CN101015713A

CN101015713A - 载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥及制备方法

Info

Publication number: CN101015713A
Application number: CN 200710066658
Authority: CN
Inventors: 徐靖宏; 谈伟强; 林军; 陈虹; 李万红
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2007-01-09
Publication date: 2007-08-15

Abstract

本发明提供载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥，含有羟基磷灰石、β－磷酸三钙，杜仲叶提取物的浓度为0.152～0.608mg/ml。采用两次煅烧和加入磷酸氢二铵液的方法制备固相部分，由Na₂HPO₄与玻璃离子水门汀液组成液相部分，将杜仲叶提取液加入液相，液/固比为0.35ml/g。本发明设计合理，符合临床对骨水泥的操作要求，适合成骨细胞的生长要求，增强了磷酸钙骨水泥的效果。该方法不仅可制备出强度高、可塑性好、具有良好生物相容性和可降解性的复合材料，且该复合材料对成骨细胞的增殖具有明显的促进作用，使该磷酸钙复合骨水泥具有骨诱导活性。可用作充填、修复、替换人体骨组织的材料。

Description

载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥及制备方法

技术领域

本发明属于材料科学与生物医学的交叉领域，具体涉及载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备方法，其磷酸钙复合骨水泥可用作充填、修复、替换人体骨组织的材料。

背景技术

磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement，CPC)是一种具有生物活性的新型非陶瓷型羟基磷灰石类人工骨材料。CPC是由固相部分(一种或几种磷酸盐的粉末加上HA的晶体)和液相部分(稀酸或生理盐水)调和后经过水化结晶反应而成的一种新型自固化型人工骨替代材料，最初是作为牙科材料而开发出来的。由于它克服了传统陶瓷型羟基磷灰石不能任意塑型和难以降解的缺点，很快成为了骨充填和修复的常用材料。与传统的陶瓷型羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)相比具有制备简易、任意塑形和缓慢降解等优点；与普通骨水泥相比，生物相容性良好，在固化结晶过程中不产热，是较理想的骨修复材料。CPC除具有良好的骨传导性和生物力学性能外，还是多种药物理想的缓释载体。但CPC只具有骨传导性而缺乏成骨诱导活性，CPC骨替代过程是它的缓慢降解和伴随传导成骨综合作用的结果。传统的CPC在完全固化前，添加有机物如藻酸钠、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素虽然可使CPC不致于崩解，但延长了CPC的凝固时间，降低了CPC的抗压强度和减慢了CPC的降解速度；添加柠檬酸虽可缩短凝固时间，增加材料的抗压强度，但使材料的PH值下降(pH＜6)，低于成骨细胞生长所要求的培养基酸碱度(PH 6.8～8.2)。

杜仲(Euconnia ulmoides Oliv)是我国特有的名贵中药材，始载于《神农本草经》，药用部位为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，其味甘、微辛，性温，归肝肾经，补肝肾、强筋骨，为骨伤科常用药物之一。现代医学研究证实了杜仲叶与皮的化学成分基本一致，具有同等功效，可以以叶代皮。杜仲叶中含有几十种药用有效成分，如绿原酸、京尼平苷、桃叶珊瑚甙、生物碱、黄酮类、内脂、维生素、微量元素、糖类、果胶、氨基酸等。研究表明，杜仲叶水煎液内服能促进骨折断端矿物质的沉积，促进创伤性骨折的愈合。体外实验研究表明，杜仲叶水提取物对成骨细胞的增殖具有明显的促进作用。

发明内容

本发明的目的是提供载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥，由固相部分和液相部分调和后经过水化结晶而成，固相中含有羟基磷灰石(HAP)、β-磷酸三钙(β-TCP)，且HAP∶β-TCP的质量比为6∶4，液相部分为0.25M Na₂HPO₄与玻璃离子水门汀液剂的混合液，且质量比为1∶1，杜仲叶提取物在液相中的最终浓度在0.152～0.608mg/ml，该磷酸钙复合骨水泥的液/固比率为0.35ml/g，PH 6.8～8.2，溶解率为2.34％。

