CN101024672A

CN101024672A - 一种新型环状小肽ba及其应用

Info

Publication number: CN101024672A
Application number: CN 200710065665
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 李建许; 李东升
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2007-02-12
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2027-02-12
Also published as: CN100522992C

Abstract

本发明涉及一种新型环状小肽BA及其应用，属于生物医学技术领域。本发明的环状小肽BA，分子量1259.56道尔顿，等电点4.44，具有一定的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，无酶活性。其全序列为：Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro ProLys Pro Cys(CWTKSIPPKPC)，第1位半胱氨酸和第11位的半胱氨酸形成分子内二硫键。该环状小肽BA作为药物设计模版及作为制备治疗肿瘤药物的应用。以环状小肽BA作为模版，在其氨基端和羰基端分别进行不同氨基酸的增加，得到具有抗菌活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的环状小肽BA1和环状小肽BA2，并作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。本发明还具有序列简单、合成方便等优点。

Description

一种新型环状小肽BA及其应用

技术领域：

本发明提供一种新型环状小肽BA及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

丝氨酸蛋自酶及其类似物如Kallikrein，tryptase在肿瘤、风湿性关节炎以及许多炎症的(如鼻炎、结膜炎、哮喘、胃肠炎、心血管系统炎症)发生中起着重要的作用。临床试验证明其抑制剂是有效的治疗药物。另一方面，目前临床上还没有有效的治疗疱疹病毒感染的药物，新的研究发现，抑制疱疹病毒丝氨酸蛋白酶是有效的治疗手段。“传统抗生素”的长期使用和滥用，导致许多耐药性细菌的产生。于是人们开始寻找新的抗微生物药物。近年来的研究发现，多肽类抗生素不但具有广谱高效的抗菌活性，而且很难诱导菌株产生耐药性；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗微生物药物。所以肽类抗生素以及丝氨酸蛋白酶抑制剂已成为国际研究的热点。而其研究与开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。

随着科学技术的突飞猛进，蛋白质组学以及其他组学研究的广泛开展，人类对自身的认识越来越深入，对于体内多肽、蛋白质功能的了解越来越透彻。存在于体内的信号分子有相当数量是肽和蛋白质，许多疾病的发生、发展均与这些物质的失衡有关。因此，源于生物体本身的蛋白质、多肽类药物日益受到重视，它们被称为内源性活性肽或蛋白质。由于生物活性肽在体内含量极少而效应极强，分布广泛，因而为多种药物研发提供了天然先导化合物。

生物活性肽的另一重要来源是外源性肽，尤其是源于动物的肽类毒素和抗生素，如：蜂毒、蛇毒、蛙毒、芋螺毒素等。其生理效应强，作用广泛，在药物研发中已经引起极大关注，特别是在镇痛、抗炎、抗肿瘤、治疗神经系统疾病领域，不乏已经开发为药物的先例。

内源性和外源性生物活性肽为肽类药物研发提供了巨大的天然活性肽库，尽管它们可直接开发为药物，由于其固有的特性，往往需要经过化学修饰，赋予其适合药物开发的特性，才能开发为有价值的药物。以内源性或外源性生物活性肽为先导是新药研发的捷径之一，给药学研究人员提供了广阔的用武之地。

据报道：2002年全球蛋白质、多肽类药物的销量已超过600亿美元，是2001年的两倍以上。近几年蛋白质、多肽类药物市场的发展迅速，年增长率达19％，远远高于增长率仅为9％的总体医药市场，成为不容忽视的亮点。

但是，多肽类药物本身也有着一定的缺点，例如在体内易降解、半衰期较短、造价成本高等。而根据天然活性多肽序列，对其进行氨基酸以及结构的改变或修饰以提高其活性和稳定性、降低其制造成本是多肽类药物设计的目的之一。

本发明旨在提供一种环状小肽模版BA，对其进行不同程度的改造，可形成抗菌肽和抑制剂两大类不同的活性物质。发明人将本发明的环状小肽在蛋白质数据库中搜索比对发现，未发现有相同的小肽。

发明内容：

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种新型的环状小肽BA及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

环状小肽模版BA：

一种环状小肽模版BA，分子量1259.56道尔顿，等电点4.44，无酶活性，其全序列为：Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys(CWTKSIPPKPC)，第1位半胱氨酸和第11位的半胱氨酸形成分子内二硫键。

环状小肽BA的制备方法及其作为模版的改造方法：

利用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atombombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

环状小肽BA作为药物设计模版及作为制备治疗肿瘤药物的应用。

利用肽类药物设计原理，对该小肽模版进行改造，改造的方法为：在其氨基端和羰基端分别进行不同氨基酸的增加，得到具有抗菌活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的：

环状小肽BA1：

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe

5 10

环状小肽BA2：

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Lys Arg

5 10 15

环状小肽BA1和环状小肽BA2作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。

本发明的有益效果在于：

提供一种环状小肽模版BA，此模版结构简单、人工合成方便。对此模版进行不同的改造，可形成抗菌或丝氨酸蛋白酶抑制剂两大类具有显著生物活性的小肽。改造形成的小肽具有结构简单、人工合成方便、活性更强等特点。

