CN101015703B - 一种反义显像剂及其反义寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反义显像剂及其反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸，其核苷酸序列为序列表中序列1。该反义显像剂，是所述反义寡核苷酸经放射性核素标记后得到的。本发明的反义显像剂具有稳定性高、特异性强的特点，能够在活体上实现识别恶性肿瘤，通过显像及时发现肿瘤并对其精确定位，具有广阔的应用前景。

Description

一种反义显像剂及其反义寡核苷酸

技术领域

本发明涉及一种反义显像剂及其反义寡核苷酸。 

背景技术

核医学显像技术的优势，与传统的影像技术(CT、MRI、B超等)比较，在于功能性成像。它能反映脏器、组织或病变的血流、功能、代谢等多方面信息，有利于疾病的早期诊断；同时，其灵敏度高，达到pmol水平，而MRI等的灵敏度一般在μmol水平；另外，随着PET/CT的逐渐应用，功能性显像与解剖性成像的完美融合，更为疾病的诊断提供重要的手段。 

近年来，以反义显像为代表的分子核医学是在活体内以分子或生物大分子作为靶目标的分子成像技术，能从分子水平上揭示人体的生理、生化及代谢水平变化，实现了在分子水平上对人体内生理或病理过程中进行无创、实时的功能显像。 

反义显像是将放射性核素标记的人工合成的一段反义寡核苷酸引入体内后，追踪其与病变组织中过度表达的目标DNA或mRNA发生特异性结合的过程，从而达到在基因水平早期、定性诊断疾病的目的。 

研究证明，在人类基因组中几乎只有一段序列能特异地与给定的16-18个碱基的寡核苷酸互补杂交，双链中如果有一个碱基错配，其亲合力就平均下降近500倍。反义显像中所使用的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASON)只作用于特异mRNA分子，不会整合到靶细胞基因组中，所以它的安全性比较高；且反义探针自身没有抗体，分子量很小，免疫原性低。 

目前，反义显像研究尚处于实验研究阶段，涉及的靶基因位置有针对c-myc，bcl-2，k-ras等原癌基因；研究主要是集中在细胞水平上，动物实验未见有明显、好的显像效果。 

端粒是由端粒DNA和端粒结合蛋白组成，其长度随着细胞分裂的持续进行而不断缩短，当达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出，细胞将发生凋亡。与端粒合成有关的端粒酶，能够通过为细胞染色体末端结构即端粒加上必要的重复序列而使端粒维持一定的长度，不再随细胞分裂而缩短。 

研究发现，大约85％-90％恶性肿瘤细胞和永生化细胞中可以检测到高表达的端 粒酶活性，而在大多数的体细胞中则检测不到端粒酶的活性。另一方面，在某些肿瘤类型，恶变前端粒酶即已被激活，随着肿瘤的进展，端粒酶活性逐渐上升，因而端粒酶活性监测可作为早期诊断或预警的一个指标。再者，端粒酶活性也可能是肿瘤患者预后评估的良好指标，至少在部分肿瘤是这样，比如在胃癌患者，端粒酶往往与肿瘤尺寸、转移情况和患者存活时间相关，端粒酶活性高者预后不良。 

人类端粒酶主要包括三种成分，即人端粒酶RNA成分(hTR)，人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)以及端粒酶相关蛋白hTEP1(TP1/TLP1)。其中hTERT是端粒酶活性的决定因素，其上调可能是人肿瘤发生、发展的关键事件。hTR和hTERT基因的对照表达研究显示，hTR基因可在增殖力强的胎儿细胞—非永生化细胞中表达，而hTERT基因仅在肿瘤细胞—永生化细胞中表达，因此hTERT基因更显示出肿瘤特异诊断和治疗的潜在应用价值。 

目前还没有hTERT基因用于反义显像中的研究报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种反义显像剂及其反义寡核苷酸。 