本发明的另一个目的是提供载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备方法，该方法不仅可制备出强度高、可塑性好、具有良好生物相容性和可降解性的复合材料，且该复合材料对成骨细胞的增殖具有明显的促进作用，使该磷酸钙复合骨水泥具有骨诱导活性。通过以下步骤实现：

(1)固相部分的制备：采用将牛骨两次煅烧和加入磷酸氢二铵(AP)液的方法制备，最终粉剂为羟基磷灰石(HAP)和β-磷酸三钙(β-TCP)两个晶相，HAP∶β-TCP的质量比为6∶4。具体是将新鲜牛网织骨粉碎为1cm³大小，双蒸水反复冲洗，浸入38℃的30％H₂O₂溶液中72小时(每隔24小时换液)后，双蒸水洗30分钟，无水乙醇浸泡24小时，双蒸水再次洗30分钟，丙酮中浸泡24小时，制成部分脱蛋白脱脂骨粒，最后双蒸水洗30分钟后70℃干燥3天。随后马弗炉中800℃煅烧(以10℃/min的速度加温)，保持6小时。将煅烧后的骨粒浸入浓度为0.3M的磷酸氢二铵(AP)溶液中，70℃浸泡24小时，滤纸吸干表面多余的AP液，70℃干燥3天。将此干燥牛骨粒盛于刚玉坩埚中置于马弗炉中以2.5℃/min的速度加热至1300℃，保持1小时，冷却至室温，粉碎后干燥保存。

(2)液相部分：固化液为0.25M Na₂HPO₄与玻璃离子水门汀(HY2 bondGlasionomer CX，日本松风公司)液剂的混合液，质量比为1∶1。

(3)杜仲叶提取物的制备：采用“醇提水沉法”提取(提取方法参照：夏循礼，陈勇.醇提水沉与水提醇沉提取杜仲叶活性成分的比较研究.湖北大学学报(自然科学版)，2003，25(3)：267-270)，提取参数为：醇浓度50％，乙醇量8倍，提取2次，提取过程参见图13。

(4)载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备：液相部分中加入预先制备好的杜仲叶提取物(为方便取用，先将一定量的杜仲叶提取物溶解于双蒸水中，制成较大浓度的溶液备用，因取用的杜仲叶提取液体积极小，引起的液相部分之体积改变可忽略不计，下同)，使杜仲叶提取物在液相部分中的最终浓度在0.152～0.608mg/ml，然后按液/固比率为0.35ml/g加入到固相部分，在清洁干燥的玻璃板上用不锈钢调拌刀充分调拌均匀，环境温度控制在23±1℃左右，调和时间60～90秒，将调和物呈膏状体时填充入一定形状的模具中成形。

本发明的有益之处是：

(1)AP的浓度在控制HAP转化量方面有重要作用。在相同煅烧温度下，随着AP浓度的增加，HAP含量减少而β-TCP含量增加。AP浓度对HAP转化量的影响，有助于制备出不同比例HAP/β-TCP的钙磷骨水泥，达到控制CPC材料降解速度的目的，以适应各种临床需要。研究显示一定比例的HAP/β-TCP(如6/4或7/3)陶瓷在修复骨缺损中比单一(如100HAP/0β-TCP或OHAP/100β-TCP)陶瓷更有效。

(2)杜仲具有补肝肾、强筋骨等作用。大量实验研究表明，杜仲叶提取物的有效成分对成骨细胞的增殖具有明显的促进作用。由此可见，杜仲是一种成分及其提取方法明确、简易，且能促进骨形成的传统中药材。在本发明中，CPC承载杜仲叶提取物后固化时间和抗压强度、pH值变化不明显；且X射线衍射仪(XRD)物相组成分析和傅里叶变换红外光谱分析(FTIR)结果发现，载药CPC出现典型的HAP和β-TCP衍射峰和基团，而不出现相应的药物衍射峰，提示杜仲的载入并不干扰CPC的理化特性，是成骨载体中理想的药物选择。

(3)本发明的磷酸钙复合骨水泥抗压强度为19MPa左右，高于人平均松质骨抗压强度0.5～11MPa适合非负重骨缺损的修复。凝固时间9min左右，符合临床对骨水泥的操作要求，操作时试样黏度较为适中。溶解率测定结果表明，CPC的溶解率为2.34％；pH值测定结果表明此CPC适合成骨细胞的生长要求(PH6.8～8.2)。

