CN101027392B - 通过调节tim-1、tim-2和tim-4功能从而调节免疫应答的方法 - Google Patents

通过调节tim-1、tim-2和tim-4功能从而调节免疫应答的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在主体中调控免疫应答的方法，如通过对主体施用调控tim-1、tim-2、或tim-4活性，或调控tim-1和tim-4间，或tim-2和tim-2配基间物理交互作用的药物。免疫应答包括，但不局限于，自身免疫失调，移植耐收，及Th1和Th2-介导的应答和失调。本发明还涉及新的鉴定调节tim-1和tim-4间物理交互作用的药物的方法。此外，本发明涉及新的可溶性tim-4多肽和其编码核酸。

Description

通过调节TIM-1、TIM-2和TIM-4功能从而调节免疫应答的方法
相关申请 
本申请对2004年3月12日提交的美国专利序列号第60/552,523，名为“通过调节TIM-1和TIM-2功能从而调节免疫应答的方法”，及2004年10月27日提交的美国专利序列号第60/622,559，名为“通过调节TIM-1和TIM-4功能从而调节免疫应答的方法”的权益提出要求。这些申请的全部教导都通过在此引述而全部合并于本文。 
关于联邦-资助的研究和发展陈述 
这里描述的发明，全部或部分地，由国家健康基金协会号1RO1NS045937-01，2R01NS355685-06，2R37NS30843-11，1RO1AI44880-03， 2P01AI39670-07， 1PO1NS38037-04和1F31GM20927-01资助。美国政府拥有本发明的某些权益。 
背景技术
对外源或内源因子的过度免疫应答可能导致疾病，其可作为Th1-或Th2-介导的疾病的特征。Th2-介导的疾病实施例，哮喘，过敏性鼻炎(花粉热)，过敏性皮炎(湿疹)和食物过敏，是非常普遍的，可影响20-40％的普通人群并造成一个主要的公共健康问题。应对这些疾病的经济开支是巨大的。仅哮喘一项， 1996年的健康保障费用估计为140亿美元。此外，过去20年工业国家中所有遗传性过敏疾病的流行极大地上升了，而原因仍未明。工业国家中哮喘的流行，其最为精确的数量，自从1982年以来已经增倍，并预期至2020年再次增倍。 
风湿性关节炎(RA)，一种Th1疾病，是一种普遍的人自身免疫疾病，在高加索人中流行率为1％(Harris，B.J.et al.，1997，In Textbook of Rheumatology 898-932)，目前影响250万美国人。RA以滑动关节的慢性炎症和活性T细胞，巨噬细胞和浆细胞浸润为特征，导致关节软骨进行性破坏。这是关节疾病最严重的形式。多重硬化症(MS)，另一种Th1疾病，是最常见的中枢神经系统(CNS)神经脱髓鞘疾病，在北美影响350,000(0.1％)人，而全世界为110万。通常，MS被认为是一种部分由前炎症CD4 T(Th1)细胞介导的自身免疫疾病，该细胞识别与由抗原(Ag)递呈细胞(APC)表达的MHC class II分子相连的特异髓磷脂多肽。另一种Th1介导的疾病实施例，人类I型或胰岛素-依赖的糖尿病(IDDM)，以胰岛中beta细胞的自身免疫性破坏为特征。Beta细胞的损耗导致血液中葡萄糖水平调节能力的丧失。在人体出现糖尿病之前有一个长期的潜伏期。在此期间胰腺beta细胞的功能逐步消失。疾病的发展以出现拮抗胰岛素，谷氨酸脱羧酶，和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体为指示。 
T辅助(Th)亚类以其产生不同细胞因子种类和提升特异免疫应答的能力进行区分。Th1细胞产生IFNγ并促进直接针对细胞内病原体的细胞-介导免疫。相反，Th2细胞产生细胞因子IL-4，IL-5，IL-13，激活针对细胞外病原体的肥大细胞和嗜曙红细胞和直接B细胞。 
由极化Th细胞产生的特异细胞因子是促进前驱Th细胞分化的最初因子，但这些细胞也交联调控其他亚类的功能活性。例如 具报道IL-4是一种促进Thp细胞分化为Th2效应细胞的有效因子。此外，IL-4拮抗IFNγ的生成。IL-10，另一种Th2细胞产生的细胞因子，也被报道可抑制Th1分化和IFNγ-介导的巨噬细胞功能。相反地，Th1产生的IFNγ可促进Th1的分化并抑制Th2细胞的增殖。这些细胞因子促进特异Th细胞亚类分化，同时抑制选择分化命运的能力，造成不断发展的极化应答结果。 
相应地，需要一种促进或抑制Th1或Th2应答发展的新的治疗方法。这些新治疗方法可以用于治疗自身免疫和过敏性疾病，增强移植组织免疫耐受力或减少癌症患者的免疫耐受力。 
发明概述 
此发明广义上涉及调控Th1或Th2细胞活性从而调控免疫应答的药物、组合物和方法。此发明部分基于这里描述的意外的发现，即tim-1和tim-4形成多肽复合物，并且此复合物的形成可调节T细胞活性和免疫应答。在某些方面，此方法提供了一种在需要治疗的病人中进行治疗或防止Th1-介导的失调的方法，该方法包括给予病人治疗有效剂量的药物，其可减少tim-1，tim-2，或tim-4表达或活性。一些实施方案中，该病人患有自身免疫疾病。此发明的相关方面提供了在有需要的病人中引发Th1应答的方法，如患有增生疾病如癌症的病人。此发明的相关方面也提供对患有Th2失调的病人进行治疗的方法，如哮喘或过敏性疾病，或在病人中引发Th2应答，而其应答将是有益的，如患有自身免疫疾病的病人。 
此发明进一步提供了在病人中调控免疫/移植耐受的方法，包括给予病人治疗有效剂量的药物，调控tim-1，tim-2，或tim-4活性，从而调控免疫耐受性。一些实施方案中，该药物通过减少tim-1，tim-2，或tim-4表达或活性从而增加免疫/移植 耐受性。在另一实施方案中，该药物通过增加tim-1，tim-2，或tim-4表达或活性从而减少免疫耐受性。 
此发明进一步提供了在有需要的病人中增强或抑制T-细胞增殖的方法，该方法包括给予病人能有效增加或抑制T-细胞增殖数量的tim-4多肽。 
此发明的其他方面提供了一种在有需要的病人中进行治疗，预防或减少A型肝炎感染的方法。某一实施方案中，A型肝炎感染的治疗或预防是通过给予病人治疗有效剂量的(i)包括tim-4IgV区域的多肽，或(II)包括与tim-4IgV区域和/或tim-4粘液素区域具有高度同源的氨基酸序列，或相似的氨基酸序列的多肽。此发明的相关方面提供了一种通过给予病人治疗有效剂量的包括tim-4IgV区域的多肽或包括与tim-4IgV区域，tim-4粘液素区域，或与其两者具有高度同源，或相似的氨基酸序列的多肽，在病人中进行遗传性过敏症的预防或减少其发生可能性的方法。在另一个实施方案中，多肽包括tim-4粘液素区域或具有与tim-4粘液素区域高度同源，或相似的氨基酸序列区域。 
此发明也提供了鉴定调控tim-1/tim-4复合物形成的药物的方法，如鉴定促进或抑制复合物形成，或阻止tim-1结合tim-4的活性的药物的方法。此发明的另一方面提供了鉴定模拟tim-4结合tim-1的药物的方法，如作为tim-4的替代物激活tim-1活性从而调控免疫应答的药物。 
此发明也提供了新的tim-4多肽，包括这些多肽的组合物，和其编码核酸。在一个特别方面提供了可溶的非膜锚定tim-4多肽。合适的可溶性多肽包括那些由粘液素区域的IgV和N-末端部分组成，但不包含tim-4跨膜区域的多肽。在一些实施方 案中，可溶tim-4多肽还包含tim-4胞内区域。可溶tim-4多肽可作为结合tim-1并调控免疫应答的药物使用。 
附图说明
图1显示Tim-2mRNA适合于在Th2细胞中表达。(A)由Th1(AE7)和Th2(D10G4)克隆制备的cDNA用tim-2和Tim-3引物进行RT-PCR。产物用1.2％琼脂糖凝胶分析。(B)D011.10 TCR转基因CD4 T细胞在Th1或Th2极性条件下用OVA323-339刺激。在每轮刺激结束时提取RNA并制备cDNA。用特异的Tim-2引物对cDNA进行循环-样品PCR。产物用1.5％琼脂糖凝胶分析。 
图2显示Tim-2配基在活性APCs中表达。树突状细胞系，D2SC/1，和巨噬细胞系，RAW 264，在20ng/ml LPS和5ng/ml IFNγ的条件下孵育。激活-后48小时，收集细胞并用生物素标记Tim-2Ig，生物素标记Tim-1Ig，生物素标记Tim-3Ig，或生物素标记hIgG进行染色并用生物亲和素-PC作为第二种检测试剂。细胞用流式细胞计数分析。 
图3Tim-2Ig的治疗引发Th2细胞因子的应答和增殖。SJL小鼠用PLP139-151免疫，并用Tim-2Ig，或hIgG或作为对照的PBS进行处理。免疫后10天收集器官并评估增殖和细胞因子的产生。Tim-2Ig(空心三角形)；PBS(实心圆形)；hIgG(实心方形)。(A)全部的脾细胞在缺失抗原的条件下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行评估。(B)全部的脾细胞在系列浓度的PLP139-151多肽存在下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行测定。(C)收集3(A)和(B)中描述的上清，用ELISA评估IL-2，IFNγ，IL-4和IL-10表达情况。 
图4显示Tim-1Ig的治疗引发增殖和Th2细胞因子的应答。SJL小鼠用PLP139-151免疫，并用Tim-1Ig，或hIgG或作为对照的PBS进行处理。免疫后10天收集器官并评估增殖和细胞因子的产生。Tim-1Ig(空心圆形)；PBS(实心菱形)；hIgG(实心方形)。(A)全部的脾细胞在缺失抗原的条件下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行评估。(B)全部的脾细胞在系列浓度的PLP139-151多肽存在下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行测定。(C)收集4(A)和(B)中描述的上清，用ELISA评估IL-2，IFNγ，IL-4和IL-10表达情况。 
图5显示在引发EAE期间用Tim-2Ig进行治疗可以延缓疾病的发作和严重性。用溶于CFA的75μg PLP139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并静脉内注射百日咳毒素。从0天至8天的每个交替日用Tim-2Ig，或作为对照的hIgG或PBS进行处理。根据EAE临床征兆对小鼠进行监控。 
图6显示在引发EAE期间用Tim-1Ig进行治疗可以延缓疾病的发作和严重性。用溶于CFA的75μg PLP139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并静脉内注射百日咳毒素。从0天至8天的每个交替日用Tim-1Ig，或作为对照的hIgG或PBS进行处理。根据EAE临床征兆对小鼠进行监控。 
图7显示活性抗原递呈细胞表达的Tim-1和tim-2配基，从Balb/c小鼠脾细胞纯化出CD11b(巨噬细胞和树突状细胞)和CD11c(树突状细胞)并用LPS和gamma干扰素激活。激活-后24小时细胞用hIgG(红线)，Tim-1Ig生物素标记(绿色线)，或Tim-2Ig生物素标记(黄色线)进行染色。抗生物素-PE被用于第二种检测试剂。所用样本用流式细胞仪分析。Tim-1和tim-2配基的表达在活性抗原递呈细胞中都是上调的。 
图8显示在Th1和Th2极化细胞系中Tim-2的表达情况。来源于C57BL/6和Balb/c小鼠的初始T细胞在存在IL-12和抗-IL-4(Th1)或IL-4和抗-IL-12(Th2)的条件下用抗-CD3/CD28刺激进行极化。从细胞中提取RNA并制备cDNA。用特异的Taqman引物和探针对Tim-2相对于GAPDH的表达进行测定。与Th1细胞相比，Tim-2的表达更倾向于在Th2细胞中进行上调。 
图9显示Tim1/Fc单一-治疗可以使微小错配的胰岛移植得到存活。Balb/c小鼠按240mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0.25mg/小鼠的剂量用Tim1/Fc进行治疗。 
图10显示Tim2/Fc单一-治疗延缓排斥并使微小错配的胰岛移植得到存活。Balb/c小鼠按240mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0.25mg/小鼠的剂量用Tim2/Fc进行治疗。 
图11显示Tim2/Fc与抗-CD154协同增效可以引发MHC错配移植耐受性。C57BL/6小鼠按260mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0.25mg/小鼠的剂量用Tim2/Fc进行治疗，并在移植的0，2天按0.25mg/小鼠的剂量用MR1进行治疗。 
图12显示Tim-4在巨噬细胞和成熟树突状细胞中，而非T细胞中表达。(a)利用Taqman定量PCR对Clontech多组织cDNA芯片进行重复试验分析小鼠不同组织中Tim4 mRNA的情况。 (b)DO11010TcR转基因T细胞在体外分化为TH1或TH2系，在每轮再刺激后从静息细胞中制备RNA。RNA也可以由长-期T细胞克隆AE7(TH1)和D10.G4(TH2)，及CHO-Tim-4稳定转化系进行制备。显示了两次试验的数据。(c)SJL/J脾和淋巴节细胞被纯化为CD11b+，CD11c+，B220+，和CD3+细胞群。显示了超过5次试验的数据。(d)用GM-CSF或Flt3L从骨髓细胞中制备体外培养的树突状细胞，一部分细胞用LPS刺激。Flt3L-制备的细胞转变为浆细胞形式。显示了2次试验的数据。(e)用CMS5 Flt3L-引发的肿瘤细胞注射CB6F1小鼠并制备体外培养的树突状细胞。转化T细胞和B细胞的脾细胞按照类型进行分离。所有细胞类型用Tim-4Taqman RT-PCR对Tim-4mRNA表达进行定量。所有数据都以tim-4相对于GAPDH的表达量进行表示，并重复三孔。 
图13显示Tim-4配基在B细胞和活性T细胞中表达。全部的SJL/J脾细胞，无论经LPS和IFN-γ(用于B细胞)，或ConA(用于T细胞)激活或未激活的，都用B220-FITC或CD3-FITC和Tim-4-Ig进行染色(用抗-人IgG-PE测定)。数据表明了四次单独试验的结果。 
图14显示Tim-4与Tim-1特异交互作用。(a)经Tim-1，Tim-3，或Tim-4cDNA转染的CHO细胞用Tim-1-Ig(用抗-mIgG2a-PE检测，用单独的二抗作为对照)，Tim-2-Ig，或Tim-4-Ig(都用抗-hIgG-PE检测，用hIgG作为对照)染色。分别用单克隆抗-Tim-1或抗-Tim-3可在细胞表面检测到Tim-1和Tim-3，而用生物素标记的抗-HA对Tim-4进行检测(用抗生物素-PE可见；所有都与同型对照进行比较)。数据表明了超过10次试验的结果。(b)经Tim-1或Tim-4转染的HEK293细胞按前述方法用Tim-1-Ig或Tim-4-Ig染色。 为评估特异的染色情况，Tim-1-Ig预先与抗-Tim-1或抗-Tim-3共孵育，并用于Tim-4转染细胞的染色。此外，Tim-1转染细胞用抗-Tim-1或抗-Tim-3预先孵育并用Tim-4-Ig染色。数据表明了超过5次试验的结果。 
图15显示可在正常T细胞中观察到Tim-4-Tim-1的交互作用。(a)从全部脾细胞中分离CD3+细胞并用抗-CD3和抗-CD28刺激。按前述用抗-Tim-1或Tim-4-Ig染色。(b)全部脾细胞用ConA刺激并按前述用抗-CD3或Tim-4-Ig染色。细胞在经Tim-4-Ig染色之前预先与抗-Tim-1或抗-Tim-3孵育从而评估Tim-1与Tim-4-Ig结合的特异性。(c，d)DO11.10 TCR转基因T细胞在体外分化为TH1和TH2细胞系并用PMA+Ionomycin+golgi Stop激活3小时，并按前述用抗-Tim-1或Tim-4-Ig染色。激活的细胞用抗-CD4进行体外染色并用细胞因子抗体进行体内染色以确定其分化为TH1和TH2细胞系。数据表明了超过4次试验的结果。 
图16显示Tim-1-Ig在体外特异结合活性CD11b+和CD11c +细胞。来源于DO110.10TcR转基因小鼠或Balb/c小鼠的脾细胞用LPS和IFN-γ刺激。CD11b+和CD11c+细胞通过MACS柱进行纯化并在存在或缺失抗Tim-1或抗Tim-3单克隆抗体的情况下用生物素标记的Tim-1-Ig染色。抗生物素-PE被用于第二种检测试剂。数据表明了2次试验的结果。 
图17显示Tim-1-Ig的治疗引发T细胞的增殖。(a)来源于免疫SJL/J小鼠的脾细胞在体内用Tim-1-Ig，或hIgG或PBS对照处理，并用PLP 139-151多肽再刺激在体外培养48小时。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。(b)按6a试验中叙述的经PLP 139-151抗原刺激48小时的体外培养上清被用于细胞因子ELISAs；显示了IL-2， IL-4，IL-10和INF-γ的表达情况。单独分析来源于单独小鼠(6只)的脾细胞，并显示了所有小鼠的平均数值。误差栏表示S.E.M值。数据表明4次独立试验的结果。黑色菱形，PBS；黑色方形，hIgG；空心三角形，Tim-1-Ig处理。 
图18显示Tim-4-Ig引发体内的T细胞增殖及体外促进T细胞的增殖。 
(a)来源于经Tim-4-Ig，或hIgG或PBS对照体内免疫的SJL/J小鼠的脾细胞，在缺失多肽再刺激的情况下体外培养48小时。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。缺失多肽再刺激的情况下体外培养48小时后收获培养上清，并用于细胞因子ELISAs以测定在缺失抗原再刺激的情况下自然细胞因子的产生数量。来自于2个不同小鼠的脾细胞被分别测试三次，并显示了其平均值。(b)来源于2只经Tim-4-Ig(T4)或hIgG(Hu)体内免疫的SJL/J小鼠的脾细胞被分离为CD11b+(Mac)，B220+(B)，和CD3+(T)细胞群并在缺失多肽再刺激的情况下进行重组。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况。(c)用包被有特定浓度的抗-CD3，抗-CD28，和Tim-4-Ig或对照Igs的板对纯化的SJL/JT细胞进行刺激。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。数据表明了2个相同试验(左列)或5个相同试验(右列)的结果。所有误差栏表明重复孔的S.E.M.值。 
图19显示体内的Tim-1-Ig给药在TH2-偏倚系统中引发了TH2应答的增强和增殖。雌性Balb/c小鼠注射50μg OVA 323-339和4mg Imject alum(Pierce)并在7天后用50μg OVA 323-339和2mg alum加强注射。在免疫前4小时及7天加强免疫前4小时，及免疫后2，4，10天，小鼠用100μgTim-1-Ig，hIgG， 或250μlPBS注射5次。第14天，处死小鼠，脾细胞被用于分析增殖和细胞因子。(a)存在OVA 323-339多肽条件下体外培养脾细胞48小时。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。OVA 323-339多肽体外刺激48小时后收集培养上清并用于细胞因子ELISAs；显示了IL-2，IL-4，IL-10的表达情况。未得到明显的IFN-γ表达。源于单独小鼠(3只)的脾细胞分别重复三孔进行分析，并显示了所有3只小鼠的平均值。黑色菱形，PBS；黑色方形，hIgG；空心三角形，Tim-1-Ig体内注射。 
图20显示了鼠tim-4位点的选择性拼接图，产生两种可溶的tim-4形式。 
发明详述 
I.综述 
本发明通常提供了新的调节免疫应答的方法和药物。本发明的方法可以调控主体中针对Th1和Th2应答的免疫应答。Th1和Th2应答，某种程度上，是互斥的，正如初始CD4+T辅助细胞分化为Th1和Th2效应细胞，其每种都可分泌不同的细胞因子。相应地，本发明诱导Th1-介导的失调的方法可以用于患有Th2-介导失调的主体，而诱导Th2-介导的失调的方法可以用于患有Th1-介导失调的主体。 
本发明一个方面提供了对具有需要的主体进行免疫应答的调控的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以调节tim-1和tim-4之间的结合。在此所述的某一实施方案中，以Th1免疫应答的提高作为免疫应答，并且药物将增加tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达，例如那些提高tim-1和tim-4 之间的结合的药物。在此所述方法的另一个实施方案中，以Th2免疫应答的提高作为免疫应答，并且药物将减弱tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达，例如那些减弱tim-1和tim-4之间的结合的药物。 
本发明进一步提供了在需要治疗的主体中进行治疗或防止或减少遭受Th-1介导的疾病可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以减少tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达。Th1-介导的疾病包括自身免疫疾病，如多发性硬化，1-型糖尿病，Hashinoto’s甲状腺炎，Crohn’s疾病，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，胃炎，自身免疫性肝炎，溶血性贫血，自身免疫血友病，自身免疫淋巴细胞增生综合症(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，肾小球肾炎，Guillain-Barre综合症，银屑病和重症肌无力。Th1-介导的疾病也包括宿主排斥移植物疾病(HVGD)和抑制物排斥宿主疾病。 
本发明进一步提供了在需要治疗的主体中进行治疗或防止或减少遭受Th-2介导的疾病可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以增加tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达。在某一实施方案中，Th2-介导的疾病是哮喘，过敏，过敏性鼻炎，胃肠过敏，食物过敏，嗜曙红细胞增多，结膜炎或肾小球肾炎。 
在某一特别实施方案中，这里所述方法中使用的调节免疫应答的药物包括多肽(1)SEQ ID NO：331-133位氨基酸；(2)SEQID NO：431-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO：3 31-133位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO：4 31-134位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12中挑选的氨基酸序列。 
在另一个特别的实施方案中，这里所述方法中使用的调节免疫应答的药物包括多肽(1)SEQ ID NO：1 21-126位氨基酸；(2)SEQ ID NO：2 21-129位氨基酸；(3)与SEQ ID NO：1 21-126位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQID NO：2 21-129位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列。在另一个实施方案中，药物包括与SEQ ID NO：1 130-237位氨基酸，SEQ ID NO：2 127-288位氨基酸，SEQ ID NO：3 134-318位氨基酸或SEQ ID NO：4 136-281位氨基酸至少具有80％，85％或90％相同或相似的氨基酸序列。 
这里所述方法的一个实施方案中，这里所述方法使用的调节免疫应答的药物包括抗体，或其抗原-结合片段，其结合tim-1，tim-2或tim-4。在一个特别实施方案中，该药物是一种结合tim-4的抗体；抗体或片段可以结合，例如，tim-4 IgV和/或粘蛋白区域。另一个实施方案中，药物是一种针对tim-1和tim-2，或tim-2和semaphorin-4A的双特异抗体。减少tim-1，tim-2或tim-4活性的药物包括反义RNA药物。在另一个实施方案中，药物包括与SEQ ID NO：1 130-237位氨基酸，SEQ ID NO：2127-288位氨基酸，SEQ ID NO：3 134-318位氨基酸或SEQ IDNO：4 136-281位氨基酸至少具有80％，85％或90％相同或相似的氨基酸序列。药物也包括peptidomimetica和小分子，如小于2kDa的非多肽复合物。 
本发明进一步提供药物研究的方法，部分基于未预料的发现，即tim-1，tim-2或tim-4形成物理复合物，而这种作用将调节免疫应答。本发明的一个方面提供了鉴定可调节tim-1多肽和tim-4多肽之间结合的药物的方法，包括：(a)在测试药 物存在的条件下将tim-1多肽和tim-4多肽相结合；(b)鉴定测试药物对于tim-1多肽和tim-4多肽相结合的影响；从而鉴定调节tim-1多肽和tim-4多肽相结合的药物。本发明也提供了调节免疫应答的药物的方法，该方法包括(a)在测试药物存在的条件下将tim-1多肽和tim-4多肽相结合；(b)鉴定测试药物对于tim-1多肽和tim-4多肽相结合的影响；从而鉴定调节免疫应答的药物。在某一实施方案中，步骤(b)包括在存在测试药物的合适的对照情况下，比较tim-1/tim-4复合物的形成。在特别实施方案中，合适的对照包括在缺失测试药物的情况下，第一种多肽和第二种多肽间复合物的形成。 
在另一实施方案中，第一种多肽或第二种多肽或其两者在细胞中都有表达。在另一实施方案中，测定复合物的形成包括测试报告基因的表达，其中报告基因的表达依赖于复合物的形成。在另一实施方案中，第一种多肽或第二种多肽或其两者都标记荧光素分子。在另一实施方案中，tim-4多肽包括(1)SEQ ID NO：331-133位氨基酸；(2)SEQ ID NO：4 31-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO：3 31-133位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO：4 31-134位氨基酸；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12中挑选的氨基酸序列。而在另一实施方案中，tim-1多肽包括(1)SEQ ID NO：12 1-126位氨基酸；(2)SEQ ID NO：2 21-129位氨基酸；(3)与SEQ IDNO：1 21-126位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO：2 21-129位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列。在另一个实施方案中，tim-1多肽包括与SEQID NO：1 130-237位氨基酸，SEQ ID NO：2 127-288位氨基酸至少具有80％，85％或90％相同或相似的氨基酸序列。 
鉴定调节tim-1和tim-4结合的药物的方法可以用于鉴定增加tim-1和tim-4结合的药物，或减弱tim-1和tim-4结合的药物。本方法并非限制于鉴定任何特定单个药物类型。药物可以是，例如，小复合物，抗体，多肽，核酸，或碳水化合物。 
此外，本发明的一个方面提供了鉴定tim-4中对于tim-1和tim-4结合起关键作用的氨基酸残基的方法，该方法包括(a)将以下两种物质相结合(1)包含tim-4 IgV区域的多肽，其中所述的tim-4 IgV区域与SEQ ID NO：3 31-133残基或SEQID NO：4 31-134残基中所列的tim-4 IgV区域具有一个和10个氨基酸之间的位点相关性；(2)tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以结合tim-4多肽；(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并且(c)若复合物的形成与合适的对照不同，则将形成的复合物与合适的对照相比较，其中一个氨基酸被鉴定为对于结合tim-1至关重要。 
本发明的相关方面提供了鉴定tim-4中对于tim-4与tim-1结合起关键作用的氨基酸残基的方法，该方法包括(a)将以下两种物质相结合(1)包括tim-4粘蛋白区域的多肽，其中所述的tim-4粘蛋白区域与SEQ ID NO：3 134-318残基或SEQID NO：4 136-281残基中所列的tim-4粘蛋白区域具有一个和10个氨基酸之间的位点相关性；(2)tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以结合tim-4；(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并且(c)若复合物的形成与合适的对照不同，则将形成的复合物与合适的对照相比较，其中一个氨基酸被鉴定为对于结合tim-1至关重要。 
在鉴定tim-4中对于tim-4与tim-1结合至关重要的氨基酸的方法中的一个实施方案中，合适的对照包括(1)tim-1多肽，和(2)包括SEQ ID NO：3 31-133氨基酸和/或SEQ ID NO：3 134-318氨基酸的对照多肽间形成的复合物。在另一个实施方案中，tim-1多肽包括(1)SEQ ID NO：1 21-126氨基酸；(2)SEQID NO：221-129氨基酸；(3)与SEQ ID NO：1 21-126氨基酸或SEQ ID NO：1 130-237氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO：2 21-129氨基酸或SEQ ID NO：2 127-288氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列。 
