CN101045158A - 胰岛素类似物干粉组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胰岛素类似物干粉组合物及其制备方法，具体的说，本发明涉及胰岛素类似物：LysB28ProB29人胰岛素的无定型干粉组合物及其制备方法。

Description

胰岛素类似物干粉组合物及其制备方法

技术领域：

本发明属于药物剂型和制剂技术领域，涉及用于糖尿病人的胰岛素类似物肺部吸入用干粉组合物的制备。更具体的说，本发明涉及胰岛素类似物：LysB28ProB29人胰岛素的无定型干粉组合物及其制备方法。

背景技术：

糖尿病是影响约6％世界人口的疾病。此外，大多数国家的人口老化，而糖尿病在老年人口中特别常见。高水平的血糖是由于低水平或缺乏内源性胰岛素引起的，它改变正常的人体化学，并可能导致许多器官的微血管系统衰竭。未治疗的糖尿病患者常常经受切断术和遭受失明以及肾衰竭。据估计，仅在美国糖尿病副作用的医学治疗和由于糖尿病的不当治疗引起的生产力丧失的年费用约400亿美元.常规的胰岛素治疗采用腹部或大腿部位皮下注射。为了维持可接受的血糖水平，通常需要每天注射胰岛素至少一次或者两次。

遗憾的是，由于与维持葡萄糖水平的精确控制需要的多次注射有关的不舒服，许多糖尿病患者不愿意接受强治疗。该类型治疗可能在心理和生理上均是痛苦的。因此，提供可以避免自我注射同时胰岛素又可被机体迅速利用的其它胰岛素制剂和给药途径，长期以来一直是人们的一个目标。口服后，胰岛素迅速在胃肠道降解而不能吸收入血流。因此，许多研究者已经研究了给予胰岛素的替代途径，例如直肠、经皮和鼻途径。当这些技术避免了皮下注射的不适以及不协调的同时，它们也都遭受了自身的限制，迄今，这些给药途径仍未产生有效的胰岛素吸收。直肠内及阴道内给药不方便，不舒适，而且后者也不能用于所有的糖尿病人。鼻内释放将方便一些，可能也比注射更容易接受，但由于鼻粘膜有一层厚的阻止大35分子通过的上皮层，需要使用有潜在毒性的“增透剂”来影响胰岛素透过鼻粘膜。

用干粉吸入的方法使用胰岛素已经报道了很多，具体内容可依据中国专利95191910.5和中国专利02112513.9所述内容。

已知，胰岛素是一个分子量为5800道尔顿的多肽激素，在存在锌的情况下，人胰岛素自缔合为稳定的六聚体型。稳定的六聚体的离解是胰岛素由皮下注射部位吸收入血流的限速步骤。

但是速效的胰岛素类似物则不易形成稳定的六聚体。因为这些胰岛素类似物不易自缔合成稳定的高级复合物，所以称为单体胰岛素类似物。这种自缔合的缺乏是由于人胰岛素的氨基酸序列中的修饰引起的。这些胰岛素类似物包括：i)用Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代B28位的氨酰基残基，而B29位的氨酰基残基是Lys或Pro；ii)B28、B29和B30位的氨酰基残基缺失；或iii)B27位的氨酰基残基缺失。这些胰岛素类似物已公开于Chance等，美国专利第5,514,646号；Chance等，美国专利申请系列第08/255,297号；Brems等，Protein Engineering，5：527-533(1992)；Brange等，EPO公布号第214,826号(于1987年3月18日公布)；和Brange等，Current Opinion in structuralBiology，1：934-940(1991)。

本发明所制备的干粉组合物中含有胰岛素类似物，优选的胰岛素类似物是AspB28。更优选的胰岛素类似物是LysB28ProB29。本发明意外的发现，LysB28ProB29人胰岛素传递后由肺的吸收至少与皮下给予后一样迅速。

本发明根据胰岛素类似物所具有的上述特性，提供一种肺部给药的使用方式，并制成肺部给药的胰岛素类似物干粉组合物，以达到最好治疗效果。

现有肺部给药方式经常是通过液体制剂的喷雾法来完成，这需要使用笨重的液体喷雾器。此外，蛋白质多肽类药物在水溶液状态下稳定性较差。本发明提供稳定的胰岛素类似物肺部给药干粉组合物。这种方法所制得的干粉组合物非常方便，能够自我给药，并且可以通过相对较少的呼吸次数(最好少于10次)传送需要的总剂量。这种组合物提供了机体对胰岛素类似物的迅速吸收，可以在45分钟或更少的时间内达到血清峰值，并在1小时或更少的时间内达到血糖谷值。从而减少或消除速效胰岛素类似物的注射。本发明的的组合物是稳定的。