(4)本发明制备的载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥，可用作充填、修复、替换人体骨组织的材料。

附图说明

图1为单纯磷酸钙骨水泥的PH值测定(样品一、二、三分别用黑、红、黄三色绘制PH值线，三线重合)。

图2为载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的PH值测定(样品一、二、三分别用黑、红、黄三色绘制PH值线，三线重合)。

图3为单纯磷酸钙骨水泥的X线衍射谱。

图4为载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的X线衍射谱。

图5为单纯磷酸钙骨水泥的傅里叶变换红外分析。

图6为载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的傅里叶变换红外分析。

图7为植入后12周的X线片观察(左：空白组，中：纯CPC对照组，右：CPC/杜仲叶提取物复合材料实验组)。

图8为空白组12周HE染色60×。

图9为纯CPC对照组12周HE染色60×。

图10为CPC/杜仲叶提取物复合材料实验组12周HE染色60×。

图11为纯CPC对照组12周SEM图谱100×。

图12为CPC/杜仲叶提取物复合材料实验组12周SEM图谱100×。

图13为制备杜仲叶提取物的提取工艺流程图。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图作进一步的说明。

实施例一载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备方法

(1)固相部分的制备：将新鲜牛网织骨粉碎为1cm³大小，双蒸水反复冲洗，浸入38℃的30％H₂O₂溶液中72小时(每隔24小时换液)后，双蒸水洗30分钟，无水乙醇浸泡24小时，双蒸水再次洗30分钟，丙酮中浸泡24小时，制成部分脱蛋白脱脂骨粒，最后双蒸水洗30分钟后70℃干燥3天。随后马弗炉中800℃煅烧(以10℃/min的速度加温)，保持6小时。将煅烧后的骨粒浸入浓度为0.3M的磷酸氢二铵(AP)溶液中，70℃浸泡24小时，滤纸吸干表面多余的AP液，70℃干燥3天。将此干燥牛骨粒盛于刚玉坩埚中置于马弗炉中以2.5℃/min的速度加热至1300℃，保持1小时，冷却至室温，粉碎后干燥保存。最终粉剂经X射线衍射仪测定为羟基磷灰石(HAP)、β-磷酸三钙(β-TCP)两个晶相，HAP∶β-TCP的质量比为6∶4。

(3)杜仲叶提取物的制备：采用“醇提水沉法”提取(提取方法参照：夏循礼，陈勇.醇提水沉与水提醇沉提取杜仲叶活性成分的比较研究.湖北大学学报(自然科学版)，2003，25(3)：267-270)，提取参数为：醇浓度50％，乙醇量8倍，提取2次。提取过程参见图13。

(4)载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备：液相部分中加入一定量的预先制备好的杜仲叶提取物，使杜仲叶提取物在液相部分中的最终浓度在一定范围内(0.152～0.608mg/ml)，然后按液/固比率为0.35ml/g加入到固相部分，在清洁干燥的玻璃板上用不锈钢调拌刀充分调拌均匀，环境温度控制在23±1℃左右，调和时间60～90秒，将调和物呈膏状体时填充入一定形状的模具中成形。

实施例二

载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥固化时间的测定

预先在固化液(即液相部分)中分别加入一定量的杜仲叶提取物，使杜仲叶提取物在固化液中的最终浓度分别为0、0.152、0.304、0.608mg/ml。称取固相部分1g，然后按液/固比率为0.35ml/g加入液相部分，在清洁干燥的玻璃板上用不锈钢调拌刀充分调拌均匀，环境温度控制在23±1℃左右，调和时间60～90秒，将调和物呈膏状体时填充入直径10mm、高2mm的模板中，调和物填充至水准面。从调和结束后第1分钟时把模板放入37℃，相对湿度大于90％的恒温箱中，箱内放置一台压头直径为1mm，压头重量为400g的针戳计。每隔30秒小心地把压头垂直降落到调和物表面，停留5秒，直至表面不能观察到圆形压痕。从调和结束至调和物表面无圆形压痕的这段时间定为凝固时间，每组测3个试样，测定结果见表1。

