CN101005767A - 改良的蒸馏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蒸馏发酵醪的改良方法，其中在蒸馏前或蒸馏过程中添加一种或多种淀粉酶和/或蛋白酶到发酵醪中。

Description

改良的蒸馏方法

发明领域

本发明涉及蒸馏发酵醪的改良方法以及包括本发明改良的蒸馏方法在内的用于产生液体发酵产物的方法。

发明背景

当生产诸如乙醇的液体发酵产物时，常通过蒸馏从发酵醪中分离出所需液体产物。基本上，蒸馏包括挥发或蒸发发酵醪并随后冷凝挥发或汽化的物质以提供包含较高含量的所需液体发酵产物的液体产物的步骤。如果需要，可使用其它方法再蒸馏或纯化所述液体产物。例如，工业乙醇蒸馏通常在96％体积乙醇的强度(192°美国强度标准(proof)下发生。用于乙醇蒸馏的现代化蒸馏系统通常是多级、连续的、逆流、蒸汽-液体接触系统，基于物质在不同温度下汽化的事实而运转。

需要进一步改良蒸馏方法，尤其是用于乙醇生产的蒸馏方法。

附图简述

图1：葡糖利用的动力学，表明由基于糊精化的蒸馏而产生了更多的初始葡萄糖。

发明详述

本发明涉及蒸馏发酵醪以提供所需液体发酵产物的改良方法以及生产液体发酵产物，尤其是乙醇的方法，包括本发明改良的蒸馏方法。

发明人发现在蒸馏前或蒸馏中添加一种或多种淀粉酶和/或蛋白酶到发酵醪中，减少了蒸馏设备内表面上固体碳水化合物和/或蛋白质物质的累积或堆积，并因此减少了由所述固体碳水化合物和/或蛋白质物质所导致的积垢。减少的积垢(fouling)增加了可从“釜馏物”(stillage)中回收的残糖量，即发酵醪蒸馏后留下的级分，使蒸馏设备容易清洗并因此减少蒸馏的费用和/或延长蒸馏设备可以使用无需清洗的周期。上述增加的残糖量可方便地回收到发酵罐(tank)中，如通过再循环稀釜馏物(stillage)，即蒸馏后釜馏物的液体级分。在实施例1中，测试了在蒸馏前添加α-淀粉酶和蛋白酶的效果。蒸馏后持续增多的葡萄糖表明在蒸馏前添加α-淀粉酶(和蛋白酶)能糊精化残留淀粉，如图1中增加的葡萄糖水平所示。据信蒸馏塔(column)中更高的温度是本发明的一个具体体现。实施例1的结果认为在蒸馏方法中α-淀粉酶(和蛋白酶)协同作用以减少粘度。该结果也认为在蒸馏前添加的α-淀粉酶(和蛋白酶)增加了蒸馏中葡萄糖的量，可作为发酵罐进一步发酵的方法。

在本发明第一方面中，涉及一种通过在蒸馏前或蒸馏中添加一种或多种淀粉酶和/或蛋白酶到发酵醪中蒸馏发酵醪的方法。在一个实施方案中，淀粉酶和/或蛋白酶在加入蒸馏设备前可注入/加入来自发酵设备的发酵醪原料流中，所述蒸馏设备例如第一和/或后继蒸馏塔。但是，将淀粉酶和/或蛋白酶直接注入诸如第一和/或后继蒸馏塔的蒸馏设备中也在本发明的范围内。在本发明的实施方案中，在发酵填料(fill)开始和/或结束时添加α-淀粉酶和/或蛋白酶。在其它实施方案中，α-淀粉酶和/或蛋白酶在蒸馏前添加到发酵池(beerwell)或另外部件(locations)中。

发酵醪

在本发明上下文中，术语“发酵醪”意指在合适的条件下，已受一种或多种发酵生物处理的任何植物(起始)原料(plant starting material)，优选液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。在一个优选的实施方案中，发酵醪制备自干磨或湿磨得含淀粉植物原料。在一个优选的实施方案中，所述发酵醪是已在合适条件下经一种或多种发酵生物发酵的植物原料，例如块茎、根、整粒(wholegrain)，包括玉米、玉米穗、小麦、大麦、黑麦(rye)、买罗高梁(milo)和谷类，含糖原料例如糖蜜、水果原料、蔗糖、甘蔗或糖用甜菜、马铃薯。在一个优选的实施方案中，所述发酵醪是整粒(whole grains)，尤其是在合适的发酵条件下液化和/或糖化的整粒经酵母发酵的玉米。优选的酵母是酵母属(Saccharomyces)的，尤其是酿酒酵母(S.cerevisae)。

发酵生物

术语“发酵生物”指任何已知能发酵糖类或直接或间接转化诸如葡萄糖或麦芽糖的糖类为所需液体发酵产物的微生物体。考虑到的生物体的例子包括真菌生物体，例如酵母和丝状真菌。丝状真菌的具体例子包括青霉属(Penicillium sp.)菌株。优选用于乙醇生产的发酵生物是酵母。优选的酵母是面包酵母(baker’s yeast)，也称为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。市售酵母包括，不限于RED STAR/Lesaffre Ethanol Red(Red Star/Lesaffre，USA)、FALI(Fleischmann’s Yeast，USA)，SUPERSTART(Alltech)、GERT STRAND(Gert Strand AB，Sweden)和FERMIOL(DSM Specialties)。通常在实际发酵开始之前添加酵母(即在增殖期时)。酵母细胞可10⁵-10¹²的量添加，优选10⁷-10¹⁰，尤其是5×10⁷活酵母计数/毫升发酵液。在乙醇生产期间，酵母细胞计数应优选在10⁷-10¹⁰，尤其是在2×10⁸左右。更多关于使用酵母发酵的指导可见如“The alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversity Press，United Kingdom 1999)，其在此引入作为参考。

