CN101033462A - 一种真皮成纤维样细胞的培养和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真皮成纤维样细胞的培养方法，并且公开了所获得的真皮成纤维样细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪分化的能力。本发明还提供了一种获得该细胞集落的方法，能获得多种细胞克隆。本发明提供的真皮成纤维样细胞可以作为构建组织工程化骨、软骨、脂肪的种子细胞活用于除皱、皮肤抗衰老及美容领域。

Description

一种真皮成纤维样细胞的培养和用途

技术领域

本发明涉及组织工程学中获得种子细胞的方法。

背景技术

种子细胞是组织工程研究的基础，从自体组织中获得成体干细胞用于组织构建是目前研究的热点。大量研究表明，骨髓、肌肉、脂肪等多种组织含有不同分化程度的多潜能细胞，经诱导后能在体内外形成不同组织，并可修复组织和器官的缺损。

皮肤包含表皮层、真皮层及附属器等多种结构，表面积巨大，细胞资源丰富。自皮肤各层中获得多潜能细胞的研究已取得一定进展，如表皮干细胞、毛囊外根鞘细胞等。研究表明，这些细胞分布于表皮的不同层次中。对于皮肤的更深层次，如真皮乳头层、网织层中是否含有间充质干细胞目前尚无定论。通常认为，真皮层普遍存在的成纤维样细胞是终末分化细胞，无多向分化潜能，仅参与损伤皮肤的疤痕修复，这种偏见阻碍了本领域更进一步从皮肤获得种子细胞的可能性，影响了利用皮肤这一具有丰富细胞资源的器官的前景。

有报道称从人出生后的皮肤组织中分离得到多潜能细胞，但所得到的多潜能细胞只能形成很少克隆，且未见到这2个克隆多向分化能力的直接证据(报道未出示相关照片)，不能有效筛选干细胞作为组织工程种子细胞。

因此，本领域迫切需要提供一种方法，通过这个方法能获得来源于皮肤真皮层的间充质干细胞，并且所获得的干细胞是普通的新鲜细胞群，能得到较多的克隆(集落)，以便于能准确而充分地用作组织工程及器官再造技术的种子细胞。

发明内容

本发明的目的是建立一种获得真皮成纤维样细胞(Dermis derivedfibroblastic cells，DDFCs)的方法。

本发明的另一个目的是提供一种真皮成纤维样细胞及其用途。

在本发明的第一个方面，提供了一种真皮成纤维样细胞克隆的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)用胶原酶消化真皮层组织，得到真皮细胞；

(b)将所述的真皮细胞接种于培养液，在适合真皮细胞生长的情况下培养，并在接种后12-72小时进行换液，从而去除非贴壁细胞，获得贴壁细胞；

(c)继续培养贴壁细胞至汇合度(confluency)为60-99％(更佳地70-95％)，

(d)对贴壁的真皮细胞进行稀释后，获得真皮成纤维样细胞克隆。

在另一优选例中，在步骤a前将去除了皮下组织的皮肤用重量体积百分比为0.01-0.3％的中性蛋白酶消化后去除表皮。

在另一优选例中，步骤a中所述的胶原酶为I型胶原酶，含量为0.05-0.3％(w/v)，优选0.08-0.2％(w/v)，更优选0.1％(w/v)。

在另一优选例中，步骤b中在接种后24-48小时换液，以去除非贴壁细胞。

在另一优选例中，步骤b中的细胞以0.1-3×10⁴/cm²的密度接种后再培养。

在另一优选例中，步骤b中的培养液为含5-20％(w/v)胎牛血清的DMEM，优选8-15％(w/v)胎牛血清，更优选10％(w/v)胎牛血清。

在另一优选例中，步骤d中将贴壁的真皮来源的细胞经有限稀释后接种于组织培养板(tissue culture dish)上。

在另一优选例中，在步骤c和d之间，还包括步骤：将贴壁的真皮层细胞以1000-4000个/cm²的密度接种，进行传代培养。

在另一优选例中，步骤b、c、d中所述的培养板是组织培养板(例如购自Falcon Labware，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)的组织培养板。

