CN101002949A - HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生命科学领域、及医药领域。证实:HIV包膜蛋白gp120、gp160抗原疫苗的临床人体试验,不能证实可以预防HIV感染人类,最重要的因素之一是:HIV包膜蛋白gp120、gp160是人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发人体免疫耐受机制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制。可以被应用研制筛选抗HIV治疗疫苗、可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,提供直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及了一种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法。它涉及生命科学领域、及医药领域。能够揭示HIV感染人体复制,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效对抗人体免疫抑制压力。证实:迄今HIV疫苗科学研究设计、研制的,所有各种不同的HIV包膜蛋白gp160、gp120抗原疫苗的临床人体试验,不能证实可以预防HIV感染人类,最重要的因素之一是:HIV包膜蛋白gp120或gp160是人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制。可以被应用做寻找HIV包膜蛋白触发人体免疫耐受机制的解决方法,研制筛选抗HIV治疗疫苗、可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,提供直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。
背景技术
自1983年人免疫缺陷病毒——艾滋病被发现以来,人类在HIV科学研究领域,HIV病毒生物学基础科学研究、HIV病毒感染传播流行病学科学研究、HIV病毒传染病综合防治与临床治疗医药科学研究等方面,取得了众多举世瞩目重大科学研究成果。但是,客观的讲,人类在根治、预防艾滋病科学研究方面,至今没有取得解决根本问题的科学研究突破。没有科学研究迹象表明:抗HIV治疗可以彻底清除患者机体病毒、治愈HIV感染者;HIV疫苗可能会有效预防HIV感染。关于是先加强基础研究,搞清HIV致病机制和免疫机制,还是尽快开始人体试验,在试验中积累知识,以便改进疫苗设计和工艺技术,对此各国专家的意见趋于一致,错误的主张采取后者。
HIV科学界,把不能根治、预防艾滋病AIDS,归咎于HIV复制速度快、HIV基因具有高度变异性:病毒的产量平均约为1010/天,HIV在体内的平均产生时间约为2.6天;体外测定每6000个核甘酸在逆转录过程中有一次错误的概率,体内测试显示每轮复制过程可能产生一次突变。可产生大量具有各种不同基因变异型或表型的毒株,应对药物抑制压力、机体免疫抑制压力,不断衍生出新的耐药毒株、免疫逃逸毒株优势病毒种株。病毒通过特异性突变所获得的选择性优点将对病毒基因组产生有力的影响。HIV感染人体免疫应答,出现高滴度的HIV的特有的抗体是HIV原发性免疫反应的特征,它出现在病毒血症的高峰或稍晚时间。这最初的抗体反应不包括HIVgp120中和抗体。抗逆转录病毒药和IL-2治疗虽然可以使CD4+T细胞计数增加,却未能使解体Vβ库恢复。应用IL-2治疗期间CD4+T细胞的增加来源于CD4+T细胞库在胸腺外的扩增,因为T细胞Vβ库的PCR分析证明缺失的克隆不能再生。用IL-2和抗逆转录病毒药试图重建T细胞Vβ库的失败,暗示免疫系统的损伤可能存在阈值,若超过该阈值,免疫功能便不能重建。间接感染或各种疫苗免疫的HIV感染个体都有血浆病毒血症暂时增加,并且与诱导产生免疫活性程度相关;类似的发现也可见于SIV感染的恒河猴中。上述众多不可被一一综述HIV科学研究发现,显示:HIV感染人体复制,是在最初期、还没有激发机体免疫应答之前,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体抗原,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV-1感染者人体免疫耐受机制,导致感染人体免疫系统针对HIV感染复制体液免疫应答反应延迟,不能首先产生针对gp120的保护性中和抗体、抑制gp120与CD4+细胞特异受体特异结合触发的免疫耐受机制;可以在人体免疫应答产生针对gp120的保护性中和抗体之前,还没有被细胞免疫CTL有效抑制时、HIV过度复制达到病毒血症峰值,进一步触发细胞免疫耐受机制-细胞免疫损伤机制;使HIV在感染者体内复制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制,能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效对抗机体免疫抑制压力。迄今HIV疫苗科学研究设计、研制的,所有各种不同的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗的各种临床人体试验,不能证实可以预防HIV感染人类,最重要的因素之一是:gp120或gp160是人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制。