本发明的另一个方面提供了测定所测多肽是否结合tim-1多肽的方法，其中所测多肽包括那些与SEQ ID NO：3 31-133氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列，该方法包括(a)将所测多肽与tim-1多肽相接触；并且(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；其中若检测到复合物的形成则所测多肽被鉴定为与tim-1多肽相结合。在一个示范性实施方案中，tim-1多肽包括(1)SEQ ID NO：1 21-126氨基酸；(2)SEQ ID NO：221-129氨基酸；(3)与SEQ ID NO：1 21-126氨基酸或SEQ IDNO：1 130-237氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO：2 21-129氨基酸或SEQ ID NO：2 127-288氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列。 
本发明的另一个方面提供了测定所测多肽是否结合tim-4多肽的方法，其中所测多肽包括那些与SEQ ID NO：1 21-126氨基酸或SEQ ID NO：1 130-237至少具有90％相同或相似的氨基酸序列，该方法包括(a)将所测多肽与tim-4多肽相接触；并且(b)测定多肽和tim-4多肽间复合物的形成；其中若检测到复合物的形成则所测多肽被鉴定为与tim-1多肽相结合。在一个实施方案中，tim-4多肽包括(1)SEQ ID NO：3 31-133位氨基酸；(2)SEQ ID NO：4 31-134位氨基酸；(3)与SEQ IDNO：3 31-133位氨基酸或SEQ ID NO：3 134-318位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO：4 31-134位氨基酸或SEQ ID NO：4 136-281位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12中挑选的氨基酸序列。 
本发明的另一个方面提供了防止或减少主体中患遗传性过敏症的方法，该方法包括给予主体治疗有效性剂量的多肽，所述多肽包括(1)SEQ ID NO：3 31-133位氨基酸；(2)SEQ IDNO：4 31-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO：3 31-133位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO：4 31-134位氨基酸或SEQ ID NO：4的136-281位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12中挑选的氨基酸序列。 
本发明的另一个方面提供了治疗或防止或减少主体中遭受A型肝炎感染的可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效性剂量的多肽，所述多肽包括(1)SEQ ID NO：3 的31-133位氨基酸；(2)SEQ ID NO：4的31-134位氨基酸；(3)与SEQ IDNO：3的31-133位氨基酸或SEQ ID NO：3的134-318位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO：4的31-134位氨基酸或SEQ ID NO：4的136-281位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQID NO：11，SEQ ID NO：12中挑选的氨基酸序列。在一个实施方案中，主体并未患有A型肝炎。在另一实施方案中，主体并未感 染A型肝炎病毒。而在另一实施方案中，主体中抗A型肝炎抗体血清呈阴性。在另一实施方案中，主体是儿童。在另一实施方案中，遗传性过敏症的疾病包括哮喘，鼻炎，湿疹和花粉热。 
本发明的另一个方面提供了一种新的可溶性tim-4多肽。一个方面提供了一种包括一种tim-4 IgV区域，tim-4胞内区域，和一个缩短了的tim-4粘蛋白粘液素区域的分离多肽，其中该多肽不包括tim-4跨膜区域。本发明的另一个方面提供了一种包括一种tim-4 IgV区域，和一个截短的tim-4粘蛋白区域的分离多肽，其中该多肽不包括tim-4跨膜区域或tim-4胞内区域。在一种优选的实施方案中，可溶性tim-4多肽是一种哺乳动物多肽，如人类或小鼠多肽。在一种特别的实施方案中，可溶性的tim-4多肽包括SEQ ID NO：3 31-133氨基酸或SEQ IDNO：4 31-134氨基酸。在另一个实施方案中，可溶性tim-4多肽包括SEQ ID NO：9，10，11，12中所列的序列，虽然在其他实施方案中可溶的tim-4多肽不包括信号序列。在一些实施方案中，可溶性tim-4多肽与其他多肽融合，如增加其体内稳定性的多肽。在一些实施方案中，融合多肽包括免疫球蛋白Fc区域或一种血清白蛋白多肽。本发明进一步提供了编码这里所述的可溶性tim-4多肽的核酸以及包括tim-4可溶性多肽和一种药物可接受载体的组合物。 
II.定义
出于方便，在此集合了说明书、实施例、和权利要求中使用的某些术语。除非另有定义，所有这里使用的技术和科学术语具有本发明所属领域中的普通技术人员通常理解上的相同含义。 
这里使用的词“一个”和“一个”指一个或多于一个(例如，至少一个)主体。根据实施例，“一个元素”指一个或多于一个元素。 
这里使用的术语“包括”，可以与术语“包括但不限于”交换使用。 
这里使用的术语“或”，可以与术语“和/或”交换使用，除非文中清楚地指明其他意义。 
这里使用的术语“例如”，可以与术语“例如但不限于”交换使用。 
术语“核酸”指多聚核酸如脱氧核糖核酸(DNA)，及在适用的地方，指核糖核酸(RNA)。该术语应理解为也包括，作为等同物的，由核酸类似物形成的RNA或DNA类似物，及，如所述实施方案中所应用的，单链(正义或反义)和双-链多聚核酸。 
术语“防止”是专业-公认的，当涉及某些情况下使用时，如局部复发(例如，疼痛)，一种疾病如癌症，一种复合症状如心脏病或其他任何医学疾病，在此领域中是熟知的，并包括在情况发生之前给予复合物治疗，使得与未接受复合物治疗的主体相比，可使主体减少发病频率，减弱严重性，或延缓医学疾病的发作。这样，癌症的防止包括，例如，通过统计的和/或具有临床意义的计数，与未接受治疗的对照群体相比，接受预防疾病治疗的病人群体中可检测到的癌症生长的数量有所下降，并且/或者与未接受治疗的对照群体相比，接受治疗的群体中可检测到的癌症生长的发生将延缓。感染的防止包括，例如，与未接受治疗的对照群体相比，接受治疗的群体中感染诊断的数量将减少，并且/或者与未接受治疗的对照群体相比，延缓接受治疗的群体中感染症状 的发作。疼痛的防止包括，例如，与未接受治疗的对照群体相比，对于接受治疗的群体遭受的疼痛，其发生频率将减少，严重性将减弱，或可选地有所延缓。 
这里使用的术语“有效数量”指达到预期结果所需的预先给予的一定剂量的有效数量。本发明的化合物的有效剂量可以根据各种因素而变化，如疾病的阶段，年龄，性别，及动物的体重。剂量方案可以进行调整以提供最优的治疗反应。例如，可以按天注射一些分离的剂量，或根据治疗情况的紧急情况所显示剂量可以适当地减少。 
这里使用的术语“主体”指任何脊椎动物，适宜地为哺乳动物，更适宜地为人类。主体的实施例包括人类，非-人类灵长类，啮齿动物，豚鼠，兔，绵羊，猪，山羊，牛，马，狗，猫，鸟，和鱼。 
这里使用的多肽的“变体”指具有一个或更多氨基酸替换的一段氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化，其中替换的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，将亮氨酸替换为异亮氨酸)。更罕见的，变体可以具有“非保守的”变化(例如，将氨基乙酸替换为色氨酸)。相似的次要辅基改变还包括氨基酸删除或插入，或两种兼有。此领域中熟知的计算机程序可以作为指南找出被替换，插入，或删除后将不会扰乱生物或免疫活性的氨基酸残基，例如，DNASTAR软件。 
这里使用的“Th1-相关的失调”是一种异常相关的疾病或情况，例如，与参考相比，如，一种正常对照，Th1细胞的活性增强(例如，Th1细胞的应答增强)或数量增加。Th1失调的实施例包括，例如，自身免疫失调(如多发硬化症、风湿性关节炎、I型糖尿病和Crohn氏病)。 
这里使用的“Th2-相关的失调”是一种异常相关的疾病或情况，例如，与参考相比，如，一种正常对照，Th2细胞的活性增强(例如，Th2细胞的应答增强)或数量增加。Th2失调的实施例包括，例如，哮喘，过敏，和抗体成分相关的失调(例如，风湿性关节炎)。 
这里使用的术语“类似物”包括，但不局限于，与参考序列相比，具有一个或多个氨基酸替换，插入，和/或删除的氨基酸序列。氨基酸替换可以是保守或非保守特性。保守的氨基酸替换包括将本发明的多肽的一个或多个氨基酸替换为具有相似电荷，大小，和/或亲水性特性的氨基酸。只有保守替换形成的类似物是功能等同的。非-保守氨基酸替换包括将多肽的一个或多个氨基酸替换为具有非相似电荷，大小，和/或亲水性特性的氨基酸。氨基酸插入可由单一氨基酸残基或2到15个氨基酸组成的序列组成。删除可以是一个或多个氨基酸的移除，或氨基酸序列的不连续部分。删除的氨基酸可以是连续的或非连续的。 
III.Tim氨基酸和核酸序列 
人类和小鼠的tim多肽序列描述于SEQ ID NOs：1-14和PCT公开No.WO03/002722，美国专利号6066498，6204371，6288218，6084083，6414117，6562343，及美国专利申请公开号2003/0069196和2003/0124114，其教导通过在此引述全部整合于本文中。本发明的Tim-1，tim-2和tim-4的核酸和多肽根据进一步的理解包括下列描述的核酸和变体的序列。变体核酸序列包括那些具有一个或多个核酸差异的序列，如替换，插入或删除，例如等位基因的变体；并且将，因此，包括与编码野生-型tim-1，tim-2和tim-4核酸序列不同的编码序列，例如，归因于遗传密码的退化。例如，编码tim-1的IgV区域的核酸 可以是与野生-型tim-1具有90％，95％，99％，或100％一致性的核酸序列。 
小鼠和人类tim-1多肽和核酸序列见美国专利申请公开号2003/0124114，其内容通过在此引述全部整合于本文中。人类tim-1多肽见Genbank Deposit No.NP_036338(SEQ ID NO：1)，并且cDNA核酸序列见NM_012206(SEQ ID NO：5)。小鼠的tim-1氨基酸和核酸(cDNA)序列分别见Genbank DepositNo.NP_599009(SEQ ID NO：2)及NM_134248(SEQ ID NO：6)。tim-1在科技文献中也指HAVCR1，KIM1，HAVCR，KIM-1，TIMD1。 
自然发生的人类tim-1等位基因变体氨基酸和核酸序列见美国专利申请公开号2003/0124114 SEQ ID NOs：17-28。这些序列通过引述在此被整合。人类tim-1 IgV区域跨越SEQ IDNO：1的21-126位残基，而小鼠tim-1 IgV区域跨越SEQ IDNO：2的21-129位残基。人类tim-1粘蛋白区域跨越130-237位残基。小鼠tim-1粘蛋白区域跨越127-288位残基。人类和小鼠tim-1的额外区域，如信号序列，跨膜区域和胞内区域描述于McIntire et.al.，Nat.Immunol.(2001)；2(12)：1109-16，其内容通过在此引述被合并于本文。 
小鼠TIM-2，一种类似的305个氨基酸的膜蛋白，与小鼠tim-1具有64％的一致性，与大鼠KIM-1具有60％一致性，与hHAVcr-1具有32％一致性。与TIM-1类似，TIM-2具有两个胞外N-连接糖基化位点和一个带有多个O-连接糖基化位点的丝氨酸，苏氨酸-富足粘蛋白区域。TIM-2也具有一个胞内酪氨酸激酶磷酸化模体，RTRCEDQVY。小鼠TIM-2多肽和核酸序列分别见美国专利申请公开号2003/0124114的序列5和8。额外的小鼠tim-2序列见Genbank Deposit No.NP_599009及 NM_134249。小鼠tim-2的IgV区域大约从SEQ ID NO：13的25-127位置。 
小鼠和人tim-4多肽和核酸的序列见美国专利申请公开号2003/0124114中描述，其内容通过在此引述而全部合并于本文。人tim-4的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和核酸(cDNA)(SEQID NO：7)序列分别见美国专利申请公开号2003/0124114，SEQ IDNOs：33和34中描述，同样的，tim-4的等位基因变量氨基酸和核酸(cDNA)序列也分别在SEQ ID NOs：35和36中被描述。小鼠tim-4的两种氨基酸序列在SEQ ID NO：4(NP_848874)和SEQ ID NO：12中被描述。对应于SEQ ID NO：12的核酸序列见SEQ ID NO：3(NM_178759)。人tim-4的IgV区域横跨SEQID NO：3的31-133位残基，小鼠tim-4的IgV区域横跨SEQID NO：4的31-134位残基。人tim-4的粘蛋白区域横跨SEQID NO：3的134-318位残基。小鼠tim-4的粘蛋白区域横跨SEQ ID NO：4的134-281位残基。 
本发明也提供了变异tim-4多肽和编码核酸。在本发明的一方面，变异tim-4多肽缺少一个或多个外显子，导致多肽缺少N-末端，C-末端或中间序列，或因为外显子删除而具有一个移码的阅读框。在某一实施方案中，本发明提供了缺失横跨膜区域的可溶性tim-4多肽。在另一实施方案中，本发明提供了缺失横跨膜的区域和缺失所有或部分粘蛋白区域的可溶性tim-4多肽。在某一实施方案中，可溶性tim-4多肽缺失粘蛋白区域C-末端的10-40个氨基酸，15-30个氨基酸，或更适宜地18-25个氨基酸。在某一实施方案中，变异的可溶性tim-4多肽包括的氨基酸序列见SEQ ID NOs：9，10，或11。在另一实施方案中，可溶性人tim-4多肽缺失SEQ ID NO：3的282-337残基。本发明也提供了编码所述的可溶性tim-4多肽的核酸。 
本发明的核酸进一步被理解为包括上述多肽的变异体的核酸。变异体核酸序列包括的序列有一个或多个核酸差异，比如，通过替换，增加或删减，如等位基因变异体；并且将，因此包括不同于野生型tim-1或tim-4核酸序列的编码序列，例如由于基因编码退化所导致。例如，编码tim-1 IgV区域的核酸可以是与野生型tim-1 IgV区域的序列至少有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，100％等同或相似的核酸序列。人和小鼠的tim多肽序列在PCT公开号WO03/002722，美国专利号6066498，6204371，6288218，6084083，6414117和6562343，及美国专利申请公开号2003/0069196和2003/0124114中被描述，其技术通过在此引述全部合并于本文中，包括所有tim-1，tim-2，tim-3和tim-4，变异体和其片段的核酸或氨基酸序列。 
由于基因编码退化导致的不同于野生-型序列的分离的核酸或它们的多肽产物也在本发明的研究范围之内。例如，许多氨基酸由超过一种的三联密码子所编码。相同氨基酸特异的密码子，或同义密码子(例如，CAU和CAC都是组氨酸的同义密码子)可造成突变“沉默”，其不影响多肽的氨基酸序列。此领域中的普通技术人员将认识到，由于自然等位基因的变异，给定物种个体中编码特定多肽的核酸存在一个或多个核酸变异。任何以及所有这些核酸变异及由此导致的氨基酸多肽性也包括在此发明的范围中。 
本发明提供了使用多肽或核酸的方法，其中核酸或多肽在一定程度上具有与其他核酸或多肽相同或相似的序列。为了鉴定两个氨基酸序列或两个核酸序列的一致性百分比，可将序列以最佳的比较目的进行阵列(例如，基于最优阵列，可在第一种和第二种氨基酸或核酸序列的一者或两者中引入间隙，而非-同源序列可出于比较目的被忽略)。在优选实施方案中，出于比较目的， 参考序列全长的至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更长部分被阵列。在对应的氨基酸位点或核酸位点的氨基酸残基或核酸将进行比较。当第一个序列中的位点上的氨基酸残基或核酸与第二个序列中对应位点相同，则该分子在此位点具有一致性(这里使用的氨基酸或核酸“一致性”等同于氨基酸或核酸“同源”)。两个序列间的一致性百分比是序列上一致性位点数量的函数，并考虑间隙的数量，及每个间隙的长度，在两个序列的最优化阵列中需要将其引入。 
序列的比较和一致性百分比的测定及两个序列的相似性可以运用数学运算完成(参见Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，new York，1988；Biocomputing：Informatics and Benome Projects，Smith，D.W.，ED.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，andGriffin，H.G.，eds.，Humans Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G，Academic Press，1987；andSequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。 
在某一实施方案中，运用Nedleman和Wunsch(J Mol，Biol.(48)：444-453(1970))算法测定两个氨基酸序列间的一致性百分比，其已经被整合入GCG软件包的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)。在一种特定实施方案中，在GAP程序中使用以下参数：Blossom 62 matrix或PAM250 matrix，及gapweight为16，14，12，10，8，6，或4及length weight为1，2，3，4，5，6。在另一个实施方案中，两个核酸序列见一致性百分比可运用GCG软件包中的GAP程序测定(Devereux，J.，et al.Nuclein acids Res.12(1)：387(1984))(可从http://www.gcg.com 获得)。示范性的参数包括NWSgapdna.CMP matrix的运用，及gap weight为40，50，60，70，或80及length weight为1，2，3，4，5，6。 
在另一个实施方案中，运用E.Myers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))算法测定两个氨基酸或核酸序列间一致性百分比，其已经整合入ALIGN程序(version2.0)，并使用PAM120重量残基表，裂缝长度处罚(gap length penalty)为12，裂缝处罚(gap penalty)为4。 
两个核酸或氨基酸序列间最佳全面阵列的测定可运用基于Brutlag et al.运算的FASTDB计算机程序完成(Comp.App.Biosci.，6：237-245(1990))。在序列阵列中query和subject序列同时皆为核酸序列或同时皆为氨基酸序列。所述的全球序列阵列结果将依据一致性百分比表述。在一种实施方案中，运用基于Brutlag et al.运算的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))进行氨基酸序列鉴定。在特定实施方案中，用于计算一致性百分比和氨基酸阵列相似性的参数包括：Matrix＝PAM150，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，JoiningPenalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5及Gap Size Penalty＝0.05。 
在某些实施方案中，本发明也包括具有较低一致性的多肽，例如具有至少60％一致性，但更包括充分相似的多肽，从而执行一种或多种与tim-1或tim-4多肽相似的功能。相似性将通过保守氨基酸替换而测定。这些替换为在多肽中将给定氨基酸替换为另一个具有相似特征的氨基酸。保守替换可能为表型沉默的。典型的保守替换是，脂肪族氨基酸AlaValLeuIle间的替换，Ser和Thr羟基的互换，Asp和Glu酸性残基的交换，Asn和Gln酰氨残基的替换，Lys和Arg碱性残基的交换，及The，Tyr芳香残 基的替换。其他涉及哪个氨基酸改变将造成表型沉默的指南见Bowie et al.，Science 247：1306-1310(1990)。 
本发明的一些方面提供了多肽，或使用这些多肽的治疗方法，其中所述的多肽，至少部分与参考序列一致。例如，本发明提供了在所需主体中调节免疫应答的方法，包括使用氨基酸序列给予所述的主体治疗，其与SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸(参考序列)至少具有90％的一致性。相应地，这些多肽具有与参考序列不一致的特定比例的氨基酸残基。在一个优选实施方案中，这些非-一致残基具有那些不一致的残基相似的特性。具有相似特性基团的氨基酸包括：E，D，N，Q；H，K，R；Y，F和W；I，L，V，M，C，A；和S，T，C，P，A。在另一个实施方案中，在至少一种进化相关物种中，如具有相同顺序的物种中，其参考序列和直系同源序列间不具有进化保守性的残基为那些不一致的残基。对于哺乳动物参考序列，在优选实施方案中，突变氨基酸是那些在参考序列和另一哺乳动物物种间不具保守性的残基。例如，如果本发明中的方法使用的多肽包括的氨基酸序列与人tim-4 IgV区域具有90％一致性，那么该多肽具有非-一致残基，其位于tim-4 IgV区域上与小鼠，大鼠，猪和/或鸡不同的位点。 
本发明进一步提供了药物生产者使用的试剂，以治疗任何这里描述的疾病。这里所述的通过给予主体药物治疗从而治疗或防治疾病的任何方法，可以被药物生产者作为治疗疾病的药物使用。例如，在特定实施方案中，tim-1 IgV-Fc融合多肽可以被药物生产者用于治疗Th1-介导的疾病。 
在特定方面，目前的发现提供了可用的分离和/纯化形式的可溶性tim-4多肽，其从其他通常与之相联的多肽或包括该多肽的特定复合物中进行分离或纯化。在特定实施方案中，可溶性tim -4多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO：2，4，6，8氨基酸序列至少具有90％，95％，97％，99％或100％一致性。使用阵列算法，如基于PAM250矩阵，通过首先对两个多肽序列进行阵列比较，能测定两个多肽之间氨基酸序列的一致性。 
在特定的实施方案中，可溶性tim-4是一种多肽，其包括的部分氨基酸序列与SEQ ID NO：9，10，11或12氨基酸序列至少具有90％，95％，97％，99％或100％一致性，并且更适宜地，其中所述的部分是一种功能部分，如可充分调节Th1/Th2活性或能结合tim-1的部分。在某一实施方案中，这部分包括tim-4的IgV区域。在一些实施方案中，可溶性tim-4多肽包括保守氨基酸替换。在特定的实施方案中，可溶性tim-4多肽被纯化或部分被纯化。在某些实施方案中，可溶性tim-4多肽包括在SEQ IDNOs：9-12列出的序列，其带有或不带有信号序列。 
本发明进一步包含包括可溶性tim-4多肽和异源多肽的融合多肽。在某一实施方案中，可溶性tim-4多肽包括IgV区域但至少缺失粘液素区域的一部分，并且缺少跨膜部分，和胞内区域。在特定的实施方案中，提供包括可溶性tim-4多肽和免疫球蛋白成分的融合多肽。一种示范性的免疫球蛋白成分如人IgG1重链Fc区域的恒定区域。(Browning et al.，J.Immunol.，154，pp.33-46(1995))。可溶性受体-IgG融合多肽是普通的免疫学的试剂，制造它们的方法在本领域是熟知的(see e.g.，U.S.PatNo.5225538，5766883，和5876969)，所有这些通过在此引述而全部合并于本文。在一些实施方案中，目前发明的可溶性多肽与Fc变异体融合。 
在相关的实施方案中，发明的改良多肽包括带有免疫球蛋白Fc区域的tim-4融合多肽。正如大家所知，每一免疫球蛋白重链的恒定区域包括四或五个区域。这些区域依次被命名为：CH1 -绞合-CH2-CH3(-CH4)。重链区域的DNA序列在免疫球蛋白家族中交叉-同源，例如，IgG的CH2区域与IgA和IgD的CH2区域，及IgM和IgE的CH3区域同源。这里使用的术语“免疫球蛋白Fc区域”是指免疫球蛋白链恒定区域的C-末端部分，尤其指免疫球蛋白重链恒定区域或其中的一部分。例如，免疫球蛋白Fc区域可以包括1)CH1区域，CH2区域，和CH3区域，2)CH1区域和CH2区域，3)CH1区域和CH3区域，4)CH2区域和CH3区域，或5)两个或更多区域和免疫球蛋白绞链区的结合。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc区域至少包括一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2区域和一个CH3区域，而缺少CH1区域。 
在某一实施方案中，这类免疫球蛋白的重链的恒定区域来源于IgG(Igγ)(γ次类1，2，3，或4)。其他的免疫球蛋白IgA(Igα)，IgD(Igδ)，IgE(Igε)，IgM(Igц)，可以被使用。免疫球蛋白重链恒定区域的适当的选择在美国专利号5,541,087和5,726,044中被详细论述。该领域的技术水平可以从特定的免疫球蛋白种类或次类中，选择特殊的免疫球蛋白重链恒定区域序列，以获得特殊的结果。编码免疫球蛋白Fc区域的DNA结构的部分首选地至少包括绞链区域，Fcγ的CH3区域的一部分或IgA、IgD、IgE、或IgM中的同源区域。 
此外，可预期地，在免疫球蛋白重链恒定区域进行氨基酸的置换或删除对发明的应用是有用的。一个例子是在CH2区域上部介导氨基酸置换以生成一个对Fc受体亲合力减少的Fc变异体。(Cole et al.(1997)J.IMMUNOL.159：3613)。使用众所周知的分子生物技术，在该领域的普通技术人员能制备这种结构物。 
在进一步的实施方案中，融合蛋白包括一个可溶性tim-4多肽和另一个异源多肽，其可以增加融合多肽在机体内的稳定 性，或调控其生物活性或定位，或便于融合蛋白的纯化。其他示范性的异源多肽能用于制备tim-4可溶性多肽，包括，但不局限于，聚组氨酸，Glu-Glu，谷光甘肽S转移酶(GST)，硫氧还蛋白，多肽A，多肽G，和免疫球蛋白重链恒定区域(Fc)，麦芽糖结合多肽(MBP)，其对于通过亲和层析分离融合蛋白有用。出于亲合层析的目的，用于亲合层析的相关的基质有谷胱甘肽-，淀粉酶-，和镍-，或钴-，共轭树脂。其他在这一领域熟知的融合区域是绿色荧光多肽(GFP)。融合区域也包括“表位标签”，其通常是一种短的多肽序列，其上可以获得特定的抗体。熟知的可获得特定单克隆抗体的表位标签包括FLAG，流感病毒血凝素(HA)，和c-myc标签。在一些例子中，融合区域有一个蛋白酶切割位点，如Xa因子或凝血酶，其允许相关的蛋白酶部分分解融合多肽并且释放重组多肽。通过随后的层析分离可以从融合区域分离释放的多肽。 
更适宜地，在周期中的典型的半衰期大于20小时的稳定的血浆多肽，与tim-4一起用于构建融合多肽。这些血浆多肽包括，但不限制：免疫球蛋白，血清清蛋白，脂多肽，阿朴脂多肽和铁传递蛋白。能够绑定特殊的细胞或组织的可溶性tim-4分子的序列也能附属于可溶性tim-4蛋白制备特定定位的可溶性tim-4融合蛋白。 
在一个优选的实施方案中，本发明提供血清蛋白的tim-4融合蛋白。正如这里使用的“血清蛋白”指所有的具有一种或更多血清蛋白功能活性(例如，生物学活性)的血清蛋白多肽或氨基酸序列，或血清蛋白片段或变异体。特别是，“血清蛋白”指人血清蛋白或其片段(参见EP 201239，EP322094WO97/24445，WO95/23857)尤其指人血清蛋白的成熟形式，或来源于其他脊椎动物的血清蛋白。在特殊情况下，本发明 的血清蛋白融合多肽可以包括自然地出现的人血清蛋白多形态的变异体或人血清蛋白的片段。(见WO95/23857)，例如这些在EP 322094中描述的片段(名为HA(Pn)，见369-419)。血清蛋白可以来源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，如人，牛，羊，或猪。非哺乳动物的血清蛋白包括，但不具限制性，母鸡和鲑鱼。血清蛋白融合多肽的血清蛋白部分可以来自不同的动物的tim-4或tim-1多肽。 
在一些实施方案中，血清蛋白融合多肽的血清蛋白多肽部分对应于血清血清蛋白的片段。血清血清蛋白的片段包括在氨基末端或C-末端有一个或多个残基被删除的多肽。一般而言，HA片段或变异体至少有100个氨基酸长度，更适宜至少有150个氨基酸长度。HA变异体至少可以包括或可选择的包括HA的整个区域。人血清蛋白的区域的描述见美国专利申请公开号2004/0171123。 
在特定的实施方案中，本发明包括编码可溶性tim-4多肽的核酸。在进一步的实施方案中，本发明也适合包含可溶性tim-4多肽和相关派生物的主体细胞。主体细胞可以是任何原核或真核细胞。如，目前发明的多肽可以在细菌细胞如E.coli，昆虫细胞(如，用杆状病毒表达系统)，酵母或哺乳动物细胞中表达。在某一实施方案中，可溶性tim-4多肽由哺乳动物细胞制备和分泌，并从培养基中纯化可溶性tim-4多肽。其他合适的主体细胞被该领域的技术人员所知。因此，目前发明的一些实施方案进一步适合制备可溶性tim-4多肽的方法。 
为了提高治疗的或预防的功效，或增加其稳定性(如在体外的保存期限和在体内抵制分解蛋白的降解)，可以通过修饰主体tim-4多肽的结构来完成。这些修饰多肽，只要还保留多肽的自然地-出现形式时的一种活性，就认为是在这里被详细描述的 tim-4多肽的功能等价物。这些修饰多肽能通过如氨基酸的置换，删除，或增加来制备。 