附图说明：

附图显示环状小肽抑制丝氨酸蛋白酶的效果。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

环状小肽BA的氨基酸序列为：

Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys

5 10

环状小肽BA的制备以及其作为模版的改造方法：

I、环状小肽BA的制备方法：用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱脱盐、纯化。

II、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶I，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

III、环状小肽BA用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快速原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

IV、利用肽类药物设计原理，对环状小肽BA进行改造，改造的方法为：在其氨基端和羰基端分别进行不同氨基酸的增加，将其分别改造为具有抗菌活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的小肽。

V、经改造小肽的合成同上。

本发明的环状小肽BA，分子量1259.56道尔顿，等电点4.44，具有一定的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，无酶活性。其全序列为：Cys Trp Thr Lys Ser Ile ProPro Lys Pro Cys(CWTKSIPPKPC)，第1位半胱氨酸和第11位的半胱氨酸形成分子内二硫键。

以环状小肽BA作为模版，利用肽类药物设计原理，对其进行改造，改造的方法为：在其氨基端和羰基端分别进行不同氨基酸的增加，将其分别改造为具有抗菌活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的小肽：

环状小肽BA1：

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe

6 10

环状小肽BA2：

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Lys Arg

5 10 15

环状小肽的药理实验：

1.环状小肽抑制丝氨酸蛋白酶的作用

不同的环状小肽溶解于0.05M Tris-HCl缓冲液与一定量的胰蛋白酶(最终浓度为40μg/ml)于0.05M Tris-HCl缓冲液于室温下保温2min，最后加入发色底物S-2238(终浓度为40μg/ml)启动反应，应用PERKIN ELMER(美国)公司生产的分光光度计于处监测吸收值变化2min，加入同样体积的0.05M Tris-HCl缓冲液与空白对照，抑制常数Ki＝[I]/(V0/VI+1)计算。[I]为蛋白酶抑制剂dibridge的摩尔浓度，V0为空白对照是胰蛋白酶与发色底物的反应速度，V1为加入环状小肽抑制剂后胰蛋白酶与发色底物的反应速度。此试验重复六次，取平均值。

结果如图所示，环状小肽BA能微弱的胰蛋白酶的抑制活性，在上述试验条件下抑制半数胰蛋白酶活性所需要的环状小肽抑制剂浓度为1μg/ml，对胰蛋白酶的抑制常数Ki是4×10^-3M。而经过改造的环状小肽BA1具有增强的抑制剂活性，其半数抑制浓度为400ng/ml，抑制常数Ki为2.44×10^-5M，但环状小肽BA2没有抑制剂活性。

2.环状小肽抑制剂抑制肿瘤生长的作用：

在96孔细胞培养板上，将待测样品用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加3×10⁵个/ml的HepG2和C8166细胞100μl。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。48小时后用MTT法测定待测化合物对细胞的毒性作用。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒性作用时的浓度。

表1 环状小肽抑制剂抑制肿瘤细胞生长的作用：

细胞系	EC5(μM)
	EC5(μM)			环状小肽BA	环状小肽BA1	环状小肽BA2
	HepG2C8166	5876	2034	环状小肽BA	环状小肽BA1	环状小肽BA2	00

由表1可见，该环状小肽抑制剂能一定程度地抑制肝肿瘤细胞系(HepG2)和淋巴细胞系(C8166)的生长，这表明该环状小肽抑制剂具有一定的抑制肿瘤细胞生长和调节免役的作用，同时还具有序列简单、合成方便等优点。可作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。

3.环状小肽抑制细菌生长的作用

表2.无指盘臭蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用

EC5(μM)

菌种	环状小肽BA	环状小肽BA1	环状小肽BA2
菌种	环状小肽BA	环状小肽BA1	环状小肽BA2	大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli ATCC25922)金黄色葡萄球菌ATCC2592(Staphylococcus auneus ATCC2592)	00	00	13.55.7
枯草杆菌(Bacillus subtilis)	0	0	3.5		00	00	13.55.7

由表2可见，环状小肽BA没有抑菌活性，经改造的环状小肽BA1也没有抑菌活性，但是经改造的环状小肽BA2却由很强的抑制细菌生长的活性。所以可作为制备新型的抗生素药物的应用。

上述试验证明，环状小肽BA可作为制备肿瘤治疗药物外，还可抑作为抗生素和肿瘤治疗药物的设计模版。

Claims

1.一种新型环状小肽BA，其特征在于该环状小肽BA的分子量1259.56道尔顿，等电点4.44，其全序列为：Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys ProCys(CWTKSIPPKPC)，第1位半胱氨酸和第11位的半胱氨酸形成分子内二硫键。

2.权利要求1所述的环状小肽BA的应用，其特征在于该环状小肽BA作为药物设计模版及作为制备治疗肿瘤药物的应用。

3.权利要求1所述的环状小肽BA的应用，其特征在于以环状小肽BA作为模版，在其氨基端和羰基端分别进行不同氨基酸的增加，得到具有抗菌活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的：

环状小肽BA1：

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe

7 10

环状小肽BA2：

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Lys Arg

5 10 15