液体发酵产物

液体发酵产物可以是任何液体发酵产物。优选的产物是醇类，尤其是乙醇，如燃料或饮料乙醇。也考虑到的是诸如啤酒或酒(wine)的饮料，但同样考虑到了其他饮料。

蒸馏

术语“蒸馏”以其传统含义用于在本发明上下文中，即其中通过加热和冷却将两种或多种物质混合物分离成其所需纯度组分级分的处理。例如，通过利用其沸点将乙醇与发酵醪分离。乙醇蒸馏温度为60-100℃，优选70-90℃，尤其是在乙醇沸点78.3℃左右。乙醇蒸馏后留下的水和干物质通常称为“釜馏物”。

淀粉酶

根据本发明的方法，所述淀粉酶可以是任何淀粉酶，优选α-淀粉酶，尤其是真菌或细菌来源的。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢杆菌属(Bacilus)α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株的α-淀粉酶。其他的α-淀粉酶包括来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM9375菌株的α-淀粉酶，详述于WO 95/26397中，以及Tsukamoto等.，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，pp.25-31描述的α-淀粉酶。所述α-淀粉酶也可以是变体或杂种。α-淀粉酶变体和杂种描述于如WO 96/23874，WO 97/41213和WO 99/19467中。其他的α-淀粉酶包括来自曲霉属(Aspergillus)菌株的α-淀粉酶，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。在另一个实施方案中，所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。所述酸性α-淀粉酶可以是来自曲霉属的酸性真菌α-淀粉酶。市售酸性真菌淀粉酶是SP288(Novozymes A/S，Denmark)。术语“酸性α-淀粉酶”意指一种α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，当其在pH 3.0-7.0下、优选在3.5-6.0下或更优选在4.0-5.0下以有效量使用时具有活性。也涉及到的酸性真菌α-淀粉酶称为FUNGAMYLTM-样α-淀粉酶。在本发明内容中，术语“FUNGAMYL-样α-淀粉酶”包括具有高同一性的α-淀粉酶，即与WO 96/23874中SEQ ID No：10所示的氨基酸序列具有大于50％，优选至少55％，更优选60％，还更优选65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，还更优选97％同一性。更适宜地，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选来自曲霉属，优选是黑曲霉或米曲霉。在一个优选的实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是Swiss-prot/TeEMBL数据库中原始登记号为P56271的公告为“AMYA_ASPNG”的黑曲霉酸性α-淀粉酶。也考虑到的是与所述酸性真菌淀粉酶具有至少70％同一性、例如至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％同一性的其变体。

优选的包含α-淀粉酶的商用组合物包括DSM的MYCOLASE^TM(GistBrochades)，BAN^TM，TERMAMYL^TM SC，LIQUOZYME^TM SC，FUNGAMYL^TM，LIQUOZYME^TM X(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000，DEX-LO^TM，SPEYME^TM FRED，SPEZYME^TM FRED-L，SPEZYME^TM AA，SPEZYME^TMETHYL以及SPEZYME^TM DELTA AA，GC262，G-ZYME G997，G-ZYMEG995，(Genencor Int.，USA)，SKA 2000(Biosinteze)，ENMEX的α-淀粉酶和以商品名称SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(Novozymes A/S，Denmark)。所述淀粉酶也可以是麦芽糖α-淀粉酶。“麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能水解直链淀粉和支链淀粉生成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖α-淀粉酶在市场上可以商品名称NOVAMYL^TM从Novozymes A/S买到。US 4,598,048,4,604,355和6,162,628中描述了麦芽糖α-淀粉酶，其在此引入作为参考。更适宜地，用于粗淀粉(rawstarch)水解处理的麦芽糖α-淀粉酶，如WO 95/10627所述，其在此引入作为参考。

根据本发明所述可添加一定量的α-淀粉酶，即当加入蒸馏设备时，所测定的其在发酵醪中的浓度为0.01-1.0 AFAU/升发酵醪，优选0.02-0.2 AFAU/升发酵醪。如果通过SSF制备发酵醪，则α-淀粉酶浓度优选为0.02-0.5 AFAU/升发酵醪，与此同时，如果发酵醪来自LSF处理(即同时液化、糖化以及发酵处理或一步发酵处理)，则优选的浓度为0.2-1.0 AFAU/升发酵醪。

蛋白酶

根据本发明，所使用的蛋白酶可以是任何蛋白酶。蛋白酶是本领域众所周知的，并且指的是催化肽键切割的酶。合适的蛋白酶包括真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即具有在酸性如低于pH7的条件下水解蛋白能力的蛋白酶。合适的酸性真菌蛋白酶包括来自曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和Torulopsis的真菌蛋白酶。在一个优选的实施方案中，所述蛋白酶来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉(参见如Koaze等.，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、Aspergillus saitoi(参见如Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Hayashida等.，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO95/02044)或米曲霉；以及来自Mucorpusillus或米赫毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