表1.磷酸钙复合骨水泥的理化特性测定结果

杜仲叶提取物浓(mg/ml)	凝固时间(min)	抗压强度(MPa)	溶解率(％)
杜仲叶提取物浓(mg/ml)	凝固时间(min)	抗压强度(MPa)	溶解率(％)	0	8.8	19.13±9.17
0.152	9.0			0	8.8	19.13±9.17
0.152	9.0			0.304	8.7
0.608	8.2	19.27±10.61^*	2.34	0.304	8.7

实施例三

载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥抗压强度测定

预先在固化液中分别加入一定量的杜仲叶提取物，使杜仲叶提取物在固化液中的最终浓度分别为0和0.608mg/ml。按液/固比率为0.35ml/g在固相部分中加入固化液，调和物60秒钟内分别填入内径为4mm、高度为6mm的不锈钢模具中，用力压实，拧上压紧螺丝，放入37℃相对湿度大于30％的恒温箱中，1h后脱模，试样即刻浸入37℃模拟体液(SBF)中，恒温保持23h，取出，将试样两端磨平，游标卡尺精确测量每一试件的直径和高度。在生物力学机上测试抗压强度，加载速度为0.5mm/min，每组测5个样品，取平均值。抗压强度计算公式为：

Ro＝P/S＝4P/πd²

其中，Ro：抗压强度(MPa)，P：最大有效破坏负荷(N)，S：受压缩面积(mm²)，d为模块直径。

计算所得抗压强度见表1。

实施例四

载有杜仲叶提取物的磷酸钙骨水泥水中溶解度测定

预先在固化液中加入一定量的杜仲叶提取物，使杜仲叶提取物在固化液中的最终浓度分别为0.608mg/ml。按液/固比率为0.35ml/g在固相部分中加入固化液，调和物60秒钟内分别填入内径为4mm、高度为6mm的不锈钢模具中夹紧，调和开始后第3分钟试样放入37℃，相对湿度大于95％的恒温箱中，1h后脱模，通过线系在已注入50ml蒸馏水的称量瓶中，使试样悬空浸没于水，在37℃静置23h，到时取出试样，称量瓶放入100℃烘箱，使水蒸发，然后升温至150℃，使称量瓶干燥至恒重，放入干燥皿中冷却到室温。称量瓶前后重量之差除以试样浸渍前重量即得到材料块溶解率，测3个试样取平均值，测定结果见表1。

实施例五

载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥水中孔隙率测定

根据阿基米德定律测定：取干燥材料块测重量(G₁)，将材料块浸入水中测得其水中的重量(G₂)，再取出材料块测得其含水的湿重重量(G₃)。G₃-G₁＝材料块所吸水的重量(所含水的体积，即材料块内部孔隙的体积)；G₁-G₂＝材料块所受浮力(材料块的体积)。孔隙率＝所含水的体积/(所含水的体积+材料块的体积)×100％。计算结果为31.3％。

实施例六

载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥水和单纯磷酸钙骨水泥的比较

按液/固比率为0.35ml/g在固相部分中加入固化液(预先在固化液中分别加入一定量的杜仲叶提取物，使杜仲叶提取物在固化液中的最终浓度分别为0和0.608mg/ml)。调和物60秒钟内分别填入内径为4mm、高度为6mm的不锈钢模具中，用力压实，拧上压紧螺丝，放入37℃相对湿度大于30％的恒温箱中，1h后脱模。随后分别进行pH值测定、X射线衍射仪(XRD)物相组成分析和傅里叶变换红外光谱分析。

水中pH值测定结果参见图1、图2，适合成骨细胞生长所要求的培养基酸碱度(PH6.8～8.2)。

X射线衍射仪物相组成分析结果参见图3、图4。其衍射谱显示载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥水和单纯磷酸钙骨水泥的衍射谱图相同，有两个晶相HAP与β-TCP。说明杜仲叶提取物的载入并未影响到CPC的固化反应，从而也说明杜仲叶提取物是以无定形形式存在于CPC的孔隙中。

