at(J04423.1), AFFX-BioC-5_at (J04423.1),AFFX-BioC-3_at   (J04423.1),AFFX-BioDn-5_at  (J04423.1),AFFX-BioDn-3_at  (J04423.1),AFFX-CreX-5_at(X03453.1),AFFX-CreX-3_at (X03453.1),AFFX-DapX-5_at (L38424.1),
AFFX-DapX-M_at   (L38424.1),AFFX-DapX-3_at  (L38424.1),AFFX-LysX-5_at(X17013.1), AFFX-LysX-M_at(X17013.1),   AFFX-LysX-3_at(X17013.1),AFFX-PheX-5_at  (M24537.1), AFFX-PheX-M_at   (M24537.1),AFFX-PheX-3_at(M24537.1), AFFX-ThrX-5_at(X04603.1),   AFFX-ThrX-M_at(X04603.1),AFFX-ThrX-3_at(X04603.1),AFFX-TrpnX-5_at     (K01391.1),AFFX-TrpnX-M_at  (K01391.1), AFFX-TrpnX-3_at   (K01391.1),AFFX-r2-Ec-bioB-5_at    (J04423.1), AFFX-r2-Ec-bioB-M_at(J04423.1),AFFX-r2-Ec-bioB-3_at(J04423.1),AFFX-r2-Ec-bioC-5_at(J04423.1),AFFX-r2-Ec-bioC-3_at(J04423.1),  AFFX-r2-Ec-bioD-5_at  (J04423.1),AFFX-r2-Ec-bioD-3_at(J04423.1),  AFFX-r2-P1-cre-5_at   (X03453.1),AFFX-r2-P1-cre-3_at (X03453.1),  AFFX-r2-Bs-dap-5_at   (L38424.1),AFFX-r2-Bs-dap-M_at (L38424.1),  AFFX-r2-Bs-dap-3_at   (L38424.1),AFFX-r2-Bs-dap-3_at (X17013.1),  AFFX-r2-Bs-lys-5_at   (X17013.1),AFFX-r2-Bs-lys-M_at (X17013.1),  AFFX-r2-Bs-phe-5_at   (M24537.1),AFFX-r2-Bs-phe-M_at (M24537.1),  AFFX-r2-Bs-phe-3_at   (M24537.1),AFFX-r2-Bs-thr-5_s_at(X04603.1), AFFX-r2-Bs-thr-M_s_at (X04603.1),AFFX-r2-Bs-thr-3_s_at(X04603.1), AFFX-YFL039C5_at      (V01288.1),AFFX-YFL039CM_at    (V01288.1),  AFFX-YFL039C3_at      (V01288.1),AFFX-YER148w5_at    (X16860.1),  AFFX-YER148wM_at(X16860.1),AFFX-YER148w3_at(X16860.1),AFFX-YER022w5_at(L12026.1), AFFX-YER022wM_at  (L12026.1),AFFX-YER022w3_at  (L12026.1),AFFX-18srRnaa_at(Z75578.1),AFFX-18srRnab_at(Z75578.1), AFFX-18srRnac_at(Z75578.1),AFFX-18srRnad_at  (Z75578.1),AFFX-18srRnae_at (Z75578.1),AFFX-25srRnaa_at(J01355.1),AFFX-25srRnab_at(J01355.1),AFFX-25srRnac_at(J01355.1),AFFX-25srRnad_at(J01355.1)以及AFFX-25srRnae_at(J01355.1)。
来自上述(1-A)中所述的non-Sc型ORF的6204个DNA序列的探针如下所述:
具有由序列号6237、6238、6239、6240、6241、6242、6243、6244、6245、6246、6247表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号33表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6248、6249、6250、6251、6252、6253、6254、6255、6256、6257、6258表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号34表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6259、6260、6261、6262、6263、6264、6265、6266、6267、6268、6269表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号35表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6270、6271、6272、6273、6274、6275、6276、6277、6278、6279、6280表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号36表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6281、6282、6283、6284、6285、6286、6287、6288、6289、6290、6291表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号37表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6292、6293、6294、6295、6296、6297、6298、6299、6300、6301、6302表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号38表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6303、6304、6305、6306、6307、6308、6309、6310、6311、6312、6313表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号39表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6314、6315、6316、6317、6318、6319、6320、6321、6322、6323、6324表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号40表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6325、6326、6327、6328、6329、6330、6331、6332、6333、6334、6335表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号41表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6336、6337、6338、6339、6340、6341、6342、6343、6344、6345、6346表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号42表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6347、6348、6349、6350、6351、6352、6353、6354、6355、6356、6357表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号43表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6358、6359、6360、6361、6362、6363、6364、6365、6366、6367、6368表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号44表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6369、6370、6371、6372、6373、6374、6375、6376、6377、6378、6379表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号45表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6380、6381、6382、6383、6384、6385、6386、6387、6388、6389、6390表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号46表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6391、6392、6393、6394、6395、6396、6397、6398、6399、6400、6401表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号47表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6402、6403、6404、6405、6406、6407、6408、6409、6410、6411、6412表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号48表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6413、6414、6415、6416、6417、6418、6419、6420、6421、6422、6423表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号49表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6424、6425、6426、6427、6428、6429、6430、6431、6432、6433、6434表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号50表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6435、6436、6437、6438、6439、6440、6441、6442、6443、6444、6445表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号51表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6446、6447、6448、6449、6450、6451、6452、6453、6454、6455、6456表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号52表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6457、6458、6459、6460、6461、6462、6463、6464、6465、6466、6467表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号53表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6468、6469、6470、6471、6472、6473、6474、6475、6476、6477、6478表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号54表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6479、6480、6481、6482、6483、6484、6485、6486、6487、6488、6489表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号55表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6490、6491、6492、6493、6494、6495、6496、6497、6498、6499、6500表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号56表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6501、6502、6503、6504、6505、6506、6507、6508、6509、6510、6511表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号57表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6512、6513、6514、6515、6516、6517、6518、6519、6520、6521、6522表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号58表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6523、6524、6525、6526、6527、6528、6529、6530、6531、6532、6533表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号59表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6534、6535、6536、6537、6538、6539、6540、6541、6542、6543、6544表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号60表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6545、6546、6547、6548、6549、6550、6551、6552、6553、6554、6555表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号61表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6556、6557、6558、6559、6560、6561、6562、6563、6564、6565、6566表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号62表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6567、6568、6569、6570、6571、6572、6573、6574、6575、6576、6577表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号63表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6578、6579、6580、6581、6582、6583、6584、6585、6586、6587、6588表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号64表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6589、6590、6591、6592、6593、6594、6595、6596、6597、6598、6599表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号65表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6600、6601、6602、6603、6604、6605、6606、6607、6608、6609、6610表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号66表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6611、6612、6613、6614、6615、6616、6617、6618、6619、6620、6621表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号67表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6622、6623、6624、6625、6626、6627、6628、6629、6630、6631、6632表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号68表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6633、6634、6635、6636、6637、6638、6639、6640、6641、6642、6643表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号69表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6644、6645、6646、6647、6648、6649、6650、6651、6652、6653、6654表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号70表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6655、6656、6657、6658、6659、6660、6661、6662、6663、6664、6665表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号71表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6666、6667、6668、6669、6670、6671、6672、6673、6674、6675、6676表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号72表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号6677、6678、6679、6680、6681、6682、6683、6684、6685、6686、6687表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号73表示的核苷酸序列的ORF。
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来自上述(1-B)中所述的non-Sc型ORF的7448个DNA序列的探针如下所述:
具有由序列号82785、82786、82787、82788、82789、82790、82791、82792、82793、82794、82795表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75337表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82796、82797、82798、82799、82800、82801、82802、82803、82804、82805、82806表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75338表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82807、82808、82809、82810、82811、82812、82813、82814、82815、82816、82817表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75339表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82818、82819、82820、82821、82822、82823、82824、82825、82826、82827、82828表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75340表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82829、82830、82831、82832、82833、82834、82835、82836、82837、82838、82839表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75341表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82840、82841、82842、82843、82844、82845、82846、82847、82848、82849、82850表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75342表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82851、82852、82853、82854、82855、82856、82857、82858、82859、82860、82861表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75343表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82862、82863、82864、82865、82866、82867、82868、82869、82870、82871、82872表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75344表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82873、82874、82875、82876、82877、82878、82879、82880、82881、82882、82883表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75345表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82884、82885、82886