现代疫苗科学研究设计、研制的,HAV甲肝灭活疫苗仅需要100ng~500ng接种一次,即可使90%以上接种人体产生保护性中和抗体;HBV乙肝重组DNA蛋白HBs抗原疫苗MSD疫苗、COH疫苗,仅需要5μg~20μg接种三次,即可使90%以上接种人体产生保护性抗-HBs中和抗体。现代疫苗科学研究设计、研制的,HIV重组DNA包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗,多数受试者在用300μg HIV-IIIB gp120、300μg或600μg HIV-MN gp120接种三次,仅可产生针对V3环的抗体、针对实验室同源毒株的中和抗体,不能中和野生HIV毒株、预防野生HIV毒株感染人类。例如,HIV包膜蛋白gp160抗原疫苗,通常需用较高剂量接种4次以上才能使少数受试者产生较低滴度的同源中和抗体;Vaxgene公司的HIV包膜蛋白gp120抗原疫苗在北美和泰国进行大规模的III临床人体试验,公布的北美地区的试验结果,其中接种疫苗人群HIV感染率为5.7%,未接种疫苗人群HIV感染率为5.8%。临床人体试验结果表明gp120抗原疫苗不能有效预防HIV感染。迄今已经有上百次各种不同HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗临床人体实验失败,不能一一综述。HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗接种临床人体,表现出体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应,与HIV感染人体复制最初表现体液免疫应答延迟,不能首先产生针对gp120的保护性中和抗体,弱免疫原体液免疫应答反应极为相似,可以为HIV感染人体,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体抗原,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效对抗人体免疫抑制压力,提供HIV疫苗相关临床人体实验科学依据。
已经被众多相关器官移植免疫耐受动物模型实验结果证实:给动物注射CD4受体的异种特异配体抗原,动物CD4受体的异种特异配体抗原与动物CD4+细胞特异受体特异结合,触发动物针对CD4异种特异配体抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制;表现出针对动物CD4异种特异配体抗原的体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应。与现代HIV疫苗科学研究实施过的,所有各种不同的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗——人CD4受体的异种特异配体抗原接种临床人体实验,表现出针对人CD4受体的异种特异配体抗原——HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应极为相似;与HIV感染人体复制最初表现体液免疫应答延迟,不能首先产生针对HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原的保护性中和抗体,弱免疫原体液免疫应答反应极为相似。2.实验证实,改变动物CD4受体的异种特异配体分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对动物CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与动物的CD4受体结合,而不能触发动物针对失去CD4异种特异配体生物性质的异种抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制。
发明者认为:1.改变HIV包膜蛋白gp120或gp160——人CD4异种特异配体分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合,而不能触发人体针对失去CD4异种特异配体生物性质的异种抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制。2.现代HIV疫苗科学研究,设计研制HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗,将有可能在研制筛选抗HIV治疗疫苗、预防HIV感染人类的HIV疫苗科学研究方面,取得科学创新突破。
发明内容
本发明公开了一种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法。1.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体IgC2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原,模拟HIV-Env基因DNA重组包膜蛋白gp120或gp160——人CD4受体的异种特异配体抗原,多次免疫注射CBA/Ca小鼠;采血检测免疫小鼠针对大鼠IgC2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。2.用大鼠抗人(或抗兔)的单克隆抗体IgC2a/b——不能与小鼠CD4受体结合的异种抗原,模拟HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原,多次免疫注射CBA/Ca小鼠;采血检测免疫小鼠针对大鼠IgC2a/b——异种抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。证实:1.改变HIV包膜蛋白gp120或gp160——人CD4异种特异配体分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合,而不能触发人体针对失去CD4异种特异配体生物性质的异种抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制;提供直接动物模型实验科学依据。2.现代HIV疫苗科学研究,设计研制HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗,将有可能在研制筛选抗HIV治疗疫苗、预防HIV感染人类的HIV疫苗科学研究方面,取得科学创新突破。3.提供可实施的小鼠、恒河猴、大猩猩与临床人体相关HIV疫苗实验科学研究方案。