在本发明的第二个方面，是提供了一种用上述的方法制得的真皮成纤维样细胞克隆。

所述的真皮成纤维样细胞克隆，其细胞具有以下特性：

(i)所述的细胞不表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)；

(ii)具有成骨、成软骨和/或成脂肪分化能力。

所述的真皮成纤维样细胞克隆中3-9％的克隆具有成骨、成脂肪及成软骨三向分化能力，10-28％的克隆具有双向分化能力，5-16％的克隆具有单向分化能力，45-80％的克隆不具有上述任何分化能力。

在另一优选例中，所述的真皮成纤维样细胞中3.5-8％的克隆具有成骨、成脂肪及成软骨三向分化能力，12-25％的克隆具有双向分化能力，8-15％的克隆具有单向分化能力，50-70％的克隆不具有上述任何分化能力；

更优选地，所述的真皮成纤维样细胞中6.4％的克隆具有成骨、成脂肪及成软骨三向分化能力，19.2％的克隆具有双向分化能力，10.6％的克隆具有单向分化能力，63.8％的克隆不具有上述任何分化能力。

在本发明的第三个方面，是提供了用上述制备方法得到的真皮成纤维样细胞的用途，它可以用作构建组织工程化骨、软骨或脂肪的种子细胞。

其中所述的真皮成纤维样细胞可用于制备骨移植物、软骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物、皮肤移植物或注射于体表用于除皱、美容；而所述的移植物可用于治疗骨骼疾病、软骨疾病、脂肪过少的疾病、肌腱疾病、皮肤疾病或皮肤抗衰老。

由此可见，本发明提供的方法能获得真皮成纤维样细胞，能得到较多的克隆(集落)，可用作组织工程及器官再造技术的种子细胞。

附图说明

图1显示了DDFCs体外生长特征，其中

A显示了倒置显微镜观察到的DDFCs贴壁3天后的情况(扩大100倍)

B显示了DDFCs体外培养不表达Nestin

C显示了细胞核PI衬染阳性对照，表达Nestin(箭头所示)(扩大100倍)

D显示了DDFCs表达Vimentin

E显示了阴性对照不表达Vimentin

F显示了细胞核PI衬染阳性对照，表达Vimentin(扩大200倍)；

图2显示了DDFCs体外生长的动力学特征

图3显示了常见的细胞表面标志物表达，其中

A显示了免疫荧光检测结果

B显示了流式细胞(FACS)的检测结果；

图4显示了油红染色的结果，其中

左图显示了DDFCs成脂肪诱导3周的结果

右图显示了未诱导的情况(扩大100倍)

右上图显示了RT-PCR检测PPAR及Leptin的情况；

图5显示了DDFCs成骨诱导的情况，其中

上图显示了成骨诱导后7天，BM Purple染色的情况

右上图显示了RT-PCR检测ALP及OCN的情况

下图显示了成骨诱导4周，ARS染色显示钙化结节形成的情况(扩大100倍)；

图6显示了DDFCs成软骨诱导的情况，其中

上图显示了诱导组表达蛋白多糖基质的情况(Safranin’O染色)及未诱导组无蛋白多糖基质表达的情况

下图显示了micromass培养后诱导组表达II型胶原、未诱导组无II型胶原表达的情况

右上图显示了RT-PCR检测Aggrecan及II型胶原基因表达的情况；

图7显示了DDFCs克隆体外多向诱导的情况，其中A，O，C，分别代表成脂肪(Adipogenic)、成骨(Osteogenic)、成软骨(Chondrogenic)三种分化方向，Neg为无上述分化能力的克隆；

图8显示了典型的三向分化克隆，其中

上图表示Clone 96A14，中图表示Clone 96A29，下图表示Clone 96A33。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种新的真皮干细胞的富集、培养方法，它通过早期换液、去除非帖壁细胞，低密度接种、传代培养，然后在组织培养皿(tissue culture dishes)上，得到能够克隆化生长的细胞群，该细胞群可以全面反映所得到的真皮干细胞的分化能力和方向。

本文所称的真皮干细胞同真皮成纤维样细胞可以互换使用。

细胞培养

本发明的真皮成纤维样细胞可以通过常规的方法获得。一种优选的方法是

(a)用I型胶原酶消化真皮全层得到细胞；

(b)用DMEM培养液培养，换液，去除非贴壁细胞，得到贴壁的真皮层细胞；

(c)将贴壁的真皮来源的细胞有限稀释后接种，得到真皮成纤维样细胞克隆。

步骤a前可以用常规的方法去除皮下组织后去除表皮层，一种优选的方法是用重量体积百分比为0.01-0.3％的中性蛋白酶消化后去除表皮。

步骤b中可以用常规的方法培养细胞，一种优选的方法是用含5-20％(w/v)胎牛血清(FCS)DMEM培养液，所述的培养液中还可以含有促进细胞生长的细胞因子，(如，FGF)。