、82887、82888、82889、82890、82891、82892、82893、82894表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75346表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82895、82896、82897、82898、82899、82900、82901、82902、82903、82904、82905表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75347表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号82906、82907、82908、82909、82910、82911、82912、82913、82914、82915、82916表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号75348表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号104207、104208、104209、104210、104211、104212、104213、104214、104215、104216、104217表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号77261表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号104218、104219、104220、104221、104222、104223、104224、104225、104226、104227、104228表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号77262表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号111236、111237、111238、111239、111240、111241、111242、111243、111244、111245、111246表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号77886表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号111247、111248、111249、111250、111251、111252、111253、111254、111255、111256、111257表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号77887表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号112028、112029、112030、112031、112032、112033、112034、112035、112036、112037、112038表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号77958表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号114371、114372、114373、114374、114375、114376、114377、114378、114379、114380、114381表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78168表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号115141、115142、115143、115144、115145、115146、115147、115148、115149、115150、115151表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78238表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号115152、115153、115154、115155、115156、115157、115158、115159、115160、115161、115162表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78239表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号115185、115186、115187、115188、115189、115190、115191、115192、115193、115194、115195表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78242表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号115933、115934、115935、115936、115937、115938、115939、115940、115941、115942、115943表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78309表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号116702、116703、116704、116705、116706、116707、116708、116709、116710、116711、116712表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78379表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号116713、116714、116715、116716、116717、116718、116719、116720、116721、116722、116723表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78380表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号116724、116725、116726、116727、116728、116729、116730、116731、116732、116733、116734表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78381表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号116735、116736、116737、116738、116739、116740、116741、116742、116743、116744、116745表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号78382表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号116746、116747、116748、116749、116750、116751、116752、116753、116754、116755、116756表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78383表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号116790、116791、116792、116793、116794、116795、116796、116797、116798、116799、116800表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78387表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号116812、116813、116814、116815、116816、116817、116818、116819、116820、116821、116822表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78389表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号116867、116868、116869、116870、116871、116872、116873、116874、116875、116876、116877表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78394表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号116878、116879、116880、116881、116882、116883、116884、116885、116886、116887、116888表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78395表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号116889、116890、116891、116892、116893、116894、116895、116896、116897、116898、116899表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78396表示的核苷酸序列的ORF。
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Figure S05837204120070429D010011
116982、116983、116984、116985、116986、116987表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78404表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号117373、117374、117375、117376、117377、117378、117379、117380、117381、117382、117383表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78439表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117384、117385、117386、117387、117388、117389、117390、117391、117392、117393、117394表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78440表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117395、117396、117397、117398、117399、117400、117401、117402、117403、117404、117405表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78441表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117406、117407、117408、117409、117410、117411、117412、117413、117414、117415、117416表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78442表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117417、117418、117419、117420、117421、117422、117423、117424、117425、117426、117427表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78443表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117428、117429、117430、117431、117432、117433、117434、117435、117436、117437、117438表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78444表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117439、117440、117441、117442、117443、117444、117445、117446、117447、117448、117449表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78445表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117450、117451、117452、117453、117454、117455、117456、117457、117458、117459、117460表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78446表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号117461、117462、117463、117464、117465、117466、117467、117468、117469、117470、117471表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78447表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号121375、121376、121377、121378、121379、121380、121381、121382、121383、121384、121385表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号78798表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号121386、121387、121388、121389、121390、121391、121392、121393、121394、121395、121396表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78799表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号121397、121398、121399、121400、121401、121402、121403、121404、121405、121406、121407表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78800表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号121408、121409、121410、121411、121412、121413、121414、121415、121416、121417、121418表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号78801表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号126071、126072、126073、126074、126075、126076、126077、126078、126079、126080、126081表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79216表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号126082、126083、126084、126085、126086、126087、126088、126089、126090、126091、126092表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79217表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号128411、128412、128413、128414、128415、128416、128417、128418、128419、128420、128421表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79423表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号131535、131536、131537、131538、131539、131540、131541、131542、131543、131544、131545表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79698表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号131546、131547、131548、131549、131550、131551、131552、131553、131554、131555、131556表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79699表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号131557、131558、131559、131560、131561、131562、131563、131564、131565、131566、131567表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79700表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号131920、131921、131922、131923、131924、131925、131926、131927、131928、131929、131930表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79733表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号131931、131932、131933、131934、131935、131936、131937、131938、131939、131940、131941表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79734表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号132140、132141、132142、132143、132144、132145、132146、132147、132148、132149、132150表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79753表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号132151、132152、132153、132154、132155、132156、132157、132158、132159、132160、132161表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79754表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号132162、132163、132164、132165、132166、132167、132168、132169、132170、132171、132172表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79755表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号132173、132174、132175、132176、132177、132178、132179、132180、132181、132182、132183表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79756表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号132184、132185、132186、132187、132188、132189、132190、132191、132192、132193、132194表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号79757表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号141728、141729、141730、141731、141732、141733、141734、141735、141736、141737、141738表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号80605表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号146411、146412、146413、146414、146415、146416、146417、146418、146419、146420、146421表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81022表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号151085、151086、151087、151088、151089、151090、151091、151092、151093、151094、151095表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81442表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号151096、151097、151098、151099、151100、151101、151102、151103、151104、151105、151106表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81443表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号154206、154207、154208、154209、154210、154211、154212、154213、154214、154215、154216表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81722表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号154217、154218、154219、154220、154221、154222、154223、154224、154225、154226、154227表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81723表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号154228、154229、154230、154231、154232、154233、154234、154235、154236、154237、154238表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81724表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号154239、154240、154241、154242、154243、154244、154245、154246、154247、154248、154249表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81725表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号154250、154251、154252、154253、154254、154255、154256、154257、154258、154259、154260表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81726表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号154261、154262、154263、154264、154265、154266、154267、154268、154269、154270、154271表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号81727表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号154272、154273、154274、154275、154276、154277、154278、154279、154280、154281、154282表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81728表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号154294、154295、154296、154297、154298、154299、154300、154301、154302、154303、154304表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81730表示的核苷酸序列的ORF。