所涉及到的蛋白酶，其不是酸性蛋白酶，包括市售产品ALCALASE^TM和NEUTRASE^TM(Novozymes A/S)。其他的蛋白酶包括Genencor Int，Inc.，USA的GC106和Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYM^TM 5006。

更适宜地，所述蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，如Handbook of ProteolyticEnzymes，A.J.Barrett，N.D编.Rawlings and J.F.Woessner，Academic Press，SanDiego，1998，Chapter 270所述的。天冬氨酸蛋白酶合适的例子包括，如R.M.Berka等.Gene，96，313(1990))；(R.M.Berka等.Gene，125，195-198(1993))；和Gomi等.Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)中所披露的那些，其在此引入作为参考。

根据本发明，蛋白酶可以如下量添加，即当加入蒸馏设备时，所测定的其在发酵醪中的浓度为0.01-1SAPU/升发酵醪，优选0.02-0.2SAPU/升醪液的量。

葡糖淀粉酶

根据本发明使用的葡糖淀粉酶可以来自任何合适的来源，如来自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自：曲霉属葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，例如WO 92/00381和WO 00/04136中所描述的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。

其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等.(1996)，Prot.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等.(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等.(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等.(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；以及在A435和S436位导入脯氨酸残基的(Li等.(1997)，Protein Engng.10，1199-1204。其他的葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsii葡糖淀粉酶(US 4,727,046)，Talaromyces葡糖淀粉酶，尤其是来自Talaromyces emersonii(WO 99/28448)，Talaromyces leycettanus(US再颁发专利号32,153)，Talaromyces duponti，Talaromyces thermophilus(US 4,587,215)的葡糖淀粉酶。所涉及的细菌葡糖淀粉酶包括来自的Clostridium的葡糖淀粉酶，尤其是来自C.thermoamylolyticum(EP 135,138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。

包含葡糖淀粉酶的市售组合物包括AMG 200L；AMG 300 L；SAN^TMSUPER，SAN^TM EXTRA L，SPIRIZYME^TM PLUS，SPIRIZYME^TM FUEL，SPIRIZYME^TM B4U和AMG^TM E(Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM 300(Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(DSM)；G-ZYME^TM G900，G-ZYME^TM和G990 ZR(Genencor Int.)。

在一个实施方案中，葡糖淀粉酶可以0.02-20AGU/g DS的量添加，优选0.1-10AGU/g DS，例如2AGU/g DS。

乙醇生产

在一方面，本发明涉及一种乙醇生产方法。根据本发明的乙醇生产方法，可使用包括上述植物原料在内的任何含淀粉的植物原料。但是，优选的原料是整粒。在本发明方法一个实施方案中，包括从包括稀釜馏物级分在内的釜馏物中回收残糖。在本发明方法另一个实施方案中，稀釜馏物回收到发酵罐中。

根据本发明的该方面，生产发酵产品，优选乙醇的方法包括步骤：

(a)研磨植物原料，

(b)通过酸处理或用淀粉酶处理液化研磨的植物原料，

(c)使用包含葡糖淀粉酶的酶组合物糖化液化的研磨原料，

(d)使用发酵生物发酵，和

(e)根据本发明的蒸馏方法蒸馏步骤(d)获得的发酵醪。

包含于本发明方法中的步骤的特定实施方案概述如下。但是，应当明白的是所述步骤能以不同的方式执行。

研磨

研磨(或以其它方式减小尺寸)诸如整粒的植物(起始)原料，以便打开其结构并供进一步处理使用。根据本发明优选两种处理：湿磨和干磨。优选用于乙醇生产的是干磨，在此整粒种仁被研磨并用于处理的剩余步骤中。湿磨亦可使用并能良好地分离胚和粗粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白质)，有些例外的是在可用于糖浆的平行生产中(location)。干磨和湿磨在如乙醇生产的领域中众所周知且应为本发明所考虑到。

液化或糖化

液化和/或糖化步骤可与发酵步骤同时进行或分开进行。在本发明的一个实施方案中，糖化和发酵步骤同时进行(通常称为SSF处理)。在另一个实施方案中，液化、糖化和发酵步骤同时进行(通常称为“LSF”处理或一步发酵处理)。

“液化”是一种其中研磨的(整)粒原料破碎(水解)为麦芽糖糊精(糊精)的处理。可如三步热浆液处理来进行液化。将浆液加热至60-95℃，优选80-85℃，添加酶以启动液化(稀释)。接着可在95-140℃，优选105-125℃温度下对浆液喷射蒸煮(jet-cooked)以完全胶凝浆液。在一个实施方案中，喷射蒸煮步骤可省去。然后将浆液冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化处理通常在pH4.5-6.5下进行，尤其是在pH5-6下进行。研磨和液化的整粒称为醪液。通常使用上列“淀粉酶”节中的任何一种α-淀粉酶进行液化处理。亦可添加其它的酶活性。

“糖化”是一种其中麦芽糖糊精(例如来自液化处理的产物)转化为低分子糖类DP_1-3(即碳水化合物源)的处理，所述低分子糖类DP_1-3可为诸如酵母的发酵生物所代谢。糖化处理在本领域中众所周知且通常包括使用具有葡糖淀粉酶活性的酶。或者，可以使用α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶。完全糖化处理可持续约24-约72小时，通常在约30-65℃、pH4-5下进行，一般在约pH4.5下。当时，通常更优选的是进行预糖化步骤，持续约40-90分钟，在30-65℃下进行，一般在约60℃下，接着在同时糖化和发酵处理(SSF)的发酵期间完全糖化。