傅里叶变换红外分析结果参见图5、图6。3433、3438、1088、1043、567cm^-1为HAP的特征吸收峰，1120、603cm^-1为TCP的特征吸收峰，1718、1719cm^-1羰基的伸缩振动吸收峰(υ_C＝O)，1596、1616、1384、1385cm^-1为羧酸根中-coo^-的振动频率，2920、2921、2851cm^-1为络合物中-CH₂-的振动频率。此外，未见到其它物质的吸收峰。由此可见，两者的图谱非常相似。

实施例七

载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥体内生物活性测试

称取150mg固体部分粉末，然后按液/固比率为0.35ml/g加入固化液，预先在固化液中加入最终浓度为0.304mg/ml的杜仲叶提取物，调和后制成9mm直径，2mm高的材料块；另称取150mgCPC粉末，然后按液/固比率为0.35ml/g加入不含杜仲的固化液，制成9mm直径，2mm高的材料块作为对照组，12kGy钴60γ射线消毒备用。

用3％戊巴比妥钠(1ml/kg)经兔耳缘静脉注射麻醉。麻醉成功后，俯卧位固定于手术台上，颅顶备皮消毒，沿兔颅顶部中线做弧形切口，长约8cm，显露出兔颅骨。用低速球钻磨除颅骨，直至硬脑膜，制备直径为9mm的洞穿性骨缺损3个。前孔为空白组，中孔填入纯CPC(单纯磷酸钙复合骨水泥)为对照组，后孔填入CPC/杜仲叶提取物复合材料(载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥)为实验组。分层缝合骨膜、皮肤。术后常规肌注青霉素钠40万单位，共计一周。分别于4、8、12周各处死一组动物，切取标本。然后分别做放射线检查，普通组织学检查(HE染色)和扫描电镜观察。

1.X线片观察

4周：植入物与骨腔界限清楚，为密度减低的环状阴影，植入物为白色高密度影象，密度明显高于骨皮质。治疗组与对照组在X线表现上基本一致，圆形骨缺损形态无变化，未见到缺损内部或边缘有密度变化。空白组为均匀一致的圆形骨密度减低影。

8周：空白组边缘出现层状高密度影，有骨小梁结构，骨缺损面积较4周变小；对照组植入物与骨缺损边缘界限不清，骨小梁结构不清楚，CPC高密度影清晰可见；治疗组与骨缺损边缘间的阴影变窄、模糊，与周围骨组织边界不清，新生骨密度较周围正常骨质略低，骨小梁结构纤细不清，CPC高密度影清晰可见。

12周：空白组边缘出现明显层状高密度影，有骨小梁结构，骨缺损形态成椭圆形，面积较8周变小，但依然存在；对照组与骨缺损边缘界限不清且阴影变窄、模糊，骨小梁结构不清楚，CPC高密度影清晰可见，未见CPC有吸收表现；治疗组植入物与骨腔边缘间的阴影基本消失，且分界不清楚，植入物边缘可见毛糙，参见图7。

2.组织学观察

4周：治疗组植入区周围未见炎性细胞浸润，未见坏死细胞，可见纤维结缔组织生成，胶原纤维增生，成纤维细胞、成骨细胞沿材料表面生长，骨样组织出现，并可见微血管形成，材料周围可见嗜酸性多核巨细胞；对照组纤维结缔组织沿材料周围生长，充填了骨缺损区，未见炎性细胞浸润，材料周围可见微血管生长；空白组胶原纤维生长。

8周：治疗组骨缺损边缘部分出现新生的不成熟的骨组织，呈片状或岛状，可见大量骨母细胞及胶原组织沿材料周围生长，并可见嗜酸性多核巨细胞及微血管生长；对照组材料周围可见纤维结缔组织连接，微血管较少，可见少量多核巨细胞，但材料吸收不明显，新生骨样组织较少；空白组骨缺损区周边出现骨髓结构，呈网孔状，偶见骨组织生长。

12周：治疗组可见骨小梁从周边长入材料内，材料周围可见多量新生骨组织和骨母细胞、成骨细胞生长，材料边缘可见多个多核巨细胞生长，高倍镜下可见多核巨细胞吞噬材料颗粒，微血管生成，有多量片状和梁状类骨质形成，与周围正常骨质间无明显分界线，但其骨小梁结构较正常骨质致密；对照组纤维组织沿材料表面紧密生长，夹杂少量片状及梁状新骨，材料吸收不明显；空白组周边骨样组织生长，中间为纤维结缔组织，参见图8，图9，图10。