例如，期望用异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸，用天冬氨酸单独替代谷氨酸，用丝氨酸替代苏氨酸或用一个结构相关的氨基酸的相似的氨基酸替代(如保守的突变)，而对结果分子不会有主要的生物学的活性的影响是合理的。保守的替代指发生在氨基酸的家族内的替代，它们有相关的侧链。起源地编码氨基酸能分为四大家族：(1)酸性的＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性的＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)无极性的＝丙胺酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电的极性的＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时共同地分类归于芳族氨基酸。相似地形式，氨基酸能分为：(1)酸性的＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性的＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)脂肪族的＝甘氨酸，丙胺酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，随意地，丝氨酸和苏氨酸被分为羟(基)脂肪族；(4)芳族的＝苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸；(5)氨基化合物＝天冬酰胺，谷氨酰胺；和(6)含硫的＝半胱氨酸和甲硫氨酸。(见，如，Biochemistry，2nd Ed.by L.Stryer，W.H.Freeman andCo.，1981)。通过评估变异体多肽在细胞中引发的，与野生-型多肽相似形式的反应，能够容易地断定多肽氨基酸序列的改变是否导致功能性同族体。比如，因为它们通过Th1或Th2细胞调节细胞因子分泌的能力，或绑定tim-1多肽的能力，可以评估tim-4多肽的变异体形式。超过一个氨基酸替代的多肽也能以相同的方法被测定。 
本发明提供的，或在本发明的方法中使用的，某些tim-1，tim-2或tim-4多肽可以进一步包括翻译后修饰。示范性的翻 译后修饰包括磷酸化，乙酰化，甲基化，ADP核糖基化，泛素化，糖基化，羟基化，小泛素样，生物素化作用，或多肽侧链或疏水组的增加。作为结果，被修饰的可溶性多肽可以包括非氨基酸成分，如脂质，多聚的或单体糖类，和磷酸盐。 
本发明的某一特定实施方案中，主体tim-1，tim-2，或tim-4多肽的修饰形式，如tim-4可溶性多肽，包括将主体的可溶性多肽与非多肽聚合体相连接。在某一特殊实施方案中，聚合体为聚乙二醇(“PEG”)，聚丙二醇，或聚氧化烯，见U.S.Pat.Nos.4640835；4496689；4301144；4670417；4791192或4179337所列的形式.众所周知，PEG是水溶性聚合体，可商业购买或根据该领域熟知的，通过乙二醇的循环-开放聚合的方法制备(Sandler and Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，NewYork，Vol.3，pages138-161)。术语“PEG”包括任何聚乙二醇分子，而不必考虑大小或PEG的末端的修饰，能以X-O(CH2CH2O) n-1CH2CH2OH的形式表示，(1)，n为20-2300，X是H或末端修饰，如C1-4烃基。在某一实施方案中，本发明的PEG末端以羟基或甲氧基终止，如X是H或CH3(“甲氧基PEG”)。PEG可以进一步包括绑定反应所必须的；产生于分子化学合成的；或作为隔层使分子各个部分保持适当距离的化学基团。此外，这种PEG能组成相互连接的一个或更多个PEG侧链。带有多于一个PEG链的PEGs称为多臂的或分支的PEGs。分支的PEGs能通过在多羟化合物上增加聚环氧乙烷，包括，丙三醇，季戊四醇，山梨醇来制备。例如，四-臂分支PEG能用季戊四醇和乙烯氧来制备。分支PEG的描述见EP-0473084和U.S.Pat.No.5932462。PEGs的一种形式包括通过赖氨酸的基本氨基酸组连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardini，C.，et al.，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。 
PEG与多肽或聚肽的连接通常包括PEG的活化及活化的PEG-介质与直接针对的目标聚肽/多肽或其连接物的耦合，该连接物随后被活化并与目标聚肽/多肽耦合。(见Abuchowski，A.et al，J.Biol.Chem.，252，3571(1977)和J.Biol.Chem.，252，3582(1977)，Zalipsky，et al.，和Harris et.Al.，in：Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and BiomedicalApplication；(J.M.Harris ed.)Plenum Press：New York，1992；Chap.21 and 22)。 
本领域中的普通技术人员可以挑选出合适的PEG分子量，例如，聚乙二醇化tim-4或tim-1多肽的临床使用方法，期望的剂量，疗程，对蛋白质水解作用的抗性，免疫原性，及其他事项。PEG及其在增强多肽作用中的使用，可参见N.V.Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 10：91-114(1993)。 
本发明的一个实施方案中，PEG分子可以激活并与tim-4或tim-1多肽的氨基族反应，如赖氨酸(Bencham C.O.et al.，Anal.Biochem.，131，25(1983)；Veronese，F.M.et al.，Appl.Biochem.，11，141(1985)；Zalipsky，S.et al.，Polymeric Drugsand Drug Delivery Systems.Adrs 9-110 ACS Symposium Series469(1999)；Zalipsky，S.et al.，Europ.Polym.J.，19，1177-1183(1983)；Delgado，C.et al.，Biotechnology and AppliedBiochemistry，12，119-128(1990))。在另一实施方案中，PEG分子可以与tim-4或tim-1多肽的巯基连接(Ssrtore，L.，et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.，27，45(1991)；Morpurgoet al.，Biocon.Chem.，7，363-368(1996)；Goodson et al.，Bio/Technology(1990)8，343；U.S.Patent No.5,766,897)。U.S.Patent Nos.6,610,281和5,766,897描述了可以连接巯基的活性PEG种类实施例。在一些实施方案中，聚乙二醇化 (pegylated)tim-4或tim-1多肽包括了与N-末端氨基酸的alpha氨基共扼连接的PEG分子。位点特异的N-末端还原性胺化作用描述于Pepinsky et al.，(2001)JPET，297，1059，和U.S.Pat.No.5,824,784。利用其他可获得的亲核氨基组，使用PEG-醛对多肽的还原性胺化作用，见U.S.Pat.No.4002531，in Wieder et al.，(1979)J.Biol.Chem.25412579，and in Chamow etal.，(1994)Bioconjugate Chem.5133。 
IV.调控免疫应答的方法 
本发明的一方面提供在主体中调控免疫应答的方法，如，但不局限于，调控Th1或Th2反应，免疫耐性和迁移耐性。这里使用的术语调控指增加或减少。在优选的实施方案中，主体是人。在另一实施方案中，主体是哺乳动物，如小鼠。 
本发明的一个特殊方面提供了治疗或阻止或降低主体遭受Th1-介导疾病可能性的方法，这种方法包括给予主体药物的治疗有效剂量以降低tim-1，tim-2，或tim-4的表达或活性或同时降低两者，或降低tim-1与tim-4的结合或降低tim-2与semaphorin-4A的结合。Semaphorin-4A的氨基酸序列的描述见Genbank Deposit No.NP_071762。本发明的另一方面以在主体中减少，约束，抑制，改进，或延迟Th1-介导的免疫应答的方法为特征，包括给主体注射tim-1，tim-2或tim-4抗原，如给予tim-1，tim-2或tim-4抗原的有效剂量，减少，约束，抑制，改进，或延迟在主体中的Th1-介导的免疫应答。 
对比于Th2-介导的疾病，这里使用的“Th1-介导的疾病”指与Th1免疫应答的发展相关的疾病。这里使用的“Th1免疫应答”指至少一种Th1-细胞因子或Th1-抗体的应答。在优选的实施方案中，产生多于一种Th1-细胞因子或Th1-抗体的应答。 因此，Th1-介导的疾病是与Th1反应应答相关的疾病并且指至少一种Th1-细胞因子或Th1-抗体的部分或全部应答或至少Th1-细胞因子或Th1-抗体的水平增加。这些疾病在该技术领域已知并且包括如，但不局限于，自体免疫的(尤其为特殊器官)疾病，牛皮癣，Th1炎症的疾病，胞外寄生虫感染(如，针对蠕虫的反应)，整体器官同种异体移植排斥(如，急性的肾同种异体移植排斥)，B型肝炎(HBV)感染相关的症状(例如，HBV急性期或恢复期)，慢性C型肝炎(HCV)感染，胰岛素-依赖的糖尿病(IDDM)，多重硬化症(MS)，亚急性淋巴甲状腺炎(“寂静性甲状腺炎”)克罗恩氏病，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，肉状瘤病，动脉硬化症，急性抑制物-对抗-宿主疾病(GvHD)，血管球性肾炎，抗-肾小球基底膜疾病，wegener′s肉芽肿病，炎症肌病，Sjogren’s综合症，Behget’s综合症，风湿性关节炎，莱姆关节炎，和原因不明习惯性流产。 
在一些实施方案中Th1-介导的疾病是从以下组中挑选的，包括动脉粥样硬化，细胞外寄生虫感染，B型肝炎(HBV)感染相关的症状(例如，HBV急性期或恢复期)，慢性C型肝炎(HCV)感染，沉默的甲状腺炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，血管球性肾炎，抗-肾小球基底膜疾病，wegener′s肉芽肿病，炎症肌病，Sjogren’s综合症，Behget’s综合症，风湿性关节炎，和原因不明习惯性流产。 
这里所述的减少Th1-介导的免疫应答的方法可以特异地有利于治疗主体中自身免疫疾病。在某一实施方案中，目前发明中减少主体中Th1应答的方法直接用于遭受自身免疫疾病，或其高危主体的治疗。“自身免疫疾病”是一种疾病，其主体自身的抗体对自身组织具有反应或免疫效应T细胞对内源性自体-多肽产生自动应答并导致组织的破坏。这样，免疫应答即针对主体自 己的抗原，称为自身-抗原。这里使用的“自身-抗原”指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。这样，针对自身-抗原的免疫应答，与自身免疫疾病相关，是一种不良免疫应答并导致正常组织的破坏，而针对肿瘤抗原的免疫应答则是一种所期望的免疫应答并导致肿瘤或癌症的破坏。 
自身免疫疾病包括，但不局限于风湿性关节炎，Crohn’s疾病，多重硬化症，全身红斑性狼疮(SLE)，自身免疫性脑脊髓炎，重症肌无力(MG)，Hashimoto’s甲状腺炎，Goodpasture’s综合症，天疱疮(例如，寻常型天疱疮)，Grave’s疾病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫血小板减少紫癜，抗-胶原质抗体硬皮病，混合粘连组织疾病，多肌炎，恶性贫血症，先天阿狄森氏病，自身免疫-相关不育，肾小球肾炎(例如，急性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎)，大疱性类天疱疮，Sjogren’s综合症，胰岛素抵抗，和自身免疫糖尿病(1型糖尿病；胰岛素-依赖糖尿病)。最近自身免疫疾病已经被意识到也包括动脉硬化症和Alzheimer’s疾病。一种特定实施方案中，自身免疫疾病从以下组群中挑选，包括多重硬化症，1-型糖尿病，Hashinoto’s甲状腺炎，Crohn’s疾病，风湿性关节炎，全身红斑狼疮，胃炎，自身免疫肝炎，溶血性贫血，自身免疫血友病，自身免疫淋巴细胞增殖综合症(ALPS)，自身免疫葡萄膜炎，肾小球肾炎，Guillain-Barre综合症，银屑病和重症肌无力。另一实施方案中，Th1-介导的疾病是宿主对抗移植物疾病(HVGD)。在一种相关实施方案中，主体是器官或组织移植受纳者。 
本发明的另一方面提供了增加主体中免疫耐受性的方法，包括给予主体治疗有效剂量的减弱tim-1，tim-2或tim-4功能的药物。某-特别实施方案中，主体是异源移植受纳者。移植可以是任何器官或组织移植，包括但不局限于心脏，肾脏，肺，皮 肤，胰腺，骨髓，皮肤或软骨。这里使用的，移植耐受，指受纳者免疫系统对捐赠器官的排斥的缺失。此外，该药物可以用于防止组织或细胞移植的排斥或减少其发生的可能性。 
本发明的另一方面提供了在具有所需的主体中减少免疫耐受并增加Th1活性的方法，方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可增加tim-1，tim-2或tim-4表达或活性，例如tim-1，tim-2或tim-4增效剂，或增加tim-1与tim-4的结合或tim-2与semaphorin4A的结合。免疫耐受的减少对于癌症的免疫治疗可能是有益的。免疫系统可以产生针对肿瘤抗原的耐受性，这样使得肿瘤逃避免疫监视。本发明的一方面，增加tim-1，tim-2或tim-4活性，或增加tim-1与tim-4的结合或tim-2与semaphorin4A的结合的药物，可以给予受增生疾病的病人治疗。 
这里交替使用的术语“癌症”和“肿瘤”，都指一种增殖疾病。某一实施方案中，癌症包括Kaposi’s肉瘤，慢性白血病，前列腺癌，乳腺癌，肉瘤，胰腺癌，白血病，卵巢癌，直肠癌，喉癌，黑色素瘤，结肠癌，膀胱癌，淋巴瘤，]肥大细胞瘤，肺癌，乳腺癌，咽鳞状上皮细胞癌，和胃肠或胃癌。另一实施方案中，癌症包括基细胞癌，胆管癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；连接组合肿瘤；消化系统癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头和颈癌；胃癌；内-上皮内赘瘤；肾脏癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞或非-小细胞)；淋巴瘤包括Hodgkin’s和非-Hodgkin’s淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔肿瘤(例如，嘴唇，舌，口，咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；眼癌；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸道系统癌症；恶性毒瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症，及其他癌和恶性肿瘤。 
在另一方面，本发明以减少，抑制，压抑，改善，或延缓Th2-相关应答(例如，过敏或哮喘反应)的方法为特点，在具有需求的主体中，该方法包括给予主体一种药物的治疗，其可以增加tim-1，tim-2，tim-4的表达或活性，例如，给予一种tim-1，tim-2或tim-4增效剂，或加强tim-1与tim-4的结合或tim-2与semaphorin4A的结合的药物。 
这里使用的“Th2-介导的疾病”指与Th2免疫应答相关的疾病。这里使用的“Th2免疫应答”指引发至少一种Th2-细胞因子或Th2-抗体。在优选的实施方案中引发超过一种Th2-细胞因子或Th2-抗体。这样，Th2-介导的疾病是一种与引发Th2-应答相关的疾病，并指至少引发一种Th2-细胞因子或Th2-抗体的部分或全部，或增加至少一种Th2-细胞因子或Th2-抗体的水平。这些疾病在此领域中是熟知的并包括，但不局限于，遗传性过敏症，如哮喘和过敏，包括过敏性鼻炎，肠胃过敏，包括食物过敏，嗜曙红细胞过多，结膜炎，血管球性肾炎，特定病原物易感如肠寄生虫(例如，利什曼病)和特定病毒易感，包括人免疫缺陷病毒(HIV)，及特定细菌易感，包括肺结核和麻风病。在优选实施方案中，Th2-相关的应答是哮喘或过敏。 
哮喘，正如这里定义，在一定时期内在个体中是可逆的呼吸流限制。哮喘以呼吸道壁上某些细胞的存在为特征，如嗜曙红细胞，肥大细胞，嗜碱细胞，和CD25+T淋巴细胞。由于具有多种通讯功能和生物效应特征的细胞因子的活性作用，这些细胞间存在紧密的关联。化学因子吸引细胞到达炎症位点并由细胞因子激活，造成炎症和粘膜破坏的后果。随着该过程的慢性发展，产生了第二次的变化，如基底膜增厚和纤维化。该疾病以呼吸道对多种刺激的增加的高反应性，及呼吸道炎症为特征。被诊断为哮喘的病人通常具有多种症状，包括喘息，哮喘的发作，和对乙酰甲 胆碱激发的积极反应，如少于大约4mg/ml乙酰甲胆碱激发引起的PC20。诊断方针可以被发现，如见the Nation Asthma EducationProgram Expert Panel Guidelines for Diagnosis and Management ofAsthma，National Insitutes of Health，1991，Pub.No.91-3042。 
这里使用的“敏感症”指已获得的对物质(过敏原)的超敏性。过敏的条件包括湿疹，过敏性鼻炎或鼻炎，花粉热，支气管哮喘，风疹(荨麻疹)和食物过敏，和其他遗传性过敏症的情况。“具有敏感症的宿主”是对过敏原具有过敏性或受其威胁的反应宿主。“过敏原”指在易受影响的宿主中能引发过敏性的或哮喘反应的物质。过敏原的种类是庞大的并且包括花粉，昆虫毒液，动物皮屑，灰尘，真菌的孢子和药物(如青霉素)。 
过敏原包括在食物中发现的过敏原，如草莓，花生，牛奶多肽，蛋白等。其他的过敏原包括各种空气传播的过敏原，如草花粉，动物皮屑，马的微小的粪便，等。分子克隆的过敏原包括Dermatophagoides pteryonyssinus(Der P1)；来源于黑麦草花粉的Lol p1-V；各种昆虫毒液，包括来源于jumper ant Myrmeciapilosula的毒液；西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒磷脂酶A2(PLA2)和5S过敏原；来源于yellow jacket Vespula maculifrons和whitefaced hornet Dolichovespula maculata的磷脂酶；大量的花粉多肽，包括桦树花粉，豚草属花粉，Parol(Parietaria officinalis)和交叉-反应过敏原Parjl(来源于Parietaria Judaica)，和其他大气的花粉包括油橄榄，Artemisia sp.，禾本科，等。其他的过敏原是吮吸血液的节肢动物引发过敏性皮炎的过敏原，如双翅目，包括蚊子(按蚊种，伊蚊种，Culiseta sp.)；苍蝇(白蛉种，Culicoidessp.)尤其是黑蝇，deer flies和biting midges；虱(Dermacenter sp.，Ornithodoros sp.，Otobius sp.)；跳蚤，如蚤目，包括generaXenopsylla，Pulex和Ctenocephalides felis。特殊的过敏原可以是多聚糖，脂肪酸部分，多肽等。 
根据本发明，调控tim-1，tim-2或tim-4活性的，或调控tim-1和tim-4之间复合物形成的药物，可以与其他成分或过程结合用于免疫应答的调控或疾病或情况的治疗。例如，肿瘤通常用外科，放射或化学手段治疗。增加tim-1活性的药物，如tim-4-IgG融合多肽可以逐步给病人注射，扩大微小转移的休眠期和稳定残留的原初肿瘤。 
此外，这里描述的方法可以结合美国专利申请号60/508319中描述的方法，其内容通过在此引述而全部合并于本文，来调控免疫应答。如在病人中增加Th1反应的方法可以包括给病人注射(i)一种阻止galectin-9与tim-3结合的药物，如tim-3Ig多肽，和(II)一种增加tim-1活性的药物，如tim-4Ig融合多肽。在本领域的普通技术人员将认识到这些药物结合的可能性。优选的，这些方法的结合是以相反的方向调控tim-3和tim-1/tim-4的活性，如增加tim-3的活性同时降低tim-1/tim-4的活性，反之亦然。美国专利申请公开号2004/0005322也描述了与tim-3相关的试剂和与这里描述的方法相关的化合物。 
本发明进一步提供了在具有需求的主体中提高或抑制T-细胞增殖的方法，这些方法包括给病人注射足够多的tim-4多肽，以提高或抑制T-细胞的增殖。这些方法部分地来源于，申请者意外的发现，依赖与剂量，tim-4Ig融合蛋白能抑制或提高T-细胞的增殖。T-细胞反应的提高可以有利于遭受病原体，包括传染物质如病毒侵害的病人。T-细胞反应的抑制可以有利于遭受Th1或Th2调控失调的病人。 
tim-4多肽的适当剂量，如tim-4：Ig融合蛋白的剂量，可以从体外或体内的数据推断，如在例16中提供的。在本领域的普通技术员能通过简单的滴定实验测定治疗病人的所需剂量。如，可以从病人获得T-细胞的样本，并且针对tim-4药物的剂 量反应曲线可以确定在病人中提高或抑制T-细胞增殖的最佳剂量。本发明的化合物剂量将根据病人和注射的特殊方式而变化。根据具体的化合物，剂量能被连续地给药，如通过连续泵，或周期性间隔给药，如一，二或更多此的分隔。特殊成分的多重剂量的理想间隔时间能通过本领域的技术人员的适当实验进行确定。 
本发明的另一方面提供了阻止或降低遭受遗传性过敏症疾病的可能性的方法。遗传性过敏症疾病具复杂的遗传特性，作为一种遗传性易患病个体中的由于环境引发的免疫应答。遗传性过敏症和非-遗传性过敏症个体暴露在相同的环境因素中，但是因为遗传性的不同导致在一些个体中产生遗传性过敏症，出现呼吸道，皮肤或胃肠道过敏的炎症，和血清IgE的提高，嗜曙红细胞过多和哮喘，打喷嚏或麻疹症状，使遗传性过敏症个体区别于非-遗传性过敏症个体。此外，过敏的炎症反应的特征是出现产生高水平IL-4，IL-5，IL-9和IL-13的Th2淋巴细胞，其提高了嗜曙红细胞，肥大细胞，嗜碱细胞和产生IgE的B细胞的生长，分化和/或补充。 
本发明的一个特殊的方面提供了阻止或降低病人遭受遗传性过敏症疾病可能性的方法，这种方法包括给病人注射治疗性有效剂量的多肽，所谓的多肽包括(i)SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸；(II)SEQ ID NO：4的31-134位氨基酸；(III)至少有90％的氨基酸序列与SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸相同或相似；或(iv)至少有90％的氨基酸序列与SEQ ID NO：4的31-134位氨基酸相同或相似；或(v)至少有90％的氨基酸序列与包含从SEQ ID NO：3 ，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组中选择的一种氨基酸序列的tim-4多肽相同。 
在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列至少有65％，70％，75％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或99.5％相同或相似于SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4所列的序列，或这些序列的一个片段，如IgV区域或粘液素区域。多肽可以包括，例如，一种与SEQ ID NO：3的31-133位残基有98％相同或相似的序列的区域，和随后的片段，其序列与SEQ ID NO：3较少或无同源，如免疫球蛋白Fc区域。 
本发明提供的阻止或降低遭受遗传性过敏症的疾病可能性的方法部分地基于申请者的发现，即tim-4可与tim-1结合，并参考了以下关联，即可与tim-1结合的A型肝炎病毒的感染的结果，可减少患遗传过敏性疾病的可能性(McIntire JJ et al.，(2003)Immunology：hepatitis A virus link to atopic disease。Nature；425(6958)：576；yon Hertzen LC，(2000)Puzzlingassociations between childhood infections and the later occurrenceof asthma and atopy Ann Med.；32(6)：397-400；Bodner C et al.(2000)Childhood exposure to infection and risk of adult onsetwheeze and atopy.Thorax.55(5)：383-7)。因此，在一些实施方案中，阻止或降低遭受遗传性过敏症的疾病可能性的方法是阻止或降低先前并没有感染肝炎A病毒的病人遭受遗传性过敏症的疾病可能性的方法，尽管在相关的实验方案中，病人对抗-肝炎A抗体是血清反应阴性的。在另一实施方案中，病人是小孩或病人的年龄小于10。另一这里描述的方法的实施方案，遗传性过敏症的疾病是从哮喘，鼻炎，湿疹和花粉热中选择的。 
这里描述的某些方法使用的药物可以降低tim-1，tim-2，tim-4或其中两者的表达或活性，或降低tim-1与tim-4或tim-2与semaphorin4A如，tim-1，tim-2，或tim-4抗体的结合。在这里描述的方法的一些实施方案中，治疗性的药物不包括(i)抗体；或(II)能特殊地结合tim-1，tim-2，或tim-4的其中 的片段。在另一实施方案中，治疗性的药物不包括病毒蛋白，如来源于肝炎病毒的病毒蛋白。 
在某些实施方案中，tim-1，tim-2，或tim-4抗体包括RNAi反义核苷酸，如双链RNA分子或能够产生双链RNA的DNA结构。双链RNA包括，但不局限于，发夹状RNA和由两个互补的单链RNA分子形成的RNA。反义核苷酸是与编码特殊多肽的mRNA的编码链(正链)互补的(或反义的)相对短小的核苷酸。虽然，反义核苷酸是典型地以RNA为基础的，但是它们也有以DNA为基础的。此外，为了增加其稳定性，反义核苷酸经常被修饰。 
不受理论的约束，这些相关小寡核苷酸与mRNA的结合被认为将促使双链RNA的延伸，其将引发内源性RNAses对信使RNA的降解。此外，某些时候寡核苷酸被特异地设计为与信使RNA启动子的附近相结合，并且在这种情况下，反义寡核苷酸将进一步干扰信使RNA的翻译。不考虑反义寡核苷酸功能的特定机制，它们作用于细胞，组织或器官将导致编码特定多肽的mRNA的降解。相应地，反义寡核苷酸减少特定多肽的表达和/或活性。 
寡核苷酸可以是DNA或RNA或人工混合物或其衍生物或修饰形式，可为单-链或双-链。寡核苷酸的修饰可以在碱基，糖基，或磷酸骨架上，例如，杂交，等，以提高分子的稳定性。寡核苷酸可以包括其它附加基团如多肽(例如，为了针对宿主细胞受体)，或复合物以加强穿越细胞膜能力(见，例如，Letsinger etal.，1989，Proc.Natl.acad.Sci.USA.86：6553-6556；Lemaitre etal.，1987，Proc.Natl.acad.Sci.84：648-652；PCT Publication No.W088/09810，1988，12月15日出版)或穿越血-脑屏障(见，例如，PCT公开号W089-10134，1988年4月25日出版)，杂交-引发的裂解试剂(见，例如，Krol et al.，1988，BioTechniques 6：958-976)或intercalating试剂。(见，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。最后，寡核苷酸可以与其它分子相连。 
反义寡核苷酸可以包括至少一个经修饰的碱基，其包括但不局限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟三乙基)尿嘧啶，5-羧甲氨基甲基-2-硫代尿苷，5-羧甲氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-galactosylqueosine，次黄嘌呤核苷，N6-异戊烯基腺苷，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，beta-D-mannosylqueosine，5’-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，假尿苷，假尿嘧啶，Q核苷，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，5-甲基-2-硫脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。 
反义寡核苷酸也可以包括至少一种修饰的糖基，包括但不局限于阿拉伯糖，2-氟代阿拉伯糖，木酮糖，和己醣。反义寡核苷酸也可以包含一个中性的多肽-相似骨架。这些分子被称为肽核酸(PNA)-低聚体并叙述于，例如，Perry-O’Keefe et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：14670和Eglom et al.(1993)Nature 365：566。PNA低聚物的一个优点是其与DNA互补链的结合能力，并且由于DNA的中性骨架，故不需要依赖于中间介质的离子力。在另一实施方案，反义寡核苷酸包括至少一种被修饰的磷酸骨架，选自包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫 代磷酰胺，磷酰胺酯，磷酰二胺酯，磷酸甲酯，烷基磷酸三酯，和formacetal或类似物。 