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具确由序列号154316、154317、154318、154319、154320、154321、154322、154323、154324、154325、154326表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81732表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号154349、154350、154351、154352、154353、154354、154355、154356、154357、154358、154359、154360、154361、154362、154363、154364、154365、154366、154367、154368、154369、154370表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号81735表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号161245、161246、161247、161248、161249、161250、161251、161252、161253、161254、161255表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82348表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号161256、161257、161258、161259、161260、161261、161262、161263、161264、161265、161266表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82349表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号161333、161334、161335、161336、161337、161338、161339、161340、161341、161342、161343表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82355表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号165154、165155、165156、165157、165158、165159、165160、165161、165162、165163、165164表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82698表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号165945、165946、165947、165948、165949、165950、165951、165952、165953、165954、165955表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82766表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号165956、165957、165958、165959、165960、165961、165962、165963、165964、165965、165966表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82767表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号165967、165968、165969、165970、165971、165972、165973、165974、165975、165976、165977表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82768表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号165978、165979、165980、165981、165982、165983、165984、165985、165986、165987、165988表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82769表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号165989、165990、165991、165992、165993、165994、165995、165996、165997、165998、165999表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82770表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166000、166001、166002、166003、166004、 166005、166006、166007、166008、166009、166010表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82771表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166011、166012、166013、166014、166015、166016、166017、166018、166019、166020、166021表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82772表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166022、166023、166024、166025、166026、166027、166028、166029、166030、166031、166032表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82773表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166033、166034、166035、166036、166037、166038、166039、166040、166041、166042、166043表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82774表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166044、166045、166046、166047、166048、166049、166050、166051、166052、166053、166054表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82775表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166055、166056、166057、166058、166059、166060、166061、166062、166063、166064、166065表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82776表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166066、166067、166068、166069、166070、166071、166072、166073、166074、166075、166076表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82777表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166077、166078、166079、166080、166081、166082、166083、166084、166085、166086、166087表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82778表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166088、166089、166090、166091、166092、166093、166094、166095、166096、166097、166098表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82779表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号166110、166111、166112、166113、166114、 166115、166116、166117、166118、166119、166120表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82781表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166121、166122、166123、166124、166125、166126、166127、166128、166129、166130、166131表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82782表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166132、166133、166134、166135、166136、166137、166138、166139、166140、166141、166142表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82783表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166143、166144、166145、166146、166147、166148、166149、166150、166151、166152、166153表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号82784表示的核苷酸序列的ORF。
来自上述(1-C)中所述的线粒体的ORF的28个DNA序列的探针如下所述:
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具有由序列号166193、166194、166195、166196、166197、166198、166199、166200、166201、166202、166203表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166155表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166204、166205、166206、166207、166208、166209、166210、166211、166212、166213、166214表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166156表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166215、166216、166217、166218、166219、166220、166221、166222、166223、166224、166225表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166157表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166226、166227、166228、166229、166230、166231、166232、166233、166234、166235、166236表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166158表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号166248、166249、166250、166251、166252、166253、166254、166255、166256、166257、166258表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166160表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号166347、166348、166349、166350、166351、166352、166353、166354、166355、166356、166357表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166169表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166358、166359、166360、166361、166362、166363、166364、166365、166366、166367、166368表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166170表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166369、166370、166371、166372、166373、166374、166375、166376、166377、166378、166379表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166171表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166380、166381、166382、166383、166384、166385、166386、166387、166388、166389、166390表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166172表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166391、166392、166393、166394、166395、166396、166397、166398、166399、166400、166401表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166173表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166402、166403、166404、166405、166406、166407、166408、166409、166410、166411、166412表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166174表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号166424、166425、166426、166427、166428、166429、166430、166431、166432、166433、166434表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166176表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号166435、166436、166437、166438、166439、166440、166441、166442、166443、166444、166445表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166177表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号166457、166458、166459、166460、166461、166462、166463、166464、166465、166466、166467表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166179表示的核苷酸序列的ORF。
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来自上述(1-D)中所述的533个DNA序列的探针如下所述:
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具有由序列号167054、167055、167056、167057、167058、167059、167060、167061、167062、167063、167064表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166491表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号167076、167077、167078、167079、167080、167081、167082、167083、167084、167085、167086表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166493表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167087、167088、167089、167090、167091、167092、167093、167094、167095、167096、167097表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166494表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167098、167099、167100、167101、167102、167103、167104、167105、167106、167107、167108表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166495表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167109、167110、167111、167112、167113、167114、167115、167116、167117、167118、167119表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166496表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167120、167121、167122、167123、167124、167125、167126、167127、167128、167129、167130表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号166497表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167131、167132、167133、167134、167135、167136、167137、167138、167139、167140、167141表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166498表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167142、167143、167144、167145、167146、167147、167148、167149、167150、167151、167152表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166499表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167153、167154、167155、167156、167157、167158、167159、167160、167161、167162、167163表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166500表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167164、167165、167166、167167、167168、167169、167170、167171、167172、167173、167174表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166501表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167175、167176、167177、167178、167179、167180、167181、167182、167183、167184、167185表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166502表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167186、167187、167188、167189、167190、167191、167192、167193、167194、167195、167196表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166503表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167197、167198、167199、167200、167201、167202、167203、167204、167205、167206、167207表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166504表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167208、167209、167210、167211、167212、167213、167214、167215、167216、167217、167218表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166505表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167219、167220、167221、167222、167223、167224、167225、167226、167227、167228、167229表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166506表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167230、167231、167232、167233、167234、167235、167236、167237、167238、167239、167240表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号166507表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167241、167242、167243、167244、167245、167246、167247、167248、167249、167250、167251表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166508表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167252、167253、167254、167255、167256、167257、167258、167259、167260、167261、167262表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166509表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号167263、167264、167265、167266、167267、167268、167269、167270、167271、167272、167273表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166510表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号167285、167286、167287、167288、167289、167290、167291、167292、167293、167294、167295表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166512表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号171146、171147、171148、171149、171150、171151、171152、171153、171154、171155、171156表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166863表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号171157、171158、171159、171160、171161、171162、171163、171164、171165、171166、171167表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166864表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号171168、171169、171170、171171、171172、171173、171174、171175、171176、171177、171178表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166865表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号171179、171180、171181、171182、171183、171184、171185、171186、171187、171188、171189表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号166866表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号172674、172675、172676、172677、172678、172679、172680、172681、172682、172683、172684表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167002表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172685、172686、172687、172688、172689、172690、172691、172692、172693、172694、172695表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167003表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172696、172697、172698、172699、172700、172701、172702、172703、172704、172705、172706表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167004表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172707、172708、172709、172710、172711、172712、172713、172714、172715、172716、172717表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167005表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172718、172719、172720、172721、172722、172723、172724、172725、172726、172727、172728表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167006表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172729、172730、172731、172732、172733、172734、172735、172736、172737、172738、172739表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号167007表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172740、172741、172742、172743、172744、172745、172746、172747、172748、172749、172750表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167008表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172751、172752、172753、172754、172755、172756、172757、172758、172759、172760、172761表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167009表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172762、172763、172764、172765、172766、172767、172768、172769、172770、172771、172772表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167010表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172773、172774、172775、172776、172777、172778、172779、172780、172781、172782、172783表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167011表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172784、172785、172786、172787、172788、172789、172790、172791、172792、172793、172794表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167012表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172795、172796、172797、172798、172799、172800、172801、172802、172803、172804、172805表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167013表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172806、172807、172808、172809、172810、172811、172812、172813、172814、172815、172816表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167014表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172817、172818、172819、172820、172821、172822、172823、172824、172825、172826、172827表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167015表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172828、172829、172830、172831、172832、172833、172834、172835、172836、172837、172838表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167016表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172839、172840、172841、172842、172843、172844、172845、172846、172847、172848、172849表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号167017表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172850、172851、172852、172853、172854、172855、172856、172857、172858、172859、172860表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167018表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172861、172862、172863、172864、172865、172866、172867、172868、172869、172870、172871表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167019表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172872、172873、172874、172875、172876、172877、172878、172879、172880、172881、172882表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167020表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172883、172884、172885、172886、172887、172888、172889、172890、172891、172892、172893表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167021表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172894、172895、172896、172897、172898、172899、172900、172901、172902、172903、172904表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167022表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172905、172906、172907、172908、172909、172910、172911、172912、172913、172914、172915表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167023表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172916、172917、172918、172919、172920、172921、172922、172923、172924、172925、172926表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167024表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172927、172928、172929、172930、172931、172932、172933、172934、172935、172936、172937表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167025表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172938、172939、172940、172941、172942、172943、172944、172945、172946、172947、172948表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167026表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172949、172950、172951、172952、172953、172954、172955、172956、172957、172958、172959表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号167027表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172960、172961、172962、172963、172964、172965、172966、172967、172968、172969、172970表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167028表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172971、172972、172973、172974、172975、172976、172977、172978、172979、172980、172981表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167029表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172982、172983、172984、172985、172986、172987、172988、172989、172990、172991、172992表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167030表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号172993、172994、172995、172996、172997、172998、172999、173000、173001、173002、173003表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167031表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173004、173005、173006、173007、173008、173009、173010、173011、173012、173013、173014表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167032表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173015、173016、173017、173018、173019、173020、173021、173022、173023、173024、173025表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167033表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173026、173027、173028、173029、173030、173031、173032、173033、173034、173035、173036表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167034表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173037、173038、173039、173040、173041、173042、173043、173044、173045、173046、173047表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167035表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173048、173049、173050、173051、173052、173053、173054、173055、173056、173057、173058表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167036表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173059、173060、173061、173062、173063、173064、173065、173066、173067、173068、173069表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号167037表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173070、173071、173072、173073、173074、173075、173076、173077、173078、173079、173080表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167038表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173081、173082、173083、173084、173085、173086、173087、173088、173089、173090、173091表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167039表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173092、173093、173094、173095、173096、173097、173098、173099、173100、173101、173102表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167040表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173103、173104、173105、173106、173107、173108、173109、173110、173111、173112、173113表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167041表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号173114、173115、173116、173117、173118、173119、173120、173121、173122、173123、173124表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号167042表示的核苷酸序列的ORF。