适合于发酵步骤的发酵生物取决于所需发酵产品。就醇类生产、尤其是乙醇生产而言，发酵生物可以是酵母，特别是来自酵母菌(Saccharomyces spp.)的，尤其是酿酒酵母的酵母，将其添加到醪液并发酵24-96小时，例如一般35-60小时。温度在26-34℃，尤其是约32℃，pH为3-6，优选约pH4-5。

就SSF和LSF处理而论，诸如酵母的发酵生物和酶可同时或分别添加。在SSF处理中，在刚发酵前，所共有的是在超过50℃的温度下引入预糖化步骤。在同时液化-糖化-发酵(LSF)处理期间，液化、糖化和发酵都在同一处理步骤中进行，即所有用于液化、糖化和发酵的酶(或可代替的或附加的非酶制剂)在同一处理步骤中添加，更优选地在同一处理步骤中同时添加。更适宜地，使用发酵生物的最佳处理条件。对于LSF处理，最佳处理条件一般指约26℃-40℃温度，优选约30-37℃，尤其是约32℃，pH约4-约8，优选4.0-5.5，尤其是约pH5，以及处理时间约48-72小时，优选约72小时。在一个实施方案中，本发明的乙醇生产方法作为直接对粗淀粉的LSF处理来进行。“粗淀粉水解”处理(RSH)不同于常规的淀粉处理方法，因为在乙醇发酵处理中使用了未蒸煮的粗淀粉，也称为颗粒状淀粉。在此使用的术语“颗粒状淀粉”指未蒸煮的粗淀粉，即禾谷类、块茎类或谷类中所见的天然形状的淀粉。淀粉在植物细胞中形成不溶于水的微小颗粒。当置于冷水时，淀粉颗粒可吸附少量液体并溶胀。在高达约50℃-75℃的温度下，溶胀是可逆的。但是，在较高温度(蒸煮)下就开始了称为胶凝的不可逆溶胀。在一个实施方案中，温度保持低于胶凝温度。

在本发明第三方面，涉及一种乙醇生产方法，包括步骤：

(a)研磨植物原料，

(b)无需蒸煮，用包含酸性真菌淀粉酶的酶组合物糖化步骤(a)中获得研磨原料，

(c)使用发酵生物发酵，和

(d)根据把发明的蒸馏方法蒸馏步骤(c)中获得的发酵醪。

步骤(b)和(c)可顺序或同时进行。此外，可使用其它用于减小含淀粉植物原料颗粒尺寸的众所周知的技术进行研磨步骤。

研磨的植物原料可以是任何如上节“发酵醪”中所述的湿磨或干磨的植物原料。步骤(b)中使用的酶组合物可进一步包含葡糖淀粉酶。所述葡糖淀粉酶可以是任何葡糖淀粉酶。优选的是在“葡糖淀粉酶”节中描述如下的葡糖淀粉酶。更适宜地，葡糖淀粉酶来自曲霉属(Asperigillus)菌株，尤其是黑曲霉(Asperigillus niger)或米曲霉(Asperigillus oryzae)，或Talaromyces菌株，尤其是T.emersonii。步骤(b)中使用的酸性真菌淀粉酶可以是任何酸性真菌α-淀粉酶。优选的是来自曲霉属菌株，尤其是黑曲霉或米曲霉的酸性真菌α-淀粉酶。在一个实施方案中，糖化和发酵同时进行(SSF)。优选先预糖化步骤继之以发酵和糖化(SSF)。可使用能发酵糖类为乙醇的生物体进行发酵。这样的生物体描述于上节“发酵生物”中。优选的发酵生物是酵母；尤其是来自酵母菌的酵母，特别是酿酒酵母。

在一个实施方案中，生产乙醇的方法包括步骤：

(a)研磨植物原料，

(b)使用发酵生物液化、糖化和发酵研磨的植物原料，和

(c)根据本发明的蒸馏方法蒸馏步骤(c)中获得发酵和糖化的原料。

在一个优选的实施方案中，进行LSF步骤(b)，无需蒸煮(未胶凝的淀粉)。在步骤(b)中的LSF期间，存在酸性α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。处理条件和酶的详细资料见上。

本发明在此描述的和要求保护的并不限于在此披露的特定实施方案的范围，因为这些实施方案旨在举例说明本发明的一些方面。任何等价的实施方案规定为在本发明的范围内。实际上，除在此显示和描述的那些外，根据前述内容本发明的各种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这样的修饰也旨在落入附加权利要求的范围中。要有冲突，以包括定义在内的本发明内容为准。

在此引用的各种参考文献，其全文公开内容引入作为参考。通过下列实施例进一步描述了本发明，不应把其理解为对本发明范围的限制。

材料和方法

测定酸淀粉分解活性(FAU)

一真菌α-淀粉酶单位(1 FAU)规定为在测定α-淀粉酶的Novozymes标准方法下每小时分解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6，Batch 9947275)的酶量，所述方法基于如下标准条件：

底物.......     可溶性淀粉

温度....        37℃

pH..........    4.7

反应时间...     7-20分钟

Novozymes方法的详细描述函索即寄。

测定酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

按AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)计量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准进行测定。

使用的标准是AMG 300L(野生型黑曲霉G1 AMG，售自Novozymes A/S，Denmark)。在室温下贮藏3周后，该AMG中的中性α-淀粉酶从大约1FAU/mL下降到低于0.05FAU/mL。