另一实施方案中，反义寡核苷酸是一种-异位寡核苷酸。异位寡核苷酸与互补RNA杂交形成特定的双-链，与通常-单元不同，该双链是相互平行的(gautier et al.，1987，Nucl.Acid Res.15：6625-6641)。该寡核苷酸是一种2’-0-methylribonucleotide(Inoue et al.，1987，Nucl.Acids Res.15：6131-6148)，或一种人工的RNA-DNA类似物(Inoue et al.，1987，FEBS Lett.215：327-330)。 
本发明的寡核苷酸可以用此领域中已知的标准方法合成，例如，运用自动DNA合成仪(如可从Biosearch，AppliedBiosystems，等获得)。作为实施例，硫代磷酸寡核苷酸可以通过Stein et al.的方法合成(1998，Nucl.Acids Res.16：3209)，甲基磷酸寡核苷酸能通过受控毛细玻璃聚合体柱制备。 
本领域的技术人员能够容易地选择适当的寡核苷酸。只要提供编码特殊多肽的核酸序列，本领域的技术人员就能设计结合上述序列的反义寡核苷酸并且能够在生物体外或在生物体内测试这些寡核苷酸以确定它们结合并且调控编码特殊多肽的mRNA的降解。寡核苷酸对特殊mRNA识别序列的唯一性，对设计特异地结合并且调控特殊mRNA降解的反义寡核苷酸是重要的。如，经常重复交叉的mRNA序列不是设计特异识别和降解特殊信使的寡核苷酸的理想选择。本领域的技术人员能设计一种寡核苷酸，通过对这种寡核苷酸的序列与存放在可公开获得的资料库的核酸序列的比较，可以确定这种序列对特殊的多肽的特性。 
在另一实施例中，可以期望设计一种结合并且调控降解多于一种信使的反义寡核苷酸。在其中一个例子中，信使可以编码相 关的多肽(如，异构的或非功能多肽)。在这种例子中，本领域的技术人员能排列编码这些相关多肽的核酸序列，并设计能识别两者信使的寡核苷酸。 
已经发展了许多输送反义DNA或RNA进入细胞的方法；如，能直接注射入组织位点的反义分子，或设计成针对目标细胞的修饰的反义分子(如，反义核酸可以结合多肽或抗体，而其特异地结合细胞表面表达的受体或抗原)能系统地被注射。 
但是，想要在特定的情况下，获得能充分抑制外源基因tim-1，tim-2或tim-4 mRNAs的反义寡核苷酸的细胞内浓度是有一定的难度的。因此，其它的方法是利用一个重组的DNA结构，将反义寡核苷酸放置在重组的DNA结构的强启动子pol III或pol II下游。如，载体被诱导进入生物体内以至被细胞吸收并且指导反义RNA的转录。这样的载体可以是游离基因或是染色体的一部分，只要能转录产生希望得到的反义RNA。这种载体能通过在本领域的DNA重组的标准方法构建。载体可以是用于在哺乳细胞中复制或表达的质粒，病毒，或其它在本领域的已知物。任何在哺乳动物中，尤其是人的细胞中，在本领域已知的起作用的启动子都可以表达编码反义RNA的序列。这些启动子可以被诱导或构建。这些启动子包括，但不局限于：SV40早期启动子区域(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310)，该启动子有Rous肉瘤病毒的3’长末端重复(Yamamoto et al.，1980，Cell 22：787-797)，疱疹胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78：1441-1445)，金属硫因基因的调控序列(Brinster et al.，1982，Nature296：39-42)，等。任何质粒，cosmid，YAC或病毒载体类型都能被用于制备可被直接诱导进入组织位点的重组DNA结构。可 选择地，病毒载体可用于选择性地感染希望得到的组织，在这种情况下，注射可以通过其它途径来完成(如，系统地)。 
RNAi结构包括能特异地阻止靶标基因表达的双链RNA。“RNA干扰”或“RNAi”是一种术语，其最初在表述植物和蠕虫中观察到的双链RNA(dsRNA)以特定的和转录后方式抑制基因表达的现象中应用。不受理论的约束，RNAi似乎包括mRNA的降解，但是，目前其生化机理是研究的活跃领域。不管一些神秘的有关的作用机理，RNAi提供了一种在生物体外或体内抑制基因表达的有效方法。这里使用的术语“dsRNA”指siRNA分子，或其它RNA分子，其包括双链特征并且能加工细胞内siRNA，如发夹状RNA分子。术语“作用的丢失”指通过给病人RNAi的方法而抑制基因，指对比于无RNAi结构时的表达水平，基因的表达水平有所减少。 
正如这里使用的短语“媒介RNAi”指区分哪种RNAs能通过RNAi加工被降解的能力，如降解出现于特殊序列方式，而不是独立序列的dsRNA反应，如PKR反应。 
正如这里使用的术语“RNAi结构”是一种用于整个说明中的基因术语，包括干扰RNAs(siRNA)，发夹RNAs，和其它在体内能分裂形成siRNA的RNA种类。这里的RNAi结构也包括表达载体(也指RNAi表达载体)，其能使在细胞中形成dsRNAs或发夹RNAs，和/或能使在体内产生siRNA的转录增加。 
“RNAi表达载体”(这里也指“ds-RNA-编码质粒”)指用于表达(转录)RNA的可复制的核酸结构，当这种结构表达时，细胞中产生siRNA分子。这种载体包括一个转录单位，包括装配(1)在基因表达时起调控作用的基因成分，如启动子，操作子，或增强子，有效地连接了(2)一个能转录产生双链RNA(两个 RNA分子在细胞中退火形成siRNA，或能形成siRNA的单个发夹RNA)的编码序列，和(3)适当的转录起始和终止序列。通常根据相应的宿主细胞选择适当的启动子和其它调控元件。一般来说，在DNA重组技术中的有效的表达载体是以质粒的形式出现，这种质粒是双链DNA环状结构，其载体的形式不结合染色体。在目前的说明中，“质粒”和“载体”可以相互转换，因为质粒是载体最普遍被使用的形式。但是，本发明企图包括表达载体的其它形式，其作用相等并且在本领域已知。 
RNAi结构包括一种核酸序列，其在细胞生理条件下与转录被抑制基因的mRNA的至少一部分核酸序列杂交(如，靶标基因)。有介导RNAi能力的双链RNA仅需要与自然的RNA充分相似。因此，本发明具有其优势，可以允许由于基因突变，品种多样性或进化分歧造成的序列变化。RNAi结构序列和目标序列间可以允许的核酸错配数量不会超过5个碱基对中的1个，或10个碱基对中的1个，或20个碱基对中的1个，或50个碱基对中的1个。位于siRNA中间的错配是最为关键的并将在根本上阻止对于目标RNA的裂解。相反，位于与目标RNA互补的siRNA3’端的错配并不明显地影响目标的特异降解。 
运用此领域中所知的序列比较和阵列运算方法可以完成序列的鉴定(见Gribskov和Devereux，Sequence analysis Primer，stockton Press，1991，及其中所引述的文献)并计算核酸序列之间的差异百分比，例如，通过利用默认参数的BESTFIT软件程序中的Smith-Waterman算法(例如，Wisconsin大学GeneticComputing组)。抑制RNA和目标基因上的一部分之间序列的一致性最好为大于90％，或甚至100％。可选地，RNA的双链区域可以通过其核酸序列与目标基因转录区域的一部分相杂交的 能力而进行功能定义(例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH6.4，1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；随后洗去)。 
RNAi结构的制备可以通过化学合成方法或重组核酸技术进行。处理细胞的内源性RNA聚合酶可以介导在生物体内的转录，或克隆的RNA聚合酶能用于在生物体外的转录。RNAi结构可以包括磷酸糖骨架或核酸的修饰，如降低细胞核酸酶的敏感性，提高生物利用度，提高合成特性，和/或改变其它药物代谢动力学特性。例如，自然RNA的磷酸二酯联接可以被修饰为包括至少一种氮或硫的杂环原子。在RNA结构中的修饰可以允许特异的基因抑制，而避免对dsRNA的普通反应。同样地，碱基可以被修饰来阻止腺苷脱氨基酶的活性。RNAi结构可以通过酶制备或通过部分/整个的有机合成，通过生物体外的酶或有机合成，被修饰的核糖核苷酸能被介导。 
化学地修饰RNA分子的方法能适合于修饰RNAi的结构(见，例如，Heidenreich et al.(1997)Nucleic Acids Res，25：776-780；Wilsh et al.(1994)J Mol Recog 7：89-98；Chen et al.(1995)Nucleic Acids Res 23：2661-2668；Hirschbein et al.(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev7：55-61)。仅举例说明，RNAi结构的骨架能用硫代磷酸酯，磷酰胺酯，磷酰二硫酯，嵌合甲基磷酸酯-磷酸二酯，肽核酸，含5-炔基-嘧啶的低聚体或糖修饰的(如，2’-替代的核糖核苷，α-结构)进行修饰。 
单个的自身-互补的RNA链或两个自身互补的RNA链可以形成双链结构。RNA双链形式可以开始于细胞内或细胞外面。RNA可以介导进入的允许数量为每细胞至少一个拷贝。双-链材料的更高的剂量(如每细胞至少5，10，100，500，1000个拷贝)可以产生更有效的抑制，尽管低剂量可以对特殊的应用有效。 抑制是序列特异性的，对应于RNA双链区域的核酸序列是基因抑制的目标。 
在特定实施方案中，病人的RNAi结构是“小干扰RNAs”或“siRNA”。这些核酸大约长19-30个核酸，并且甚至更适宜地有21-23个核酸长度，如由长双链RNAs的小核酸产生的片段。SiRNA是一种新型的核酸复合物并且通过特异的序列配对，指导复合物绑定mRNA。作为结果，目标mRNA通过多肽复合物中的核酸酶降解。在一个特殊的实施方案中，21-23个核酸长度的siRNA分子包括3’羟基。 
通过本领域技术人员已知的许多技术可以获得本发明的siRNA分子。例如，通过本领域已知的方法，siRNA能被化学地合成或重组制备。例如，小的正义和反义RNA低聚体可以被合成并退火形成在每一末端带有2-核苷突出的双链RNA结构(Caplen，et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA，98：9742-9747；Elbashir，et al.(2001)EMBO J，20：6877-88)。通过被动的吸收或选择的系统传送，这些双链的siRNA结构能被直接诱导入细胞，正如下面所描述的。 
在特定的实施方案中，通过加工长的双链RNA可以制备siRNA结构，如通过dicer酶。在某一实施方案中，在生物体外的果蝇系统被应用。在这里的实施方案中，dsRNA与来源于果蝇胚胎的可溶性提取物结合，产生了化合物。此化合物保存于一定的将dsRNA加工形成大约21-23个核酸长度的RNA分子的条件下。 
通过许多本领域内的普通技术人员已知的技术的可以纯化siRNA分子。例如，凝胶电泳能用于纯化siRNA。可选择地，非-变性的方法，如非-变性色谱柱，能用于纯化siRNA。此外， 色谱(如，分子筛色谱)，甘油梯度离心，抗体的亲合纯化能用于纯化siRNA。 
在特定的优选实施方案中，至少siRNA分子的一条链上有1-6个核酸长度的3’长末端，也可以是2-4个核酸长度。更可取的，有1-3个核酸长度的3’长末端。在特定的实施方案中，一条链有3’长末端而另一链是平末端或也是长末端。每条链的长末端的长度可以相同或不同。为了进一步提高siRNA的稳定性，3’长末端可以通过抗降解来增加稳定性。在某一实施方案中，通过包含嘌呤碱，如腺苷或鸟苷核酸来增加RNA的稳定性。可选择地，通过修饰的相似物，可代替嘧啶核苷酸，如2’脱氧胸苷代替尿苷核酸的3’长末端是被允许的并且不影响RNAi的有效性。2’羟基的缺失明显提高了在组织培养基中末端的核酸抵抗力并且可能在生物体内也有益。 
在其它的实施方案中，RNAi以长双链RNA的形式存在。在特殊的实施方案中，RNAi结构至少有25，50，100，200，300或400个碱基。在特殊的实施方案中，RNAi结构有400-800个碱基长度。双链RNAs在细胞内降解，在细胞内产生siRNA序列。但是，在生物体内长双链RNAs的使用并不总是起作用的，可能是因为由序列-非依赖dsRNA反应产生的有害作用。在这种实施方案中，优选使用局部传送系统和/或减少干扰或PKR的作用的药物。 
在特定的实施方案中，RNAi结构是一种发夹结构(命名为发夹RNA)。发夹RNA能在体外合成或在体内通过RNA聚合酶III启动子转录形成。制备和使用这种发夹RNAs使哺乳动物细胞中基因沉默的例子见Paddison et al.，Genes Dev，2002，16：948-58；McCaffrey et al.，Nature，2002，418：38-9；McManus etal.，RNA，2002，8：842-50；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci USA， 2002，99：6047-52中描述。更适宜地，这种发夹RNAs在细胞中或在动物中被设计以保证目的基因被连续并且稳定抑制。这是在本领域已知的，siRNA能通过在细胞中发夹RNA的加工被制备。 
然而，在其它的实施方案中，质粒被用于输送双-链RNA，例如，作为转录产物。在这种实施方案中，质粒被设计成包含一种位于每一RNAi结构的正链或反义链“编码序列”。这种编码序列可以是相同的序列，如，与反向启动子相连，或是两个独立的序列，每一序列的转录受独立的启动子控制。在编码序列的后面是转录产物，互补RNA转录碱基-对形成双链RNA。 
PCT申请WO01/77350描述了载体的一个实施例，在真核细胞中，转移基因的双向转录产生了同一转移基因的正链和反义RNA转录物。因此，在特定的实施方案中，目前发明提供的重组载体有以下特征：它包含一个病毒的复制子，其在相反的位置上有两个重叠的转录单位并且侧面为RNAi结构转移基因，其中的两个重叠转录单位在宿主细胞中产生同一转移基因的正链和反义RNA转录物。 
RNAi结构包括双链RNA相同物长延伸或目标核酸序列的等价物，或双链RNA相同物短延伸或目标核酸序列一个区域的等价物。制备和输送长或短的RNAi结构的方法见，如WO01/68836和WO01/75164。 
在另一实施方案中，tim-1，tim-2或tim-4抗体是酶性核酸分子，其降低tim-1，tim-2或tim-4的表达水平。被设计成可催化分裂mRNA转录物的酶性核酸分子能用于阻止tim-1，tim-2或tim-4 mRNA的翻译。(见，如PCT InternationalPublication WO90/11364，公开于10月4日，1990；Sarver et al.， 1990，Science 247：1222-1225以及U.S.Patent No.5093246)。尽管在位点-特异识别序列切割mRNA的酶性核酸能用于破坏特殊的mRNAs，但是，更适宜使用锤头状的酶性核酸。锤头状的酶性核酸在与目标mRNA碱基对互补的侧链区域位点切割mRNAs。只要目标mRNA有两个碱基(5’-UG-3’)序列。锤头状的酶性核酸的结构和产物在本领域被熟知并且在Haseloffand Gerlach，1988，Nature，334：585-591被详细地描述。 
这里描述的在方法中可使用的酶性核酸也包括内源酶性核酸RNA(以下称“Cech-型酶性核酸”)，如自然地出现在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中(以IVS，或L-19IVS RNA著名)，其已经被Thomas Cech和其同事(Zaug，et al.，1984，Science，224：574-578；Zaug and Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug，et al.，1986，Nature，324：429-433；WO88/04300by University Patents Inc.；Been and Cech，1986，Cell47：207-216)详细地描述。当Cech-型酶性核酸的8个碱基对的作用位点与目标RNA序列杂交后，出现目标RNA的切割。本发明包括结合8个碱基对作用位点序列的Cech-型酶性核酸。 
在反义方法中，酶性核酸由修饰的寡核苷酸组成(如，提高稳定性，结合力，等)并且在体外或体内能输送入细胞。输送的一个优选的方法包括用在一个强结构性的pol III或pol II启动子控制下的“编码”酶性核酸的DNA结构，以至于转染的细胞可以产生足够数量的酶性核酸来破坏目标信使并且抑制翻译。并不象反义分子，酶性核酸具催化作用，因此为保证其效率，一种低的细胞内浓度是需要的。 
这里描述的另一实施方案中的方法，tim-1，tim-2或tim-4拮抗剂包括抗-tim-1，抗-tim-2或抗-tim-4抗体。本领域的技术人员能制备结合tim-1，tim-2或tim-4胞外区域 的抗体，如单克隆抗体，通过本发明提供的方法，这些抗体被进一步测试其抑制tim-1，tim-2或tim-4的结合的能力。优选的抗抗体能够抑制tim-1或tim-4之间的相互结合作用，而它们自己没有作为tim-1或tim-4活性的催化剂。例如，使用在实验操作中描述的评估，本领域的技术人员可以测定是否一个候选抗体是tim-1的催化剂，还是Th1反应的诱导子和Th2反应的抑制子。这种测试可以通过给免疫小鼠注射抗体并分离小鼠脾T细胞以测定体内淋巴细胞的增殖进行。优选的增加Th2反应(或降低Th1反应)的抗体可以抑制tim-1与tim-4配基的结合或诱导tim-1的催化作用。Tim-1的催化作用可以被监控，如，通过监控细胞内tim-1的酪氨酸磷酸化作用。 
这里使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性，如包括特异结合抗原的抗原结合位点的分子。这种抗体包括，如多克隆的，单克隆的，嵌合的，单链的，Fab，Fab’和F(ab’)2的片段，和Fab表达库。一般而言，涉及IgG，IgM，IgA，IgE和IgD的来源于人抗体分子，与在分子中存在的重链的性状不同。某些种类还有亚类，如IgG1，IgG.sub2，和其它。而且，在人类中，轻链可能是kappa链或lambda链。这里涉及的抗体包括所有涉及的人抗体品种的种类，亚类和类型。针对Tim-1或Tim-4多肽的抗体也包括针对包含Tim-1或Tim-4多肽的融合多肽或Tim-1或Tim-4多肽片段的抗体。 
Tim-1，Tim-2或Tim-4多肽能被用作为抗原，或其片段的一部分，此外还能被用作为免疫原，使用制备多克隆和单克隆抗体的标准技术，用于产生免疫特异地结合抗原的抗体。作为免疫原使用的抗原的抗原多肽片段，包括如氨基末端区域的氨基酸序列的至少7个氨基酸残基，其氨基酸序列在SEQ ID Nos：1-4所示，和包含其表位，而针对该多肽的增高的抗体，或可与完整 长度的多肽或包含表位的片段形成的特异免疫复合物。更适宜地，抗原多肽包括至少10个氨基酸残基，或至少15个氨基酸残基，或至少20个氨基酸残基，或至少30个氨基酸残基。受抗原多肽包围的优选的表位是位于其表面的多肽区域；一般地，这些是亲水区域。在优选的实施方案中，抗原多肽包括Tim-1，Tim-2，或Tim-4的IgV和/或粘液素区域的一部分片段或整个部分。 
在一些实施方案中，抗原多肽包围的至少一种表位是位于多肽表面的Tim-1，Tim-2，或Tim-4多肽区域，如一种亲水区域。Tim-1或Tim-4多肽的疏水分析表明Tim-1或Tim-4多肽区域是亲水的，并且可能为针对目标抗体的表面编码残基。作为目标抗体生产的方式，表示亲水的或疏水的区域的亲水性图谱可以由本领域熟知的方法制备，包括，如，Kyte Doolittle or theHoop Woods methods，either with or without Fouriertransformation.See，e.g.，Hopp and Woods(1981)proc.Nat.Acad.Sci.USA 78：3824-3828；Kyte and Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105-142。这里也能提供，针对抗原多肽，其衍生物，片段，类似物或同源物中的一个或更多区域的特异抗体。在某些实施方案中，Tim-1或Tim-4的衍生物，片段，类似物，同源物或直向同源物可以作为一种免疫原用于制备免疫特定结合这些多肽成分的抗体。 
在本领域中已知的各种操作程序可以被用于针对本发明的多肽，其衍生物，片段，类似物，同源物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体的生产。见，例如，ANTIBODIES：A LABORATORYMANUAL，Harlow and Lane(1988)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.其中的某些抗体在下面被描述。 
这里使用的术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体成分”指一种抗体分子群体，其仅仅包含一种包括唯一轻链基因产物和唯一重链基因产物的抗体分子的分子类型。特别地，单克隆抗体的补充决定区域(CDRs)在所有分子群体中是相同的。因此MAbs包含一个抗原结合位点，其能与唯一的对MAbs有结合亲合力的特性的抗原的特殊表位发生免疫应答。 
用杂交瘤的方法可以制备单克隆抗体，如由Kohler andMilstein(1975)Nature，256：495描述的。在杂交瘤的方法中，小鼠，亚洲产的大颊的鼠类，或其它合适的宿主动物，被免疫药物典型地免疫以释放淋巴细胞，其产生或能够产生特异结合免疫药物的抗体。可选择地，淋巴细胞能在体外被免疫。 
针对本发明的多肽抗原的抗体能进一步包括人源化的抗体或人抗体。这些，适合给人注射的抗体不产生针对注射的免疫球蛋白的免疫应答。抗体的人源化形式是主要包括人免疫球蛋白序列的嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其中的片段(如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2，或其它抗体的抗原-结合序列)，和其它包括来源于非-人类免疫球蛋白的最小序列。人源化能通过下列的Winter and co-worker的方法制备(Jones et al.(1986)Naturre，321：522-525；Riechmann et al.(1988)Nature，332：323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science，239；1534-1536)，将啮齿目的CDRs或CDR序列取代为人抗体的相应的人抗体序列(还可见美国专利第5,225,539号)。 
包括tim-1，tim-2或tim-4独特型的抗体片段，可以通过本领域已知的技术被制备，包括，但不限于：(i)由胃蛋白酶分解的抗体分子产生的F(ab’)2片段；(II)通过减少F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab片段；(III)通过用木瓜蛋白酶和还原药物处理抗体分子而产生的Fab片段和(iv)Fv片段。 
在这里描述的方法的某些实施方案中，tim-1，tim-2或tim-4的抗体包括单克隆抗体，尤其是人或人源化抗体，其至少有两种不同的抗原的结合特异性。在目前的例子中，其中一个结合特异性针对tim-1，tim-2或tim-4。第二个结合目标是其它抗原，方便地为细胞-表面多肽或受体或受体亚单位。 
在这里描述的方法的某些实施方案中，tim-1，tim-2或tim-4抗体包括tim-1，tim-2或tim-4多肽，类似物，变异体，或其中的片段。在某一实施方案中，抗体包括tim-1 IgV区域，tim-2 IgV区域，tim-4 IgV区域，tim-1粘液素区域，tim-2粘液素区域，tim-4粘液素区域，或其中的结合。在另一实施方案中，抗体包括一种多肽，其包括的氨基酸序列至少有60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％等同或相似于tim-1 IgV区域，tim-2 IgV区域，tim-4 IgV区域，tim-1粘液素区域，tim-2粘液素区域，tim-4粘液素区域序列。不受理论限制，这些抗体可以通过tim配体滴定而使其不结合tim多肽进行特征分析。通过结合位点的空间位阻可以导致这种滴定的出现。 
在本发明中使用的嵌合的或融合的多肽能通过标准的DNA重组技术制备。如，编码不同多肽序列的DNA片段根据常规的技术由片段被结合在一起，如，使用用于连接的平-末端或粘-末端，限制性内切酶提供适当的末端，适当地填平粘末端，通过碱性磷酸酯酶处理，而避免不希望的连接，和酶连。在另一实施方案中，通过常规的技术能合成融合基因，包括DNA的自动合成。可选择地，基因片段的PCR扩增能使用在两个连续的基因片段之间互补的-交错引物被实现，此两个连续的基因片段能够随之被退火并且扩增以产生嵌合基因序列。(见，例如，Ausubelet al.(eds.)CURRENT PROTOCLS IN MOLECULAR BIOLOGY， John.Wiley&Sons，1992)。而且，许多编码融合分子的表达载体可购买获得(如，免疫球蛋白重链的Fc区域)。Tim-1，tim-2或tim-4的编码核酸能被克隆进入这种表达载体，以使融合分子与免疫球蛋白多肽联系。 
在某些实施方案中，抗体包含Tim-1，tim-2或tim-4的变异序列，其序列与自然出现的Tim-1，tim-2或tim-4序列相比有一个突变，相对于非-变异序列，变异序列能导致突变形式和其结合配体之间的较高的亲合结合。在某些实施方案中，作为突变Tim多肽的Tim多肽或Tim多肽分子，其序列与自然出现的Tim序列有一个突变，相对于非-变异序列，变异的Tim序列对蛋白质水解酶的抵抗性更强。 
第二种多肽，即与Tim-1，tim-2或tim-4序列融合的多肽，是可溶性的。在某些实施方案中，第二种多肽提高了相连接的多肽的半衰期(如，血清的半衰期)。在某些实施方案中，第二种多肽包含一种序列，其便于融合多肽与第二种Tim-1多肽的连接。在优选的实施方案中，第二种多肽包括至少一种免疫球蛋白多肽区域。免疫球蛋白融合多肽在本领域已知并且在如，美国专利5516964；5225538；5418130；5514582；5714147；和5455165中被描述。在某些实施方案中，第二种多肽包括完整长度的免疫球蛋白多肽。可选择地，第二种多肽包括少于完整长度的免疫球蛋白多肽，如，一条重链，轻链，Fab，Fab2，Fv或Fc。更适宜地，第二种多肽包括免疫球蛋白多肽的重链。更适宜地，第二种多肽包括免疫球蛋白多肽的Fc区域。在某些实施方案中，第二种多肽比野生型免疫球蛋白重链的Fc区域有较少的效应作用。Fc效应作用包括，如，Fc受体结合，互补定位，和T细胞的消耗活性(见，例如，美国专利6136310)。分析T细胞的消耗活性，Fc融合效应，和抗体稳定性的方法在本领域已知。在某一实 施方案中，第二种多肽对Fc受体有低的或没有亲合力。在另一实施方案中，第二种多肽对互补的C1q多肽有低的或没有亲合力。 
在一个优选的实施方案中，这里所描述的的方法中使用的抗体是一种小的有机分子，如除了多肽或寡核苷酸，有少于2000道尔顿的的分子，其抑制了Tim-1与tim-4，tim-2与semaphorin 4A的结合，或阻止Tim-1与tim-4的结合活性。这种试剂能被鉴定，如使用目前发明提供的方法。在另一实施方案中，试剂是多肽或多肽的衍生物，其在结构上仿效tim-1的结合tim-4的部分，反之亦然。这里描述的一些方法，使用增加tim-1，tim-4或两者的表达或活性的试剂，或使用减少tim-1与tim-4结合的试剂(如，tim-1抗体或tim-4抗体)。 
在某些实施方案中，增加这里描述的方法中的提高tim-1或tim-4活性的药物是一种抗原。结合tim-1和模仿tim-4的结合的抗体可以被制备，该抗体可产生细胞内信号和Th2反应抑制。针对tim-1和tim-4的抗体的制备在先前的部分中已经被描述。如，可以制备结合tim-1胞外区域的抗体，并且该抗体可以用于测定其对tim-1是否具促进或抑制作用。 
在某一特殊的实施方案中，激动剂包含结合tim-1/tim-4复合物的抗体。不受理论的约束，结合tim-1/tim-4复合物的抗体可以稳定或促进复合物的形成并且因此增加了tim-1/tim-4的信号。通过用tim-1/tim-4多肽复合物(如在它们胞外区域的复合物)免疫动物可以产生结合tim-1/tim-4复合物的抗体。可选择地，可以通过体外选择技术从随机的抗体文库中选择结合tim-1/tim-4复合物的抗体的方法制备抗体。 
这里所述方法的一些实施方案中，tim-1，tim-2，tim-4激动剂包括了tim-1，tim-2，tim-4多肽，类似物，变体或其片段。在一种实施方案中，增效剂包括了tim-1 IgV区域，tim-2 IgV区域，tim-4 IgV区域，tim-1粘液素区域，tim-2粘液素区域，tim-4粘液素区域，或其联合物。在另一实施方案中，增效剂包括了一个多肽，其包括的氨基酸序列至少与tim-1IgV区域，tim-4 IgV区域，tim-1粘液素区域，tim-4粘液素区域具有60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％一致性。不受理论的约束，这些激动剂在结构上能模仿tim-1，tim-2，tim-4的活性。在某一实施方案中，激动剂包括一个tim-4 IgV和/或一个tim-4粘液素区域。在另一实施方案中，激动剂包括多肽二聚体，而每一个都包括一个tim-4 IgV和/或一个tim-4粘液素区域多肽。这些激动剂可以用于交联并活化tim-1受体。在另一实施方案中，多肽激动剂可以作为编码所述多肽的核酸而给药，如通过腺病毒载体。 