可以用常规的方法去除非贴壁细胞，一种优选的方法是在接种后24-48小时换液，每3天换液一次。

所得的贴壁细胞1000-4000个/cm²的密度接种、传代培养，优选3000个/cm²的密度，至对数生长期后以0.25％胰酶(含lmM EDTA)消化、并持续传代。

真皮成纤维样细胞

本发明提供的真皮成纤维样细胞是用上述的方法培养获得的，所述的真皮成纤维样细胞，不表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)，可以用作构建组织工程化骨、软骨或脂肪的种子细胞；可以用于制备骨移植物、软骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物或皮肤移植物；可以用于治疗骨骼疾病、软骨疾病、脂肪过少的疾病、肌腱疾病或皮肤疾病，治疗中可直接注入所述的真皮成纤维样细胞，或含有上述真皮成纤维样细胞的组合物。

所述的骨移植物、软骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物或皮肤移植物包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；和(b)用上述的培养方法所获得的真皮成纤维样细胞。所述的药学上可接受的生物可降解材料包括(但并不限于)：

(i)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(ii)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(iii)可注射性材料，如Pluronic(一种市售的聚环氧乙丙烯商品)、藻酸钙凝胶等；

(iv)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。

真皮成纤维样细胞克隆(集落)

可以用常规的方法克隆真皮成纤维样细胞，一种优选的方法是将细胞有限稀释后接种于组织培养板(tissue culture dish)上，所得到的细胞克隆中3-9％的克隆具有成骨、成脂肪及成软骨三向分化能力，10-28％的克隆具有双向分化能力，5-16％的克隆具有单向分化能力，45-80％的克隆不具有上述任何分化能力。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的作为种子细胞的真皮成纤维样细胞取材广泛，资源丰富；

2、本发明的克隆方法获得的真皮成纤维样细胞集落多，可充分反映其各种特性，便于准确利用；

3、方法重复性高，成本低廉。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

RT-PCR检测

细胞经RNAzol(Biotecx Lab.Inc.，Houston，TX)抽提得到细胞总RNA后，以其为模版合成cDNA。逆转录试剂盒购自Biotech公司，具体步骤参见其说明书。cDNA经标准的PCR反应扩增，详见Gronthos等人的文献(Gronthos S.，Zannettino A.C.，Hay S.J.，et al.Molecular and cellular characterisation of highly purifiedstromal stem cells derived from human bone marrow.J.Cell Science 2003；116(9)：1827-1835.)。反应产物于1％Agarose凝胶中电泳，经溴乙啶显色后观察。β-actin作为内参照，引物购自上海宝生物工程公司。

                                           表1PCR引物序列

基因	登录号	SEQ ID NO：	引物序列	产物
					PPAR-γ2	D83233	12	反义：5′-GGTCAGCGGGAAGGACTTTA-3′有义：5′-GATCCAGTGGTTGCAGATTA-3′	516bp
Leptin	BC060830	34	反义：5′-GCCAGAGTTCCTTCCCTTAA-3′有义：5′-CAAGCTGTGCCCATCCAAAA-3′	508bp
					ALP	NM_000478	56	反义：5′-GGCGGCAGACTTTGGTTT-3′有义：5′-CCCGTGGCAACTCTATCTT-3′	552bp
Aggrecan	NM_001135	78	反义：5′-TCCTGGAAGCTCTTCTCAGT-3′有义：5′-ATGCCCAAGACTACCAGTGG-3′	510bp
					Collagen II	NM_001844	910	反义：5′-TCCCCGGCACTCCTGGCACTGAT-3′有义：5′-CTTGGGCACCTCGGGCTCCTTTAG-3′	501bp
β-actin	BC016045	1112	反义：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′有义：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3′	310bp