根据AF 9 1/3(用于真菌α-淀粉酶测定的Novo法)测定该AMG标准中的酸性α-淀粉酶活性。在该方法中，1AFAU规定为在标准条件下每小时分解5.260mg淀粉干物质的酶量。

碘与淀粉形成蓝色络合物，但不与其降解产物形成蓝色络合物。因此，颜色强度与淀粉浓度成正比。在特定分析条件下使用作为淀粉浓度减少的逆比色法测定淀粉酶活性。

α-淀粉酶

淀粉+碘→糊精+寡糖

40℃，pH2.5

蓝/紫罗兰t＝23秒.脱色

标准条件/反应条件：(每分钟)

底物：    淀粉，约0.17g/L

缓冲液：  柠檬酸盐，约0.03M

碘(I₂)：  0.03g/L

CaCl₂：   1.85mM

pH：      2.50±0.05

温育温度：   40℃

反应时间：   23秒

波长：       λ＝590nm

酶浓度：     0.025AFAU/mL

酶工作范围： 0.01-0.04AFAU/mL

更多细节可见EB-SM-0259.02/01，函索Novozymes即寄，并在此引入作为参考。

葡糖淀粉酶活性(AGI)

葡糖淀粉酶(相当于淀粉葡萄糖苷酶)转化淀粉为葡萄糖。在此通过用于活性测定的葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的量。该方法描述于“Approvedmethods of the American Association of Cereal Chemists”.Vol.1-2 AACC.American Association of Cereal Chemists，(2000)；ISBN：1-891127-12-8中的76-11节Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucosewith Glucose Oxidase。

一葡糖淀粉酶单位(AGI)是在所述方法的标准条件下每分钟形成1微摩葡萄糖的酶量。

标准条件/反应条件：

底物：      可溶性淀粉

            浓度约16g干物质/L.

缓冲液：    醋酸盐，约0.04M，pH＝4.3

pH：        4.3

温育温度：  60℃

反应时间：  15分钟

终止反应：  NaOH到浓度约0.2g/L(pH～9)

酶浓度：    0.15-0.55AAU/mL.

所述淀粉应当是Lintner淀粉，其是一种在实验室中用作为比色指示剂的低稠性(thin-boiling)淀粉。通过稀盐酸处理天然淀粉使得其保留与碘反应形成蓝色能力而获得Lintner淀粉。

酸性α-淀粉酶单位(AAU)

可按AAU(酸性α-淀粉酶单位)计量酸性α-淀粉酶活性，其是一种绝对法。一酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准条件下每小时转化1g淀粉(100％干物质)为在与和一颜色基准相等的已知浓度的碘溶液反应后在620nm处具有透射的产物的酶的量。

标准条件/反应条件：

底物：       可溶性淀粉，浓度约20g DS/L

缓冲液：     柠檬酸盐，约0.13M，pH＝4.2

碘溶液：     40.176g碘化钾+0.088g碘/L

自来水       15°-20°dH(德国硬度)

pH：         4.2

温育温度：   30℃

反应时间：   11分钟

波长：       620nm

酶浓度：     0.13-0.19AAU/mL

酶工作范围： 0.13-0.19AAU/mL

所述淀粉应当是Lintner淀粉，其是一种在实验室中用作为比色指示剂的低稠性淀粉。通过稀盐酸处理天然淀粉使得其保留与碘反应形成蓝色能力而获得Lintner淀粉。更多细节可见 EP0140410B2，其公开内容在此引入作为参考。

测定α-淀粉酶活性(KNU)

1.Phadebas测定法

通过使用PHADEBAS片作为底物的方法测定α-淀粉酶活性。Phadebas片(PHADEBAS淀粉酶化验剂，Pharmacia Diagnostic提供)含有交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，已与牛血清白蛋白及缓冲物质混合并压制成片。

在每次测定中，将一片悬浮在含5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl₂，用NaOH调节pH到所需值)的试管中。在水浴中于所需温度下进行测试。要被测试的α-淀粉酶在xml50mM Britton-Robinson缓冲液中稀释。添加1ml该α-淀粉酶溶液到5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。淀粉为α-淀粉酶所水解，获得了溶性蓝片段。用分光光度计在620nm处测定所生成的蓝色溶液的吸光度，即为α-淀粉酶活性的函数。

重要的是在10或15分钟温育(测试时间)后所测定的620nm吸光度是在620nm处0.2-2.0吸光度单位范围之内。在该吸光度范围内，活性和吸光度之间呈线性(Lambert-Beer定律)。因此，必须调节酶的稀释度以符合该标准。在特定组条件(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg给定的α-淀粉酶将水解一定量的底物并产生蓝色。在620nm处测定颜色强度。在给定组条件下，所测定的吸光度与所述α-淀粉酶的比活性(活性/毫克纯α-淀粉酶蛋白)成正比。

2.备选方法

通过使用PNP-G7底物的方法测定α-淀粉酶活性。PNP-G7是对硝基苯基-α，D-麦芽糖庚糖苷(maltoheptaoside)的缩写，是一种能为内淀粉酶所切割的封闭(blocked)寡糖。裂解后，试剂盒内的α-葡糖苷酶消化底物释放游离的PNP分子，其具有黄颜色并因此能利用可见分光光度计在λ＝405nm(400-420nm)下测定。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒是Boehringer-Mannheim制造的(产品目录号1054635)。