Tim-1，Tim-2或Tim-4，或作为激动剂使用的这些多肽的片段可以与载体分子融合，如这里所述方法中使用的免疫球蛋白。例如，Tim-1可溶形式可以通过“连接”序列与免疫球蛋白的Fc部分融合。其它带有GST(例如，谷胱甘肽S-转移酶)，LexA，或MBP(例如麦芽糖结合多肽)的融合多肽也可以被使用。另一实施方案中，Tim-4或Tim-1激动剂融合多肽可以连接一个或多个额外的半族。例如，Tim-4或Tim-1融合多肽可以额外地连接GST融合多肽，其中Tim-1融合多肽序列与GST序列的C-末端连接。这些融合多肽将有助于Tim-4或Tim-1融合多肽的纯化。在另一实施方案中，融合多肽在其N-末端包括一个异源信号序列(例如，在自然的Tim-4或Tim-1核酸编 码的多肽中不存在的多肽序列)。例如，自然Tim-4或Tim-1信号序列可以被去除并由另一个多肽中的信号序列替换。 
在一些实施方案中，激动剂包括具有自然-发生的Tim-4或Tim-1序列中的突变的Tim-1，Tim-2或Tim-4变体序列，其与非-突变序列相比，突变形式与其结合配基的亲和力更高，例如，突变Tim-1多肽对于Tim-4更高的亲和力。在一些实施方案中，Tim-1，Tim-2或Tim-4半族以带有突变的自然-发生tim序列(野生型)的变体形式提供，其(与非-突变序列相比)多肽对于蛋白质水解具有更强的抵抗力。例如，tim蛋白中作为蛋白酶切位点的丝氨酸，天冬氨酸或半胱氨酸可以被去除。 
在一种优选实施方案中，在此所述方法中使用的激动剂是一种小的有机分子，如，除了多肽或寡核苷酸，其具有少于2000道尔顿的分子量，其促进tim-1与tim-4的结合或在缺乏tim-4与tim-1的结合时引起tim-1的活性。这些试剂能够被鉴定，如，使用目前发明提供的方法。在另一实施方案中，试剂是一种多肽或多肽的衍生物，其在结构上仿效tim-4结合tim-1的部分，或tim-2结合semaphorin4A的部分。这种多肽可以通过诱导tim-1或tim-4和它们配基的活性而作为一种激动剂，或通过竞争tim蛋白之间的结合而作为一种拮抗剂。 
V.鉴定调节Tim-1和Tim-4之间结合的药物 
本发明的另一方面提供了调节免疫应答药物的鉴定方法，正如鉴定调节tim-1和tim-4结合的药物。使用这里所述的方法鉴定的药物可以用于调节在所需病人中的TH1和TH2反应。抑制tim-1/tim-4相互作用的药物可以被预见来阻止tim-1的活化，其导致Th2活性的增加和Th1活性的降低。 
在一方面，用X-射线晶体学，神经元衍射，核磁共振光谱测定，和其它本领域技术人员熟知的技术测定的tim-1和tim-4多肽的结构特征，能用于发明中所述的tim-1/tim-4复合物的鉴定，其便于复合物形成的增效剂和拮抗剂的理性设计。理性的药物设计方法在本领域熟知(见，Chemical and StructuralApproaches to Rational Drug Design，David B.Weiner，WilliamV.Williams，CRC Press(1994)；Rational Drug Deign：NovelMethodology and Practical Applications，Vol.719，Abby L.Parrill(Editor)，American Chemical Society(1999)；Structure-basedLigand Design，Klaus Gubernator，Wiley，John&Sons，Incorptrated(1998))。 
本发明的另一方面提供了筛选促进或抑制在tim-1和tim-4之间的复合物形成的药物。这些方法可以在体外或细胞内操作，它们可以通过完整长度的多肽或一种或两种多肽的可溶性形式被操作。在这里所述的筛选方法的某些实施方案中，可溶性多肽包括tim-1或tim-4的IgV区域，随意地粘液素区域，可以被使用。在筛选分析中可以包括其它多种试剂。这些试剂包括如，盐类，中性多肽，如，血清白蛋白，去垢剂，等，其可被用于优化理想的多肽-多肽的结合和/或降低非-特异的或背景干扰。提高分析效率的试剂，如蛋白酶抑制剂，核酸酶抑制剂，抗-微生物的试剂，等也可以被使用。结合所必需的组合物成分可以以任何次序被添加。在任何适合的温度下孵育，典型的温度为4℃-40℃之间。孵育时间以最适宜的活性为选择，但也可以是最有利于快速的高-通量的筛选。典型地在0.1-1小时之间的时间足够于体外的分析。 
目前发明的鉴别试剂的方法十分适合在多孔板中筛选化合物库(如，96-孔板)，即在每一孔放置不同的测试化合物或测 试化合物组。尤其，这些方法可以被用于组合库。这些方法可以通过任何可接受的缩小的方法在分析系统中被“缩小”，包括，但不限于，多孔板，如24，48，96或384孔板，微型-芯片或幻灯片。在微型-芯片上作分析时可以减少其大小，包括减少试剂和其它材料的数量。任何有利于高-通量的筛选的小型化处理都属于发明的研究范围。 
本发明的某一特殊的方面提供了鉴定在tim-1多肽和tim-4多肽之间调节结合的试剂的方法，包括：(a)在测试药物存在时，结合tim-1多肽和tim-4多肽；和(b)测定测试试剂对tim-1多肽和tim-4多肽的结合效果；从而，测定了在tim-1多肽和tim-4多肽之间调节结合的试剂。 
本发明的一个相关方面提供了调节免疫应答的试剂鉴定的方法，此方法包括(a)在测试药物存在时，结合tim-1多肽和tim-4多肽；和(b)测定测试试剂对tim-1多肽和tim-4多肽的结合效果；从而，测定了调节免疫应答的试剂。 
在本发明的某一方面，试剂的鉴定是通过体外分析完成的。多种分析形式是充足的，根据目前的发现，那些在这里未清楚地被描述的形式将仍然被本领域的普通技术人员理解。接近多肽复合物形成，酶活性的条件的分析形式，可以在许多不同的形式中进行，包括基于无-细胞系统的分析，如，多肽或细胞溶解产物的纯化，和利用完整细胞的以细胞为基础的分析。简单的结合分析也可以用于测定结合tim-1或tim-4的试剂。这种结合分析也可以测定干扰在tim-1多肽和tim-4多肽之间相互作用的试剂。被测定的试剂能通过如，细菌，酵母，或其它有机体(如，自然产品)，化学合成产物(如，小分子，包括拟肽)，或重组产物制备。因为tim-1或tim-4是跨膜多肽，因此用于描述鉴定在tim-1或tim-4之间调节复合物形成的试剂的分析和方法的 优选实施方案，应使用这些多肽的可溶性形式而不是完整长度的多肽。可溶性形式包括那些缺失跨膜区域和/或那些包含IgV区域或其中的片段，但仍然保持其结合能力的多肽。 
在测试化合物库和自然提取物的许多药物筛选程序中，在给定时间内，为了测试最大数量的化合物，高通量的分析是希望得到的。在无-细胞系统中执行的目前发明的分析，其可以用纯化或半-纯化的多肽或溶解产物开展，经常被作为“初级”筛选，因为在受测试化合物调节的分子靶标中，它们能允许通过改造而被快速开发和相对简单的测定。而且，通常，测试化合物的细胞毒性和/或生物利用度的作用在体外系统可被忽视，分析主要关注于药物对分子靶标的作用，如可以证明与其它多肽结合亲合力的改变或分子靶标的酶特性的改变。 
在目前分析的优选的体外实施方案中，重组的tim-1/tim-4复合物包括一种至少不完全-纯化多肽构成的重组复合物。不完全-纯化，指重组组合物中利用的多肽已经预先与其它细胞或病毒多肽分离。例如，对比于细胞裂解物，tim-1/tim-4复合物结构中包括的多肽相对于其它多肽其纯度至少占复合物的50％，或更适宜地其纯度占90-95％。本方法的特定实施方案中，通过将高度纯化的多肽混合构建重组多肽组合物，使得重组组合物充分地去除其它多肽(如来源于细胞或病毒)，而其可能干扰或改变调节tim-1/tim-4复合物装配和/或分解的能力。 
在存在或缺失一种实验试剂的情况下，对tim-1/tim-4复合物的分析，可以在任何合适装载反应物的容器中进行。实施例包括微量滴定板，试管，微量-离心管。在一种筛选分析中，实验试剂的效果分析可以通过，例如，分析实验试剂对动力学，稳定性-状态和/或反应终点的影响效果完成。 
本发明的一个实施方案中，可以建立药物筛选分析方法，其基于抑制试剂干扰tim-1/tim-4复合物装配或稳定性的能力对其进行测定。在一种示范性结合分析中，关注的化合物与包括tim-1/tim-4复合物的组合物相连。对tim-1/tim-4复合物进行测定和量化则提供了一种方法，测定化合物抑制(或加强)这两种多肽间的相互作用的能力。化合物的效果可以通过利用各种浓度的实验化合物获得数据制备剂量效应曲线进行分析。此外，也可以进行对照实验以提供比较基线。在对照实验中，在缺失实验化合物的情况下对组合物进行量化分析。 
可以通过多种技术测定复合物的形成。如，通过免疫分析，或色谱检测，复合物的形成的调节可以用，如可测定的标记多肽(如，放射性标记，荧光的标记，或酶标)被定量。表面胞质基因共振系统，如从Biacore International AB(Uppsala，Sweden)购买的，也可以被用于测定多肽-多肽的相互作用。 
这里描述的多肽和肽可以被固定不动。通常，肽和多肽被固定以便于复合物从多肽的一种非复合的形式分离，同时提供分析的自动化。肽和多肽能被固定于任何固体介质，如，基质，珠或过滤器。肽和多肽可以被固定在包含与多肽结合的反应物的介质上。可选择地或结合，反应物如多肽中的半胱氨酸能与介质结合并且起反应。在另一实施方案中，多肽可以与另一对介质有高结合亲合力的多肽一起作为融合多肽被表达，对生物素有高亲和力的链霉亲和素融合蛋白。 
在一个例证性的实施方案中，提供增加某一区域的融合多肽，该区域允许多肽与不能溶解的介质结合。如，GST-TIM-1-IgV-区域融合多肽，其包含融合了谷胱甘肽转移酶的tim-1的IgV区域，能够被吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生物微量滴定基质上，然后与tim -4或其可溶性片段结合(如，35S-标记的多肽，和测试化合物)，最后在有利于复合物形成的条件下孵育。孵育后，洗脱珠子以移去未结合的多肽，直接测定放射标记的介质结合-珠(如，放射信号的珠)，或测定复合物解离后的上清，例如，使用微量滴定板时。可选择地，当洗去未结合多肽后，复合物可以从介质中分离，通过SDS-PAGE凝胶分散，通过标准的电泳技术，可以在基质-结合部分的数量中发现交互作用的多肽水平。 
应该理解的是，对上述分析的各种修饰都包括在本发明的范围内。如，多肽的角色能被转换-即，tim-4多肽可以被固相介质固定并且一种可溶性的包含tim-1的多肽可以与被绑定的tim-4多肽连接。此外，在结合实验之前被固定的多肽或游离的多肽可以暴露于测试化合物，并且此预-暴露效果可以根据对照分析。以这种方式测定的化合物也抑制tim-1与tim-4的结合或反之亦然。可选择地，测试化合物可以被加入到tim-1和tim-4的组合物中。在这种分析中，有利于降低结合水平的化合物将tim-4多肽替换为tim-1多肽，反之亦然。 
除了Western blots，其它，更快速的，测定方案，如多-孔ELISA-型方法，可以被应用。如，可以通过在板中注入含有多肽的溶液使多肽结合于塑料底部，将纯化的(如，上面的GST方法)tim-1多肽包被于多-孔板的孔底部(例如，96孔板)。洗脱过量的含有-多肽的溶液，加入封闭液(含有，例如，牛血清白蛋白(BSA))封闭非-特异结合的位点。将板洗涤数次并加入含有tim-4多肽的溶液，及在实验孔(对比于对照)中加入实验化合物。不同孔可以含有不同的实验化合物，同一实验底物的不同浓度，不同tim-1多肽或tim-4多肽，或不同浓度的tim-1多肽或tim-4多肽。此外，众所周知这种测定方案可以进行不同的修正。例如，除了tim-1多肽，多-孔板的孔中 还可以用含有tim-4多肽的多肽包被，并加入自由tim-1多肽进行结合交互分析。孔中也可以预先-包被增加多肽结合力的化合物以固定和/或减少非-特异结合的水平。例如，孔中可含有谷胱甘肽并用BSA预先-包被，以增加固定多肽以已知的方位与暴露结合位点的结合力。 
在这些实验中有用的测定方法包括基于-抗体的方法(例如，直接针对“自由”多肽的抗体)，直接测定与“自由”多肽联合的受体基团(如荧光标记)，及邻近能量转移方法(如放射活性的“自由”多肽可使与固定多肽或与固体支持物连接的分子发出荧光或闪烁光。) 
鉴定可以影响tim-1多肽与tim-4多肽结合的化合物的本发明另一种方法的变化方法，是通过亲合生物传感器方法进行的。这些方法可以基于压电的效应，电化学，或光学方法，如椭圆光度法，光波引导，及表面胞质基因共振(SPR)。SPR对于实时监控分子交互作用具有特别优势，对比于以上所述方法，能够对实验化合物对两种多肽结合的影响进行灵敏的和复杂分析。然而，这种优势也会由于该技术教低的通量(相比于多-孔-基于的方法)而略有抵销。 
正如这里前面提及的，如果化合物具有影响tim-1多肽结合tim-4多肽的效果(例如，该化合物增加或减少结合)，则可以说该化合物具有影响tim-1多肽和tim-4多肽间结合的效果，并且该效果超越了一个域值(其如上所述由本发明的发明人设定为一个期望的水平；例如，结合的数-倍增加或数-倍减少)。适宜地，对于结合的影响是一种重要影响。这里使用的术语“重要”，特别是术语“重要影响”，指运用标准统计方法得到的两个相互比较的组之间量化参数的具有统计学-意义的差异。这里所述的方法的一些实施方案中，步骤(b)包括在具有实验试剂和 合适的对照存在下，比较tim-1/tim-4复合物的形成。一些实施方案中，合适的对照包括在缺失实验试剂或化合物的情况下第一种多肽和第二种多肽间复合物的形成。 
因此，本发明的一个实施方案中，提供了一种筛选影响tim-1多肽和tim-4多肽结合的化合物的方法，包括：(a)在存在实验化合物的情况下将tim-1多肽和tim-4多肽连接；(b)测定实验化合物对tim-1多肽和tim-4多肽结合的影响；并且(c)如果化合物对于结合程度影响的测定效果高于一个域值水平则该化合物被鉴定为有效。 
术语“影响tim-1多肽和tim-4多肽的结合”指在实验化合物存在的情况下tim-1多肽和tim-4多肽的结合与实验化合物不存在(对照)的情况下tim-1多肽和tim-4多肽的结合相比，具有差异。在一个特别的实施方案中，重要的差异包括结合增强或减弱至少10％，20％，30％，40％，50％，75％，100％，150％，200％或500％。化合物可以抑制或增强结合，或根据对tim-1的影响，将作为拮抗剂，增效剂或作为增强其它拮抗剂或增效剂效果的化合物。用于将实验化合物对tim-1多肽和tim-4多肽结合影响进行量化的测试方法类型将依据实验类型和用于测定的方法并可由具有此领域普通技术的人员进行测定。例如，当运用Western blotting作为测试方法进行生物筛选时，可以利用密度计量学测定结合。密度计量学值可被标准化，而域值水平可基于一系列对照样本(例如，缺失实验化合物)间的信号变异值设定。变异越小，能被测定的实验化合物的效果就越小。 
本实验另一实施方案中，利用细胞培养技术的优势提供项目实验，由全细胞制备tim-1/tim-4复合物。例如，如下所述，tim-1/tim-4复合物可以在真核细胞培养系统中构建，例如哺乳动物细胞和酵母细胞。此领域普通技术人员已知的其它细胞也可以 使用。在全细胞中进行项目实验的优势包括测定抑制物的能力，在与运用抑制物治疗时所需要的条件相似的条件下，其具有功能活性，包括试剂进入细胞的能力。此外，本实验体内实施方案的特定方面，如以下得到的实施例，允许实验试剂的高通量筛选。tim-1/tim-4复合物对于挑选用于实验的细胞而言是内源性的。可选地，一些或所有成分可来源于外源。例如，通过重组技术(如通过使用表达载体)可以将融合多肽引入细胞，如同将融合多肽本身或编码融合多肽的mRNA显微注射入细胞。 
然而，在另一实施方案中，tim-1和tim-4多肽能被用于产生相互作用陷阱分析(见，美国专利6200759及5925523；Zervoset al.(1993)Cell 72：223-232；Madura et al.(1993)J.Biol Chem268：12046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14：920-924；and Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 8：1693-1696)，对干扰多肽相互结合的药物进行测定。 
酵母的双杂交多肽的相互作用分析也可以被用于测定影响tim-1多肽与tim-4多肽结合的化合物。这种分析是基于该发现，大部分真核细胞的转录催化剂具有标准组件，如催化剂典型地包括催化转录的催化领域，和使催化剂适当结合DNA分子的区域的DNA结合区域。 
在双杂交系统中，第一种融合多肽包括与DNA结合区域融合的一对相互作用的多肽的其中一条，第二种融合多肽包括与转录催化区域融合的一对相互作用的多肽的另一条。两条融合多肽在相同的细胞中单独表达，在融合多肽“相互作用的多肽”部分相互作用，重新组成转录催化因子的作用，其通过催化受体基因的转录被测定。至少两种以不同的细胞为基础的两种混合多肽-多肽之间的相互作用分析系统已经被用于分析结合的相互作用和/或测定相互作用的多肽。两者都使用一对融合混合多肽，其中 一部分包括融合了转录催化因子的转录催化区域的两种“相互作用”多肽的一条，另一部分包括融合了转录催化因子的DNA结合区域的两种“相互作用”多肽的一条。 
在另一实施方案中，其中一条多肽在细胞中表达，如在细胞的表面，而另一多肽是一种纯化或部分纯化的并且与细胞结合的自然的或重组多肽，如允许复合物的形成。 
在某些实施方案中，被测定的作为调节tim-1和tim-4结合相互作用的药物，可以被进一步评估其作用效果，如在体外或在体内由T细胞诱导的Th1/Th2反应的效果，如使用在这里的实验部分描述的分析。 
测试药物或测试化合物能够是任何药物或化合物，包括，但不限于，多肽(包括抗体)，肽，核酸(包括RNA，DNA，反义寡核苷酸，肽核酸)，碳水化合物，有机化合物，无机化合物，自然产品，库提取物，体液和其它样品，其希望用于测定tim-1和tim-4多肽之间的结合作用。尤其，测试化合物可以是tim-1多肽或其片段的拟态的多肽。在某些实施方案中，测试药物是纯化的或部分纯化的药物，但是在另一实施方案中其是不纯化的。 
测试药物包含许多化学的种类，虽然典型地它们是有机分子，尤其是大于50小于2500道尔顿分子量的小有机化合物。测试药物包括与多肽结构相互作用必需的功能基团，尤其是氢键结合，典型地包括至少一个胺基，羟基，羰基或羧基组，更适宜地，至少包括两个化学功能基团。测试药物经常包括环状的碳或杂环结构，和/或取代一种或多种上述功能作用的芳烃或芳烃杂环结构。测试药物也能在生物分子中被发现包括，但不限于：肽，糖 类，脂肪酸，类固醇，嘌呤，嘧啶，衍生物，结构类似物或其中的化合物。 
可以从多种来源获得测试药物，包括合成库或自然化合物。如，可获得大量有机化合物和生物分子的随机和直接合成的方式，包括寡核苷酸和寡多肽随机的表达。小型有机物/多肽的文库可以通过组合技术产生，如在Blondelle et al.(1995)Trends Anal.Chem.14：83；the Affymax U.S.Patents 5359115 and 5362899；theEllman U.S.Patent5288514；the Still et al.PCT pubication WO94/08051；Chen et al.(1994)JACS116：2661；Kerr et al.(1993)JACS115：252；PCT publications WO92/10092，WO93/09668 andWO/07087；and the Lerner et al.PCT publication WO93/20242中所描述的。 
可选择地，在细菌，真菌，植物和动物提取物中的自然化合物文库是可以购买或容易地生产的。此外，通过传统的化学的，物理的，和生物的方法，自然的或合成的产品文库和化合物可被容易地修饰，并且可被用于生产组合文库。所知的药理学的药物可以受化学修饰直接或随机的影响，如，酰化，烃化，酯化，amidification，等，来产生其结构类似物。 
在另一实施方案中，测试药物是tim-1，tim-4或其中片段的拟肽。拟肽是基于或来源于肽或多肽的化合物。通过使用非自然氨基酸，构象限制，等电子的取代，等类似的方式对已知类似多肽序列的结构的修饰，可获得被用于目前发明的拟肽。主体拟肽组成了多肽和非-多肽合成结构之间的结构空间的主体；类似物的拟肽可能在描绘药效团和帮助多肽转化进入带有亲本类似肽的活性的非多肽化物中起作用。 
而且，从本发明中可显然地知道，tim-1和tim-4序列的拟位(mimetope)能被提供。这种拟肽具有以下特性：非-水解的(如，增加了对蛋白酶的稳定性或增加了降解相应肽的其它生理学条件)，增加特异性和/或效力，和为拟肽的细胞外定位增加了细胞的渗透性。为了说明性的目的，生产本发明的肽类似物，可以使用如，苯(并)二氮卓(如，见，Freidinger et al.in Pepeides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher；Leiden，Netherlands，1988)，替换gamma内酰胺环(Garvey et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOMPublisher：Leiden，Netherlands，1988，p123)，C-7mimics(Huffman et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshalled.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p.105)，keto-methylene pseudopeptides(Ewenson et al.(1986)J Med Chem29：295；and Ewenson et al.in Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9 th American Peptide Symposium)PierceChemical Co.Rockland，IL，1985)，B-turn dipeptide cores(Nagaiet al.(1985)Tetrahedron Lett26：647；and Sato et al.(1986)J ChemSoc perkinTrans1：1231)，a-aminoalcohols(Gordon et al.(1985)Biochem Biophys Res Commun126：419；and Dann et al.(1986)Biochem Biophys Res Commun 134：71)，diaminoketones(Natarajanet al.(1984)Biochem Biophys Res Commun124：141)，andmethyleneamino-modifed(Roark et al.in Peptides：chemistry andBiology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p134)。还可见于，SessionIII：Analytic andsynthetic methods，in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)。 
除了执行可产生主体类似物拟肽的多种侧链替换，本发明特别关注使用多肽二级结构的构象限制模拟物。已经制备了多种用 于多肽氨基结合的试剂。通常使用的氨基结合试剂包括以下组(1)反式-链烯，(2)氟代烯，(3)亚甲氨基，(4)膦酰胺，和(5)磺酰胺。 
在一些实施方案中，在测定实验试剂是否可以影响tim-1和tim-4多肽结合之前，将根据其结合tim-1和tim-4多肽的能力进行预筛选。某一实施方案中，实验试剂可首先根据其结合tim-1和tim-4多肽的能力进行筛选。可以通过扫描实验试剂文库，如多肽文库或噬菌体显示文库，对实验试剂进行预筛选。 
VI.鉴定Tim-1和Tim-4变量和analogs的方法 
本发明的另一方面提供了鉴定改变结合活性，或具有改变功能的tim-1或tim-4多肽的变量形式的方法。一方面，本发明提供了鉴定tim-4多肽的方法，其结合特性相对于野生-型tim-4有所改变。某一实施方案中，在N-或C-末端，或两端具有截短的tim-4多肽，进行与tim-1多肽的结合情况的实验。这些实验将可以，例如，鉴定保持其结合tim-1能力的最小的tim-4片段。此实验中的tim-4片段可以与第二种多肽融合，如Ig区域或GST融合多肽。此外，突变，例如但不局限于，一个或多个氨基酸位点的删除，插入，或替换，可以被引入一个DNA片段，其编码(a)全-长tim-4多肽或(b)可结合tim-1多肽的tim-4片段，并且通过测定该突变多肽是否具有改变的与tim-1多肽的结合亲和力，测试该突变tim-4片段的能力。另一方面，类似于鉴定与野生-型tim-4相比，其结合特性改变了的tim-4多肽，本发明提供了鉴定与野生-型tim-1相比，其结合特性改变了的tim-1多肽的方法。 
tim-4和tim-1突变体的制备可通过，例如，运用任何本领域的普通技术人员已知的技术制备突变多肽文库来完成。克隆基 因的体内突变方法是已知的。筛选突变体的方法实施例见Gustinet al.，Biotechniques 14：22(1993)；Barany，Gene37：111-23(1985)；Colocelli et al.，Mol Gen Genet 199：537-9(1985)；和Prentki et al.，Gene 29：303-13(1984)。位点特异突变的方法见Sambrook et al.，Molecular Cloning：a Laoratory Manual，CSHPress 1989，pp.15.3-15.108；Weiner et al.，Gene 126：35-41(1993)；Sayers et al.，Biotechniques 13：592-6(1992)；Jones andWinistorfer，Biotechniques 12：528-30(1992)；Barton et al.，Nucleic Acids Res 18：7349-55(1990)；Marotti and Tomich，Geneanal Tech 6：67-70(1989)；和Zhu Anal Biochem 177：120-4(1989)。基于以下特征的相似度可进行氨基酸替换，如电荷，水溶性，疏水性，亲水性，和/或氨基酸包含的两性特征。另一实施方案中，突变是随机产生的。 
具有改变的结合特性的tim-1或tim-4多肽，指具对于tim-4或tim-1的亲合性分别具有改变。在一些特别实施方案中，突变多肽在一些生理条件下具有与非-突变形式相同的结合亲合性，而在其它条件下则亲和性不同。例如，由以下部分组成的tim-4多肽可以测试其结合tim-1多肽的情况，(a)至少一个氨基酸突变的tim-4IgV区域；(b)任意的tim-4 mucin区域；及(c)任意的人类Ig区域或一个亲合标签。这些Tim-4多肽在37℃条件下具有与非突变的Tim-4多肽相同的对tim-1的亲合力，但在35℃时则显示不同的亲和力。相似地，当另一参数改变时突变多肽可以显示不同的活性，如pH或单价或二价离子的存在或缺失。 
本发明的另一方面提供了鉴定tim-4中对于tim-4结合tim-1起作用的氨基酸残基的方法，包括 
(a)将(1)包括tim-4 IgV区域的多肽，其中所述的tim-4 IgV区域相比与SEQ ID NO：3所列的tim-4 IgV区域残基具有1至10个氨基酸的替换；及(2)tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽具有结合tim-4的能力；(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并(c)将复合物与同合适的对照比较，其中如果复合物形成的程度与合适的对照不同则氨基酸被鉴定为对结合tim-1起作用。 
某一实施方案中，合适的对照包括(1)tim-1多肽，和(2)包括SEQ ID NO：3  所列的tim-4 IgV区域的氨基酸的对照多肽两者间复合物的形成。另一实施方案中，合适的对照包括一个预定的域值水平。另一实施方案中，tim-1多肽包括一个序列，其与tim-1 IgV区域的氨基酸序列即SEQ ID NO：1所列的21-126位残基具有至少80％，85％，90％，95％96％，97％，98％，或99％相同或相似。在一相关实施方案中，该多肽包括一个与tim-4粘蛋白区域的氨基酸序列具有至少90％相同或相似的序列。 
本发明的另一方面提供了鉴定tim-1中对于tim-1结合tim-4起作用的氨基酸残基的方法，包括 
(a)将(1)包括tim-1 IgV区域的多肽，其中所述的tim-1 IgV区域相比与SEQ ID NO：121-126位残基中所列的tim-1 IgV区域具有1至10个氨基酸的替换；及(2)tim-4多肽或其片段，其中所述的tim-4多肽或其片段具有结合tim-1的能力；(b)测定多肽和tim-4多肽间复合物的形成； 
并(c)将复合物与同合适的对照比较，其中如果复合物形成的程度与合适的对照不同则氨基酸被鉴定为对结合tim-4起作用。 
本发明的一个相关方面提供了鉴定实验多肽是否结合tim-1多肽的方法，其中实验多肽包括的氨基酸序列至少与SEQ IDNO：3 31-133位氨基酸具有90％的一致性，该方法包括(a)将实验多肽与tim-1多肽相连；并且(b)测定实验多肽和tim-1多肽间复合物的形成，其中若检测到复合物则该实验多肽被鉴定为可与tim-1多肽结合。某一实施方案中，实验多肽包括一个序列，其与SEQ ID NO：3 31-133位残基或SEQ ID NO：431-134位残基所属的tim-4 IgV区域具有至少70％，80％，90％或95％一致性或相似性。另一实施方案中，实验多肽包括的序列与tim-4多肽具有至少70％，80％，90％或95％一致性或相似性，其中tim-4多肽包括的序列来自SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12。 
另一实施方案中，实验多肽包括一个多肽序列，其可以有助于其纯化，或增强稳定性或体内活性，如Fc免疫球蛋白区域或亲合标签。 