本发明的目的是,提供一种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法。设计、实施HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验,揭示HIV感染人体复制,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效对抗人体免疫抑制压力。证实:迄今HIV疫苗科学研究设计、研制的,所有各种不同的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗的临床人体试验,不能证实可以预防HIV感染人类,最重要的因素之一是:HIV包膜蛋白gp120或gp160是人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制。可以被应用做寻找HIV包膜蛋白触发人体免疫耐受机制的解决方法,研制筛选抗HIV治疗疫苗、可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,提供直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。
具体实施方式
为达到上述目的,实施本发明采用的方案:
HIV-Env基因DNA
变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法
1.实验动物与临床试验人体
1.1.实验动物:4~6周龄无菌动物,CBA/Ca小鼠,C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠,Hu-PBL-SCID小鼠;非人类的灵长类动物,恒河猴,大猩猩。
1.2.临床试验人体:未感染HIV-I的正常健康人,感染HIV-I急性期患者。
2.实验生物材料
2.1.大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体IgC2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原,模拟HIV-Env基因DNA重组包膜蛋白gp120或gp160——人CD4受体的异种特异配体抗原;大鼠抗人或抗兔等其它动物的单克隆抗体IgC2a/b——不能与小鼠CD4受体结合的异种抗原,模拟HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原。抗小鼠CD4受体的单克隆抗体,抗人或抗兔等其它动物的单克隆抗体,可以应用其它动物如兔、羊、人的同种Ig型的单克隆抗体。
2.2.感染体外培养CD4+细胞的HIV-I病毒:由取自HIV-I感染者最初急性期的血浆、液氮低温冷冻保存备用;由取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC细胞与CD4+细胞共同培养获得;实验室HIV-I毒株。猴SIV毒株;将人HIV膜蛋白替换猴SIV膜蛋白所构成的镶嵌病毒-SHIV杂合毒株。
2.3.体外培养CD4+细胞:取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC细胞;取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC细胞;传代人CD4+细胞系,例如人T淋巴细胞系MT4。
2.3.人淋巴细胞:取自HIV-I感染者最初急性期,经非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗,经HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原抗HIV疫苗多次免疫注射治疗后的,人淋巴细胞。
2.4.C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠血清:正常小鼠血清;小鼠经HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原多次免疫注射,含抗gp120抗体的小鼠血清。恒河猴血清:正常恒河猴血清;恒河猴经HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原多次免疫注射,含抗gp120抗体的恒河猴血清。大猩猩血清:正常大猩猩血清;大猩猩经HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原多次免疫注射,含抗gp120抗体的大猩猩血清。正常健康人AB血清。未感染HIV-I者的正常健康人,经HIV-Env基因DNA重组包膜蛋白gp120或gp160抗原多次免疫注射,含抗gp120抗体的人AB血清。未感染HIV-I者的正常健康人,经HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异科抗原多次免疫注射,含抗gp120抗体的人AB血清。HIV-I感染者最初急性期,经非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗,经HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原抗HIV治療疫苗多次免疫注射后,停止用药治疗7d后抽取的,含抗gp120抗体的人血清。
3.实验检测、药物和试剂及与培养液
3.1.检测gp120抗体的双夹心法、或直接夹心法试剂。
3.2.HIV前病毒检测与试剂。
3.3.HIV病毒载量检测HIV-1 Qiantiplex实验与试剂,或AmplicorHIV-1Monitor实验与试剂,或NucliSens HIV-1实验与试剂。
3.4.CD4+T淋巴细胞检测实验与试剂。
3.5.RPMI-2加2%血清培养液,RPMI1640加10%~20%血清培养液含青霉素-G100U/ml、庆大霉素50μg/ml;Ficoll-Hystopaque密度梯度溶液d=1.077g/ml Pharmacia,把10ml Ficoll液预先内置于50ml离心管内;淋巴细胞处理液Nycomed,Birmingham,UK,把15ml淋巴细胞处理液预先内置于50ml离心管内;EDTA钠盐、用生理盐水配制4%抗凝液,把0.4ml抗凝EDTA钠盐溶液预先内置于10ml注射器内,把0.6ml抗凝EDTA钠盐溶液预先内置于20ml注射器内。
4.制备生物实验材料