将一瓶底物(BM 1442309)添加到5ml缓冲液(BM1442309)中以制备底物。将一瓶α-葡糖苷酶(BM 1462309)添加到45ml缓冲液(BM1442309)中以制备α-葡糖苷酶。通过将5mlα-葡糖苷酶溶液与0.5ml底物混合制备工作溶液。

通过将20μl酶溶液转移到96孔微量滴定板中并在25℃下温育进行该测定。添加200μl 25℃的工作溶液。混合溶液并预温育1分钟，在3分钟时间内每15秒测定一次OD 405nm吸光度。

在给定组条件下，随时间变化的吸收曲线的斜率与所述α-淀粉酶的比活性(活性/毫克酶)成正比。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)规定为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：醋酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下，每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

可以使用自动分析系统。将变旋酶添加到葡糖脱氢酶试剂中以便将所有存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡糖脱氢酶与β-D-葡萄糖起特异性反应，形成NADH，使用光度计在340nm处测定NADH，作为原始葡萄糖浓度的度量。

AMG温育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	醋酸盐(acetate)0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

显色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

函索Novozymes A/S，Denmark即寄更详细描述该分析方法的折叠印刷品(EB-SM-0131.02/01)，该印刷品在此引入作为参考。

酸性蛋白酶(SAPU)分光光度测定

该测定基于在pH3.0和37℃下，30分钟的Hammersten酪蛋白底物蛋白水解。用三氯乙酸沉淀不水解的底物并通过过滤除去。然后通过分光光度法IV测定溶解的酪蛋白。一分光光度(Specirophotomevic)酸性蛋白酶单位(SAPU)是在测定条件下每分钟释放1微摩尔酪氨酸的活性。

专用设备

恒温浴(37+/-0.1℃)

紫外分光光度计(275nm)

pH计

秒表(精度(Graduated)为1/5秒)

磁力搅拌器

试剂和溶液

甘氨酸-盐酸缓冲液(0.05M)：在大约800ml的蒸馏水中溶解3.75g甘氨酸。使用用标准校验了的pH计，添加1N盐酸直至该缓冲液pH到3.0。定量转移到1升容量瓶中并用蒸馏水稀释。

盐酸溶液(1N)：移取86.5ml浓盐酸到含有大约800ml蒸馏水的1升容量瓶中。用蒸馏水稀释到容量(volume)。

盐酸溶液(0.1N)：移取100ml盐酸溶液(1N)到含有大约800ml蒸馏水的1升容量瓶中。用蒸馏水稀释到容量。

三氯乙酸溶液(1.8％w/v)：在大约800ml蒸馏水中溶解18.0g三氯乙酸和11.45g无水醋酸钠。添加21.0ml冰醋酸。定量转移到1升容量瓶中并添加蒸馏水到容量。每周制备新溶液一次。

酪蛋白：使用Hammersten酪蛋白，Nutritional Biochemicals Corp-，21010Miles Avenue，Cleveland，Ohio，44128或其等价物。

酪蛋白底物(0.7％w/v)：在连续搅动下，移取8ml 1N盐酸到大约500ml蒸馏水中。分散7.0g(不含水的(moisture-free-basis))Hammersten酪蛋白到该溶液中。在沸水浴中加热30分钟，偶尔搅拌一下。将溶液冷却至室温。溶解3.75g甘氨酸到溶液中。使用用标准校验了的pH计，通过添加盐酸溶液(0.1N)调节溶液pH到3.0。定量转移到1升容量瓶中并用蒸馏水稀释到容量。

酶制剂

在0.05M甘氨酸-HCl缓冲液中制备酶溶液，使得2ml的最终稀释液给出0.200-0.500的δA。称重酶，定量转移到玻璃研钵中，并与0.05M甘氨酸-HCl缓冲液一同研磨。定量转移到合适的容量瓶中并用0.5M甘氨酸-HCl缓冲液稀释到容量。

分析程序

1)移取10ml酪蛋白底物到一系列的25×150mm试管中。为每个样品提供至少两个试管，一个用于每种酶空白，另一个用于底物空白。塞住(stopper)试管并在的37+/-0.1℃水浴中平衡15分钟。