本发明的另一相关方面提供了鉴定实验多肽是否结合tim-4多肽的方法，其中实验多肽包括的氨基酸序列至少与SEQ IDNO：12 1-126位氨基酸具有90％的一致性，该方法包括(a)将实验多肽与tim-4多肽相连；并且(b)测定实验多肽和tim-4多肽间复合物的形成，其中若检测到复合物则该实验多肽被鉴定为可与tim-4多肽结合。某一实施方案中，实验多肽包括一个序列，其与SEQ ID NO：1 21-126位残基或SEQ ID NO：2 21-129位残基所属的tim-4 IgV区域具有至少70％，80％，90％或95％一致性或相似性。另一实施方案中，，实验多肽包括一个多肽序列，其可以有助于其纯化，或增强稳定性或体内活性，如Fc免疫球蛋白区域或亲合标签。 
在这里所述的测定实验多肽是否结合tim-1多肽或tim-4多肽的方法的一个实施方案中，其中实验多肽是tim-1或tim-4的拟肽，如先前章节所述。用于设计潜在的生物活性拟肽的计算机程序见美国专利第5,331,573号，其阐述内容通过在此引述而全部合并于本文。 
VII.配方 
这里所述的治疗药物可以制备成药物组合物形式。依照本发明使用的药物组合物可以利用一种或多种生理可接受的载体或赋形剂制备成常规形式。这样，组合物和其生理可接受盐和溶剂化物可以制备成药物形式，并通过气雾剂，静脉内注射，口服或局部给药。给药途径包括病灶内，腹膜内，皮下，肌肉内或静脉内注射；灌输；脂质体-介导的输送；局部，胸廓内，齿龈袋，直肠给药，支气管内，鼻腔，透膜，肠内，口服，眼内或耳内输送。 
本发明的示范性组合物包括混合了输送系统，如脂质体系统的RNAi，并可选择性地包括合适的赋形剂。在一优选实施方案中，组合物被制备成注射形式。 
技术和配方通常可以参考Remmington的PharmaceuticalSciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA。对于系统性给药优选注射形式，包括肌肉内，静脉内，腹腔内，和皮下。为适合于注射，本发明的组合物可以制备成液体形式，优选地为生理相容缓冲液如Hank’s液或Ringer’s液。此外，组合物可以制备成固体形式并在使用前进行溶解或悬浮。也包括冻干形式。 
为进行口服给药，药物组合物可以用药物可接受赋形剂如结合试剂(例如，预凝胶化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基 甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素，磷酸氢钙)；滑润剂(例如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；分解质(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)并根据常规方法制备成，例如，片剂或胶囊形式。片剂可以用此领域中已知的方法包被。用于口服途径的液体可制备成溶液，糖浆或悬浮液形式，或在使用前以干燥形式存在，并以水或其它合适媒介溶解。这些液体制备物可以用药物可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆，纤维素衍生物或食用氢化油脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非-水媒介(例如，ationd oil，油酯，乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)，运用常规方法制备。制备物也可恰当地含有缓冲盐，调味剂，着色剂和甜味剂。 
口服给药制剂可以制备成合适形式以控制释放活性成分。用于口腔给药的组合物可以用常规方法制备成片剂或锭剂形式。吸入给药，根据目前发明使用的化合物，用一种合适的推进物，(如，二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳，或其它合适的气体)从增压包装或喷雾器以气雾剂喷射方式被方便的给予。在增压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过有刻度的输送阀来测定。在吸入器或吹药器中使用的凝胶胶囊和包囊可以包括化合物的混合粉剂和合适的粉剂如，乳糖或淀粉。 
化合物可以是非肠道的形式，通过注射给药，如通过注射或输液。注射的形式可以是带有附加的防腐剂的单位剂量的形式，如，一次用量的针剂或多-剂量容器。化合物可以有以下形式：在油相或水相溶剂中的悬浮液，溶液或乳状液，可以包括的药物形式有：悬浮剂，稳定剂，和/或分散剂。可选择地，在使用前，活性成分可以和合适的溶剂(如消毒的无热源的水)构成粉剂的形式。 
化合物也可以被制成直肠用组合物，如栓剂或灌肠剂，如，包括常规的栓剂基质如可可油或其它甘油酯。 
除了先前描述的配方，化合物也可以是一种补给制剂的形式。这种长效形式可以通过灌输(如皮下的或肌肉的)或肌肉注射给药。因此，如，化合物可以与合适的聚合的或疏水的材料(如，在可接受的油相中的乳状液)或离子交换树脂，或保守的可溶性衍生物如，保守的可溶性盐类形成制剂。 
身体组织的给药可以通过透膜或透皮的形式。对于透膜或透皮形式的给药，适合渗透进入屏障的渗透剂被用于制剂中。这些渗透剂的形式通常被本领域所知，包括，如，用于透膜注射的胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，去垢剂可以被使用来便于渗透。透膜可以通过鼻腔喷射或用栓剂给药。对于局部给药，正如本领域所知的，发明的低聚体与药膏，涂油膏，凝胶体或乳油形成制剂。一种洗脱溶液能局部用于治疗损伤或炎症以加速治愈。 
如果希望，组合物可以被包装或置于储备装置中，其可以包含一种或更多包括活性成分的单位剂量。包装可以是如包括金属的或塑料的箔，如硬质泡沫塑料衬垫包装.包装或储备装置与给药说明一起携带。 
对于治疗，包括本发明的核酸，低聚体的给药有各种给药方式，包括全身和局部或定位给药。技术和配方通常可以见于Remmington’s Pharmaceutical Sciences，Meade PublishingCo.Easton，PA。对于全身给药，注射是优选的方式，包括肌肉的，静脉的，腹膜内的，intranodal，皮下的注射，本发明的低聚物能制备成液体溶液，优选的在生理学上相容的缓冲剂包括Hank’s溶液或Ring’溶液。此外，低聚物可以先制备成固体的形式，使用前迅速地再溶解或悬浮。也包括干冻的形式。 
全身给药也能通过透膜或透皮的方式，或口服地供给化合物。对透膜或透皮给药方式，适合渗透进入屏障的渗透剂被用于制剂的制造中。这些渗透剂通常是本领域所知的，包括，如，适合透膜给药的胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，去垢剂可以用于便于渗透。透皮可以通过鼻腔喷射或用栓剂给药。对于口服给药，低聚物制成传统的口服给药形式如，胶囊，片剂或tonics。对于局部给药，正如本领域所知的，发明的低聚体与药膏，涂油膏，凝胶体或乳油形成制剂。 
本发明的成分和药物的毒性和治疗功效能通过在细胞培养或实验动物中标准的制药学上的程序来测定，如测定LD50(50％的致死数量的剂量)和ED50(50％有效治疗数量的剂量)。在毒性和治疗功效之间的剂量比率是治疗指标，以LD50/ED50的比值表示。表现出大的治疗效果的化合物是优选的。尽管表现了毒性的负面效果的化合物可以被使用，但是，为了谨慎，设计一种输送系统，其绑定这些化合物进入受影响的组织，尽量地减少对非感染细胞的潜在威胁，从而降低负面影响。 
从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可以被用于在人类中使用剂量范围的参考。这些化合物的剂量在循环浓度的范围之内，包括很小的ED50值或没有毒性。根据剂量成分和给药起作用的途径，剂量可以在这种范围内变化。在本发明的方法中使用的化合物，治疗性地有效剂量可以从细胞培养分析中被估计。剂量可以在动物中表示来获得循环的血浆浓度范围，其包括在细胞中测定的IC50(如，获得症状的最大-半数的抑制时所需的测试化合物的浓度)。这种信息可被用于更精确地测定在人类中的有效剂量。如，通过高效液相色谱，可以测定在血浆中的水平。 
在这里描述的方法的某一实施方案中，药物的有效剂量为每千克病人重量给药1mg到50mg之间。在某一实施方案中，药物 的有效剂量为每千克病人重量给药2mg到40mg之间。在某一实施方案中，药物的有效剂量为每千克病人重量给药3mg到30mg之间。在某一实施方案中，药物的有效剂量为每千克病人重量给药4mg到20mg之间。在某一实施方案中，药物的有效剂量为每千克病人重量给药5mg到10mg之间。 
在这里描述的方法的某一实施方案，每天至少给药一次。在某一实施方案中，每天给药一次。在某一实施方案中，每两天给药一次。在某一实施方案中，每6-8天给药一次。在某一实施方案中，每周给药一次。 
就对病人注射的化合物和/或药物的数量来说，本领域普通技术人员将知道怎样测定适当的剂量。正如这里用到的，剂量或数量将是指对抑制疾病，治疗疾病，治疗病人或阻止病人免受疾病的充足的量。这种剂量可以被认为是有效剂量。本领域的普通技术人员能通过简单的滴定实验测定治疗病人需要的数量。本发明的成分的剂量将依赖于病人和特殊的被使用的给药途径而变化。在某一实施方案中，剂量的范围为每千克病人体重大约给药0.1到100000ug。根据化合物，剂量可以被连续地输送，如通过连续的抽吸，或周期性间隔的方式。如，分一次或多次独立的时间。特殊成分的多剂量的希望的时间间隔能通过本领域的技术人员的适当实验测定。 
有效剂量可以基于，在其它情况下，化合物的大小，化合物的生物降解能力，化合物的生物活性和化合物的生物药效率。如果不是快速降解的化合物，有生物药效率且高活性，则较小的剂量对有效性是需要的。本领域的技术人员对有效剂量是知晓的；它也将依赖于化合物的形式，大小和化合物的生物药效率。本领域的技术人员能够例行执行实验化合物活性测试，来测定在生物分析中的生物活性并以此来测定有效剂量。在上述方法的某一实 施方案中，化合物的有效剂量包括每千克病人体重1.0ng到100mg。在上述方法的另一实施方案中，化合物的有效剂量包括每千克病人体重100ng到50mg。在上述另一实施方案中，化合物的有效剂量包括每千克病人体重1.0ug到10mg。在上述方法的另一实施方案中，化合物的有效剂量包括每千克病人体重100ug到1mg。 
对化合物，组合物和/或药物的给药时间而言，本领域的技术人员能测定对受药者给予化合物和/或药物的时间。给药可以被持续一定的时间或周期和相隔特殊的时间。化合物可以被输送每小时一次，每天一次，每周一次，每月一次，每年一次(如，依时间释放形式)或同时输送。输送可以是一段时间的连续输送，如静脉内的注射。在这里描述的某一实施方案中，药物至少每天被给药一次。在这里描述方法的实施方案中，药物被每天给药。在这里描述方法的实施方案中，药物被隔天给药。在这里描述方法的实施方案中，药物被每6到8天给药。在这里描述方法的实施方案中，药物被每周给药。 
在这里描述方法的实施方案中，给病人施用的药物包含一条多肽，通过给病人注射编码这种多肽的基因多肽而施用给病人。治疗性多肽的表达结构(如，包括野生型或变异体tim-4 IgV区域的多肽)可以用生物有效载体进行给药，例如，任何带有重组融合基因的能有效地在体内转染入细胞的形式或成分。方案包括将主要融合基因插入病毒载体，包括重组逆转录病毒，腺病毒，腺-相关病毒，和单纯疱疹病毒-1，或重组细菌或真核质粒。病毒载体可以用于直接转染细胞；质粒DNA的输送可借助于，例如，阳离子脂质体(lipofectin)或衍生物(例如，抗体共轭)，多熔素共轭，短杆菌肽S，人工病毒包装颗粒或其它细胞内载体，及直接注射基因构建物或进行体内CaPO4沉淀。合适靶细胞的转 染是基因治疗中关键的第一步，特定基因输送途径的选择将依赖于这些引述如目标的类型和给药途径，例如，局部或系统。此外，病毒载体中编码的分子，例如，通过病毒载体中包含的cDNA，在已经转染病毒载体的细胞中高效表达。 
逆转录病毒和腺一相关病毒载体是通常熟知的转染外源基因进入体内，特别是进入人体的可选的重组基因输送系统。这些载体提供了有效的输送基因进入细胞的方法，并且转染的核酸稳定地整合入宿主染色体DNA。使用逆转录病毒的首要先决条件是保证其使用的安全性，特别关注于野生-型病毒在细胞群落中的传播可能性。仅产生复制-缺陷逆转录病毒的特定细胞系(术语“包装细胞”)的发展已经增加了用于基因治疗的逆转录病毒的运用，并且出于基因治疗目的用于基因转染的缺陷病毒是熟知的(见综述Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。这样，可以将逆转录病毒部分编码序列(gag，pol，env)替换为编码DKI多肽的核酸而构建重组逆转录病毒，使逆转录病毒产生复制缺陷。复制缺陷逆转录病毒随后被包装入病毒颗粒，其可以通过标准技术使用辅助病毒感染靶细胞。制备重组逆转录病毒及用这些病毒在体外或体内感染细胞的方法见Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel，F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)，Sections 9.1O-9.14和其它标准实验手册。合适的逆转录病毒的例子包括pLJ，pZIP，pWE，和pEM这些例子被本领域的技术人员熟知。制备嗜性逆转录病毒和兼嗜性逆转录病毒体系的合适的包装病毒系的例子包括Ψcrip，Ψcre，Ψ2和ΨAm。逆转录病毒被用于介导各种基因进入许多不同的细胞类型，包括在体外或在体内的神经系统的细胞，上皮细胞，内皮细胞，淋巴细胞，成肌细胞，肝细胞，骨髓细胞(见，如，Eglitis，et al.(1985)Science 230：1395-1：Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：6460-6464；Wilson et al.(1988)Proc. Natl.Acad.Sci.USA85：3014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381；Chowdhury et al.(1991)Science 254：1802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7640-7644；Kay et al.(1992)Human GeneTherapy 3：641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150：4104-4115；U.S.Patent No.4868116；U.S.Patent No.4980286；PCTApplication WO89/07136；PCT Application WO89/02468；PCTApplication WO89/05345；and PCT Application WO92/07573)。 
此外，据显示，通过对病毒粒子表面的病毒包装多肽进行修正，来限制逆转录病毒及逆转录病毒-基础载体谱是可能的(见，例如PCT publications WO93/25234，WO94/06920，和WO94/11524)。例如，对逆转录病毒载体感染谱进行修正的策略包括：将病毒env多肽与细胞表面抗原特异抗体相连(Roux et al.(1989)PNAS 86：9079-9083；Julan et al.(1992)J.Gen Virol73：3251-3255；和Goud et al.(1983)irology 163：251-254)；或将病毒env多肽与细胞表面配基相连(Neda et al.(1991)J Biolchem 266：14143-14146)。连接形式可以是与多肽或其它种类间的化学交互-连接(例如，乳糖从而将env多肽转变为asialoglycopolypeptide)，以及形成融合多肽(例如，单-链抗体/env融合多肽)。这些用于限制或指引感染特定组织类型的技术，也可以用于将亲嗜性逆转录病毒载体转变为兼嗜性逆转录病毒载体。 
除了如上所述病毒转染方法，非-病毒方法也可以用于在动物组织中表达目的多肽。许多非病毒基因转染方法依赖哺乳动物 细胞运用的正常机制进行大分子的摄取和细胞内转运。在优选实施方案中，本发明的非-病毒基因输送系统依赖于靶细胞的细胞内吞途径进行基因摄取。这种类型的基因输送系统实施例包括源于脂质体的系统，聚-赖氨酸共扼物，和人工病毒包膜。 
在一个代表性实施方案中，编码目标多肽的基因可以被装载入表面带有正电荷的脂质体(例如，脂褐质)并且(可选地)以针对目标组织细胞表面抗原的抗体作为标记(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Geka 20：547-551；PCT publicationWO91/06309；日本专利申请1047381；和欧洲专利申请EP-A-43075)。例如，神经胶质瘤细胞lipofection可以用拮抗神经胶质瘤-相关抗原的单克隆抗体标记的脂质体进行(Mizuno et al.(1992)Neurol.Med.Chir.32：873-876)。 
临床上，基因输送系统可以通过任何方法引导入病人体，其中每一种都是此领域熟知的。例如，基因输送系统的药物学制备物可以系统地引导入，例如，通过静脉内注射，并且基因输送途径引起的转染特异性，转录控制序列调控基因表达导致细胞-型或组织-型表达，或其两者联合，可引发目标细胞的特异转染。另一实施方案中，最初的重组基因输送被更多地限定于局部引导入动物体。例如，基因输送途径能够可以通过导管(见U.S.Patent5,328,470)或通过无菌注射(例如，Chen et al.(1994)PNAS91：3054-3057)引导入动物体。 
序列清单的描述
SEQ ID NO：1是Tim-1人类多肽。这种序列被作为GenbankDeposit No.NP_036338列出。 
SEQ ID NO：2是Tim-1小鼠多肽。这种序列被作为GenbankDeposit No.NP_599009列出。 
SEQ ID NO：3是Tim-4人类多肽变量#1。 
SEQ ID NO：4是Tim-4小鼠多肽。这种序列被作为GenbankDeposit No.NP_848874列出。 
SEQ ID NO：5是Tim-1人类核酸。这种序列被作为GenbankDeposit No.NM_012206列出。 
SEQ ID NO：6是Tim-1小鼠核酸。这种序列被作为GenbankDeposit No.NM_134248列出。 
SEQ ID NO：7是Tim-4人类核酸变体#1。 
SEQ ID NO：8是Tim-4小鼠核酸。这种序列被作为GenbankDeposit No.NM_178759列出。 
SEQ ID NO：9是小鼠tim-4缺失6和7外显子的可溶性形式。 
SEQ ID NO：10是小鼠tim-4缺失6外显子的一种异构体。外显子6的删除导致外显子5后面序列的移码。 
SEQ ID NO：11是人tim-4的可溶形式，它与鼠tim-4可溶形式类似，但缺少6和7外显子。 
SEQ ID NO：12是Tim-4的鼠多肽突变物。 
SEQ ID NO：13是Tim-2鼠多肽(NP_599010)。 
具体实施例
现已对本发明进行了描述，参照下面的仅为说明本发明某个方面或某个实施方案而给出的实施例，将可以更好地理解本发明，这些实施例不在任何方面限制本发明，正如同本专业人员从上文的讲述和下面的实施例所认识到的，其它的DNA微矩阵，细胞类型，试剂，构建物和数据分析方法等，都可在不超出本发明权利要求范围的条件下被使用。 
本申请中任何引用的专利，专利申请，专利申请公开或科学文献的内容，都通过在此引证而合并于本文。 
实验部分概述 
这里描述的实施例表明在Th2细胞Tim-2被优先上调。为了说明Tim-2的功能，产生了一个针对Tim-2的单克隆抗体和包含Tim-2和免疫球蛋白Fc恒定区的融合蛋白。实例表明施用Tim-2Ig诱导T细胞活化和产生Th2型细胞因子。此外，当在诱导Th1型介导的疾病如实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)时施用Tim-2Ig，疾病的临床症状明显减少。当在诱导外周免疫耐受时施用Tim-2Ig能促进移植免疫耐受。总之，这些数据表明Tim-2在Th2型分化细胞表达，并且阻断了Tim-2与其放大了Th2效应的配体间相互作用，延缓了自主免疫疾病EAE的发生和严重程度，增强了移植免疫耐受。该实例更进一步表明在小鼠胰岛移植模型中施用Tim-1/Fc融合多肽有助于同种异体移植耐受。 
实例也证实Tim-4是Tim-1的天然配体，表明Tim-4在有限的免疫组分如巨噬细胞和树突状细胞(DCs)中表达。使用可溶的Ig融合蛋白，发现Tim-4特异的与Tim-1结合，而这个结合被抗Tim-1抗体抑制。而且，体内施用Tim-1-Ig导致TH2细胞的优 先扩增，而施用Tim-4-Ig刺激T细胞扩增。这些实例都证明Tim-4-Tim-1相互作用的模型传递了对T细胞扩增的所必需的信号。 
实验程序 
抗体，小鼠和Ig融合多肽 
所有的动物实验均遵照“哈佛医药领域动物标准委员会(草案696)”要求进行，所有的小鼠均买自杰克逊实验室。FACS分析所用的来自BD Pharmingen的抗体为：FITC标记的抗鼠：B220，CD3ε，CD11b，CD11c和CD4；PE标记的抗鼠：IFN-γ，IL-4，IL-10；链霉素-PE，和特异的同种型对照。二级PE标记检测试剂羊F(ab’)2抗人IgG，羊抗大鼠Ig(H+L)和羊抗鼠IgG2a均来源于Southern Biotechnology公司。抗HA生物素(12CA5克隆)来源于Roche公司。抗Tim-3抗体(2C12)以前已有描述【Monney等，(2002)，自然，415，536-541】，抗Tim-1抗体为新制。所有Ig融合多肽都为Chimerigen公司制作，将目的多肽的胞外区域融合在人IgG1 Fc尾端。 
TH1和TH2细胞系和克隆 
AE7，一个鸽子细胞色素C特异的TH1型克隆和D10.G4，一个伴白蛋白A特异的TH2型克隆均按以前描述的静止刺激方案进行维持【Sabatos等，(2003)，自然免疫，4，1102-1110】。DO11.10TcR Tg TH1和TH2型细胞系均按以前描述的方法在体外产生，通过细胞内因子染色证实每轮静止刺激后都被成功的极化【Monney等，(2002)，自然，415，536-541】。 
转染物 
Tim-4和Tim-1转染物均构建入pDisplay载体(Invitrogen)。Tim-4使用下列引物从克隆的cDNA中扩增：5’-AGTCAGATCTGGGTTTTTGGGCCAGCCGGTG-3’(斜体为BglII位点)和5’-AGTCCTGCAGTCAGAGAGTGAAGATCCCG-3’(斜体为PstI位点)。扩增产物没有Tim-4的信号肽，从而避免了载体N端HA标签被切去而能享用整体的信号肽序列。Tim-4-pDisplay构建物用GeneJuice(Novagen)转染进入CHO或HEK293细胞，稳定转染物用1.5μg/ml G418(Gibco)筛选。Tim-1用如下引物从克隆的cDNA中扩增：5’-AGTCAGATCTATGAATCAGATTCAAGTCTTC-3’(斜体为BglII位点)和5’-AGTCCTGCAGAGGTCTATCTTCAACAATG-3’(斜体为PstI位点)，Tim-1-pDisplay构建物如上述方法转染HEK293细胞。通过含有鼠源Tim-1 cDNA的pEF6载体和含有嘌呤霉素抗性基因的FuGENE(Roche)载体共转染CHO-K1细胞获得CHO-Tim-1细胞。用嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选，并通过流式细胞仪，用抗Tim-1的大鼠多克隆抗体血清分拣表达Tim-1的细胞并进行亚克隆。CHO-Tim-3转染物的获得前面已有描述【Monney等，(2002)，自然，415，536-541】。 
细胞分离和刺激 
借助MACS LS分离柱(Miltenyi Biotec)，通过阳性筛选MACS分拣磁珠从脾脏和淋巴结纯化获得CD11b+，CD11c+和B220+细胞，而CD3+T细胞通过阴性筛选柱(R&D system)纯化获得，纯化的细胞通过流式细胞仪检测纯度。 
总淋巴细胞或者纯化的CD11b+或CD11c+细胞群用1ng/ml的LPS(Sigma)和10ng/ml的IFN-γ(R&D)刺激42-48h。为了激活T细胞，总淋巴细胞或者纯化的CD3+T细胞用1μg/ml的伴刀豆蛋白A(ConA)(Sigma)刺激42-48h。在37℃下，纯化的CD3+T细胞在用0.5μg/孔抗-CD3(克隆145-2C11，BDPharmingen)和0.5μg/孔抗-CD28(克隆37.51，BD Pharmingen)包被的24-孔板中也刺激2h。如前所述【Sabatos等，(2003)。自然免疫学第四卷，1102-1110】，所有刺激实验都在不含rIL-2的完全培养基中进行。 
DC细胞产生 
为了体外产生DC细胞，从CB6F1股骨中冲洗出骨髓细胞，裂解红细胞后，余下的细胞调整浓度至106/ml，与20ng/mlGM-CSF或者200ng/ml Flt3L一起接种培养板。GM-CSF刺激5d后或者Flt3L刺激8d后，在某些培养物中加入40ng/ml的LPS并继续培养12-14h。在总共用GM-CSF刺激培养6d后或者用Flt3L刺激培养9d后收获细胞。为获得CD86+细胞，从GM-CSF诱导产生的DC细胞中分离获得成熟髓样细胞。分离方法如上所述，采用MACS磁珠阳性筛选策略获得。通过抗Gr-1抗体MACS阴性筛选法，除去Flt3L诱导的细胞中的粒细胞(结果是主要剩下CD11c+细胞群)。有些Flt3L诱导的细胞通过MACS分选除去B220+类浆细胞。 
为了体外产生DC细胞，给CB6F1小鼠皮下注射2×106分泌Flt3L的CMS5细胞(由Devin Turner慷慨赠送)。9d后收集脾脏，通过上述方法除去粒细胞后获得总CD11c+细胞群。采用MACS阳性筛选策略，根据细胞表面标记分子进行DC分型。 
定量TaqMan RT-PCR 
通过Trizol法(Invitrogen)提取细胞总RNA。然后用RNeasyMini Kit(Qiagen)在室温下按0.6单位/μg DNAse(Qiagen)的量消化RNA，用ABI Prism 
Figure S05814074X20061116D000921
反转录试剂进行反转录，模版为1-2μg消化后的RNA(使用随机六聚体和多聚dT作为引物)。Tim-4和内对照GAPDH的表达水平同时采用多重PCR检测，探针分别标记羧基荧光素(FAM)或者 
Figure S05814074X20061116D000922
(AppliedBiosystems)，使周TAMRA作为淬灭剂。Taqman引物/探针用Primer Express v1.0(Applied Biosystems)软件设计，覆盖了Tim-4外显子3：外显子4结合区。引物为5’-CACCTGGCTCCTTCTCACAA-3’和5’-TAGTTGGATGCAGGCAGAGTT-3’，探针为6FAM-5’-AAAAGGGTCCGCCATCACTACAGAATCAG-3’-TAMRA。GAPDH成套引物和探针从Applied Biosystems购买。用 
Figure S05814074X20061116D000923
通用PCR主反应混合物(Applied Biosystems)进行PCR，PCR循环在ABI PEISM 7700 Sequence Detection System上完成。设置相对阈值循环数(CT)来判断基因的表达水平。对每一个样品而言，Tim-4 CT值用如下公式进行标化：ΔCT＝CTTIM-4-CTGAPDH。为确定相对表达，确定平均ΔCT，相对Tim-4表达水平用2-ΔCT表示。 
用抗-Tim-1封闭 
表达Tim-4的细胞用5μg/ml Tim-1-Ig染色，该Ig提前在冰上与350μg/ml的抗-Tim-1或抗-Time-3的抗体孵育1h，用抗-鼠Ig2a-PE检测。在1μg/ml的Tim-4-Ig加入反应液之前，表达Tim-1的细胞在冰上与350μg/ml的抗-Tim-1或抗-Time-3的抗体孵育1h，用抗-huIgG-PE检测。 
增殖实验与ELISA 
雌性SJL/J小鼠(6-12周龄)每侧皮下注射50-100μg PLP130-151肽(HSLGKWLGHPDKF)(生化制品级)，佐剂为完全弗氏佐剂(CFA)(Difco)。隔天腹腔注射(i.p.)100μg Tim-1-Ig或者Tim-4-Ig，100μg对照hIgG1(Sigma)，或者PBS(与Ig融合肽体积相同)(免疫的同一天开始记为0天，一直连续计算到第8天)。第10天处死小鼠，收集脾脏。细胞按5×105/孔接种于圆底96孔板(BD Falcon)，培养基为含有0-100μg/ml PLP139-151肽的完全培养基。48h后收集上清用于ELISA检测细胞因子，板内细胞用1μCi/孔3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷标记16-18h。用Beta Plate液闪计数仪(Perkin Elmer Wallac Inc)检测吸附的放射性标记的胸腺嘧啶脱氧核苷。结果用三孔每分钟计数的平均值(c.p.m)表示。细胞因子的产生用定量捕捉ELISA检测，方法如前所述【Sabatos等(2003)，自然免疫学，第四卷，1102-1110】。 
为检测增殖细胞的类型，总脾细胞按上述方法分为B220+，CD11b+，CD3+细胞群，然后用105T细胞与不同的2×105的APC重新组合接种，总体积为100μl/孔，设3个复孔。按上述方法在48h后检测增殖情况。 
共刺激实验 
从总淋巴结细胞中纯化获得的CD3+细胞接种在培养皿上，37℃下培养1h，以除去残存的APC细胞。除去非贴壁细胞后，然后将贴壁细胞按105/孔接种在预先用抗体或者文中所述浓度的融合肽包被的平底96-孔板中。96-孔板在37℃下包被2h，然后用PBS洗2-3次。48h后，96-孔板用1μCi/孔3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷标记16-18h，T细胞增殖按三孔中吸附的3[H]胸腺嘧啶 脱氧核苷的计算。统计学显著性用Mann-Whitney Test确定，数据来自所有重复实验。 