4.1.设计、研制:各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原。
4.2.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体——大鼠IgC2a/b,模拟HIV-Env基因DNA重组包膜蛋白gp120或gp160——人CD4受体的异种特异配体抗原,分别制备:含有10%小鼠血清的生理盐水3μg/ml、6μg/ml、10μg/ml溶液;用大鼠抗人或抗兔的单克隆抗体——大鼠IgC2a/b,模拟HIV-Env基因DNA变构重组、失去人CD1受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原,分别制备:含有10%小鼠血清的生理盐水3μg/ml、6μg/ml、10μg/ml溶液。
4.3.用HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp16抗原,分别制备:含有109小鼠血清的生理盐水50μg/ml溶液;含有10%人AB血清的生理盐水50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml溶液。
4.4.制取人PBMC细胞:应用预先内置有0.4ml抗凝EDTA钠盐溶液的10ml注射器,无菌抽取未感染HIV-I者静脉血10ml、或感染HIV-I者静脉血10ml,加2倍RPMI-2培养液混匀;将其仔细缓慢加入预先内置有Ficoll液10ml的50ml离心管上层;20℃、400g离心30min;用灭菌吸管小心把离心管Ficoll液和血液分界层间的PBMC细胞吸出,置入新离心管加5倍RPMI-2培养液混匀;20℃、300g离心10min,弃上清液,加5倍RPMI-2培养液混匀;20℃、200g离心5min,弃上清液,用含有10%人AB血清的RPMI1640培养液,配制细胞悬液1×107/ml、并进行活细胞计数。
4.5.制取人淋巴细胞:应用预先内置有0.6ml抗凝EDTA钠盐溶液的20ml注射器,无菌抽取未感染HIV-I者静脉血15ml、或感染HIV-I者静脉血15ml,加1倍RPMI-2培养液混匀;将其仔细缓慢加入预先内置有淋巴细胞处理液15ml的50ml离心管上层;不要刹车,20℃、800g离心25min;用灭菌吸管小心吸取离心管淡黄色层,置入新离心管加5倍RPMI-2培养液混匀;20℃、300g离心10min,弃上清液,加5倍RPMI-2培养液混匀;20℃、200g离心5min,弃上清液,用含有10%人AB血清的RPMI1640培养液,配制细胞悬液2×107/ml、并进行活细胞计数。
4.6.活细胞计数检测:EB和AO各0.1mg溶于100ml PBS液,制备EB/AO工作液;待检测细胞悬液20μl~50μl,与适量体积20μl~1ml的EB/AO溶液混合,使最终细胞浓度为2×105~2×106/ml;将细胞悬液加入血球计数器,使用荧光显微镜配合紫外线UV和可见光,对活细胞绿色、死细胞橙色计数。或应用2.5g/L台盼蓝溶于PBS液,做细胞染色活细胞计数;台盼蓝是致癌剂,实验操作需要带手套。
4.7.制取人血清:无菌抽取未感染HIV-I者静脉血200ml、或感染HIV-I者静脉血200ml;分置4只100ml离心管内,2000g离心10min,离心后4℃低温静置60min;然后用血管钳挤压血凝块,挤出内含的血清;弃去血凝块,再分置2只100ml离心管内,5~10000g离心60min;用一系列过滤器(如,Acrodisc,Pall Gelman;Millex,Millipore)进行过滤,最后用0.1μm孔径无菌过滤器进行过滤后;分置于多个小无菌高密度聚丙烯容器,放置-70℃冰箱保存备用。
4.8.制取动物血清:方法如上。
4.9.人淋巴细胞免疫缺陷鼠Hu-PBL-SCID的再构建:用人淋巴细胞悬液2×107/ml、0.2ml/只,注射到4~6周龄免疫缺陷鼠的腹膜腔内。
5.建立体外HIV-I毒株感染细胞培养系统
5.1.建立体外实验室HIV-I毒株感染细胞培养系统;体外HIV-I感染者最初急性期HIV-I毒株感染细胞培养系统
5.1.1.用含有10%胎牛血清、10%含抗gp120抗体的动物血清的RPMI1640培养液,调整MT4细胞浓度为5×106/ml培养细胞悬液,每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养MT4细胞浓度悬液,在细胞培养瓶中接种浓度为1000TCID50的实验室HIV-I毒株,将细胞培养瓶放置37℃,5%CO2的培养箱中培养;用含有10%胎牛血清、10%不含gp120抗体的正常动物血清的RPMI1640培养液,调整MT4细胞浓度为5×106/ml培养细胞悬液,每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养MT4细胞浓度悬液,在细胞培养瓶中接种浓度为1000TCID50的实验室HIV-I毒株,将细胞培养瓶放置37℃,5%CO2的培养箱中培养。每培养3d吸取细胞培养瓶中上清液,补充新鲜培养液。培养第4d后每天在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养12d后,对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。
5.1.2.用含有10%正常人AB血清、10%含抗gp120抗体的动物血清的RPMI1640培养液,调整正常人PBMC细胞浓度为5×106/ml培养细胞悬液,每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬液,在细胞培养瓶中接种2.5×106、取自HIV-I感染者最初急性期液氮低温保存备用复苏的人PBMC细胞,将细胞培养瓶放置37℃,5%CO2的培养箱中培养;用含有10%正常人AB血清、10%不含gp120抗体的正常动物血清的RPMI1640培养液,调整正常人PBMC细胞浓度为5×106/ml培养细胞悬液,每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬液,在细胞培养瓶中接种2.5×106、取自HIV-I感染者最初急性期液氮低温保存备用复苏的人PBMC细胞,将细胞培养瓶放置37℃,5%CO2的培养箱中培养。每培养3d吸取细胞培养瓶中上清液,补充新鲜培养液。培养第4d后每天在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养12d后,对细胞培养瓶中没行被HIV-I感染致死的活细胞计数。