本发明所提供的用于制备反义显像剂的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为序列表中序列1。反义寡核苷酸是根据人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA设计的；具有18个核苷酸，可以与人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)特异性结合，抑制端粒酶的活性。 

本发明所提供的反义显像剂，是上述反义寡核苷酸经放射性核素标记后得到的。 

所述反义寡核苷酸为全程硫代修饰的核苷酸。 

所述反义寡核苷酸的3′端还连接有一个伯胺(NH₂)。 

所述伯胺通过连接子与所述反义寡核苷酸连接，所述连接子为己基((CH₂)₆)。 

所述放射性核素可为^99mTc、¹³¹I、¹⁸F、¹¹¹In、⁶⁸Ga，¹⁸⁸Re等；以^99mTc为例，所述放射性核素^99mTc是利用螯合剂NHS-MAG₃标记到所述反义寡核苷酸上的。 

本发明的反义显像剂，是首次以一段针对hTERT mRNA的、具有18个碱基的反义序列(5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′，序列1)作为反义寡核苷酸，以放射性核素^99mTc进行标记制备的反义分子探针； 

本发明的反义显像剂，由于其反义寡核苷酸可以与人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA特异性结合的原理，可用于检测各种实体肿瘤，如乳腺癌、膀胱癌、肝细胞癌、前列腺癌、胃癌、黑色素瘤、甲状腺 癌、结直肠癌等。 

通过大量的验证该反义显像剂制备的药物在肿瘤显像中的应用效果实验表明，该反义显像剂具有稳定性高、特异性强的特点，能够在活体上，通过显像及时发现肿瘤并对其精确定位，实现识别恶性肿瘤，还具有早期性、灵敏性、定量性、无创性、安全性等特点。 

本发明的反义显像剂，根据其标记的反射性核素的不同，可达到不同的作用，实验中以^99mTc标记反义寡核苷酸为例，如应用其它放射性核素(如¹³¹I、¹⁸F、¹¹¹In、 ⁶⁸Ga等)进行标记，亦能达到特异诊断肿瘤的目的；另外，如果应用治疗性的放射性核素(如¹⁸⁸Re等)进行标记，还能达到特异治疗肿瘤的目的。 

附图说明

图1为^99mTc-MAG₃-ASON在室温下、与生理盐水孵育(室温)、与人新鲜血清孵育(37℃)24小时内于不同时相测定的放射性化学纯度曲线图 

图2为^99mTc-MAG₃-ASON的稳定性检测结果 

图3为显像剂^99mTc-MAG₃-ASON的特异性检测结果 

图4为显像剂^99mTc-MAG₃-ASON在荷瘤裸鼠体内显像照片 

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 

实施例1、显像剂^99mTc-MAG₃-hTERT ASON的制备 

1、hTERT ASON的设计 

针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA的一段起始于2331位置、含有18个碱基的序列(自GENBANK号为AF015950的第2331-2348位核苷酸)，即5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′(正义序列，hTERT SON)，设计反义寡核苷酸序列(即hTERT ASON)为5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′(序列表中序列1)。 

人工合成该hTERT ASON序列，并对hTERT ASON进行全程硫代修饰，以增加反义寡核苷酸在体内外的稳定性，不易于被内外核酸酶所降解；并在3′端连上一个伯胺(primary amine)，NH₂与骨架之间以己基(CH₂)₆作为连接子，即结构式为5′-ASON-(CH₂)₆-NH₂-3′，在下文中简称ASON。上述修饰的原理是：适用于核医学研究的放射性核素大多数是金属，而金属核素标记单链寡核苷酸最有价值的方法就是在带有伯胺的末端上衍生出反义寡核苷酸，加上一个合适的连接子，使空间障碍最小化，然后通过连接子进行放射性核素标记。本发明中在寡核苷酸的5′ 端NH₂与骨架之间以己基(CH₂)₆作为连接子，满足与螯合剂偶联的需要。同理人工合成hTERT SON(正义序列)，将hTERT SON(正义序列)进行全程硫代修饰，并在3′端连上一个伯胺(primary amine)，NH₂与骨架之间以己基(CH₂)₆作为连接子，即结构式为5′-SON-(CH₂)₆-NH₂-3′，在下文中简称SON(正义序列)。 