实施例1：鉴定Tim-2在Th2细胞的表达
为了在RNA水平确定Tim-2的表达，本申请人使用了半定量PCR法。Tim-2在未刺激的Th2细胞克隆中表达，在Th1细胞中不表达(图1A)。Tim-2 mRNA水平增加，直到DO11.10 CD4+ T细胞向Th2型分化(图1B)。相比之下，在向Th1型分化的细胞中，Tim-2 mRNA的水平低至难以检测(图1B)。这些数据表明，与Th1细胞相比，Tim-2偏向于在Th2细胞中表达。 
实施例2：构建表达Tim-1Ig和Tim-2Ig融合多肽的载体
为了确定Tim-1和Tim-2的潜在配体，以及Tim-1和Tim-2及其配体在体内的功能关系，本专利申请人构建了Tim-1Ig和Tim-2Ig融合多肽的载体。在每个构建物中，编码胞外IgV和粘液素的cDNA被插入在编码人IgG1 Fc片段cDNA的尾端。Tim-2构建物稳定转入NS.1细胞，Tim-1构建物稳定转入CHO细胞。通过柱层析，从上清中纯化目的融合多肽。 
实施例3：在活化的抗原呈递细胞表达Tim-1和Tim-2配体
为了研究Tim-1和Tim-2的功能，本专利申请人用Tim-2融合多肽鉴定表达Tim-2配体的细胞群。不同的细胞系均用Tim-1Ig和Tim-2Ig融合多肽染色，结果显示未活化的树枝状细胞(DCs)和巨噬细胞都显示低表达Tim-1配体。有趣的是，没有未活化的细胞群表达Tim-2配体。但是，当用LPS和干扰素γ(IFNγ)活化后，树枝状细胞和巨噬细胞系Tim-1配体表达升高，并诱导Tim-2配体的表达(图2A和2B)。在这些细胞群中，Tim-1和 Tim-2配体表达水平升高伴随着MHC II类、B7-1和B7-2表达水平的升高。对所有检测T细胞群而言，无论是原始的还是经过特殊活化的，均未检测到Tim-1和Tim-2配体的表达。总之，这些数据表明Tim-1和Tim-2配体在活化的树枝状细胞和巨噬细胞中表达，暗示了交互作用涉及T细胞和活化的抗原呈递细胞。 
实施例4：Tim-1和Tim-2融合多肽诱导T细胞增殖和Th2细胞因子产生
既然Tim-1和Tim-2在Th2细胞中表达，本专利申请人很想弄清楚这些分子在体内免疫反应中的作用。为了明确这一问题，SJL/J用CFA乳化的PLP139-151，Tim-1Ig，Tim-2Ig人IgG或者PBS(稀释对照)免疫。收集的脾细胞和淋巴结细胞在体外重新刺激，以检测在融合多肽存在时的增殖反应和细胞因子的分泌。来自对照组的小鼠脾细胞的增殖与PLP 139-151的剂量呈正相关关系(图3B和4B)。相比之下，来自接种Tim-1Ig或Tim-2Ig小鼠的脾细胞在无抗原体外刺激情况下，显示很高的基础增殖水平(图3A和4A)。该脾细胞的增殖与PLP 139-151剂量呈弱正相关关系(图3B和4B)。这些数据表明，Tim-1Ig和Tim-2Ig免疫能在体内超活化细胞，使得脾细胞在体外缺乏抗原的情况下也能继续增殖。 
这些实验的上清液在重新刺激48h后用于ELISA，以检测IL-2、IFNγ、IL-4和IL-10的产生。免疫Tim-1Ig和Tim-2Ig小鼠的总脾细胞分泌大量的IL-2。这与高水平的基础增殖结果一致(图3C和4C)。有趣的是，从免疫Tim-1Ig和Tim-2Ig小鼠脾细胞的上清中，检测到高含量的IL-4和IL-10，IFNγ的含量很低或者没有(图3C和4C)。在缺乏抗原的情况下，在上清中检测不到细胞因子。免疫Tim-1Ig和Tim-2Ig小鼠细胞能检测到IL-2的分泌，IL-4和IL-10含量较低，但在抗原刺激时它们的含量明显 增加(图3C和4C)。相比之下，来自对照组的小鼠细胞在缺乏抗原情况下，IL-2分泌很少或者没有分泌，IFNγ也不能检测(图3C和4C)。总之，这些结果表明，Tim-1Ig和Tim-2Ig能扩展Th2型T细胞及细胞因子。此外，这两种融合多肽免疫后能在以Th1型为主的动物模型中产生Th2型反应。 
通过分离接种Tim-2Ig，hIgG或者PBS的小鼠主要的抗原呈递细胞群和T细胞，揭示出在缺乏抗原的情况下，没有哪一种细胞亚群(T、B细胞，巨噬细胞或者DC)单独影响高水平的基础细胞增殖。此外，也没有哪一种细胞亚群在缺乏抗原的情况下单独影响细胞因子的分泌。在接种Tim-2Ig的小鼠细胞中观察到的背景细胞增殖反应可能是由于在抗原呈递细胞存在的情况下，由来自接种Tim-2Ig或者对照组小鼠的Tim-2Ig T细胞再生所致。将来自接种Tim-2Ig小鼠的APC细胞亚群与来自对照组小鼠的T细胞共培养，没有观察到高水平的基础增殖反应，这表明APC不是引起高水平基础增殖的主要因素。此外，仅仅在T细胞与抗原共培养的情况下才检测到细胞因子的产生，这表明在Tim-2Ig小鼠细胞中观察到的细胞增殖和Th2细胞因子的产生依赖于T细胞和APC细胞间的相互作用。 
实施例5：施用Tim-1和Tim-2融合多肽后延缓EAE的发作和严重程度
由于Tim-1Ig和Tim-2Ig能在Th1型为基础环境下产生偏向Th2型的免疫反应，本专利申请人对Tim-1-Tim-1配体，Tim-2-Tim-2配体间的相互作用对基于Th1型的自身免疫疾病的影响很感兴趣。为了阐明这一问题，本专利申请人用脑炎肽PLP139-151免疫SJL/J小鼠以诱导实验性自主免疫性脑脊髓炎(EAE)，此病为Th1型介导的自主免疫疾病，该小鼠是研究人类多发性硬皮症疾病的模型动物。用含完全弗氏佐剂的PLP 139-151免疫的SJL/L以诱导疾病。免疫获病的小鼠也施用Tim-1Ig，Tim-2Ig，hIgG或PBS，并监控三十天时期以上的临床指征。施用hIgG或PBS的小鼠被证实有预期的复发-缓解的疾病过程(图5和6)。相反，施用Tim-2Ig融合多肽的小鼠在免疫24天内显得温和而不麻痹。Tim-2Ig处理小鼠的的临床疾病高峰值为1.5，明显低于对照处理小鼠(图5)。Tim-1Ig处理小鼠使疾病的发生有轻微的延迟，也表现出明显降低疾病严重程度的特性(图6)。 
总而言之，这些数据证实Tim-1和Tim-2在Th2型细胞中差异表达，体内施用这些融合多肽能产生Th2效应，甚至在Th1偏向性体系中。而且，给Th1型介导的自主免疫疾病发生期间小鼠施用Tim-1Ig或Tim-2Ig能延缓临床症状的发生和严重程度，为该类疾病的治疗处理提供了可能的靶点。 
实施例6：Tim-2在Th2细胞中差异表达
从C57BL/6和BALB/c小鼠获得的天然T细胞可在含IL-12和抗IL-4(Th1)或IL-4和抗IL-12(Th2)的情况下用抗CD3/CD28刺激而极化。从细胞中提取RNA，获得cDNA。使用特异的Taqman引物和探针，检测相对于GAPDH的Tim-2表达水平。相对于Th1细胞，Tim-2的表达水平优先在Th2细胞中上调(图7)。 
实例7：在活化的抗原呈递细胞中表达Tim-1和Tim-2配基
从BALB/c小鼠脾细胞纯化获得B220(B细胞)，CD11b(巨嗜细胞和树突状细胞)和CD11c(树突状细胞)用LPS和γ干扰素活化。24小时活化细胞用hIgG(红线)或生物素标记的Tim-1Ig(绿线)或生物素标记的Tim-2Ig(蓝线)染色。用Streptavidin-PE作为二级检测试剂。所有的样品均用流式细胞仪 进行分析。在活化的抗原呈递细胞中Tim-1配基和Tim-2配基的表达均上调(图8)。 
实施例8：在小鼠胰岛移植模型施用Tim1/Fc融合多肽有助于同种异体移植物耐受
T细胞依赖型同种免疫反应结果，即排斥或耐受，经常依赖于i)病变的T细胞与ii)免疫调节T细胞比值的平衡。我们以前的研究表明Th1型偏向Th2免疫促使同种异体移植耐受的机制至少部分依靠增强T细胞的调节功能。既然施用Tim1/Fc或Tim2/Fc能诱导Th1向Th2免疫偏向，本专利申请者推知Tim1/Fc和Tim2/Fc治疗将有助于同种异体移植耐受。 
本专利申请人使用最小和最大组织相容性障碍物交叉的胰岛同种异体移植模型。短期用Tim1/Fc单药的治疗就足够使所有三个交叉最小组织相容性障碍物的受体获得无排斥的永久胰岛移植，而非处理组的平均移植存活期仅为28天(图9)。Tim2/Fc处理的受体也观察到类似的结果。施用Tim2/Fc导致三个受体明显的胰岛移植排斥延缓和一个受体的永久移植(图10)。此外，结合一个亚优化的剂量抗CD154(MR1)抗体，Tim2/Fc治疗使所有五个MHC完全错配的小鼠品系组合的受体实现了永久胰岛同种异体移植(图11)。 
这些数据表明Tim1/Fc和Tim2/Fc治疗促进Th1型向Th2型免疫偏向，增强T调节功能，有助于同种异体移植耐受。 
实施例9：Tim-4在巨嗜细胞和成熟树突状细胞中表达，而不在T助细胞亚系中表达
因为Tim分子不仅在T细胞反应中具有特性【Kuchroo等，(2003)，自然免疫学评述，第三卷，454-462】，本专利申请人首先确定Tim-4是否也在免疫器官中表达。多组织cDNA定量PCR显示Tim-4 mRNA在小鼠脾细胞和淋巴结中表达，在肺、肝和胸腺中表达水平很低(图12A)。这种明显的免疫器官的限制表明Tim-4是一个免疫相关分子。 
本专利申请人接下来分析了Tim-4是否也能在TH1和TH2亚细胞系中差异表达。申请者用定量PCR检测Tim-4mRNA在TH1(AE7)和TH2(D10.G4)克隆的水平，及在体外向TH1比TH2系极化的转基因T细胞DO11.10中的水平。这些细胞在每轮极化后分析以鉴定Tim-4表达的动力学。尽管第三轮体外极化后这些TH1细胞特异的表达Tim-3，TH2细胞特异的表达Tim-2【Monney等，(2002)，自然，415，536-541】，在四轮极化中Tim-4mRNA在TH1型或TH2型细胞中均没检测到(图12B)。Tim-4呈现一种与其它已定性的Tim分子不同的在免疫系统中的表达方式。因为Tim-4 mRNA在脾细胞中高表达，申请者接下来分析了脾细胞中哪种细胞类型表达Tim-4 mRNA。CD11b+，CD11c+和B220+细胞(主要分别代表巨嗜细胞，树突状细胞和B细胞)都通过阳极筛选从SJL/J或C57BL/6小鼠脾细胞中分离。在这些细胞中实时定量RT-PCR显示在CD11b+，CD11c+细胞中Tim-4mRNA高水平的表达，在B220+亚细胞系中表达稍低(图12C)。然而，本专利申请者没有在T细胞中检测到Tim-4 mRNA。因此Tim-4在脾抗原呈递细胞(APCs)中表达，而不在T细胞中表达。 
因为抗原呈递细胞代表一种极端异化的细胞群，申请者需鉴定哪种类型的APCs决定性的表达Tim-4 mRNA。申请者将注意 力集中在树突状细胞亚系，因为不同群的这些专业抗原呈递细胞的优先诱导不同类型的T助细胞反应【Eisenbarth等(2003)，免疫学当前评论，15，620-626；Rissoan等(1999)，科学，283，1183-1186】。骨髓细胞在体外通过与粒细胞-巨噬细胞克隆-刺激因子(GM-CSF)或FMS类似酪氨酸激酶3配基(Flt3L)温浴，在加入或不加入脂多糖(LPS)情况下产生树突状细胞。GM-CSF衍化的DCs主要是骨髓系，而Flt3L处理产生混合的骨髓和淋巴DC型【Brase等，(2000)，血液，96，3029-3039；Gilliet等，(2002)，实验医学杂志，195，953-958；Maraskovsky等(1996)，实验医学杂志，184，1953-1962】。LPS处理使DCs成熟，并使F1t3L处理培养物中淋巴DCs优先生长【Brasel等，(2000)，血液，96，3029-3039】。Tim-4 mRNA主要由Flt3L产生，LPS成熟细胞高表达(图12D)。这些Tim-4阳性细胞是淋巴系的而不是浆细胞系的，因为B220+细胞的这些群被消耗。在不成熟或成熟骨髓型DCs中没有表达。为了进一步观察Tim-4 mRNA在成熟淋巴树突状细胞中表达，用Flt3L产生细胞处理小鼠，将处理小鼠的脾细胞分离为不同的细胞群。与以前的观察相一致，在表达CD11c和CD8的最成熟的树突状细胞中观察到最高的Tim-4表达【Martinez del Hoyo等(2002)，血液，99，999-1004】(图12E)。总而言之，这些数据表明，与其它Tim家族不同，Tim-4不在T细胞中表达而存在于APCs，特别是成熟DCs中。 
为了鉴定Tim-4是否能作为多肽表达，申请者用编码N端含HA标签的Tim-4cDNA转染CHO和HEK293细胞，通过抗HA抗体染色观察到在两种细胞编码的表达(图14，15)。此外，申请者能证实这些细胞有一条约60kDa的带能被抗HA抗体免疫杂交。这些数据表明Tim-4不仅存在于mRNA水平，也能被翻译为功能蛋白。 
实施例11：活化T细胞和B细胞中Tim-4配基的表达
为了鉴别和分析潜在Tim-4配基(Tim-4L)的表达方式，申请者构建了一个含胞外IgV和Tim-4粘蛋白区的可溶Ig融合多肽(Tim-4-Ig)，并融合到人IgG1 Fc的尾端。该融合多肽可在流式细胞仪中用于检测SJL/J鼠脾细胞中Tim-4L的表达。在未刺激的脾细胞中，Tim-4L能在B(B220+)细胞群中观察到，而不能在T(CD3+)细胞中观察到；然而，LPS和γ干扰素处理活化后，Tim-4L能在大部分B细胞和大多数ConA活化的T细胞中可观察到(图13)。因此，与Tim-4在抗原呈递细胞中表达相反，Tim-4L在活化的B和T细胞中表达。这种表达模式，包括与Tim家族成员的结构上的相似性，使我们想到检测Tim-4是否能与以前鉴定的表达于活化T细胞的Tim分子相反应。Tim-3不在所有的活化T细胞中表达，但仅仅在末端分化的TH1细胞中有些上调，并不在B细胞中表达。因此，Tim-3不是Tim-4的配基，而Tim-1和Tim-2仍有可能与Tim-4相互作用。 
实施例12：鉴定Tim-1作为Tim-4的内源配基
为了鉴定Tim-4能否与其它Tim分子相互作用，申请者使用CHO细胞转染物在细胞表面表达Tim-1，Tim-3或Tim-4，用各种Tim融合多肽(Tim-1-Ig，Tim-2-Ig，Tim-4-Ig)来作细胞表面染色。Tim-4-Ig能与Tim-1转染物结合而不与Tim-3和Tim-4转染物结合(图14A)。相反，Tim-1-Ig与Tim-4转染物结合而不与Tim-1或Tim-3转染物结合(图14A)。用Tim-1-Ig融合多肽染色Tim-4转染物可在用含Tim-1 IgV和粘蛋白区域的全长Tim-1-Ig或只含IgV区域的Tim-1-Ig中观察到(图14A)。相反，Tim-2-Ig融合多肽(也含胞外IgV和粘蛋白区域)不能染色任何已分析的转染物，没有融合多肽与CHO-Tim-2转染物结合。这 些数据表明Tim-4与Tim-1结合而不与与Tim-1有同源性的Tim-2结合【McIntire等，(2003)，自然，425，576】。 
为了评估该结合的特异性，申请者检测抗Tim-1单克隆抗体是否能封闭Tim-1-Tim-4的结合。这个抗体针对Tim-1分子的IgV区域，因此不与Tim-1的粘蛋白区域结合。首先，表达全长Tim-1的Tim-1转染物与抗Tim-1抗体温浴，然后用Tim-4-Ig染色。用抗Tim-1抗体的预温浴能降低Tim-4-Ig预Tim-1转染物的结合但不能完全消除结合。相反，与抗Tim-3抗体【Monney等，(2002)，自然，415，536-541】(作为对照)温浴对Tim-4-Ig的结合有一点影响(图14B)。这不完全的封闭特性很可能由于Tim-1转染物表达全长Tim-1分子，而抗体仅结合IgV区域，因此，表明Tim-4和Tim-1的一些反应可能发生在Tim-1粘蛋白区域。在一个相反的实验中，Tim-1-Ig融合多肽(只含Tim-1 IgV区域)与抗Tim-1抗体预温浴，再用Tim-4转染物染色。Tim-1-Ig与抗Tim-1抗体预温浴能完全的消除融合多肽与Tim-4转染物的结合(图14B)。总之，这些实验指出转染物的染色代表Tim-4和Tim-1的特异结合，该结合能被抗Tim-1抗体预温浴而封闭。 
实施例13：Tim-4特异结合具有Tim-1的T细胞的证实实验
观察到转染细胞上Tim-4和Tim-1体外相互作用后，申请者想确定这种相互作用是否也能自然的发生在表达Tim-1的T细胞上。因为申请者以前已观察到Tim-4-Ig能染色活化的T细胞(图13)，天然SJL/J小鼠中获得的CD3+T细胞被活化用于分析Tim-1的表达和它与Tim-4-Ig结合的稳定性。Tim-1在未活化的T细胞很低量的表达，而在活化的T细胞中表达量上调(图15A)。这种Tim-1表达模式与其它观察相一致。Tim-4-Ig与这些T细胞结合与Tim-1的表达直接相关，因为Tim-4-Ig能染色活化的而不是非活化的T细胞。Tim-4-Ig与活化T细胞的结合可部分的被抗 Tim-1抗体封闭而不能被抗Tim-3抗体封闭(图15B)。与Tim-1转染物上观察到的一样，封闭Tim-4-Ig与活化T细胞的结合是不完全的。这也进一步支持了除结合于IgV之外，Tim-1粘蛋白区域也在Tim-1-Tim-4的结合之列这个概念，所以仅结合于IgV区域的抗体不能完全的阻止Tim-4-Ig与活化T细胞上的Tim-1结合。 
假设Tim-4与活化T细胞上的Tim-1很好的结合，申请者需鉴定这种结合是否优先发生在活化的TH1型或TH2型细胞。为了这个目的，申请者检测Tim-4-Ig与活化的体外极化的DO11.10TCR转基因TH1型和TH2型细胞的结合，并平行检测这些细胞Tim-1的表达。尽管Tim-1在活化的TH1型和TH2型细胞中都表达，但它的表达在活化的TH2型细胞中更高，而不是TH1型细胞(图15C和15D)。与Tim-1表达相一致，Tim-4-Ig染色比TH1型细胞更高比例的TH2型细胞。这些细胞成功的极化进入TH1型和TH2型亚系可通过细胞内染色来证实，已证明极化的TH1型细胞产生大量的γ干扰素和极少量的白介素(IL)-4或IL-10；与之相反，TH2型细胞产生大量的IL-4和IL-10和很少量的γ干扰素(图15C和15D)。这些数据证实Tim-4-Ig能与活化的T细胞结合，并极化后与TH1型细胞相比与TH2型细胞具更高的结合。 
实施例14：在树突状细胞和巨嗜细胞中表达Tim-1L
因为Tim-4在巨嗜细胞和DCs细胞中表达而不在T细胞中表达，申请者分析可溶的Tim-1-Ig是否能结合正常的体内衍化的巨嗜细胞和DCs。事实上，体内衍化的巨嗜细胞和DCs(纯化的CD11b+和CD11c+脾细胞亚系)经LPS和IFN-γ活化后可特异的与Tim-4-Ig结合。与之相比，检测的非纯化的T细胞群(CD4+ 或CD8+)，无论是活化的或非活化的，均与Tim-1-Ig结合。为了保证观察到的染色是特异的，申请者实施用抗Tim-1抗体进行封 闭实验研究，用抗Tim-3作为对照。Tim-1-Ig用抗Tim-1抗体预温浴抑制在活化CD11b+和CD11c+细胞中观察的染色现象(图16)。而与抗Tim-3抗体预温浴没有观察到染色的抑制证明了染色是由于Tim-1和表达其配基的巨嗜细胞和DCs特异的结合。这些研究证实Tim-1和Tim-4不仅在检测到的体外来源CHO转染物结合时相互作用，而且Tim-4-Ig能很强的与活化的TH2型细胞结合(尽管也观察到与TH1型细胞有较微弱的结合)，而Tim-1-Ig能结合体内来源的活化的巨嗜细胞和DCs。 
实施例15：体内施用Tim-1-Ig增加Th2反应
既然Tim-1在所有活化T细胞中均有表达，申请者假设Tim-1-Tim-4的相互作用能调节所有T细胞的扩增和效应功能。然而，TH2型细胞的该效应可能更大些，因为Tim-1在TH2型细胞的表达高于TH1型细胞。Tim-1在许多组织中都表达，它的胞内尾部含公认的酪氨酸磷酸化基序，而Tim-4 mRNA的表达则主要限制在脾和淋巴结，它的尾部缺乏公认的信号传递基序。因此，申请者选择用可溶的Tim-1-Ig治疗小鼠，它能特异的与APCs表面的Tim-4和任一Tim-4共聚集物结合，增强通过Tim-1向T细胞的信号传递，或封闭Tim-1和Tim-4之间的相互作用。为了研究在体内免疫反应中施用Tim-1-Ig的功能性影响，申请者检测用Tim-1-Ig治疗对能诱导潜在的TH1反应的蛋白酯类多肽(PLP)139-151肽免疫的SJL/J小鼠T细胞反应的影响。 
用完全弗氏佐剂(CFA)乳化后PLP139-151肽免疫SJL/J小鼠后，给该小鼠施用Tim-1-Ig或对照试剂(PBS或人IgG1)。获得免疫处理小鼠的脾脏用于检测体外增殖和细胞因子反应。用对照人IgG1(hIgG)或PBS免疫处理的小鼠脾细胞在无抗原的情况下只有很低的背景增殖。而Tim-1-Ig处理的小鼠细胞甚至在无体外抗原刺激下表现出可判定的基础增殖(图6a)。用PLP抗原 刺激后，两个对照组的细胞具PLP139-151特异的剂量依赖性增殖。而Tim-1-Ig处理小鼠的脾细胞仅表现出比加入抗原的背景略有提高的增殖(图17A)。类似的高背景可从无其它抗原单独用CFA免疫、用Tim-1-Ig处理的小鼠中观察到，这表明这种增殖反应不是特异抗原仅有的。这些数据表明用Tim-1-Ig治疗导致体内细胞高度活化，因此这些细胞能在体外无抗原刺激下继续增殖。 
这些实验的上清液可通过ELISA分析IL-2，IFN-γ，和IL-10的表达。Tim-1-Ig处理小鼠的脾细胞在无抗原刺激下分泌高水平的IL-2，这与观察到的高基础增殖相同。不再生也产生大量的IL-10和IFN-γ，而对照(hIgG和pBS)处理免疫小鼠的脾细胞在无体外抗原刺激下具很低背景的细胞因子表达。尽管无再生Tim-1-Ig处理细胞只表达少量的IL-4，对照细胞却检测不到其表达。这可能是由于PLP多肽免疫的SJL/J小鼠诱导有效的TH1型反应而抑制TH2型反应。体外用PLP139-151刺激，对照处理细胞被证实有预期的表达IL-2和IFN-γ的TH1反应(图17B)。Tim-1-Ig处理小鼠的脾细胞再刺激后持续产生IL-2，再次与这些细胞中观察到持续的，非剂量依赖性扩增相一致(图17C)。与对照处理小鼠细胞相比，Tim-1-Ig处理小鼠脾细胞在抗原再刺激后产生大量的IL-4和IL-10，表明Tim-1-Ig治疗优先在再活化的TH2型细胞中发展。而用脑炎PLP肽免疫SJL/J小鼠电子TH1型细胞和细胞因子被诱导(也见于PBS和hIgG处理的对照小鼠)，用Tim-1-Ig处理抑制抗原特异的IFN-γ的产生(图17B)。CFA处理的PLP139-151免疫的SJL/J小鼠产生极深的TH1型反应，在这套系统中施用Tim-1-Ig电子TH2型细胞因子(IL-4和IL-10)的产生和抑制IFN-γ的产生。 
为了鉴定是否确有TH2偏向性免疫反应，申请者用含明矾的OVA 323-339肽免疫BABL/c小鼠，并如上法监测Tim-1-Ig。在这些TH2偏向性条件下，Tim-1-Ig也增强基础增殖，伴随着IL-2， IL-4和IL-10表达的提高，但不包括IFN-γ(图19)。总之，这些数据表明Tim-1-Ig影响体内Tim-1-Tim-4的相互作用，导致T细胞的高度活化以致于它们能在体外继续增殖和产生TH1型(IL-2和IFN-γ)和TH2型(IL-4和IL-10)细胞因子。尽管无抗原再刺激情况下Tim-1-Ig处理的小鼠脾细胞继续产生大量的IL-2，IFN-γ和IL-10，体外抗原再活化这些细胞导致抑制TH1型反应和扩增TH2型细胞，甚至在TH1型偏向性免疫方案中。无论这是因为由于活化诱导细胞死亡而造成的TH1型细胞优先消除，或是因为TH2型细胞的扩增仍待鉴定。从这个数据来看，Tim-1传递的是阴性或阳性信号，也就是说Tim-1-Ig是在Tim-1和Tim-4之间封闭一个阴性的相互作用或促进一个阳性的相互作用是不清楚的。因此申请者用与Tim-1结合的Tim-4-Ig来鉴定直接与Tim-1结合的试剂会在体内和体外产生怎样的效应。 
实施例16：Tim-4-Ig共刺激T细胞扩增
为了鉴定Tim-4-Ig是刺激或抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生，申请者如上所述用含CFA的PLP 139-151和Tim-4-Ig，hIgG或PBS免疫SJL/J小鼠。小鼠的脾细胞又一次用于体外检测增殖和细胞因子反应。与Tim-1-Ig处理的脾细胞相似，Tim-4-Ig处理脾细胞在无抗原再刺激下表现出很高的基础增殖(图18A)。此外，Tim-4-Ig处理的脾细胞在无再刺激的情况下产生大量的IL-2和IFN-γ和低浓度的IL-4和IL-10。既然Tim-4与表达于T细胞的Tim-1结合，申请者想知道高背景增殖是否是由于T细胞或其它类型细胞的高扩增。为了鉴定引起高背景反应的细胞的身份，申请者将Tim-4-Ig和hIgG处理脾细胞分为CD11b+，B220+和CD3+群，再或者单独培养，或者体外结合，并检测它们在无抗原再刺激的情况下扩增的能力。无APCs时，Tim-4-Ig处理的小鼠增殖而hIgG处理的小鼠并不增殖，并且APC群单独也不增殖(图18B)。然而，当Tim-4-Ig处理T细胞与任何类型的APC群组合 后，可检测到更高的增殖。这种T细胞的增殖不是依赖于APCs的来源，因为Tim-4-Ig或hIgG处理小鼠的APCs都能引导相近数量的T细胞增殖。类似的增殖效应在任何含hIgG处理T细胞的培养物中都没有观察到。这个数据表明Tim-4-Ig处理脾细胞的超级增殖完全是由于Tim-4-Ig对T细胞的效果。 
在鉴定T细胞是Tim-4-Ig影响的细胞群后，申请者需估计Tim-4-Ig是否能体内直接共刺激T细胞。纯化的SJL/J CD3+T细胞用抗CD3和抗CD28抗体和Tim-4-Ig(或者hIgG或者hCTLA4-Ig作为对照)一起刺激。因为Tim-4-Ig与T细胞上的Tim-1结合，并且该体系中不含APCs，天然的Tim-4-Tim-1相互作用不被封闭；因此任何观察到的效应被期望通过进入T细胞的Tim-1信号来调节。有趣的是，申请者观察到依赖于Tim-4-Ig使用浓度的效果不同的结果。如果T细胞用抗CD3加抗CD28抗体局部优化刺激(图18C，左边部分)，申请者观察到加入Tim-4-Ig后很大的扩增增加。申请者也观察到在Tim-4-Ig低浓度时有微弱的扩增抑制(p＝0.03)。加入对照hIgG或hCTLA4-Ig表明对抗CD3加抗CD28抗体介导的扩增有很少的效应。当只与抗CD3抗体组合时，Tim-4-Ig也不能改变扩增，这表明它需要CD3和CD28两个信号去刺激T细胞扩增。未来鉴定Tim-4-Ig是否在低浓度时真的抑制T细胞的扩增，用更高浓度的抗CD3加抗CD28抗体刺激纯化的CD3+T细胞(图18C，右边部分)，并再次分析以决定Tim-4-Ig如何影响T细胞的增殖。单用抗CD3加抗CD28抗体诱导T细胞的高水平扩增，加入较低浓度的Tim-4-Ig很强的抑制这种扩增(p＝0.007)。当使用较高浓度的Tim-4-Ig后，增殖转为正常或加强，超过单用抗CD3加抗CD28抗体引起的增殖(图18C)。总之，很明显Tim-4-Ig能共刺激T细胞的增殖，这很可能是由于Tim-4-Ig能使得它的配体与T细胞交联并传递活化的信号。 
序列清单
SEQ ID NO：1；Tim-1人类多肽(NP_036338) 
MHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGS 
CSLFTCQNGIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGV 
YCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTT 
VPTTTVPTTMSIPTTTTVPTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPM 
PLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTES 
SDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGIYAGVCISVLVLLALLGVIIAKKYFF 
KKEVQQLSVSFSSLQIKALQNAVEKEVQAEDNTYIENSLYATD 
SEQ ID NO：2；Tim-1小鼠多肽(NP_599009) 
MNQIQVFISGLILLLPGTVDSYVEVKGVVGHPVTLPCTYSTYRGITTTCWGR 
GQCPSSACQNTLIWTNGHRVTYQKSSRYNLKGHISEGDVSLTIENSVESDSG 
LYCCRVEIPGWFNDQKVTFSLQVKPEIPTRPPTRPTTTRPTATGRPTTISTRST 
HVPTSIRVSTSTPPTSTHTWTHKPEPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPTDWNGTV 
TSSGDTWSNHTEAIPPGKPQKNPTKGFYVGICIAALLLLLLVSTVAITRYILM 
KRKSASLSVVAFRVSKIEALQNAAVVHSRAEDNIYIVEDRP 
SEQ ID NO：3；Tim-4人类多肽变体#1 
MSKEPLILWLMIEFWWLYLTPVTSETVVTEVLGHRVTLPCLYSSWSHNSNS 
MCWGKDQCPYSGCKEALIRTDGMRVTSRKSAKYRLQGTIPRGDVSLTILNP 
SESDSGVYCCRIEVPGWFNDVKINVRLNLQRASTTTHRTATTTTRRTTTTSP 
TTTRQMTTTPAALPTTVVTTPDLTTGTPLQMTTIAVFTTANTCLSLTPSTLPE 
EATGLLTPEPSKEGPILTAESETVLPSDSWSSAESTSADTVLLTSKESKVWDL 
PSTSHVSMWKTSDSVSSPQPGASDTAVPEQNKTTKTGQMDGIPMSMKNEM 
PISQLLMIIAPSLGFVLFALFVAFLLRGKLMETYCSQKHTRLDYIGDSKNVLN 
DVQHGREDEDGLFTL 
SEQ ID NO：4；Tim-4小鼠多肽 
MSKGLLLLWLVMELWWLYLTPAASEDTIIGFLGQPVTLPCHYLSWSQSRNS 
MCWGKGSCPNSKCNAELLRTDGTRIISRKSTKYTLLGKVQFGEVSLTISNTN 
RGDSGVYCCRIEVPGWFNDVKKNVRLELRRATTTKKPTTTTRPTTTPYVTT 
TTPELLPTTVMTTSVLPTTTPPQTLATTAFSTAVTTCPSTTPGSFSQETTKGSA 
ITTESETLPASNHSQRSMMTISTDIAVLRPTGSNPGILPSTSQLTTQKTTLTTSE 