5.1.3.用含有10%正常人AB血清、10%含抗gp120抗体的人血清的RPMI1640培养液,调整正常人PBMC细胞浓度为5×106/ml培养细胞悬液,每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬液,在细胞培养瓶中接种2.5×106、取自HIV-I感染者最初急性期液氮低温保存备用复苏的人PBMC细胞,将细胞培养瓶放置37℃,5%CO2的培养箱中培养;用含有20%正常人AB血清的RPMI1640培养液,调整正常人PBMC细胞浓度为5×106/ml培养细胞悬液,每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬液,在细胞培养瓶中接种2.5×106、取自HIV-I感染者最初急性期液氮低温保存备用复苏的人PBMC细胞,将细胞培养瓶放置37℃,5%CO2的培养箱中培养。每培养3d吸取细胞培养瓶中上清液,补充新鲜培养液。培养第4d后每天在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养12d后,对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。
6.实验方法、检测、结果评定
6.1.模拟HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫CBA/Ca小鼠抗HIV模型,实验方法、检测、结果评定:
6.1.1.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体IgC2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原,模拟HIV-Env基因DNA重组包膜蛋白gp120或gp160——人CD4受体的异种特异配体抗原,分别肌肉注射免疫1组10只4~6周龄CBA/Ca小鼠:3μg/ml、0.2ml/只,0d、3d、6d、9d各一次;6μg/ml、0.2ml/只,12d、15d各一次;10μg/ml、0.2ml/只,18d各一次;6μg/ml、0.2ml/只,21d、44d各一次;3μg/ml、0.2ml/只,27d、30d、33d各一次。
6.1.2.用大鼠抗人或抗兔的单克隆抗体IgC2a/b——不能与小鼠CD4受体结合的异种抗原,模拟HIV-Env基因DNA变构重组、HIV包膜蛋白gp120或gp160失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160异种抗原,分别肌肉注射免疫2组10只4~6周龄CBA/Ca小鼠:3μg/ml、0.2ml/只,0d、3d、6d、9d各一次;6μg/ml、0.2ml/只,12d、15d各一次;10μg/ml、0.2ml/只,18d各一次;6μg/ml、0.2ml/只,21d、44d各一次;3μg/ml、0.2ml/只,27d、30d、33d各一次。
6.1.3.在免疫接种第14d、21d、28d、35d、42d,分别对1组、2组各自10只小鼠,尾部微量采血,检测每只小鼠针对大鼠IgC2a/b——异种抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。2组免疫小鼠针对大鼠IgC2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原的体液免疫应答延迟、血清抗大鼠IgC2a/b异种抗原的抗体滴度,明显低于实验1组免疫小鼠针对大鼠IgC2a/b——异种抗原的体液免疫应答、血清抗大鼠IgC2a/b异种抗原的抗体滴度。动物实验结论:1.给动物注射CD4受体的异种特异配体抗原,动物CD4受体的异种特异配体抗原与动物CD4+细胞特异受体特异结合,触发动物针对CD4异种特异配体抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制;表现出针对动物CD4异种特异配体抗原的体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应。与现代HIV疫前科学研究实施过的,所有各种不同的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗——人CD4受体的异种特异配体抗原接种临床人体实验,表现出针对人CD4受体的异种特异配体抗原——HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应极为相似;与HIV感染人体复制最初表现体液免疫应答延迟,不能首先产生针对HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原的保护性中和抗体,弱免疫原体液免疫应答反应极为相似。2.实验证实,改变动物CD4受体的异种特异配体分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对动物CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与动物的CD4受体结合,而不能触发动物针对失去CD4异种特异配体生物性质的异种抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制。3.实验证实,改变HIV包膜蛋白gp120或gp160——人CD4异种特异配体分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合,而不能触发人体针对失去CD4异种特异配体生物性质的异种抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制;提供直接动物模型实验科学依据。4.现代HIV疫苗科学研究,设计研制HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原疫苗,将有可能在研制筛选抗HIV治疗疫苗、预防HIV感染人类的HIV疫苗科学研究方面,取得科学创新突破。