2、^99mTc标记ASON的制备 

利用双功能螯合剂NHS-MAG₃(巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯)进行 ^99mTc标记； 

1) NHS-MAG₃螯合反义寡核苷酸(MAG₃-ASON)的合成 

在振荡条件下，将NHS-MAG₃(溶于无水DMF，浓度为20mg/ml)溶液加入ASON溶液(溶于HEPES缓冲液(0.1M，pH8.0)，浓度为5μg/μl)中，使二者的最终摩尔比(MAG₃/ASON)为20∶1。室温下静置反应60-120min。反应产物通过Sephadex G₂₅层析(0.7×28cm)纯化，用PB缓冲液(50mM，pH7.2)洗脱，0.4ml/管收集。紫外分光光度计测定每管在260nm处的波长吸收情况(OD_260nm)。合并紫外吸收值峰管(取最高峰1-2管)，以10μg/管的量分装。冷冻干燥后，-20℃保存备用(3个月)。质谱分析MAG₃-ASON的合成结果。按照同样的方法将NHS-MAG₃ (溶于无水DMF，浓度为20mg/ml)溶液加入SON溶液(溶于HEPES缓冲液(0.1M，pH8.0)，浓度为5μg/μl)中，使二者的最终摩尔比(MAG₃/SON)为20∶1，按照MAG₃-ASON的合成和纯化的方法，反应纯化MAG₃-SON，冷冻干燥后，-20℃保存备用(3个月)。 

2)^99mTc-MAG₃-ASON(^99mTc标记反义寡核苷酸(ASON))的制备 

在上述得到的MAG₃-ASON或MAG₃-SON分别溶于NH₄OAc缓冲液(0.25M，pH5.2)，配成300-500μg/ml的MAG₃-ASON溶液或300-500μg/ml的MAG₃-SON溶液。在10μg的MAG₃-ASON溶液或10μg的MAG₃-SON溶液中分别加入50mg/ml的酒石酸钠溶液，使酒石酸钠的浓度为7μg/μl(标记时pH值为7.6)。再依次加入37-74MBq的新鲜^99mTcO₄ ^-淋洗液和3-4μl新鲜配制的1g/L的SnCl₂·2H₂O溶液。室温下静置反应30-60min，得到^99mTc-MAG₃-ASON标记液或^99mTc-MAG₃-SON标记液。 

将反应后的^99mTc-MAG₃-ASON标记液用纸层析方法测定^99mTc-MAG₃-ASON的标记率。标记率是指放射性核素被标记到待标记化合物上的量占放射性核素的总的投入量的百分比，最常用的测定分析方法之一是放射性纸层析。纸层析是以层析 纸为固定相，以适当的展开液作为流动相，当流动相随着纤维素分子上行时，待测样品(点在滤纸的下端)也随之移动。由于样品中各个组分的性质不同，在固定相上的吸附能力和在流动相中的溶解度不同，因而各个组分随流动相的移动速度也就不相同，即各个组分在固定相上的移动距离不一样，从而使样品中各个组分能有效地分开。常用比移值Rf来表示各组分移动的相对速度，即Rf＝待测组分和原点的距离(1)/流动相的前沿合原点的距离(L)。Rf在0-1之间。某一物质在同一层析系统和同一层析条件下，其Rf值总是保持不变的。 