SLQKTTKSHQINSRQTILIIACCVGFVLMVLLFLAFLLRGKVTGANCLQRHK 
RPDNTEDSDSVLNDMSHGRDDEDGIFTL 
SEQ ID NO：5；人类核酸(NM_012206) 
GTTACCCAGCATTGTGAGTGACAGAGCCTGGATCTGAACGCTGATCCCA 
TAATGCATCCTCAAGTGGTCATCTTAAGCCTCATCCTACATCTGGCAGAT 
TCTGTAGCTGGTTCTGTAAAGGTTGGTGGAGAGGCAGGTCCATCTGTCAC 
ACTACCCTGCCACTACAGTGGAGCTGTCACATCAATGTGCTGGAATAGA 
GGCTCATGTTCTCTATTCACATGCCAAAATGGCATTGTCTGGACCAATGG 
AACCCACGTCACCTATCGGAAGGACACACGCTATAAGCTATTGGGGGAC 
CTTTCAAGAAGGGATGTCTCTTTGACCATAGAAAATACAGCTGTGTCTGA 
CAGTGGCGTATATTGTTGCCGTGTTGAGCACCGTGGGTGGTTCAATGACA 
TGAAAATCACCGTATCATTGGAGATTGTGCCACCCAAGGTCACGACTAC 
TCCAATTGTCACAACTGTTCCAACCGTCACGACTGTTCGAACGAGCACCA 
CTGTTCCAACGACAACGACTGTTCCAACGACAACTGTTCCAACAACAAT 
GAGCATTCCAACGACAACGACTGTTCCGACGACAATGACTGTTTCAACG 
ACAACGAGCGTTCCAACGACAACGAGCATTCCAACAACAACAAGTGTTC 
CAGTGACAACAACGGTCTCTACCTTTGTTCCTCCAATGCCTTTGCCCAGG 
CAGAACCATGAACCAGTAGCCACTTCACCATCTTCACCTCAGCCAGCAG 
AAACCCACCCTACGACACTGCAGGGAGCAATAAGGAGAGAACCCACCA 
GCTCACCATTGTACTCTTACACAACAGATGGGAATGACACCGTGACAGA 
GTCTTCAGATGGCCTTTGGAATAACAATCAAACTCAACTGTTCCTAGAAC 
ATAGTCTACTGACGGCCAATACCACTAAAGGAATCTATGCTGGAGTCTG 
TATTTCTGTCTTGGTGCTTCTTGCTCTTTTGGGTGTCATCATTGCCAAAAA 
GTATTTCTTCAAAAAGGAGGTTCAACAACTAAGTGTTTCATTTAGCAGCC 
TTCAAATTAAAGCTTTGCAAAATGCAGTTGAAAAGGAAGTCCAAGCAGA 
AGACAATATCTACATTGAGAATAGTCTTTATGCCACGGACTAAGACCCA 
GTGGTGCTCTTTGAGAGTTTACGCCCATGACTGCAGAAGACTGAACAGG 
TATCAGCACATCAGATGTCTTTTAGACTCCAAGACAATTTTTCTGTTTCA 
GTTTCATCTGGCATTCCAACATGTCAGTGATACTGGGTAGAGTAACTCTC 
CCACTCCAAACTGTGTATAGTCAACCTCATCATTAATGTAGTCCTAATTT 
GTTTTGCTAAAACTGGCTCAATCCTTCTGATCATTGCAGAGTTTTCTCTCA 
AACATGAACACTTTAGAATTGTATGTTCTCTTTAGACCCCATAAATCCTG 
TAT 
SEQ ID NO：6；小鼠核酸(NM_134248) 
ATGAATCAGATTCAAGTCTTCATTTCAGGCCTCATACTGCTTCTCCCAGG 
CACTGTGGATTCTTATGTGGAAGTAAAGGGGGTAGTGGGTCACCCTGTC 
ACACTTCCATGTACTTACTCAACATATCGTGGAATCACAACGACATGTTG 
GGGCCGAGGGCAATGCCCATCTTCTGCTTGTCAAAATACACTTATTTGGA 
CCAATGGACATCGTGTCACCTATCAGAAGAGCAGTCGGTACAACTTAAA 
GGGGCATATTTCAGAAGGAGATGTGTCCTTGACGATAGAGAACTCTGTT 
GAGAGTGACAGTGGTCTGTATTGTTGTCGAGTGGAGATTCCTGGATGGTT 
TAATGATCAGAAAGTGACCTTTTCATTGCAAGTTAAACCAGAGATTCCCA 
CACGTCCTCCAACAAGACCCACAACTACAAGGCCCACAGCTACAGGAAG 
ACCCACGACTATTTCAACAAGATCCACACATGTACCAACATCAATCAGA 
GTCTCTACCTCCACTCCTCCAACATCTACACACACATGGACTCACAAACC 
AGAACCCACTACATTTTGTCCCCATGAGACAACAGCTGAGGTGACAGGA 
ATCCCATCCCATACTCCTACAGACTGGAATGGCACTGTGACATCCTCAGG 
AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAGCAATCCCTCCAGGGAAGCCGCAG 
AAAAACCCTACTAAGGGCTTCTATGTTGGCATCTGCATCGCAGCCCTGCT 
GCTACTGCTCCTTGTGAGCACCGTGGCTATCACCAGGTACATACTTATGA 
AAAGGAAGTCAGCATCTCTAAGCGTGGTTGCCTTCCGTGTCTCTAAGATT 
GAAGCTTTGCAGAACGCAGCGGTTGTGCATTCCCGAGCTGAAGACAACA 
TCTACATTGTTGAAGATAGACCTTGA 
SEQ ID NO：7；Tim-4人类核酸变体#1 
ATGTCCAAAGAACCTCTCATTCTCTGGCTGATGATTGAGTTTTGGTGGCT 
TTACCTGACACCAGTCACTTCAGAGACTGTTGTGACGGAGGTTTTGGGTC 
ACCGGGTGACTTTGCCCTGTCTGTACTCATCCTGGTCTCACAACAGCAAC 
AGCATGTGCTGGGGGAAAGACCAGTGCCCCTACTCCGGTTGCAAGGAGG 
CGCTCATCCGCACTGATGGAATGAGGGTGACCTCAAGAAAGTCAGCAAA 
ATATAGACTTCAGGGGACTATCCCGAGAGGTGATGTCTCCTTGACCATCT 
TAAACCCCAGTGAAAGTGACAGCGGTGTGTACTGCTGCCGCATAGAAGT 
GCCTGGCTGGTTCAACGATGTAAAGATAAACGTGCGCCTGAATCTACAG 
AGAGCCTCAACAACCACGCACAGAACAGCAACCACCACCACACGCAGA 
ACAACAACAACAAGCCCCACCACCACCCGACAAATGACAACAACCCCA 
GCTGCACTTCCAACAACAGTCGTGACCACACCCGATCTCACAACCGGAA 
CACCACTCCAGATGACAACCATTGCCGTCTTCACAACAGCAAACACGTG 
CCTTTCACTAACCCCAAGCACCCTTCCGGAGGAAGCCACAGGTCTTCTGA 
CTCCCGAGCCTTCTAAGGAAGGGCCCATCCTCACTGCAGAATCAGAAAC 
TGTCCTCCCCAGTGATTCCTGGAGTAGTGCTGAGTCTACTTCTGCTGACA 
CTGTCCTGCTGACATCCAAAGAGTCCAAAGTTTGGGATCTCCCATCAACA 
TCCCACGTGTCAATGTGGAAAACGAGTGATTCTGTGTCTTCTCCTCAGCC 
TGGAGCATCTGATACAGCAGTTCCTGAGCAGAACAAAACAACAAAAACA 
GGACAGATGGATGGAATACCCATGTCAATGAAGAATGAAATGCCCATCT 
CCCAACTACTGATGATCATCGCCCCCTCCTTGGGATTTGTGCTCTTCGCA 
TTGTTTGTGGCGTTTCTCCTGAGAGGGAAACTCATGGAAACCTATTGTTC 
GCAGAAACACACAAGGCTAGACTACATTGGAGATAGTAAAAATGTCCTC 
AATGACGTGCAGCATGGAAGGGAAGACGAAGACGGCCTTTTTACCCTCT 
AACAACGCAGTAGCATGTTAG 
SEQ ID NO：8；Tim-4小鼠核酸(NM_178759) 
AGGAAATGGAGAAAGCAGCTCAGAGAAAGGGAGGACGGAGATAAGGG 
AAGGCATGGCACACAACAGAGATGGATGGACAGTCTGAGGCTGAGAGA 
GGGCTAGTGATTTCTCGGACACTTGGGCAGTAGAACCCATACCACCCTGT 
TCTCTGGGATCCGATGGCCTTGGAGAGGGGGCTGCAGGGCCCGAGGACA 
CCAACTCTTCCCAGAGCGCTGGCATGGAGCCAGACTGAAATTACCATGT 
GTCCAAATTAAAATTGCGTACTTCAAGGATTATTTGAAGGACTATTCTTA 
GACCCTTTTAAGAAGATTTTTTAAAAAAACAGTTACTGGCTGCAGACAC 
GGAAATGCTCTGACTGCTGTAGAGCCAGTGGGCCCTTTAGGGGAGCTCC 
AGCCCTGTGGAAGCCAGACAACCAACTTGAAGCCATTTCCAAATTGTGG 
GTGGTGATCCATTTCAAGTTATGAAATGAATTTGATGATTCAAGGCCATC 
GTTTATTAAAACTAATTACCTCGTGCCGAATTCGGCACGAGGGGCTTCTC 
ATCCTCTGGCTGGTGACGGAGCTCTGGTGGCTTTATCTGACACCAGCTGC 
CTCAGAGGATACAATAATAGGGTTTTTGGGCCAGCCGGTGACTTTGCCTT 
GTCATTACCTCTCGTGGTCCCAGAGCCGCAACAGTATGTGCTGGGGCAA 
AGGTTCATGTCCCAATTCCAAGTGCAATGCAGAGCTTCTCCGTACAGATG 
GAACAAGAATCATCTCCAGGAAGTCAACAAAATATACACTTTTGGGGAA 
GGTCCAGTTTGGTGAAGTGTCCTTGACCATCTCAAACACCAATCGAGGTG 
ACAGTGGGGTGTACTGCTGCCGTATAGAGGTGCCTGGCTGGTTCAATGA 
TGTCAAGAAGAATGTGCGCTTGGAGCTGAGGAGAGCCACAACAACCAA 
AAAACCAACAACAACCACCCGGCCAACCACCACCCCTTATGTGACCACC 
ACCACCCCAGAGCTGCTTCCAACAACAGTCATGACCACATCTGTTCTCCC 
AACCACCACACCACCCCAGACACTAGCCACCACTGCCTTCAGTACAGCA 
GTGACCACGTGCCCCTCAACAACACCTGGCTCCTTCTCACAAGAAACCA 
CAAAAGGGTCCGCCTTCACTACAGAATCAGAAACTCTGCCTGCATCCAA 
TCACTCTCAAAGAAGCATGATGACCATATCTACAGACATAGCCGTACTC 
AGGCCCACAGGCTCTAACCCTGGGATTCTCCCATCCACTTCACAGCTGAC 
GACACAGAAAACAACATTAACAACAAGTGAGTCTTTGCAGAAGACAACT 
AAATCACATCAGATCAACAGCAGACAGACCATCTTGATCATTGCCTGCT 
GTGTGGGATTTGTGCTAATGGTGTTATTGTTTCTGGCGTTTCTCCTTCGAG 
GGAAAGTCACAGGAGCCAACTGTTTGCAGAGACACAAGAGGCCAGACA 
ACACTGAAGATAGTGACAGCGTCCTCAATGACATGTCACACGGGAGGGA 
TGATGAAGACGGGATCTTCACTCTCTGACTCACCATCTTTATTTAGGATT 
AAGGATAGGGAATGGCACTTGAATTGTCAAAATAAGTTTGGGGACATTG 
TAATTTCCGTTTAAAGTCTCACTCTGTTTACTGATGCTGTGGGTCCTGTCT 
GGTTGTATCTTCCCACATGAAGGTGTTTTAGAGACACATCTTCCCTGCCT 
CGTGCCTTAGTCCTCTTCGTTGTTTTGTGGCTAGGTGACTTTTCACACTGG 
GCTTGAACACTGTCAGTGATGGTGAAATCCTTGCCACAGCTTTGGGAGTC 
TCTTGCAGTCTCCCAGCAGTAGAGGGAGTTAGAAATATCCAGAGGGGAA 
AAAAAATCTCTCTTTTCAGACAGTATCTGCTTTATTGGTGGTAGCTGAAT 
TTCATTTATACAGAGCTCCTTTAACCTGTCTGTCTTCTTCTTGGTATCTAA 
GCTGCCTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTATGATATTAACTTCTTTT 
CACATTCAAGTTTCTTTAAAGTTGACTATAGTGCCTTCTGAACTCTTGCA 
GAGAGTTTGGATTTTGGAAGCTGCCAGGTACCTATCACAGCAGGGGTGC 
CAGTGACAAGGATGGTGTACAAATGAAACACTGAAGCTATCCAAATAAA 
TTCCTCTAAGTGTAATTCATTTTACTGCAGCACAGGAAGAACAAATTTGT 
CTTACAACTTTAATAATTAGTACCATTATGAACCCTAGGAGAGAAATAA 
GAGCAAATACCTGTTGAATAAATGAATGTAAGAAAAAAAAAAAAAAAA 
AAAAAAA 
SEQ ID NO：9；小鼠Tim-4的可溶性形式； 
MSKGLLLLWLVMELWWLYLTPAASEDTIIGFLGQPVTLPCHYLSWSQSRNS 
MCWGKGSCPNSKCNAELLRTDGTRIISRKSTKYTLLGKVQFGEVSLTISNTN 
RGDSGVYCCRIEVPGWFNDVKKNVRLELRRATTTKKPTTTTTRPTTTPYVTT 
TTPELLPTTVMTTSVLPTTTPPQTLATTAFSTAVTTCPSTTPGSFSQETTKGSA 
FTTESETLPASNHSQRSMMTISTDIAVLRPTGSNPGILPSTSQLTTQKTRKVTG 
ANCLQRHKRPDNTEDSDSVLNDMSHGRDDEDGIFTL 
SEQ ID NO：10；小鼠Tim-4拼接变体，缺少外显子6； 
MSKGLLLLWLVMELWWLYLTPAASEDTIIGFLGQPVTLPCHYLSWSQSRNS 
MCWGKGSCPNSKCNAELLRTDGTRIISRKSTKYTLLGKVQFGEVSLTISNTN 
RGDSGVYCCRIEVPGWFNDVKKNVRLELRRATTTKKPTTTTRPTTTPYVTT 
TTPELLPTTVMTTSVLPTTTPPQTLATTAFSTAVTTCPSTTPGSFSQETTKGSA 
ITTESETLPASNHSQRSMMTISTDIAVLRPTGSNPGILPSTSQLTTQKTNQQQT 
DHLDHCLLCGICANGVIVSGVSPSRESHRSQLFAETQEARQH 
SEQ ID NO：11；人类Tim-4可溶性异构体； 
MSKEPLILWLMIEFWWLYLTPVTSETVVTEVLGHRVTLPCLYSSWSHNSNS 
MCWGKDQCPYSGCKEALIRTDGMRVTSRKSAKYRLQGTIPRGDVSLTILNP 
SESDSGVYCCRIEVPGWFNDVKINVRLNLQRASTTTHRTATTTTRRTTTTSP 
TTTRQMTTTPAALPTTVVTTPDLTTGTPLQMTTLAVFTTANTCLSLTPSTLPE 
EATGLLTPEPSKEGPILTAESETVLPSDSWSSAESTSADTVLLTSKESKVWDL 
PSTSHVSMWKTSDSVSSPQPGASDTAVPEQNKTTKTGQMDGIPMSMKNEM 
PISQLLMIIAPSLGFVLFALFVAFLLRGKLMTYCSQKHTRLDYIGDSKNVLN 
DVQHGREDEDGLFTL 
SEQ ID NO：12；小鼠Tim-4交换N-末端异构体(NP_848874) 
MNLMIQGHRLLKLITSCRIRHEGLLILWLVTELWWLYLTPAASEDTIIGFLGQ 
PVTLPCHYLSWSQSRNSMCWGKGSCPNSKCNAELLRTDGTRIISRKSTKYTL 
LGKVQFGEVSLTISNTNRGDSGVYCCRIEVPGWFNDVKKNVRLELRRATTT 
KKPTTTTRPTTTPYVTTTTPELLPTTVMTTSVLPTTTPPQTLATTAFSTAVTTC 
PSTTPGSFSQETTKGSAFTTESETLPASNHSQRSMMTISTDIAVLRPTGSNPGI 
LPSTSQLTTQKTTLTTSESLQKTTKSHQINSRQTILIIACCVGFVLMVLLFLAF 
LLRGKVTGANCLQRHKRPDNTEDSDSVLNDMSHGRDDEDGIFTL 
SEQ ID NO：13；小鼠Tim-2多肽(NP_599010) 
MNQIQVFISGLILLLPGAVESHTAVQGLAGHPVTLPCIYSTHLGGIVPMCWG 
LGECRHSYCIRSLIWTNGYTVTHQRNSRYQLKGNISEGNVSLTIENTVVGDG 
GPYCCVVEIPGAFHFVDYMLEVKPEISTSPPTRPTATGRPTTISTRSTHVPTST 
RVSTSTSPTPAHTETYKPEATTFYPDQTTAEVTETLPDTPADWHNTVTSSDD 
PWDDNTEVIPPQKPQKNLNKGFYVGISIAALLILMLLSTMVITRYVVMKRKS 
ESLSFVAFPISKIGASPKKVVERTRCEDQVYIIEDTPYPEEES 

Claims (59)

1.多肽、抗体或者抗原结合片段在制备用于治疗或阻止在需要这种治疗的病人中由Th1-介导的疾病的药物中的应用，所述多肽、抗体或者其抗原结合片段能够减少tim-1或tim-4活性。
2.根据权利要求1的应用，其中Th1-介导的疾病是自体免疫疾病。
3.根据权利要求2的应用，其中自体免疫疾病是从多发性硬化，1-型糖尿病，Hashinoto’s甲状腺炎，Crohn’s疾病，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，胃炎，自身免疫性肝炎，溶血性贫血，自身免疫血友病，自身免疫淋巴细胞增生综合症(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，肾小球肾炎，Guillain-Barre综合症，银屑病和重症肌无力组成的组中选择的。
4.根据权利要求1的应用，其中Th1-介导的疾病是宿主排斥移植物疾病(HVGD)。
5.根据权利要求1的应用，其中Th1-介导的疾病是移植物排斥宿主疾病(GVHD)。
6.根据权利要求4的应用，其中病人是器官移植接受者。
7.根据权利要求4的应用，其中病人是异源细胞的接受者。
8.根据权利要求1的应用，其中的多肽、抗体或者其抗原结合片段减弱tim-1与tim-4的结合。
9.根据权利要求8的应用，其中的多肽、抗体或者其抗原结合片段竞争性地抑制tim-1与tim-4的结合。
10.根据权利要求8的应用，其中的多肽、抗体或者其抗原结合片段能特异地结合tim-1或tim-4。
11.根据权利要求8的应用，其中的多肽、抗体或者其抗原结合片段不能特异地结合tim-1或tim-4。
12.根据权利要求1的应用，其中的多肽、抗体或者其抗原结合片段进一步包括
i.人类血清清蛋白；或
ii.一种免疫球蛋白的Fc区域。
13.多肽、抗体或者抗原结合片段在制备用于在需要这种治疗的病人中治疗由Th2-介导的疾病的药物中的应用，所述多肽、抗体或者其抗原结合片段能够增加tim-1或tim-4活性。
14.根据权利要求13的应用，其中的Th2-介导的疾病是一种遗传性过敏症的疾病。
15.根据权利要求13的应用，其中的Th2介导的疾病是哮喘，过敏，过敏性鼻炎，胃肠过敏，食物过敏，嗜曙红细胞增多，膜炎或肾小球肾炎。
16.根据权利要求13的应用，其中的多肽、抗体或者其抗原结合片段增加了tim-1的细胞内区域的磷酸化作用。
17.多肽、抗体或者其抗原结合片段在制备用于促进在所需病人中Th1免疫反应的药物中的应用，所述多肽、抗体或者其抗原结合片段能够增加tim-1或tim-4活性。
18.根据权利要求17的应用，其中病人患有增生的情况。
19.根据权利要求18的应用，其中的增生的情况是肾脏癌，Kaposi’s肉瘤，慢性白血病，前列腺癌，乳腺癌，肉瘤，胰腺癌，白血病，卵巢癌，直肠癌，喉癌，黑色素瘤，结肠癌，膀胱癌，淋巴瘤，肥大细胞瘤，肺癌，乳腺癌，咽鳞状上皮细胞癌，睾丸癌，和胃肠癌或胃癌或其联合。
20.多肽、抗体或者抗原结合片段在制备用于增加在病人中移植耐受力的药物中的应用，所述多肽、抗体或者其抗原结合片段能够减少tim-1或tim-4活性。
21.根据权利要求13或者17的应用，其中的多肽由下述序列之一组成：
(i)SEQ ID NO：3的31-133位的氨基酸；
(ii)SEQ ID NO：4的31-134位的氨基酸；
(iii)与SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸具有至少95％一致性的保守替换类似物，其中类似物结合人tim-1(SEQ ID NO：1)并增加tim-1的活性；或
(iv)与SEQ ID NO：4的31-134位的氨基酸具有至少95％一致性的保守替换类似物，其中类似物结合鼠tim-1(SEQ ID NO：2)并增加tim-1的活性。
22.根据权利要求21的应用，其中的多肽进一步包括
(a)人类血清清蛋白；或
(b)一种免疫球蛋白的Fc区域。
23.一种鉴定药剂的方法，所述药剂调节tim-1多肽和tim-4多肽之间的结合，所述方法包括：
(a)在有测试药剂存在时，结合tim-1多肽和tim-4多肽；和
(b)测定测试药剂对tim-1多肽和tim-4多肽结合的影响；
由此鉴定调节结合在tim-1多肽和tim-4多肽之间的药剂。
24.一种鉴定调节免疫反应的药剂的方法，此方法包括：
(a)在有测试药剂存在时，结合tim-1多肽和tim-4多肽；和
(b)测定测试药剂对tim-1多肽和tim-4多肽结合的影响；
由此鉴定调节免疫反应的药剂。
25.根据权利要求23或24的方法，其中步骤(b)包括在测试药剂存在时的tim-1/tim-4复合物形式与合适的对照的比较。
26.根据权利要求25的方法，其中合适的对照包括在不存在测试药剂时，在tim-1多肽和tim-4多肽之间的复合物的形成。
27.根据权利要求23或24的方法，其中的药剂增加tim-1和tim-4的结合。
28.根据权利要求23或24的方法，其中的药剂减少tim-1和tim-4的结合。
29.根据权利要求23或24的方法，其中的药剂是小化合物，抗体或多肽。
30.根据权利要求23或24的方法，其中tim-1多肽和tim-4多肽或两种多肽在分离的细胞中表达。
31.根据权利要求30的方法，其中测定复合物的形成包括测定报告基因的表达，其中报告基因的表达依赖于复合物的形成。
32.根据权利要求23或24的方法，其中tim-1多肽和tim-4多肽或两种多肽被荧光素分子标记。
33.一种鉴定在tim-4中对tim-4与tim-1结合关键的氨基酸残基的方法，该方法包括
(a)结合
(i)一种包括tim-4IgV区域的多肽，其中所述的tim-4IgV区域相对于在SEQ ID NO：4所列的tim-4IgV区域有一到十个氨基酸的置换；和
(ii)一种tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽能结合tim-4；
(b)测定在多肽和tim-1多肽之间的复合物的形成；
和
(c)与合适的对照比较复合物的形成，其中如果复合物形成的程度不同于合适的对照，则一种氨基酸被鉴定为是结合tim-1的关键氨基酸。
34.根据权利要求33的方法，其中合适的对照包括在(i)tim-1多肽，和(ii)一种由SEQ ID NO：3的31-133位的氨基酸或SEQ ID NO：4的31-134位的氨基酸组成的对照多肽之间的复合物的形成。
35.根据权利要求33的方法，其中tim-1多肽由
(i)SEQ ID NO：1的21-126位的氨基酸；或
(ii)SEQ ID NO：2的21-129位的氨基酸；
之一组成。
36.一种测定测试多肽是否结合tim-1多肽的方法，其中的测试多肽包括SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸的保守替换类似物，此方法包括
(a)测试多肽与tim-1多肽结合；和
(b)测定在测试多肽和tim-1多肽之间的复合物的形成；
如果观察到复合物，则表明其中测试多肽与tim-1多肽结合。
37.根据权利要求23、24或36中任意一项所述的方法，其中的tim-1多肽由
(i)SEQ ID NO：1的21-126位的氨基酸；或
(ii)SEQ ID NO：2的21-129位的氨基酸；
之一组成。
38.一种测定测试多肽是否结合tim-4多肽的方法，其中的测试多肽包括SEQ ID NO：1的21-126位氨基酸的保守替换类似物，该方法包括
(a)测试多肽与tim-4多肽结合；和
(b)测定在测试多肽和tim-4多肽之间的复合物的形成；
如果观察到复合物，则表明其中测试多肽与tim-4多肽结合。
39.根据权利要求23、24、36中任意一项所述的方法，其中的tim-4多肽由：
(i)SEQ ID NO：3的31-133位的氨基酸；或
(ii)SEQ ID NO：4的31-134位的氨基酸或SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12；
之一组成。
40.多肽在制备用于预防病人中遗传性过敏的疾病的药物中的应用，所述多肽能够增加tim-1或者tim-4的活性，所述多肽由
(i)SEQ ID NO：3的31-133位的氨基酸；
(ii)SEQ ID NO：4的31-134位的氨基酸；
(iii)与SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸具有至少95％一致性的保守替换类似物，并且其中所述类似物结合人tim-1(SEQ ID NO：1)并增加tim-1的活性；或
(iv)与SEQ ID NO：4的31-134位氨基酸具有至少95％一致性的保守替换类似物，并且其中所述类似物结合鼠tim-1(SEQ ID NO：2)并增加tim-1的活性；
之一组成。
41.多肽在制备用于治疗或阻止在所需病人中甲型肝炎感染的药物中的应用，所述多肽能够增加tim-1或者tim-4的活性，所述的多肽由
(i)SEQ ID NO：3的31-133位的氨基酸；
(ii)SEQ ID NO：4的31-134位的氨基酸；
(iii)与SEQ ID NO：3的31-133位氨基酸具有至少95％一致性的保守替换类似物，并且其中所述类似物结合人tim-1(SEQ ID NO：1)并增加tim-1的活性；或
(iv)与SEQ ID NO：4的31-134位氨基酸具有至少95％一致性的保守替换类似物，并且其中所述类似物结合鼠tim-1(SEQ ID NO：2)并增加tim-1的活性；
组成。
42.根据权利要求41的应用，其中的病人没有感染甲型肝炎。
43.根据权利要求41的应用，其中的病人没有感染甲型肝炎病毒。
44.根据权利要求41的应用，其中的病人对甲型肝炎抗体呈血清阴性。
45.根据权利要求41的应用，其中的病人是小孩。
46.根据权利要求40的应用，其中的遗传性过敏症疾病从哮喘，鼻炎，湿疹和花粉热组成的组中选择。
47.一种分离的多肽，其包括tim-4IgV区域，tim-4胞内区域，和截短的tim-4粘液素区域，其中的多肽不包括tim-4的跨膜区域。
48.根据权利要求47的多肽，其中的多肽是人类或小鼠的多肽。
49.根据权利要求47的多肽，其中tim-4IgV区域包括SEQID NO：3的31-133位的氨基酸。
50.根据权利要求47的多肽，其中tim-4IgV区域包括SEQID NO：4的31-134位的氨基酸。
51.根据权利要求47的异构体多肽，包括在SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列。
52.根据权利要求47的异构体多肽，包括在SEQ ID NO：11中列出的氨基酸序列。
53.根据权利要求47的异构体多肽，进一步包括一种免疫球蛋白或一种血清白蛋白多肽的Fc区域。
54.一种组合物，其包括根据权利要求47的分离的多肽和药物学可接受载体。
55.一种分离的核酸，其编码权利要求47的多肽。
56.tim-4在制备用于提高在所需病人中的T-细胞增殖的药物中的应用。
57.根据权利要求56的应用，其中的病人被病原体感染。
58.tim-4在制备用于抑制在所需病人中的T-细胞增殖的药物中的应用。
59.根据权利要求58的应用，其中的病人感染Th1-介导的或Th2-介导的疾病。
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