发明内容：

本发明提供无定型的胰岛素类似物干粉组合物及其制备方法。

本发明所述胰岛素类似物包括：i)用Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代B28位的氨酰基残基，而B29位的氨酰基残基是Lys或Pro；ii)B28、B29和B30位的氨酰基残基缺失；或iii)B27位的氨酰基残基缺失。优选的是Asp取代B28位脯氨酸的胰岛素类似物天冬胰岛素(Aspart)和B28位脯氨酸与B29位赖氨酸互换的胰岛素类似物赖脯胰岛素(Lispro)，更为优选的是赖脯胰岛素(Lispro，LysB28ProB29)。

本发明的制备方法是，将胰岛素类似物溶于一个含药物载体的缓冲水溶液中，然后将该溶液干燥制得颗粒尺寸小于10μm的无定型颗粒，再经过微粉化处理制得本发明的干粉。

其中所述载体选自糖、有机盐、氨基酸、多肽或蛋白质，这些载体在喷雾干燥中可以制得大体无定形的结构。无定形载体可以增加胰岛素类似物在贮存过程中的稳定性。更为有利的是，这种稳定化的制剂还可以在吸入到肺泡区后有效地将胰岛素类似物释放进入血液。

其中所述干燥可以采用喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、蒸发干燥等方式来形成无定型结构。优选的是喷雾干燥，得到的无定型胰岛素类似物干粉组合物再经过研磨粉碎或微粉化处理制得在适宜颗粒大小范围内的干粉粒子。

本发明的组合物是通过吸入方式使用的，如可将本发明的组合物装入型号为1-4号的胶囊，优选型号为4号。按照本发明，胰岛素类似物干粉组合物可以用本领域已知的、用于吸入给予治疗剂的各种胶囊型粉末吸入装置中的任何一种传递。适合实施本发明的市售吸入装置的具体实例有国产的胶囊型粉剂吸入器(上海天平制药厂)及美国的Inhale和瑞典的Astra胶囊型干粉吸入装置等。优选采用上海天平制药厂的胶囊型粉剂吸入器，该装置采用挤破胶囊的装置可以反复使用。

本发明的组合物优选地由直径低于10μm颗粒组成，更为优选的低于7.5μm，最为优选的低于5μm，通常在0.1μm至5μm的范围之内。根据本发明，组合物干粉中的水分含量低于重量比的大约10％，通常低于重量比的大约5％，优选低于重量比的大约3％。

本发明的组合物，其特征在于在，组合物中含有重量比为5％至98％的胰岛素类似物(如：LysB28ProB29人胰岛素)，较好为10％至98％的胰岛素类似物(如：LysB28ProB29人胰岛素)，更为常用的是从20％至80％的胰岛素类似物(如：LysB28ProB29人胰岛素)附着在一个合适的药物载体上。

本发明所述载体，选自糖、有机盐、氨基酸、多肽或蛋白质，

药物载体的量为2-95％，优选的为2-90％，更优选的为20-80％。

其中所述的糖选自甘露醇、棉子糖、乳糖、麦芽糖、糊精和海藻糖。优选的为甘露醇。

其中所述的有机盐选自柠檬酸钠、乙酸钠、抗坏血酸钠。优选的为柠檬酸钠。

其中所述的氨基酸选自甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸。优选的为甘氨酸。其中所述的多肽或蛋白质选自人血清白蛋白、鱼精蛋白。优选的为人血清白蛋白。

本发明的组合物，其优选的配方组成为：

胰岛素类似物                          5％至98％

糖                                    0.5％至94％

有机盐                                0.5％至94％

氨基酸                                0.5％至94％

蛋白质                                0％至93.5％

更优选的是

胰岛素类似物                          20％至80％

糖                                    5％至65％

有机盐                                5％至65％

氨基酸                                5％至65％

蛋白质                                0％至65％。

特别优选的是：

胰岛素类似物                          50％，

糖                                    10％，

有机盐                                20％，

氨基酸                                20％。

具体更优选的是

胰岛素类似物                          20％至80％

甘露醇                                5％至65％

甘氨酸                                5％至65％

柠檬酸钠                              5％至65％

人血清白蛋白                           0％至65％

具体特别优选的是

胰岛素类似物                           50％，

甘露醇                                 10％，

甘氨酸                                 20％，

柠檬酸钠                               20％。

以上组成的量是根据投料量计算的，排除了水的量。

本发明的干粉组合物及其制备方法优点在于：

本发明所述的胰岛素类似物干粉组合物颗粒微细，易于粉雾化，肺部沉积性能良好，溶解性好，肺部吸收好。本发明所述的胰岛素类似物干粉组合物制备工艺简单易操作，制备过程不破坏胰岛素类似物结构，产品质量稳定。胰岛素干粉组合物的胶囊剂能方便地进行工业化生产，而且便于携带，胶囊中胰岛素类似物的量可准确控制。