实施例1

培养获得真皮成纤维样细胞

1.取包皮环切术剩余之皮肤，PBS充分振洗后去除皮下组织，并剪至2×2mm²大小；

2.0.1％(w/v)的中性蛋白酶4℃消化过夜后揭去表皮层，继以0.1％(w/v)的I型胶原酶，37℃恒温振荡消化4h；

3.收集所得细胞以1×10³/cm²的密度接种于培养皿，以含10％FCS高糖DMEM培养液37℃恒温培养(5％二氧化碳)；

4.接种后24-48小时换液，以去除非贴壁细胞，每3天换液一次，直至细胞长至85％融合后传代或进行相应检测。

实施例2

检测

一、实施例1中所得真皮层细胞以3200个/cm²的密度接种细胞培养板中，至对数生长期后以0.25％胰酶(含1mM EDTA)消化、并持续传代至第15代(约97天)；对数生长期的观测采用MTT法(3-[4，5-dimethylthia-zolyl-2]-2，5-diphenyltetrazolium bromide)，连续测定第3天至第12天的平均MTT值，根据其生长曲线，评估出每代DDFCs生长至对数增殖期的时间(约5-7天)，计算出最低倍增时间。具体如下公式：倍增时间＝生长时间/倍增次数；倍增次数＝(logN1-NO)/log2。

二、免疫荧光检测

盖玻片培养的真皮层细胞及各种对照组细胞均在完全贴壁、生长良好后终止培养，进行免疫荧光检测。所采用的一抗为鼠抗人Vimentin及Nestin(购自Santa Cruze，美国)单克隆抗体，经丙酮固定、绵羊血清封闭，单克隆抗体(1∶200)4℃过夜孵育、羊抗鼠二抗(IgG-FITC)反应、PI衬染后甘油封片，荧光显微镜观察。

三、FACS检测

为检测常见间充质干细胞标志物的表达，真皮层被收集后进行了FACS检测，具体步骤参见Zuk等人的文献(Zuk P.A.，Zhu M.，Mizuno H.，et al.Multilineage cells from human adipose tissue：implications forcell-based therapies.Tisssue Eng.2001；7(2)：211-228.)。所用的抗体包括鼠抗人IgG：CD13-FITC，CD14-FITC，CD29-FITC，CD34-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC，CD54-FITC，CD58-FITC，CD133-FITC，CD166-FITC，CD49d-PE，CD105-PE，CD106-PE(购自Santa Cruze，美国)；鼠抗人IgM：Stro-1及其二抗(购自Santa Cruze，美国)。标记后的细胞同时经过直接的荧光显微镜下观测及流式细胞仪(购自BD公司，美国)检测。

结果

一、真皮成纤维样细胞的体外生长特征

经胶原酶消化后的真皮层细胞培养后24小时见细胞贴壁。经早期换液，去除活力不佳的细胞以及非贴壁生长的细胞。3至5天后，镜下出现大量成纤维样细胞(图1A)。免疫荧光染色显示这种贴壁生长的细胞不表达Nestin(图1B-C)，但表达中胚层来源的标志物Vimentin(图1D-F)。结果显示这种真皮细胞具有与成纤维细胞具有相似的外形特征，且能快速贴壁生长，为真皮成纤维样细胞(Dermis-derived Fibroblastic Cells，DDFCs)。

二、真皮成纤维样细胞的生长动力学特征

DDFCs在体外以接近1∶3的比例传代至第15代时，仍然保持旺盛的扩增能。传代过程中DDFCs的平均倍增时间未出现明显的变化，均保持在4天左右，不同代数的细胞MTT曲线表现出较为接近的特征(结果未显示)，说明DDFCs在体外长期传代培养时其生长动力学特征无明显变化。计数每代细胞的扩增倍数，并转化成累积倍增数(Cumulative PopulationDoubling)显示每次传代后细胞分裂了1.7次；更重要的是在传代的后期，尤其是传代次数超过10次以后，细胞每代的倍增率仍然维持在相近的水平，未出现下降或减缓的趋势。(见图2)

结果显示DDFCs在体外能够长期传代、扩增，其生长动力学特征无明显变化。

三、真皮成纤维样细胞的表面标志物的检测

免疫荧光检测显示DDFCs表达Stro-1、CD29、CD49d及CD105，但不表达CD34、CD106、CD133及CD166(图3A)。

流式细胞仪分析显示，常见的间充质干细胞标志物Stro-1、CD29、CD105等都有不同程度的表达；造血干细胞的标志物CD34、CD133低表达；另外，DDFCs高表达CD49d但低表达CD106的特征又与脂肪干细胞较相似(图3B)。