^99mTc标记反义寡核苷酸的产物中主要含有三种，即^99mTc-MAG₃-ASON、水解锝(^99mTcO₂)以及游离锝(^99mTcO₄ ^-)，前者是所要得到的产物，而后两者是放化杂质，需要纯化去除。采用新华一号滤纸(购自北京化学试剂公司)为固定相，分别以生理盐水和丙酮为展开剂。在生理盐水展开体系中，水解锝(^99mTcO₂)停留在层析纸的原点处，而^99mTc-MAG₃-ASON以及游离锝(^99mTcO₄ ^-)上行至层析纸的前沿处。在丙酮展开体系中，水解锝(^99mTcO₂)与^99mTc-MAG₃-ASON停留在层析纸的原点处，而游离锝(^99mTcO₄ ^-)上行至层析纸的前沿处。结合两个展开体系，算出标记产物^99mTc-MAG₃-ASON的标记率。三种产物的Rf值如表1所示： 

表1.^99mTc-MAG₃-ASON、^99mTcO₄-和^99mTcO₂的Rf值 

具体方法是：在层析纸距底边2cm处用铅笔轻画出一条与底边平行的起跑线，然后将待测样品点在起跑线上，点样的直径小于0.5cm。将点过样的两张层析纸分别吊在装有展开液(丙酮或生理盐水)的层析瓶中，展开液的液面不能触到样品，大约浸到起跑线以下1cm即可，当展开液在层析纸上展开到一定距离(15cm)时，取出，晾干。然后将层析纸分别由下到上逐段(每段1cm)剪开，逐段测量层析纸的放射性，其中总的放射性核素的放射量等于各段的总和。根据其比移值Rf，分别进行各组分的放射性测量，以丙酮为展开液的层析计算出游离锝(^99mTcO₄ ^-)的标记率(游离锝(^99mTcO₄ ^-)的放射量÷总的放射性核素的放射量×100％)，以生理盐水展开液的层析计算出水解锝(^99mTcO₂)的标记率(水解锝(^99mTcO₂)的放射量÷总的放射性核素的放射量×100％)，则^99mTc-MAG₃-ASON标记率＝(1-游离锝(^99mTcO₄ ^-)标记率-水解锝(^99mTcO₂)标记率)×100％。结果表明，在室温下反应30-60min后，反应产物^99mTc-MAG₃-ASON的标记率达到76％±5％(n＝5)。 

用放射性活度仪测定^99mTc-MAG₃-ASON的活度值，从而计算其比活度，比活度＝活度值/MAG₃-ASON的质量。结果表明，在室温下反应30-60min后，反应产物^99mTc-MAG₃-ASON的比活度达到1850KBq/μg(50μCi/μg)。 

反应产物^99mTc-MAG₃-ASON标记液或^99mTc-MAG₃-SON标记液通过SephadexG₂₅层析纯化，PB缓冲液(50mM，pH7.2)洗脱，每管0.4ml收集。分别测定各收集管在260nm处的吸光度和放射性计数，收集高峰管(OD_260nm值和放射性活度值均最高的1-2管)即为标记产物^99mTc-MAG₃-ASON或^99mTc-MAG₃-SON。 

测定计算标记产物^99mTc-MAG₃-ASON的放射性化学纯度，计算方法与标记率的计算方法相同(标记率是针对在室温下反应后得到的反应产物而言；而放射性化学纯度是针对反应产物经过纯化、去除放化杂质之后的标记产物而言，二者的概念不同，但是测定、计算方式相同)，结果表明^99mTc-MAG₃-ASON的放射性化学纯度达到96％。 

实施例2、显像剂^99mTc-MAG₃-hTERT ASON的功能验证 

1、显像剂^99mTc-MAG₃-ASON的稳定性检测 

取100μl^99mTc-MAG₃-ASON分别放置在以下条件：室温下放置；溶于生理盐水，室温下孵育；溶于人新鲜血清，37℃中水孵育。在24小时内于不同时相测定 ^99mTc-MAG₃-ASON放射性化学纯度，具体方法与测定标记率一致，即纸层析方法测定，其中，以新华一号滤纸(北京化学试剂公司)为固定相，分别以生理盐水和丙酮为展开剂，按照实施例1中的步骤2中的步骤2)所述的方法测定放射性化学纯度。结果表明，各组处理24小时后，^99mTc-MAG₃-ASON放射性化学纯度均大于93％，具体数据如图1所示。 