具体实施方式：

下列实例是为了说明本发明，不是限定本发明。

实施例1

将2.5g的LysB28ProB29人胰岛素溶于含有药物载体(甘露醇1.25g或糊精1.25g)的1000ml柠檬酸钠缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为6.5±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃到120℃之间，供给液体速度为5ml/min，形成出口处的温度在60℃到70℃之间。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。生成的粉末在于燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

实施例2

将2.5g的LysB28ProB29人胰岛素溶于含有药物载体(甘氨酸1.25g，或赖氨酸1.25g)的1000ml磷酸盐缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为6.8±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃到120℃之间，供给液体速度为5ml/min，形成出口处的温度在70℃到80℃之间。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。装入4号胶囊，干燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

实施例3

将5g的LysB28ProB29人胰岛素溶于含有药物载体(甘露醇1g，甘氨酸2g)的1000ml柠檬酸钠(约2g)缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为6.5±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃到120℃之间，供给液体速度为5ml/min，形成出口处的温度在60℃到70℃之间。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。生成的粉末在于燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

实施例4

将5g的Asp取代B28位脯氨酸的胰岛素类似物天冬胰岛素(Aspart)溶于含有药物载体(甘露醇1g，甘氨酸2g)的1000ml柠檬酸钠(约2g)缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为6.5±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃到120℃之间，供给液体速度为5ml/min，形成出口处的温度在60℃到70℃之间。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。生成的粉末在于燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

实施例5

将5g的B27位的氨酰基残基缺失的胰岛素类似物溶于含有药物载体(甘露醇1g，甘氨酸2g)的1000ml柠檬酸钠(约2g)缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为6.5±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃到120℃之间，供给液体速度为5ml/min，形成出口处的温度在60℃到70℃之间。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。生成的粉末在于燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

实施例6

将实施例1和实施例2方法制备得到的LysB28ProB29人胰岛素和药物载体的混和物的无定型颗粒作简单研磨分散后，加入到Micron-Master超细研磨粉碎机械中，利用喷射空气将被研磨的颗粒加速到声速，粒子之间产生相互碰撞来完成的。粉碎30分钟，取出微粉化颗粒。颗粒平均粒径小于10μm。

实施例7

实施例3得到的粉末的颗粒粒径大小分布的测量是将粉末铺散在载玻片上，采用带有刻度标尺的光学显微镜仪观察记录粒径大小，并进行数据分析。结果未发现粒径＞10μm颗粒，粉末的水分含量的测定是通过Kari Fischer法在三菱CA-06湿度计上进行。

在粉末制作过程前后的胰岛素类似物完整性的测量是以人胰岛素标准品为参照，将称量过的部分粉末重新溶于蒸馏水中并将重新溶解的溶液与加人喷雾干燥器内的原始溶液进行比较。通过反相HPLC中的保留时间和峰面积来测定胰岛素类似物分子是否在此过程中发生了化学修饰或降解。通过偏光显微镜来确证胰岛素类似物粉末的无定型特性。

实施例8

经大鼠肺部给药试验

健康♂SD大鼠禁食(不禁水)12～14h，随机分为6组，每组5只。第1组为生理盐水气管滴注组(空白对照组)；第2、3组分别为普通INS和胰岛素类似物(LysB28ProB29人胰岛素)溶液(5u·kg-1)气管滴注组(药物对照组)；第4、5组分别为甘氨酸和赖氨酸溶液(5％)气管滴注组(辅料队照组)；第6、7组分别为甘氨酸和赖氨酸与胰岛素类似物(LysB28ProB29人胰岛素)混合溶液气管滴注组(剂量均为5u·kg-1)。气管滴注给药前用15％乌拉坦将大鼠麻醉，以细线挂住门牙并挂在一倾斜约80°的木板上，大鼠可自主呼吸；剪开喉部皮肤，露出气管，以平头针伸入气管至分支处，待其吸气时快速滴注药液，给药后维持60s，再与水平成30°放置。于一定时间点眼眶静脉取血0.4mL，4000rpm离心10min分离得血清。