其中Stro-1(12.26％)，CD29(24.42％)，CD49d(37.3％)，CD105(22.08％)CD34(3.04％)，CD106(1.1％)，CD133(0.12％)，CD166(1.31％)。

实施例3

真皮成纤维样细胞成脂肪诱导及检测

实施例1中，体外培养近融合时，加入成脂肪诱导液，其中含：DMEM培养液，10％FCS，0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(isobutyl-methylxanthine)，1μM地塞米松(dexamethasone)，10μM胰岛素(insulin)，200μM吲哚美辛(indomethacin)，每3天换液一次。诱导3周后，经4％多聚甲醛固定后进行油红(Oil red)染色。为检测脂肪相关基因PPAR-γ2及Leptin的表达，细胞总RNA被抽提后进行RT-PCR检测。

结果

DDFCs经成脂诱导后3周，细胞内出现细小空泡，油红染色呈红色，未诱导组无油红着色的细胞(图4)；RT-PCR检测显示诱导后2周的细胞表达脂肪细胞特异性基因PPAR及Leptin(图4右上图)，DDFCs经脂肪诱导后表达PPAR及Leptin，未诱导组均无明显表达。

结果显示，DDFCs具有向脂肪细胞分化的能力。

实施例4

真皮成纤维样细胞成骨诱导及检测

实施例1中，体外培养近融合时，经成骨诱导，其中诱导条件为：DMEM，10％FCS，10mM β-磷酸甘油，10nM维生素D₃，0.1μM地塞米松(Dexamethasone)。3周后，经0.4％多聚甲醛固定，加入BM Purple(购自Roache公司)染色溶液，以检测碱性磷酸酶活性(ALP)；以茜素红(Alizarn Red-Tris-HCL，40Mm，pH4.1)染色镜下观察钙化结节的形成；用RT-PCR检测成骨细胞特异性标志ALP，OCN的mRNA表达。

结果

DDFCs经成骨诱导1周后，即可见较多ALP染色阳性细胞，明显高于未诱导组；诱导4周后，光镜下可见局部区域形成不透光的结节，ARS染色呈红色，说明此处有钙盐的沉积，而未经诱导的DDFCs无钙化结节形成(图5)；RT-PCR检测显示诱导后的细胞ALP及骨钙蛋白(OCN)的表达均升高(图5右上图)。结果显示，DDFCs具有向成骨细胞分化的能力。

实施例5

真皮成纤维样细胞成软骨诱导及检测

实施例1中，体外培养近融合时，成软骨诱导，诱导条件为：DMEM，10％FCS，10ng/ml转化生长因子β₁(TGF-β₁)，100ng/ml胰岛素样生长因子(IGF)，0.1μM地塞米松(Dexamethasone)。3周后，4％多聚甲醛固定，Safranin’O染色，镜下观察蛋白多糖类基质。细胞微团块(micromass)经成软骨诱导3周后，以4％多聚甲醛固定，进行II型胶原的免疫组织化学检测(ABC法)。所用抗体为鼠抗人II型胶原单克隆抗体(购自Sigma公司)。用RT-PCR方法检测软骨相关基因Aggrecan和Collagen II的表达。

结果

DDFCs经成软骨诱导后2周，细胞出现局部聚集生长，Safranin’O染色呈阳性(图6上)；RT-PCR检测显示诱导分化的细胞表达软骨细胞相关基因Aggrecan及II型胶原，明显高于未诱导组(图6右上图)；DDFCs经微团块培养3周，可形成乳白色软骨样组织，免疫组织化学检测显示胞外基质中存在II型胶原(图6)。

结果显示，DDFCs同样具有向软骨细胞分化的能力。

实施例6

单细胞克隆的培养、多向诱导及检测

实施例1所得的真皮来源的细胞经有限稀释后接种至96孔板内(tissueculture dish)(2个/孔)，接种后24小时标记出单个细胞存在的孔，3周后将所有单细胞形成的克隆(＞32细胞)通过胰酶消化，传代至24孔板内继续扩增。其后，细胞被相继转移至6孔板及常规培养皿内继续培养与扩增，并分别进行成骨、成脂肪及成软骨诱导、分化和检测，计算三向、双向及单向分化克隆的数量与比例。

结果

DDFCs经有限稀释并在体外培养3周后，部分单个细胞增殖形成克隆(大于32个细胞)，其中仅有50％左右的克隆能在传代后继续生长扩增，共获47个克隆。对每个克隆分别进行三向诱导分化并进行组织学及免疫组织化学检测。(见图7)