来自上述(1-E)中所述的1479个ORF序列的探针如下所述:
具有由序列号174604、174605、174606、174607、174608、174609、174610、174611、174612、174613、174614表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173125表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174615、174616、174617、174618、174619、174620、174621、174622、174623、174624、174625表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173126表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174626、174627、174628、174629、174630、174631、174632、174633、174634、174635、174636表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173127表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174637、174638、174639、174640、174641、174642、174643、174644、174645、174646、174647表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173128表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174648、174649、174650、174651、174652、 174653、174654、174655、174656、174657、174658表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173129表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174659、174660、174661、174662、174663、174664、174665、174666、174667、174668表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173130表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174669、174670、174671、174672、174673、174674、174675、174676、174677、174678、174679表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173131表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174680、174681、174682、174683、174684、174685、174686、174687、174688、174689、174690表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173132表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174691、174692、174693、174694、174695、174696、174697、174698、174699、174700、174701表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173133表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174702、174703、174704、174705、174706、174707、174708、174709、174710、174711、174712表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173134表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174713、174714、174715、174716、174717、174718、174719、174720、174721、174722、174723表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173135表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174724、174725、174726、174727、174728、174729、174730、174731、174732、174733、174734表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173136表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174735、174736、174737、174738、174739、174740、174741、174742、174743、174744表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173137表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174745、174746、174747、174748、174749、174750、174751、174752、174753、174754、174755表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173138表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174756、174757、174758、174759、174760、 174761、174762、174763、174764、174765、174766表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173139表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174767、174768、174769、174770、174771、174772、174773、174774、174775、174776、174777表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173140表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174778、174779、174780、174781、174782、174783、174784、174785、174786、174787、174788表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173141表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174789、174790、174791、174792、174793、174794、174795、174796、174797、174798、174799表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173142表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174800、174801、174802、174803、174804、174805、174806、174807、174808、174809、174810表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173143表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174811、174812、174813、174814、174815、174816、174817、174818、174819、174820、174821表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173144表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174822、174823、174824、174825、174826、174827、174828、174829、174830、174831、174832表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173145表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174833、174834、174835、174836、174837、174838、174839、174840、174841、174842、174843表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173146表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174844、174845、174846、174847、174848、174849、174850、174851、174852、174853、174854表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173147表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174855、174856、174857、174858、174859、174860、174861、174862、174863、174864、174865表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173148表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174866、174867、174868、174869、174870、 174871、174872、174873、174874、174875、174876表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173149表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174877、174878、174879、174880、174881、174882、174883、174884、174885、174886、174887表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173150表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174888、174889、174890、174891、174892、174893、174894、174895、174896、174897、174898表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173151表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174899、174900、174901、174902、174903、174904、174905、174906、174907、174908、174909表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173152表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174910、174911、174912、174913、174914、174915、174916、174917表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173153表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号174918、174919、174920、174921、174922、174923、174924、174925、174926、174927、174928表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号173154表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号190283、190284、190285、190286、190287、190288、190289、190290、190291、190292、190293表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174556表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190294、190295、190296、190297、190298、190299、190300、190301、190302、190303、190304表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174557表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190305、190306、190307、190308、190309、190310、190311、190312、190313、190314、190315表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174558表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190316、190317、190318、190319、190320、 190321、190322、190323、190324、190325、190326表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174559表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号190624、190625、190626、190627、190628、190629、190630、190631、190632、190633、190634表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174587表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190635、190636、190637、190638、190639、190640、190641、190642、190643、190644、190645表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174588表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号190668、190669、190670、190671、190672、190673、190674、190675、190676、190677、190678表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174591表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190679、190680、190681、190682、190683、190684、190685、190686、190687、190688、190689表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174592表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190690、190691、190692、190693、190694、190695、190696、190697、190698、190699、190700表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174593表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190701、190702、190703、190704、190705、190706、190707、190708、190709、190710、190711表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174594表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190712、190713、190714、190715、190716、190717、190718、190719、190720、190721、190722表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174595表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190723、190724、190725、190726、190727、190728、190729、190730、190731、190732、190733表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174596表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190734、190735、190736、190737、190738、190739、190740、190741、190742、190743、190744表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174597表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190745、190746、190747、190748、190749、190750、190751、190752、190753、190754、190755表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174598表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号190767、190768、190769、190770、190771、190772、190773、190774、190775、190776、190777表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174600表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190778、190779、190780、190781、190782、190783、190784、190785、190786、190787、190788表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174601表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190789、190790、190791、190792、190793、190794、190795、190796、190797、190798、190799表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174602表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号190800、190801、190802、190803、190804、190805、190806、190807、190808、190809、190810表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号174603表示的核苷酸序列的ORF。
来自上述(2)中所述的403个S.cerevisiae ORF的探针如下所述:
具有由序列号191214、191215、191216、191217、191218、191219、191220、191221、191222、191223、191224表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190811表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191225、191226、191227、191228、191229、191230、191231、191232、191233、191234、191235表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190812表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191236、191237、191238、191239、191240、191241、191242、191243、191244、191245、191246表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190813表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191247、191248、191249、191250、191251、191252、191253、191254、191255、191256、191257表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190814表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191258、191259、191260、191261、191262、191263、191264、191265、191266、191267、191268表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190815表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191269、191270、191271、191272、191273、191274、191275、191276、191277、191278、191279表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190816表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191280、191281、191282、191283、191284、191285、191286、191287、191288、191289、191290表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190817表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191291、191292、191293、191294、191295、191296、191297、191298、191299、191300、191301表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190818表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191302、191303、191304、191305、191306、191307、191308、191309、191310、191311、191312表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190819表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191313、191314、191315、191316、191317、191318、191319、191320、191321、191322、191323表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190820表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191324、191325、191326、191327、191328、191329、191330、191331、191332、191333、191334表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190821表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191335、191336、191337、191338、191339、191340、191341、191342、191343、191344、191345表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190822表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191346、191347、191348、191349、191350、191351、191352、191353、191354、191355、191356表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190823表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191357、191358、191359、191360、191361、191362、191363、191364、191365、191366、191367表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190824表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191368、191369、191370、191371、191372、191373、191374、191375、191376、191377、191378表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190825表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191379、191380、191381、191382、191383、191384、191385、191386、191387、191388、191389表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190826表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191390、191391、191392、191393、191394、191395、191396、191397、191398、191399、191400表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190827表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191401、191402、191403、191404、191405、191406、191407、191408、191409、191410、191411表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190828表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191412、191413、191414、191415、191416、191417、191418、191419、191420、191421、191422表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190829表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号191423、191424、191425、191426、191427、191428、191429、191430、191431、191432、191433表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190830表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号191445、191446、191447、191448、191449、191450、191451、191452、191453、191454、191455表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号190832表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号195291、195292、195293、195294、195295、195296、195297、195298、195299、195300、195301表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191187表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195302、195303、195304、195305、195306、195307、195308、195309、195310、195311、195312表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191188表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195313、195314、195315、195316、195317、195318、195319、195320、195321、195322、195323表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191189表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195335、195336、195337、195338、195339、195340、195341、195342、195343、195344、195345表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191190表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195324、195325、195326、195327、195328、195329、195330、195331、195332、195333、195334表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191191表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195346、195347、195348、195349、195350、195351、195352、195353、195354、195355、195356表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191192表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195357、195358、195359、195360、195361、195362、195363、195364、195365、195366、195367表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191193表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195368、195369、195370、195371、195372、195373、195374、195375、195376、195377、195378表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191194表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195379、195380、195381、195382、195383、195384、195385、195386、195387、195388、195389表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191195表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195390、195391、195392、195393、195394、195395、195396、195397、195398、195399、195400表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191196表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195401、195402、195403、195404、195405、195406、195407、195408、195409、195410、195411表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191197表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195412、195413、195414、195415、195416、195417、195418、195419、195420、195421、195422表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191198表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195423、195424、195425、195426、195427、195428、195429、195430、195431、195432、195433表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191199表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195434、195435、195436、195437、195438、195439、195440、195441、195442、195443、195444表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191200表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195445、195446、195447、195448、195449、195450、195451、195452、195453、195454、195455表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191201表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195456、195457、195458、195459、195460、195461、195462、195463、195464、195465、195466表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191202表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195467、195468、195469、195470、195471、195472、195473、195474、195475、195476、195477表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191203表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195478、195479、195480、195481、195482、195483、195484、195485、195486、195487、195488表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191204表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195489、195490、195491、195492、195493、195494、195495、195496、195497、195498、195499表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191205表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195500、195501、195502、195503、195504、195505、195506、195507、195508、195509、195510表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191206表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195511、195512、195513、195514、195515、195516、195517、195518、195519、195520、195521表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191207表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195522、195523、195524、195525、195526、195527、195528、195529、195530、195531、195532表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191208表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195533、195534、195535、195536、195537、195538、195539、195540、195541、195542、195543表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191209表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号195555、195556、195557、195558、195559、195560、195561、195562、195563、195564、195565表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191211表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195566、195567、195568、195569、195570、195571、195572、195573、195574、195575、195576表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191212表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195577、195578、195579、195580、195581、195582、195583、195584、195585、195586、195587表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号191213表示的核苷酸序列的ORF。
来自上述(3)所述的用作内标的基因的64个DNA序列的探针如下所述:
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具有由序列号195673、195674、195675、195676、195677、195678、195679、195680、195681、195682、195683、195684、195685、195686、195687、195688、195689、195690、195691、195692表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195589表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195693、195694、195695、195696、195697、195698、195699、195700、195701、195702、195703、195704、195705、195706、195707、195708、195709、195710、195711、195712、195713表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195590表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号195734、195735、195736、195737、195738、195739、195740、195741、195742、195743、195744、195745、195746、195747、195748、195749、195750、195751、195752、195753表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195592表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195754、195755、195756、195757、195758、195759、195760、195761、195762、195763、195764、195765、195766、195767、195768、195769、195770、195771、195772、195773、195774表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195593表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号195795、195796、195797、195798、195799、195800、195801、195802、195803、195804、195805、195806、195807、195808、195809、195810、195811、195812、195813、195814、195815表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195595表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号195877、195878、195879、195880、195881、195882、195883、195884、195885、195886、195887、195888、195889、195890、195891、195892、195893、195894、195895、195896表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195599表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195897、195898、195899、195900、195901、195902、195903、195904、195905、195906、195907、195908、195909、195910、195911、195912、195913、195914、195915、195916表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195600表示的核苷酸序 列的ORF。