血糖含量测定

用葡萄糖氧化酶法测定血糖，样品管和标准管中分别加入血清和葡萄糖标准溶液20μL，均与酶酚混合试剂3mL混合均匀，37℃水浴保温20min后，以酶酚混合试剂为空白，于505nm测定吸光度，计算血糖含量。

血清Lispro INS水平测定

血清中胰岛素类似物(LysB28ProB29人胰岛素)含量用放射免疫分析方法(lispro INS RIA kit，LINCO Tec.)测定。

实施例9

将喷雾干燥或冷冻干燥制得的胰岛素类似物(LysB28ProB29人胰岛素)药物载体无定型干粉混和物经气流粉碎或研磨粉碎后得到平均粒径小于10μm颗粒，装入4号硬胶囊。临用时，将胶囊放入胶囊型粉剂吸入器(天平^TM)，针刺破坏胶囊壳后，将吸入器开口端放入口腔内，用力吸取微粉化固体颗粒，引起降糖效果。

实施例10

将2.5g的天冬胰岛素(Aspart)溶于含有药物载体(甘氨酸1.25g或赖氨酸1.25g)的1000ml磷酸盐缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为6.8±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃，供给液体速度为500ml/min，形成出口处的温度在70℃。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。装入4号胶囊，干燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

实施例11

将2.5g的天冬胰岛素(Aspart)溶于含有药物载体(甘氨酸1.25g和甘露醇1.25g)的1000ml磷酸盐缓冲溶液中，得到的最终固体浓度为5.0mg/ml，pH值为7.0±0.2。喷雾干燥器的操作在入口处的温度在110℃到120℃之间，供给液体速度为5ml/min，形成出口处的温度在60℃到70℃之间。然后将溶液滤过0.22μm的滤膜，并在喷雾干燥器内喷雾干燥，形成良好的白色无定形粉末。装入4号胶囊，干燥环境中(相对湿度＜10％)保存于盖紧盖子的容器内。

Claims (10)

1、一种稳定的无定型胰岛素类似物干粉组合物，其特征在于，由胰岛素类似物和药物载体组成。

2、权利要求1的组合物，其特征在于，其中所述胰岛素类似物选自：i)用Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代B28位的氨酰基残基，而B29位的氨酰基残基是Lys或Pro；ii)B28、B29和B30位的氨酰基残基缺失；或iii)B27位的氨酰基残基缺失；所述载体选自糖，有机盐，氨基酸，蛋白质。

3、权利要求2的组合物，其特征在于，其中所述的糖选自甘露醇、棉子糖、乳糖、麦芽糖、糊精和海藻糖；其中所述的有机盐选自柠檬酸钠、乙酸钠、抗坏血酸钠；其中所述的氨基酸选自甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸；其中所述的蛋白质选自人血清白蛋白、鱼精蛋白。

4、权利要求3的组合物，其特征在于，其配方组成为：

胰岛素类似物                                5％至98％

糖                                          0.5％至94％

有机盐                                      0.5％至94％

氨基酸                                      0.5％至94％

蛋白质                                      0％至93.5％。

5、权利要求3的组合物，其特征在于，其配方组成为：

胰岛素类似物                                20％至80％

糖                                          5％至65％

有机盐                                      5％至65％

氨基酸                                      5％至65％

蛋白质                                      0％至65％。

6、权利要求3的组合物，其特征在于，其配方组成为：

胰岛素类似物                                50％，

糖                                          10％，

有机盐                                      20％，

氨基酸                                      20％。

7、权利要求4、5、6任何一项的组合物，其特征在于，其中胰岛素类似物是Asp取代B28位脯氨酸的胰岛素类似物-天冬胰岛素(Aspart)和B28位脯氨酸与B29位赖氨酸互换的胰岛素类似物赖脯胰岛素(Lispro)。

8、权利要求1的组合物的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：将胰岛素类似物溶于含药物载体的缓冲水溶液中形成溶液；以及将该溶液采用喷雾干燥、冷冻干燥方法制得平均粒径小于10μm的无定形颗粒，微粉化后即得。

9、根据权利要求8的制备方法，其特征在于，经过以下步骤，将重量比为5％-98％的胰岛素类似物，与药物载体，水混合，混合液按重量/体积比计浓度为0.1％-10％，喷雾干燥，其中喷雾干燥进口温度为100-120℃，出口温度为60-70℃，喷嘴流速800L/h。

10、根据权利要求9的制备方法，其特征在于：将LysB28ProB29人胰岛素5份，甘露醇1份，甘氨酸2份，柠檬酸钠2份，与水混合，混合液浓度按重量/体积比2.0％，喷雾干燥，所得胰岛素粉末，装入胶囊。