取100μl ^99mTc-MAG₃-ASON溶于人新鲜血清在37℃中水孵育0h(对照)、1h、2h、4h或6h之后，采用酚/氯仿法分别从血清中提取出，经过75％乙醇-20℃过夜沉淀，重新溶解于无菌注射用水中，取样进行PAGE凝胶电泳检测。结果如图2所示，结果表明，在孵育不同时间时，均仅有18bp位置出现清晰的电泳条带，说明 ^99mTc-MAG₃-ASON在血清中保持完整，不被降解，具有稳定性。图2中，泳道1-5分别是人新鲜血清孵育0h(对照)、1h、2h、4h或6h的PAGE凝胶电泳检测；泳道M为分子量标准。 

2、显像剂^99mTc-MAG₃-ASON的特异性检测 

用DMEM培养液，在37℃，5％CO₂条件下培养HepG2细胞(人肝细胞癌细胞，端粒酶阳性，购自美国ATCC公司)，2-3天换液一次，4-5天传代一次，倒置显微镜下观察细胞的生存状态。 

取对数期生长的HepG2细胞进行^99mTc-MAG₃-ASON转染实验(通过脂质体介导)，以^99mTc-MAG₃-SON转染细胞(通过脂质体介导)和无任一显像剂转染的细胞(DMEM+10％FBS培养)作为对照组。具体转染实验步骤按照脂质体Lipofectamine^TM2000转染说明书(Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司)。 

转染24h后，以Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR法检测不同处理组细胞的hTERT mRNA表达情况(β-actin为内参基因)。先逆转录RNA为cDNA(具体方法按照逆转录试剂盒说明书进行，试剂盒购自BBI公司)。PCR引物分别是：hTERT，扩增产物长度为202bp，上游引物为5’-TCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’，下游引物为5’-GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA-3’；内参β-actin，扩增产物长度为540bp，上游引物为5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物为5’-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。PCR扩增的体系为：10×PCR buffer，5μl；dNTP(2mM)，5μl；上游引物(10pM)，2μl；下游引物(10pM)，2μl；Taq酶(2u/μl)，1μl；MgCl₂(25mM)，2μl；第一链cDNA，2μl；补足适量的ddH₂O(31μl)，使总体积达50μl。扩增程序为：预变性94℃，4min；34个循环，包括变性94℃(30s)，退火61℃(30s)和延伸72℃(30s)；最后延伸72℃，5min。PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图3中A)，并计算不同处理组hTERT mRNA表达量与β-actin表达量比值，制作柱形图(图3中B)。 

结果如图3中A和图3中B所示，结果表明，^99mTc-MAG₃-ASON转染组的条带密度明显降低(图3中A中泳道3)；而未转染组(图3中A中泳道1)以及转染^99mTc-MAG₃-SON组的条带(图3中A中泳道2)密度无明显差异。通过不同处理组细胞的hTERT mRNA表达量与β-actin内参基因表达量比较(柱形图如图3中B所示，也说明^99mTc-MAG₃-ASON转染组(图3中B中^99mTc-MAG₃-ASON)细胞hTERT mRNA表达量明显降低，而未转染组(图3中B中10％FBS)以及转染 ^99mTc-MAG₃-SON组的(图3中B中^99mTc-MAG₃-SON)hTERT mRNA表达量有明显差异。表明^99mTc-MAG₃-ASON确实作用于靶目标基因，能降低hTERT mRNA的表达，具有特异性。 