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具有由序列号195937、195938、195939、195940、195941、195942、195943、195944、195945、195946、195947、195948、195949、195950、195951、195952、195953、195954、195955、195956表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195602表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号195957、195958、195959、195960、195961、195962、195963、195964、195965、195966、195967、195968、195969、195970、195971、195972、195973、195974、195975、195976表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195603表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号196037、196038、196039、196040、196041、196042、196043、196044、196045、196046、196047、196048、196049、196050、196051、196052、196053、196054、196055、196056表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195607表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196057、196058、196059、196060、196061、196062、196063、196064、196065、196066、196067、196068、196069、196070、196071、196072、196073、196074、196075、196076表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195608表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196077、196078、196079、196080、196081、196082、196083、196084、196085、196086、196087、196088、196089、196090、196091、196092、196093、196094、196095、196096表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195609表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196097、196098、196099、196100、196101、196102、196103、196104、196105、196106、196107、196108、196109、196110、196111、196112、196113、196114、196115、196116表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195610表示的核苷酸序列的ORF。
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具有由序列号196157、196158、196159、196160、196161、196162、196163、196164、196165、196166、196167、196168、196169、196170、196171、196172、196173、196174、196175、196176表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195613表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196177、196178、196179、196180、196181、196182、196183、196184、196185、196186、196187、196188、196189、196190、196191、196192、196193、196194、196195、196196表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195614表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196197、196198、196199、196200、196201、196202、196203、196204、196205、196206、196207、196208、196209、196210、196211、196212、196213、196214、196215、196216表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195615表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196217、196218、196219、196220、196221、196222、196223、196224、196225、196226、196227、196228、196229、196230、196231、196232、196233、196234、196235、196236表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195616表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196237、196238、196239、196240、196241、196242、196243、196244、196245、196246、196247、196248、196249、196250、196251、196252、196253、196254、196255、196256表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195617表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196257、196258、196259、196260、196261、196262、196263、196264、196265、196266、196267、196268、196269、196270、196271、196272、196273、196274、196275、196276表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195618表示的核苷酸序 列的ORF。
具有由序列号196277、196278、196279、196280、196281、196282、196283、196284、196285、196286、196287、196288、196289、196290、196291、196292、196293、196294、196295、196296表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195619表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196297、196298、196299、196300、196301、196302、196303、196304、196305、196306、196307、196308、196309、196310、196311、196312、196313、196314、196315、196316表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195620表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196317、196318、196319、196320、196321、196322、196323、196324、196325、196326、196327、196328、196329、196330、196331、196332、196333、196334、196335、196336表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195621表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196337、196338、196339、196340、196341、196342、196343、196344、196345、196346、196347、196348、196349、196350、196351、196352、196353、196354、196355、196356、196357、196358、196359、196360、196361、196362、196363、196364、196365、196366、196367、196368、196369、196370、196371、196372、196373、196374、196375、196376、196377、196378、196379、196380、196381、196382、196383、196384、196385、196386表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195622表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196387、196388、196389、196390、196391、196392、196393、196394、196395、196396、196397、196398、196399、196400、196401、196402、196403、196404、196405、196406、196407、196408、196409、196410、196411、196412、196413、196414、196415、196416、196417、196418、196419、 196420、196421、196422、196423、196424、196425、196426、196427、196428、196429、196430、196431、196432、196433、196434、196435、196436、196437表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195623表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196438、196439、196440、196441、196442、196443、196444、196445、196446、196447、196448、196449、196450、196451、196452、196453、196454、196455、196456、196457、196458、196459、196460、196461、196462、196463、196464、196465、196466、196467、196468、196469、196470、196471、196472、196473、196474、196475、196476、196477、196478、196479、196480、196481、196482、196483、196484、196485、196486、196487表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195624表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196488、196489、196490、196491、196492、196493、196494、196495、196496、196497、196498、196499、196500、196501、196502、196503、196504、196505、196506、196507、196508、196509、196510、196511、196512、196513、196514、196515、196516、196517、196518、196519、196520、196521、196522、196523、196524、196525、196526、196527、196528、196529、196530、196531、196532、196533、196534、196535、196536、196537表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195625表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196538、196539、196540、196541、196542、196543、196544、196545、196546、196547、196548、196549、196550、196551、196552、196553、196554、196555、196556、196557、196558、196559、196560、196561、196562、196563、196564、196565、196566、196567、196568、196569、196570、196571、196572、196573、196574、196575、196576、196577、196578、196579、196580、196581、196582、196583、196584、196585、196586、196587、196588表示的核苷酸序列的探针选自具有由 序列号195626表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196589、196590、196591、196592、196593、196594、196595、196596、196597、196598、196599、196600、196601、196602、196603、196604、196605、196606、196607、196608、196609、196610、196611、196612、196613、196614、196615、196616、196617、196618、196619、196620、196621、196622、196623、196624、196625、196626、196627、196628、196629、196630、196631、196632、196633、196634、196635、196636、196637、196638表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195627表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196639、196640、196641、196642、196643、196644、196645、196646、196647、196648、196649、196650、196651、196652、196653、196654、196655、196656、196657、196658、196659、196660、196661、196662、196663、196664、196665、196666、196667、196668、196669、196670、196671、196672、196673、196674、196675、196676、196677、196678、196679、196680、196681、196682、196683、196684、196685、196686、196687、196688、196689表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195628表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196690、196691、196692、196693、196694、196695、196696、196697、196698、196699、196700、196701、196702、196703、196704、196705、196706、196707、196708、196709、196710、196711、196712、196713、196714、196715、196716、196717、196718、196719、196720、196721、196722、196723、196724、196725、196726、196727、196728、196729、196730、196731、196732、196733、196734、196735、196736、196737、196738、196739、196740表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195629表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196741、196742、196743、196744、196745、196746、196747、196748、196749、196750、196751、196752、 196753、196754、196755、196756、196757、196758、196759、196760、196761、196762、196763、196764、196765、196766、196767、196768、196769、196770、196771、196772、196773、196774、196775、196776、196777、196778、196779、196780、196781、196782、196783、196784、196785、196786、196787、196788、196789、196790表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195630表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196791、196792、196793、196794、196795、196796、196797、196798、196799、196800、196801表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195631表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196802、196803、196804、196805、196806、196807、196808、196809、196810、196811、196812表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195632表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196813、196814、196815、196816、196817、196818、196819、196820、196821、196822、196823表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195633表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196824、196825、196826、196827、196828、196829、196830、196831、196832、196833、196834表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195634表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196835、196836、196837、196838、196839、196840、196841、196842、196843、196844、196845表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195635表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196846、196847、196848、196849、196850、196851、196852、196853、196854、196855、196856表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195636表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196857、196858、196859、196860、196861、196862、196863、196864、196865、196866、196867表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195637表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196868、196869、196870、196871、196872、196873、196874、196875、196876、196877、196878表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号195638表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196879、196880、196881、196882、196883、196884、196885、196886、196887、196888、196889表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195639表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196890、196891、196892、196893、196894、196895、196896、196897、196898、196899、196900表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195640表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196901、196902、196903、196904、196905、196906、196907、196908、196909、196910、196911表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195641表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196912、196913、196914、196915、196916、196917、196918、196919、196920、196921、196922表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195642表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196923、196924、196925、196926、196927、196928、196929、196930、196931、196932、196933表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195643表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196934、196935、196936、196937、196938、196939、196940、196941、196942、196943、196944表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195644表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196945、196946、196947、196948、196949、196950、196951、196952、196953、196954、196955表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195645表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196956、196957、196958、196959、196960、196961、196962、196963、196964、196965、196966表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195646表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196967、196968、196969、196970、196971、196972、196973、196974、196975、196976、196977表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195647表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196978、196979、196980、196981、196982、196983、196984、196985、196986、196987、196988表示的核苷酸序 列的探针选自具有由序列号195648表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号196989、196990、196991、196992、196993、196994、196995、196996、196997、196998、196999表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195649表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号197000、197001、197002、197003、197004、197005、197006、197007、197008、197009、197010表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195650表示的核苷酸序列的ORF。