2)在零时间，快速移取2ml合适的酶稀释液到平衡的底物中。在零时间启动秒表。漩涡混合，塞上塞子，并换水浴中的试管。重要的是所有测试的试管在温育期间要塞上塞子。

3)在精确的30分钟温育后，添加10ml TCA溶液到每个试管中以停止反应。漩涡混合。为安全起见，使用滴定管或移液装置。

4)制备含有10ml酪蛋白底物、2ml 0.05M甘氨酸-HCl缓冲液和10mlTCA溶液的底物空白。

5)依序制备含有10ml酪蛋白底物、10ml TCA溶液和2ml合适的酶稀释液的酶空白。

6)将所有试管放回到37℃水浴中温育30分钟，让沉淀的蛋白完全凝结。转移试管到冰浴中温育5分钟。

7)用Whatman No.42滤纸过滤每种样品。滤液应完全澄清。

8)对底物空白测定每种滤液275nm处的吸光度。通过减去各自酶空白的吸光度校正各自的吸光度。

计算

一分光光度酸性蛋白酶单位(SAPU)是在测定条件下每分钟释放1微摩尔酪氨酸的活性。

$\mathrm{SAPU}/g=\frac{(\mathrm{\δA}*l)22}{S\×30\×W}$

这里：

δA＝校正的酶温育滤液在275nm处的吸光度，

L＝标准曲线的截距(intercept)，

22＝温育混合物终体积(in mi.)(ml)，

S＝标准曲线的斜率，

30＝温育时间(分钟)，

W＝添加到2ml等分量温育混合物中的酶重量(克)。

标准曲线测定

通过在60ml盐酸溶液(0.1N)中溶解181.2mg L-酪氨酸制备酪氨酸储液。定量转移到1升容量瓶中并添加蒸馏水到容量。从酪氨酸储液制备稀释液如下：

稀释     微摩尔酪氨酸/毫升

5/50     .10

10/50    .20

15/50    .30

20/50    .40

25/50    .50

对蒸馏水空白测定每种稀释液275nm处的吸光度。作吸光度对每毫升微摩尔酪氨酸的图。应得到一条直线。测定供计算使用的斜率和截距。应获得接近于1.38的值。可通过最小二乘法计算斜率和截距如下：

这里：

n＝标准曲线上点数(point)，

M＝标准曲线上每点的每毫升微摩尔酪氨酸

A＝样品吸光度。

取样计算

用0.05M甘氨酸-盐酸缓冲液(155.6mg.1000mls.)稀释未知的真菌蛋白酶到1升。在零时间，移取2ml到10ml平衡的底物中。在测定条件下，未知真菌蛋白酶的δA为0.355。标准曲线的斜率为1.39，截距为0.001。

$\mathrm{SAPU}/g.=\frac{(0.355-\mathrm{0,001})\left(22\right)}{\left(1.39\right)\left(30\right)\left(0.1113112\right)}=600$

参考文献

Weast，Robert C.，Ph.D(1959).C.R.C.Standard Mathematical Tables，Twelfth编.The Chemical Rubber Co，Cleveland，Ohio。

实施例1

在蒸馏前添加淀粉酶和蛋白酶

该测试的目的在于评估在蒸馏前添加α-淀粉酶和蛋白酶的效果。

在发酵填料开始时，将18-36升市售α-淀粉酶(LIQUOZYME^TM SC 120AFAU(KNU)/ml，Novozymes，Denmark))添加到80,000加仑(300,000升)的含有研磨的未糊化玉米淀粉、葡糖淀粉酶(SPIRIZYME^TM PLUS，Novozymes，Denmark)和增殖的酵母(FALI^TM yeast，Fleischmann’s Yeast，USA)的发酵醪中。发酵醪进料速度为102-105加仑/分钟(386-397升/分钟)(醪液填料速度为105-110加仑/分钟(397-416升/分钟))。按照惯例，在发酵填料前开始添加α-淀粉酶。温度条件包括96-98(36-37℃)，pH4.2-4.8。当发酵完成时，pH减少到4.0-4.4。

在整个蒸馏过程中pH保持在4.0-4.4，直到再次发酵填料之前才调节pH。发酵55-60小时后(在发酵罐中停留时间)，将发酵混合物分批填加到发酵池中并冷却到82-85(28-29℃)。蒸馏前在186-188.5(86-87℃)温度的反萃取塔(striper column)中将温度增加到107-142(42-61℃)。在反萃取塔中将乙醇与混合物分离。通过离心全釜馏物组分并进一步离心稀釜馏物组分，进一步分离混合物的固体和液体部分。将稀釜馏物组分与预混合水混合。在浆液槽中冷却到102(39℃)并注入发酵罐中，因此完成循环。此外，在发酵填料开始时，随同α-淀粉酶添加12升市售蛋白酶(GC106，Genencor Int.Inc.，USA))到80,000加仑(300,000升)发酵醪中。

图1显示了在两轮(第1轮和第2轮)发酵蒸馏后葡萄糖的百分数。蒸馏后持续增多的葡萄糖表明在蒸馏前添加α-淀粉酶(和蛋白酶)能糊精化残糖，如图1中增加的葡萄糖水平所示。

Claims (46)

1.一种蒸馏发酵醪的方法，其中在蒸馏前或蒸馏过程中添加一种或多种淀粉酶和/或蛋白酶到发酵醪中。

2.权利要求1的方法，其中所述蒸馏在60-100℃，优选70-90℃温度下进行。

3.权利要求1或2的方法，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶，尤其是芽孢杆菌属α-淀粉酶。

4.权利要求1或2的方法，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶，优选真菌α-淀粉酶，尤其是曲霉属α-淀粉酶，例如黑曲霉或米曲霉。

5.权利要求3或4的方法，其中所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述α-淀粉酶加入蒸馏设备的浓度为0.01-1 AFAU/升发酵醪，优选为0.02-0.2 AFAU/升发酵醪。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述蛋白酶是细菌或真菌蛋白酶，优选酸性蛋白酶，尤其是芽孢杆菌属或曲霉属蛋白酶。

8.权利要求7的方法，其中所述蛋白酶来自黑曲霉。

9.权利要求8的方法，其中所述蛋白酶加入蒸馏设备的浓度为0.01-1SAPU/升发酵醪，优选为0.02-0.2 SAPU/升发酵醪。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述蒸馏在蒸馏塔中进行。