结果显示：

所有克隆中，能同时向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞方向分化的仅3个克隆，占6.4％；

部分克隆仅向2个方向分化，其中，成脂肪-成骨双向分化克隆占12.8％，成骨-成软骨双向分化克隆占6.4％，未发现典型的成脂肪-成软骨双向分化克隆；

少数克隆仅检测出单一方向的分化能力(成骨单向分化者占8.5％，成脂肪单向分化者占2.1％)；

大部分克隆(约占63.8％)未表现出任何明显的成骨、成软骨或成脂肪的分化能力。

图8显示3个典型的三向分化克隆：同一克隆来源的细胞分别经过成脂肪、成软骨及成骨诱导，其特征发生明显改变。成脂诱导后细胞产生脂滴，形成典型的脂肪细胞结构；经微团块培养和成软骨诱导后，产生乳白色质韧团块，镜下可见明显软骨陷窝(箭头所示)及II型胶原表达；同样，经成骨诱导后的细胞ALP染色呈阳性，并出现较多的钙化物质。经油红染色、II型胶原染色、茜素红染色及ALP染色证实诱导后分别产生了脂肪细胞、软骨细胞及成骨细胞。

讨论

创伤后的组织修复都有一个共同的物质基础：不断增生的细胞及新合成的细胞外基质。对于一种主要由终末分化细胞构成的组织，其细胞的分裂增生能力有限，因而其自我修复能力较差，关节软骨便是其中的典型。相反，长干骨中由于存在骨髓基质干细胞，在损伤时干细胞便能迅速扩增并分化为成骨细胞，合成新的类骨基质并进而形成新的骨组织。真皮组织具有较快的创伤后愈合能力，尽管其机理目前尚未充分了解，但至少终末分化细胞不是其快速自我修复的原因。

Toma等人的研究发现，真皮内存在的一种具有向神经外胚层及部分中胚层细胞分化的多潜能细胞。通过胰酶消化，并辅以机械分离，可得到真皮内的非贴壁细胞(Skin derived procusors，SKPs)。这种细胞表达神经嵴干细胞的标志物Nestin，并能向神经细胞分化。这种分化甚至在未给予特殊诱导条件便能产生：经含B-27的无血清培养液培养的人SKPs能同时表达Nestin及beta3-tubulin，后者是神经来源细胞的一种标志物。将SKPs注射入鸡胚胎的神经嵴内，发现SKPs能像神经嵴细胞一样向外周迁徙。这些特征提示SKPs可能就是一种源于真皮层的与神经外胚层相关的干细胞。本发明的DDFCs是由胶原酶消化真皮全层所得到的细胞，与SKPs相反，这些细胞完全贴壁生长且呈Nestin阴性，表达中胚层间充质细胞的标记，提示DDFCs与SKPs应该属于两种不同类型的细胞。

本发明人从47个DDFCs单细胞克隆分析发现并不是所有的克隆均具有三向分化潜能，仅6.4％(3/47)的克隆具有成骨、成脂肪及成软骨三向分化能力。除此之外，便是具有部分分化能力的克隆：19.2％(9/47)的克隆具有双向分化能力，10.6％(5/47)的克隆具有单向分化能力。另外还有63.8％的克隆(30/47)不具有上述任何分化能力(至少在体外培养过程中未检测到明显的分化倾向)。即使考虑到干细胞在体外长期培养时的自发分化现象，发明人对真皮细胞的克隆分析结果仍提示，真皮中确实存在至少可以同时向三种中胚层细胞分化的多潜能细胞。