具有由序列号197011、197012、197013、197014、197015、197016、197017、197018、197019、197020、197021表示的核苷酸序列的探针选自具有由序列号195651表示的核苷酸序列的ORF。
(实施例18)在锌缺乏环境下具有高诱导性的分子标记物的鉴别
1.mRNA的制备
在30℃使菌株34/70于LZMM培养基+40μM硫酸锌中振摇培养过夜。LZMM培养基含有含有0.17%酵母氮基w/o氨基酸(DIFCO制)、0.5%硫酸铵、20mM柠檬酸钠(pH4.2)、125μM MnCl2、10μM FeCl2、2%麦芽糖、10mM EDTA(pH8.0)。收集细胞并以无菌蒸馏水洗涤三次,然后接种至光学密度(OD600)为0.25的500ml下述培养基中:1)乏锌培养基(LZMM培养基)、2)富锌培养基(LZMM培养基+40μM硫酸锌)、3)氧化应激培养基(LZMM+40μM硫酸锌+2mMH2O2)、4)碳饥饿培养基(从上述LZMM培养基+40μM硫酸锌中去除麦芽糖)。细胞在30℃生长6小时然后收集,用于RNA制备。
总RNA的制备利用
Figure S05837204120070429D017031
小试剂盒(QIAGEN制)按照操作手册来进行。总RNA中的Poly(A)+mRNA的制备利用Oligotex Direct mRNA试剂盒(QIAGEN制)按照操作手册来进行。
2.生物素标记cRNA的合成
生物素标记cRNA的合成利用生物阵列高收率RNA转录标记试剂盒(Affymetrix制)按照操作手册来进行。
3.杂交
将5μg的生物素标记cRNA、1.7μl的3nM对照寡聚核苷酸B2(Affymetrix制)、5μl的20X真核细胞杂交对照(Affymetrix制)、1μl的10mg/ml鲱精DNA(Affymetrix制)、1μl的50mg/ml乙酰化BSA(Affymetrix制)、50μl的2X杂交缓冲液(Affymetrix制)与水(Affymetrix制)进行混合,以使终体积为100μl,并按照Affymetrix的技术手册杂交至DNA阵列。
杂交16小时后,移出杂交混合物(cocktail),以
Figure S05837204120070429D017032
FludicsStation(Affymetrix制)等洗涤DNA阵列,然后以600μl的抗生蛋白链菌素藻红蛋白(300μl的2X MES染色缓冲液(Affymetrix制)、24μl的50mg/ml乙酰化BSA(Affymetrix制)、6μl的1mg/ml抗生蛋白链菌素藻红蛋白(Affymetrix制)、270μl的水(Affymetrix制)按照Affymetrix的技术手册来进行染色。
4.数据分析
DNA阵列信号强度的检测利用Affymetrix的基因芯片分析基础系统和分析软件(GCOS;基因芯片操作软件1.0)按照技术手册来进行。
利用GCOS中的全探针组进行标准化以调节比较分析中的信号。利用GCOS分别创建在下述(1)至(3)中所进行的比较的基因表达的比较条件:(1)乏锌条件与富锌条件;(2)氧化应激条件与富锌条件;(3)碳饥饿条件与富锌条件。仅将上述比较(1)中基因表达以信号对数比衡量增加了0.3以上的基因列于表4。
Sc-1159-1_at,Sc-1161-1_at,Sc-5030-1_at,Sc-2123-1_at分别为Sc YGL258W,Sc YGL256W,Sc YOL154W,Sc YKL175W。已知这些基因在乏锌条件下具有转录诱导(Higgins,V.J.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,69:7535-7540(2003))。将-4216-1_s_at设计为与Non-Sc YKL175W相应,其功能被认定为锌离子转运子(transporter)活性已知锌离子转运子在乏锌条件下具有转录诱导。概括地说,在乏锌条件下被高度诱导的分子标记物可利用下部发酵酵母DNA阵列进行鉴别。
(表4)
Figure S05837204120070429D017051
信号对数比(2n)表示两个阵列进行比较时转录物的大小和方向。该检测表示,基于GCOS中带有缺省参数的检测运算所计算的p值而进行的检测,是否确实检测到了转录物(P;存在)或未检测到转录物(A;不存在)。变化值表示,基于GCOS中带有缺省参数的检测运算所计算的p值的变化,转录物是否确实有所增加(I;增加)或减少(D;减少)或未发生变化(NC;无变化)。类型表示基因是否为Sc ORF(Sc)或Non-Sc ORF(Non-Sc)。
(实施例19)酿造酵母在啤酒发酵条件下的基因表达分析
利用34/70菌株在下述条件下进行发酵实验。
最初提取物:12.84%
发酵等级:2升
溶解氧浓度:约9ppm
发酵温度:15℃
接种量:10g湿酵母细胞/2L麦芽汁
周期性地对麦芽汁进行取样,并监测细胞生长(OD600)(图12-(a))以及表观浸出物(图12-(b))。按照实施例18中所述方法,利用接种42小时后从发酵管中取出的细胞进行mRNA的提取,并进行生物素标记以及杂交至下部发酵酵母DNA阵列。信号强度的检测利用Affymetrix制的基因芯片分析基础系统和分析软件(GCOS;基因芯片操作软件1.0)来进行。
有数个基因以上的Sc型探针组和non-Sc型探针组表现出非常不同的信号强度。与啤酒发酵过程中的亚硫酸盐生成相关的SSU1基因和MET14基因的示例示于表5中。对于34/70菌株的SSU1基因和MET14基因来说,non-Sc型基因的表达高于Sc型基因的表达,对于上述两种基因,该表达比分别为3.4倍和7倍。
为了确认该差别既不是因为每一探针组的杂交效率的不同也不是因为Sc型和non-Sc型探针组之间的交叉杂交,利用34/70菌株、实验室菌株(Saccharomycescerevisiae)S288C和啤酒酵母菌株IFO11023来进行比较基因组与下部发酵酵母DNA阵列的杂交。利用上述方法来进行基因组DNA的制备、与DNA阵列的杂交、以及信号强度的检测。如表6所示,对于SSU1基因来说,non-Sc型与Sc型的信号强度比率为1.0;而对于MET14基因来说,non-Sc型与Sc型的信号强度比率为1.3。该结果说明Sc和non-Sc探针组的杂交效率几乎相同。
此外,不具有non-Sc型基因的S288C菌株与non-Sc型探针组具有非常低的信号强度,而不具有Sc型SSU1基因和Sc型MET14的IFO11023菌株对于Sc型SSU1和Sc型MET14探针组具有非常低的信号强度。这些结果清楚表明Sc和non-Sc型探针组之间未发生交叉杂交。
由上述结果可知,在34/70菌株中,non-Sc SSU1和non-Sc MET14的表达分别显著高于Sc SSU1和Sc MET14的表达。这些基因被认为是与下部发酵酵母中的高亚硫酸盐生成相关的候选物。
总的来说,上文揭示了,利用下部发酵酵母DNA阵列所进行的酿造酵母基因表达分析对于功能分析基因的选择是有用的。
(表5)
基因 Sc SSU1 non Sc SSU1 Sc MET14 non Sc MET14
探针组 Sc-3594-1_at Lg-3333-1_at Sc-2246-1_at Lg-1564-1_at
信号强度 145.2 490.4 177.3 1245.8
(表6)
Figure S05837204120070429D017071
(实施例20)通过与下部发酵酵母DNA阵列的比较基因组杂交进行酿造菌株的鉴定
按照实施例8中所述进行酵母基因组DNA的制备以及与DNA阵列的杂交。利用Affymetrix制的基因芯片分析基础系统和分析软件(GCOS;基因芯片操作1.0)来进行DNA阵列信号强度的检测。如表7所示,计算探针中与酿造酵母的DNA杂交的百分比,并估算34/70菌株与受试菌株之间的同一性。BH225,BH232和BH235菌株与下部发酵酵母DNA阵列的Sc型探针和non-Sc型探针的杂交超过99%。这说明这些菌株与34/70菌株非常相近,且该阵列对于这些菌株的基因表达分析是有用的。另一方面,BH212菌株表现出相对较低的杂交百分比(对于Sc型和non-Sc型探针分别为97.8和97.7%),这表示该菌株与34/70菌株略有不同。由上述结果可知,可估算大量酿造菌株之间的关系,并可进行大量酿造菌株的鉴别。
由BH212菌株的分析结果发现了一些具有较低信号强度的基因座。它们可能在BH212菌株中缺失,或其序列可能与34/70菌株中的不相同。与之相对,还发现了一些具有较高信号强度的基因座。它们在BH212菌株中可能具有高拷贝数。由于该类基因座可能与BH212和34/70菌株之间的发酵特性的差别相关,因而可将该类基因座选择用于功能性分析。
(表7)杂交探针的百分比
菌株号 34/70 BH225 BH232 BH235 BH212
Sc型 99.6 99.8 99.8 99.8 97.8
Non-Sc型 99.5 99.9 99.9 99.6 97.7
(实施例21)核苷酸多态性的检测
此外,通过分析比较基因组杂交可检测(单)核苷酸多态性。每一探针的寡聚核苷酸组由与34/70菌株的序列完全相同的完全匹配寡聚核苷酸(PM)和在寡聚核苷酸的中央位置具有一个碱基错配的错配寡聚核苷酸(MM)组成。将实验室菌株S288C的基因组DNA与下部发酵酵母DNA阵列进行杂交。如表8所示,在MM中的信号比在PM中的信号更高(高于5倍)的探针具有单核苷酸多态性。
(表8)
Figure S05837204120070429D017081
工业实用性
本发明中制备了集合有工业酵母的全基因组序列的数据库,或者,更特异地,制备了集合有用于制备啤酒等酒精饮料的酿造酵母的全基因组序列的数据库。利用该数据库对酿造酵母的基因进行选择,通过酵母细胞中的破坏和过表达对基因的功能进行分析,并寻找与所需酿造特征相关的基因。此外,还可以通过控制所述基因的表达来培养酵母菌株,并可制备产量或质量得到提高的酒精或酒精饮料,例如可制备具有高浓度的亚硫酸盐的酒精饮料以使所述产品具有抗氧化活性、优异的口味稳定性和更长的保质期。
在本发明中,基于集合有工业酵母(或者,更特异地,酿造酵母)的全基因组序列的数据的数据库来制备DNA阵列。使用该DNA阵列可以分析基因的功能、鉴别工业酵母、以及检测核苷酸多态性等。
序列列表 
序列表通过一光盘进行提交,光盘中的内容以参考的方式全部引入本文中。所述光盘中具有一命名为″YCT966sequence listing″的数据,该数据于2004年8月23日创建,其大小为52,018kb(kirobytes)。 
序列表的摘要如下所述: 
序列号1表示nonSc-SSU1基因的核酸序列。 
SEQ ID NO;2表示nonSc-MET14基因的核酸序列。 
序列号3表示由核酸序列所推出的nonSc-SSU1蛋白的氨基酸序列。 
SEQ ID NO;4表示由核酸序列推出的nonSc-MET14蛋白的氨基酸序列。 
序列号5-32表示用于扩增的寡聚核苷酸引物。 
序列号33-6236表示可优选用作微阵列探针的non-Sc型ORF的6204个DNA序列。 
SEQ ID Nos.6237-75336表示可优选用作微阵列探针的基于序列号33-6236的DNA序列的寡聚核苷酸序列。 
序列号75337-82784表示Sc型ORF的7448个DNA序列。 
序列号82785-166153表示基于序列号75337-82784的DNA序列的寡聚核苷酸序列。 
序列号166154-166181表示可优选用作微阵列探针的来自34/70菌株的线粒体ORF的28个DNA序列。 
序列号166182-166489表示表示可优选用作微阵列探针的基于序列号166154-166181的寡聚核苷酸序列。 
序列号166490-167042表示经鉴别并非为上述non-Sc ORF但是通过利用NCBI-BlastX同源搜索发现与Saccharomyces cerevisiae的蛋白具有显著相似型的553个DNA序列。 
序列号167043-173124表示基于序列号166490-167042的DNA序列的寡聚核苷酸序列。 
序列号173125-174603表示经鉴别并非为上述ORF但是通过利用NCBI-BlastP同源搜索发现与Saccharomyces cerevisiae的蛋白具有显著相似 型的1479个ORF的DNA序列。 
序列号174604-190810表示基于序列号173125-174603的DNA序列的寡聚核苷酸序列。 
序列号190811-191213表示经鉴别并非为34/70菌株中的Sc型ORF的由SGD所得的403个Saccharomyces cerevisiae ORF。 
SEQ ID Nos.191214-195587表示基于序列号190811-191213的寡聚核苷酸序列。 
序列号195588-195651表示用作内标的来自Saccharomyces cerevisiae,Bacillus subtulis,Escherichia coli.,或Bacteriophage Pl的基因的64个DNA序列。 
SEQ ID Nos.195652-197021表示基于序列号195588-195651的寡聚核苷酸序列。 
在序列表的多个核苷酸序列中所使用的字符″n″与本领域中公知的含义相应,其表示或代表a或g或c或t/u、或未知、或其它。

Claims (14)

1.一种DNA阵列,其包含一种或多种DNA,其中的每一种DNA选自下述组(1)至(3)中的至少一组:
(1)由工业酵母的开放阅读框的核苷酸序列或其部分构成的DNA,其中所述开放阅读框编码与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有70至97%同一性的氨基酸序列,并且其中所述核苷酸序列选自序列号33~6236、序列号166154~166181、序列号6237~75336和序列号166182~166489,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA;
(2)由序列号166490~167042中的任一核苷酸序列构成的DNA,或由序列号167043~173124中的任一核苷酸序列构成的DNA,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA;和
(3)由序列号173125~174603中的任一核苷酸序列构成的DNA,或由序列号174604~190810中的任一核苷酸序列构成的DNA,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA。
2.如权利要求1所述的DNA阵列,其包含的DNA中至少一种选自(1)~(3)中的每一组。
3.如权利要求1或2所述的DNA阵列,其除包含选自(1)至(3)的至少一组的DNA之外,还进一步包含下述(4)组中的DNA:
(4)由工业酵母的开放阅读框的核苷酸序列或其部分构成的DNA,其中所述开放阅读框编码与Saccharomyces cerevisiae中的基因所编码的氨基酸序列具有97%以上同一性的氨基酸序列,并且其中所述核苷酸序列选自序列号75337~82784或序列号82785~166153,或由与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA;
并任选包含下述(4′)组中的DNA:
(4′)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是与(4)的DNA具有1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的DNA阵列,其除包含选自(1)至(3)中的至少一组DNA之外,还包含选自下述(5-1)、(6-1)和(7-1)中的至少一组DNA:
(5-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是与(1)的DNA具有1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列;
(6-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是与(2)的DNA具有1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,以及
(7-1)由下述核苷酸序列所构成的DNA,所述核苷酸序列是与(3)的DNA具有1个碱基错配的核苷酸序列,或是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的DNA阵列,其包含选自(1)至(3)的至少一组DNA、选自(5-1)、(6-1)和(7-1)中的至少一组DNA、(4)组中的DNA以及(4′)组中的DNA。
6.如权利要求1-5中的任意一项所述的DNA阵列,其中所述DNA为由10-30个核苷酸构成的寡核苷酸。
7.权利要求1-6中的任意一项所述的DNA阵列用于工业酵母基因的分析方法中的应用。
8.鉴别工业酵母的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与权利要求3-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)计算与(1)至(3)的任一组的杂交率,并计算与(4)组的杂交率。
9.权利要求8所述的鉴别方法,其中使用权利要求5中的DNA阵列,并且
将与(1)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(1)至(3)的任一组的杂交率,而并非将与(5-1)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(1)至(3)的任一组的杂交率;并且
将与(4)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(4)组的杂交率,而并非将与(4′)组中的DNA进行杂交的基因的百分比确定为与(4)组的杂交率。
10.检测工业酵母基因组中的核苷酸多态性的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母制备的基因组DNA与权利要求4-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)选择与(5-1)、(6-1)和(7-1)任一组中的DNA的杂交强度高于与(1)至(3)任一组中的DNA的杂交强度的基因。
11.筛选工业酵母的有用菌株的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母菌株制备的基因组DNA与权利要求1-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)当所述菌株满足下述条件时,将其确定为有用的工业酵母菌株:所述菌株含有其杂交强度较与(1)至(3)任一组中的DNA的平均杂交强度高1.5倍、或是上述平均杂交强度的2/3以下的一种或多种基因。
12.筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a)将由工业酵母菌株制备的基因组DNA与权利要求1-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)筛选其杂交强度较与(1)至(3)任一组中的DNA的平均杂交强度高1.5倍、或是上述平均杂交强度的2/3以下的基因。
13.筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a-1)将由工业酵母制备的基因组DNA、cDNA或cRNA与权利要求1-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;
(a-2)与步骤(a-1)相独立地,将由其它工业酵母制备的基因组DNA、cDNA或cRNA与权利要求1-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;以及
(b)筛选在步骤(a-1)中与(1)至(3)中任一组的DNA的杂交强度与在步骤(a-2)中的杂交强度明显不同的基因。
14.筛选工业酵母基因的方法,其包括下述步骤:
(a-1)将由工业酵母制备的cDNA或cRNA与权利要求1-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交;
(a-2)与步骤(a-1)相独立地,将由工业酵母制备的cDNA或cRNA与权利要求1-6中任意一项所述的DNA阵列进行杂交,其中,(a-2)步骤中所述的工业酵母与(a-1)步骤中所述的工业酵母在不同的培养条件下进行培养;以及
(b)筛选在步骤(a-1)中与(1)至(3)中任一组的DNA的杂交强度与在步骤(a-2)中的杂交强度明显不同的基因。
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