11.权利要求1-10任一项的方法，其中将所述淀粉酶和/或蛋白酶在加入蒸馏设备前添加到来自发酵设备的原料流中或直接输入蒸馏塔。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述发酵醪是发酵的干磨植物原料。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述发酵醪是已进行液化和/或糖化，优选SSF或LSF过程的发酵的整粒。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述发酵醪是发酵的湿磨植物原料。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述发酵醪是发酵的干磨或湿磨植物原料，所述植物原料在酸性α-淀粉酶活性、麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性存在下，在发酵前在低于初始胶凝温度的0℃-20℃温度下保存5分钟-12小时。

16.权利要求1-5任一项的方法，其中所述发酵醪是发酵的干磨或湿磨植物原料，其在发酵前用包含酸性真菌淀粉酶的酶组合物进行糖化处理，无需蒸煮。

17.权利要求15或16的方法，其中所述酸性α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，优选来自曲霉属菌株，尤其是黑曲霉或米曲霉。

18.权利要求15或16的方法，其中所述麦芽糖生成酶活性是来自芽孢杆菌属菌株的细菌产麦芽糖α-淀粉酶。

19.权利要求1-18任一项的方法，其中使用能发酵糖类或转化糖类的生物进行发酵，所述糖类例如葡萄糖和/或麦芽糖。

20.权利要求15的方法，其中所述发酵生物酵母，尤其是酵母属，尤其是酿酒酵母。

21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述发酵醪包含乙醇。

22.一种生产乙醇的方法，包括下列步骤：

(a)研磨植物原料，

(b)通过酸处理或用淀粉酶处理液化研磨的植物原料，

(c)使用葡糖淀粉酶糖化，

(d)使用发酵生物发酵，和

(e)蒸馏如权利要求1-21中所定义的步骤(d)中获得的发酵醪。

23.权利要求22的方法，其中所述液化步骤包括下列子步骤：

b1)加热浆液至60-95℃，优选80-85℃，并添加至少一种α-淀粉酶；

b2)在95-140℃下，优选在105-125℃下对浆液喷射蒸煮以完全胶凝浆液；

b3)将浆液冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶以完成水解。

24.权利要求23的方法，其中所述研磨的植物原料包括湿磨或干磨的整粒。

25.权利要求22-24任一项的方法，其中在酸性真菌α-淀粉酶存在下进行步骤(b)。

26.权利要求22-25任一项的方法，其中步骤(c)中所用的葡糖淀粉酶来自曲霉属菌株，尤其是黑曲霉或米曲霉，或Talaromyces属菌株，优选埃Talaromyces emersonii，或Athelia菌株，优选Athelia rolfsii。

27.权利要求22-26任一项的方法，其中步骤(b)中的液化处理在pH4.5-6.5，尤其是在pH5-6下进行。

28.权利要求22-27任一项的方法，其中糖化和发酵步骤同时进行(SSF)。

29.权利要求28的方法，其中步骤(c)和(d)作为预糖化继之以同时发酵和糖化(SSF)来进行。

30.权利要求22-27任一项的方法，其中液化、糖化和发酵步骤同时进行(LSF)。

31.权利要求22-30任一项的方法，其中步骤(b)中用于液化的淀粉酶是α-淀粉酶，优选芽孢杆菌属或曲霉属α-淀粉酶。

32.权利要求22-31任一项的方法，其中使用能发酵糖类为乙醇的生物体进行发酵。

33.权利要求22-32任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母，优选来自酵母菌的酵母，尤其是酿酒酵母。

34.一种生产乙醇的方法，包括步骤：

(a)研磨植物原料，

(b)无需蒸煮，使用包含酸性真菌淀粉酶的酶组合物糖化步骤(a)中获得的研磨原料，

(c)使用发酵生物发酵，和

(d)蒸馏如权利要求1-21所定义的步骤(c)中获得的发酵醪。

35.权利要求34的方法，其中所述研磨的植物原料是湿磨或干磨的整粒。

36.权利要求33(34)或34的方法，其中步骤(b)中的组合物进一步包含葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属菌株，尤其是黑曲霉或米曲霉、或Talaromyces属菌株，尤其是Talaromyces emersonii。

37.权利要求34-36任一项的方法，其中糖化和发酵步骤同时进行(SSF)。

38.权利要求34的方法，其中步骤(c)和(d)作为预糖化继之以同时发酵和糖化来进行。

39.权利要求34-38任一项的方法，其中液化、糖化和发酵步骤同时进行(LSF)。

40.权利要求34-39任一项的方法，其中步骤(b)中使用的酸性真菌淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其优选来自曲霉属，尤其是来自黑曲霉或米曲霉菌株。

41.权利要求34-40任一项的方法，其中使用能将糖类发酵为乙醇的生物体进行发酵。

42.权利要求34-42任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母，优选来自酵母属菌的酵母，尤其是酿酒酵母。

43.权利要求39的方法，包括步骤：

(a)研磨植物原料，

(b)使用发酵生物液化、糖化和发酵研磨的植物原料，和

(d)根据权利要求1-21任一项的方法蒸馏步骤(c)中获得发酵和糖化的原料。

44.权利要求43的方法，其中所进行的LSF步骤(b)无需蒸煮。

45.权利要求43或44的方法，其中步骤(b)的LSF过程中存在酸性α-淀粉酶。

46.权利要求43的方法，其中所述研磨的植物原料是湿磨或干磨的整粒。

47.权利要求43-46任一项的方法，其中步骤(b)的LSF过程中存在葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属菌株，尤其是黑曲霉或米曲霉，或Talaromyces属菌株，尤其是talaromyces emersonii的葡糖淀粉酶。

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