3、显像剂^99mTc-MAG₃-ASON在荷瘤裸鼠体内生物分布 

建立荷MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠的动物模型，具体方法为：荷MCF-7 乳腺癌肿瘤裸鼠一只(购自北京大学医学部实验动物科学部)，无菌条件下，取出肿瘤瘤块，灭菌生理盐水冲洗，切成1mm³的小瘤块，各取一块接种在BALB/c nu/nu裸鼠(购自北京大学医学部实验动物科学部)右上肢处，裸鼠在SPF环境中饲养，待肿瘤直径长至1cm，进行实验。每只MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠尾静脉注射10μCi ^99mTc-MAG₃-ASON，分别于注射后的0.5h、1h、2h、4h和6h处死。取主要脏器组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、膀胱、肌肉、骨、血液、肿瘤)，分别称重，然后放置于干燥的玻璃管中，在γ计数仪中测定每个脏器组织的放射性计数，计算每个脏器的％ID(％ID表示各脏器组织的放射性摄取的相对值，＝(脏器组织计数-本底计数)/(标准源计数-本底计数)×100％)，其中本底是指天然环境、大气中的放射性计数。标准源的制备方法是：取用于注射动物同体积的同位素样品(即^99mTc-MAG₃-ASON)，稀释100倍后，再取相同体积作为标准源。结果表明^99mTc-MAG₃-ASON主要经消化系统和泌尿系统排泄，因此腹腔脏器的放射性较大；4h之后，随着血液清除以及放射性逐渐在肿瘤部位聚集，肿瘤/肌肉的放射性比值达到8。除肝、肾、胃、肠之外，其它脏器组织(如心、脾、骨、肺、肌肉等)的放射性均较小。 

4、显像剂^99mTc-MAG₃-ASON在荷瘤裸鼠体内显像检测 

按照步骤3的方法，建立荷MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠的动物模型。每只荷MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠尾静脉注射200μCi ^99mTc-MAG₃-ASON(或 ^99mTc-MAG₃-SON(对照))，分别于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h和8h进行SPECT显像。显像参数为：矩阵256×256，放大倍数2，低能高分辨，采集10⁵计数。结果如图4所示，结果表明，在注射显像剂^99mTc-MAG₃-ASON(或^99mTc-MAG₃-SON(对照))后4h时，注射^99mTc-MAG₃-ASON(实验组)的裸鼠右上肢肿瘤部位有清晰的放射性浓聚区，而注射^99mTc-MAG₃-SON(对照组)的裸鼠右上肢肿瘤部位未有明显的放射性浓聚区。由于显像剂主要通过消化系统和泌尿系统排泄，因此在腹腔部位可见有明显的放射性浓聚区。 

按照同样的方法，对其他放射性核素标记ASON，并进行动物反以显像实验，结果表明，本发明的反义寡核苷酸应用其它放射性核素(如¹³¹I、¹⁸F、¹¹¹In、⁶⁸Ga等)进行标记，亦能达到特异诊断肿瘤的目的；另外，应用治疗性的放射性核素(如 ¹⁸⁸Re等)进行标记，还能达到特异治疗肿瘤的目的。 

序列表 

<160>1 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>1 

tagagacgtg gctcttga                                                    18 

Claims (8)

1.一种反义寡核苷酸，其核苷酸序列为序列表中序列1。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于：所述核苷酸为经全程硫代修饰的核苷酸。

3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于：反义寡核苷酸的3′端还连接有一个伯胺；所述伯胺通过连接子与所述反义寡核苷酸连接，所述连接子为己基。

4.一种反义显像剂，是权利要求3所述反义寡核苷酸经放射性核素标记后得到的。

5.根据权利要求4所述的反义显像剂，其特征在于：所述放射性核素为^99mTc、¹³¹I、¹⁸F、¹¹¹In、⁶⁸Ga或¹⁸⁸Re。

6.根据权利要求5所述的反义显像剂，其特征在于：所述放射性核素为^99mTc。

7.根据权利要求6所述的反义显像剂，其特征在于：所述放射性核素^99mTc是利用螯合剂NHS-MAG₃标记到所述反义寡核苷酸上的。

8.权利要求4-7中任一项所述的反义显像剂在制备检测和/或定位肿瘤的试剂中的应用；所述肿瘤为乳腺癌。

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