3.扫描电镜观察

对照组：

4周：材料表面可见疏松纤维组织连接，几乎无新生骨组织，间隙较明显。

8周：材料表面可见薄层不连续的新生骨样组织，大部分为疏松的纤维组织，与材料连接较4周时紧密。

12周：材料表面可见薄层不连续的新生骨小梁结构，与材料表面结合较8周时紧密，有些区域仍有纤维组织连接，未见骨组织长入材料内，参见图11。

实验组：

4周：材料与骨组织之间为疏松纤维组织连接，有薄层不连续的新生骨小梁形成，新生骨小梁与材料表面结合较为松散，界限清楚。

8周：材料表面可见薄层不连续的新生骨小梁形成，骨小梁厚度较4周稍厚，疏松纤维组织连接区域缩小，新生骨小梁与材料表面结合较4周时紧密。

12周：材料表面可见有基本连续的新生骨小梁形成，厚度较8周为厚，新生骨小梁与材料表面结合较8周更为紧密，有些区域可见骨小梁长入材料内，骨组织与材料表面界限不清，参见图12。

本实施例共选取9只新西兰兔作为实验对象，植入实验材料后，无一例出现急性排斥反应，手术切口均愈合良好，一期愈合。在实验过程中未出现慢性脓肿及窦道形成，初步显示CPC制备的方法可行，复合物未有明显的毒性反应。

材料植入区数字X线摄片、组织切片和扫描电镜观察在评价新生骨的情况上是基本符合的。本实验中两种CPC复合物周围均未见破溃液化，脱钙骨组织切片观察未出现明显的炎症反应，证明了此CPC复合物具有良好的生物相容性。4-12周连续X线及扫描电镜观察，可见人工骨与骨组织间隙逐渐模糊、缩小，直至消失，与骨组织连接逐渐紧密，阴影处密度逐渐增加。实验组8周时已与骨组织连接紧密，边缘部分隐约可见骨纹理，12周时材料边缘模糊，骨组织部分长入材料内，材料有少量降解，表面密度稍有降低；组织学检查表明随着时间的推移，胶原纤维逐渐钙化，新生骨小梁从边缘向材料内部生长，骨新生活跃，有骨岛形成，12周时达到骨性连接，并有血管化生成，材料被逐渐降解。而对照组12周时材料几乎无降解，新生骨小梁较少，仍以纤维组织为主。这显示了CPC/杜仲叶提取物复合材料具有良好的生物相容性和骨生成性，能引导和促进新生骨小梁向材料内部生长，同时加速材料的降解。

Claims

1.一种载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥，由固相部分和液相部分调和后经过水化结晶而成，其特征是：固相部分中羟基磷灰石和β-磷酸三钙的质量比为6∶4，液相部分中0.25M Na₂HPO₄与玻璃离子水门汀液剂质量比为1∶1，杜仲叶提取物在液相中的最终浓度为0.152～0.608mg/ml，该磷酸钙复合骨水泥的液/固比率为0.35ml/g，PH 6.8～8.2，溶解率为2.34％。

2.根据权利要求1所述的载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：

(1)固相部分的制备：采用将牛骨两次煅烧和加入磷酸氢二铵液的方法制备，最终粉剂为羟基磷灰石和β-磷酸三钙两个晶相，羟基磷灰石∶β-磷酸三钙的质量比为6∶4；

(2)液相部分：为0.25M Na₂HPO₄与玻璃离子水门汀液剂的混合液，质量比为1∶1；

(3)杜仲叶提取物的制备：采用“醇提水沉法”提取，其中醇浓度50％，乙醇量8倍，提取2次；

(4)载有杜仲叶提取物的磷酸钙复合骨水泥的制备：液相部分中加入由步骤(3)获得的杜仲叶提取物，使杜仲叶提取物在液相部分中的最终浓度在0.152～0.608mg/ml，然后按液/固比率为0.35ml/g加入到固相部分，充分调拌均匀，温度控制在23±1℃，调和时间60～90秒，调和物呈膏状体在模具中成形。