那么，真皮中的这些多向分化潜能细胞到底来自何处，主要有以下几种可能：1)血液循环中的骨髓间充质干细胞。几乎所有的DDFCs均表达Vimentin，同时表达Stro-1，CD13，CD29，CD44，CD54，CD58，CD105等常见间充质干细胞的标志物，不表达CD34，CD133等造血干细胞的标志物，与骨髓间充质干细胞有很大的相似之处。但是，骨髓间充质干细胞本身含量极低，每10⁵个细胞中可能只有1个干细胞，而外周血循环中的含量将更低。DDFCs在体外可有近1％的克隆形成能力，其中近6％的克隆具有多向分化潜能。因此，血液循环中的骨髓的间充质细胞是真皮内干细胞来源的可能性极小。2)皮下脂肪来源的间充质干细胞。Zuk等人的研究表明，皮下脂肪层含有间充质干细胞，表达CD49d，但不表达CD106，具有很强的成脂肪能力及一定的成骨及成软骨的能力。但是，真皮来源的DDFCs与脂肪来源的细胞也有着明显的不同。首先，用于分离DDFCs的真皮组织均认真去除了皮下组织，组织学检查未见明显的脂肪结构，RT-PCR检测时亦无PPAR的表达，因此从来源上基本排除了脂肪组织的污染。其次，DDFCs成脂肪能力明显低于脂肪来源的间充质细胞；最后，部分细胞表面标记，如CD105及CD49d的表达两者有较明显的差别。因此，DDFCs来源于脂肪组织间充质细胞的可能性很小。3)毛囊乳头层的真皮细胞。Jahoda等人的研究表明，毛囊乳头细胞(follicle dermal papilla cells，DP cells)具有明显的双向分化能力，即成骨及成脂肪的能力。DDFCs的克隆中12.8％具有成骨-成脂肪的双向分化能力，似乎暗示其与DP cells具有相同的起源。但是，啮齿类动物的触须毛囊结构发达，DP cells的含量因而较多；而人的包皮组织毛囊很少，甚至在显微镜下也很难找到毛囊结构。同时，DDFCs的克隆中有6％的细胞具有三向分化能力，DP cells不具备此特性，因此，DDFCs来源于毛囊乳头层的可能性也不大。4)原本存在于真皮组织的间充质干细胞。人体内大多数的组织内都有与其生长相关的组织干细胞。真皮组织位于人的体表，经常受到机械、物理化学的伤害，需要不断进行自我修复，其组织中存在一定量的组织干细胞，具有一定的合理性，以此本发明人推断DDFCs是一群原本存在于真皮组织中的间充质干细胞。

DDFCs具有向骨、软骨、脂肪等细胞分化的潜能，同时具有在体外长期传代扩增的能力，而皮肤是人体最大、最表浅的器官，来源丰富，取材方便，如果能利用它进行组织缺损的修复，它将比骨髓基质干细胞更具优势。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                  序列表

<110>上海国睿生命科技有限公司

<120>一种真皮成纤维样细胞的培养和用途

<130>061053

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Claims (10)

1.一种真皮成纤维样细胞克隆的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)用胶原酶消化真皮层组织，得到真皮细胞；

(b)将所述的真皮细胞接种于培养液，在适合真皮细胞生长的情况下培养，并在接种后12-72小时进行换液，从而去除非贴壁细胞，获得贴壁细胞；

(c)继续培养贴壁细胞至汇合度为60-99％；

(d)对贴壁的真皮细胞进行稀释后，获得真皮成纤维样细胞克隆。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中在接种后24-48小时换液，以去除非贴壁细胞。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d中将贴壁的真皮来源的细胞经有限稀释后接种于组织培养板上。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤c和d之间，还包括步骤：将贴壁的真皮层细胞以1000-4000个/cm²的密度接种，进行传代培养。

5.一种如权利要求1所述的方法制得的真皮成纤维样细胞克隆。

6.如权利要求5所述的真皮成纤维样细胞克隆，其特征在于，所述的细胞具有以下特性：

(i)所述的细胞不表达神经上皮干细胞蛋白；

(ii)具有成骨、成软骨和/或成脂肪分化能力。

7.如权利要求5所述的真皮成纤维样细胞克隆，其特征在于，所述的真皮成纤维样细胞克隆中3-9％的克隆具有成骨、成脂肪及成软骨三向分化能力，10-28％的克隆具有双向分化能力，5-16％的克隆具有单向分化能力，45-80％的克隆不具有上述任何分化能力。

8.根据权利要求1所述的制备方法得到的真皮成纤维样细胞的用途，其特征在于，用作构建组织工程化骨、软骨或脂肪的种子细胞。

9.根据权利要求1所述的制备方法得到的真皮成纤维样细胞的用途，其特征在于，用于制备骨移植物、软骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物、皮肤移植物或注射于体表用于除皱、美容。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的移植物用于治疗骨骼疾病、软骨疾病、脂肪过少的疾病、肌腱疾病、皮肤疾病或皮肤抗衰老。

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