6.2.HIV-Env·基因DNA变构重组包膜蛋白gp120、或gp160抗原免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠抗HIV模型,实验方法、检测、结果评定:
6.2.1.对1组24只4~6周龄C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠,实施断头采血,制取正常动物血清。
6.2.2.用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120、或gp160抗原免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠,分别肌肉注射免疫2组24只4~6周龄C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠:50μg/ml、0.2ml/只,0d、14d、28d、42d各一次。在免疫接种第14d、21d、28d、35d、42d,尾部微量采血,检测每只小鼠针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。49d,分别各自断头采血处死24只小鼠,制取含抗gp120抗体的动物血清。
6.2.3.分别用1组24只小鼠的混合正常动物血清、2组24只小鼠的含抗gp120抗体混合动物血清,实施5.1.1./5.1.2.体外HIV-I毒株感染细胞培养系统实验:2种体外HIV-I毒株感染T4细胞培养、每种3个细胞培养瓶,2种体外HIV-I毒株感染人PBMC培养、每种3个细胞培养瓶。各自培养12d后,对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。揭示用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠抗HIV模型,体液免疫应答产生的抗gp120抗体,抑制实验室HIV-I毒株感染细胞的能力、抑制感染人体野生HIV-I毒株感染细胞的能力。
6.2.实验应用做检验、筛选:设计、研制的,各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,提供相关动物模型实验科学依据。
6.3.HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原免疫恒河猴抗HIV模型,实验方法、检测、结果评定:
6.3.1.对12只恒河猴各自抽取静脉血20ml,制取正常动物血清。
6.3.2.用小鼠实验筛选得到的,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,分别肌肉注射免疫12只恒河猴:50μg/ml、1ml/只,0d、21d、42d各一次。在免疫接种第14d、21d、28d、35d、42d、49d,微量采血,检测每只恒河猴针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。60d,分别各自抽取静脉血20ml,制取含抗gp120抗体的动物血清。分别对12只恒河猴实施2种不同剂量SHIV毒株静脉注射接种5×106、5×107攻毒保护实验。
6.3.3.分别用每只恒河猴的正常动物血清、含抗gp120抗体的动物血清,实施5.1.1./5.1.2.体外HIV-I毒株感染细胞培养系统实验:2种体外HIV-I毒株感染T4细胞培养、每种3个细胞培养瓶,2种体外HIV-I毒株感染人PBMC培养、每种3个细胞培养瓶。各自培养12d后,对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。揭示用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原免疫恒河猴抗HIV模型,体液免疫应答产生的抗gp120抗体,抑制实验室HIV-I毒株感染细胞的能力、抑制感染人体野生HIV-I毒株感染细胞的能力。
6.3.实验应用做检验、筛选:设计、研制的,各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,提供进一步相关动物模型实验科学依据。
6.4.HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原免疫大猩猩抗HIV模型,实验方法、检测、结果评定:
6.4.1.对6~8只大猩猩各自抽取静脉血20ml,制取正常动物血清。
6.4.2.用被恒河猴实验证实的,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,分别肌肉注射免疫6~8只大猩猩:200μg/ml、2ml/只,0d、21d、42d各一次。在免疫接种第14d、21d、28d、35d、42d、49d,微量采血,检测每只大猩猩针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。60d,分别各自抽取静脉血20ml,制取含抗gp120抗体的动物血清。分别对6~8只实施2种不同剂量的,取自临床人体感染HIV-1毒株急性期血浆攻毒保护实验,静脉注射接种含有5×107、5×108HIV-1毒株的血浆。
6.4.3.分别用每只大猩猩的正常动物血清、含抗gp120抗体的动物血清,实施5.1.1./5.1.2.体外HIV-I毒株感染细胞培养系统实验:2种体外HIV-I毒株感染T4细胞培养、每种3个细胞培养瓶,2种体外HIV-I毒株感染人PBMC培养、每种3个细胞培养瓶。各自培养12d后,对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。揭示用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原免疫大猩猩抗HIV模型,体液免疫应答产生的抗gp120抗体,抑制实验室HIV-I毒株感染细胞的能力、抑制感染人体野生HIV-I毒株感染细胞的能力。
6.4.实验应用做检验、筛选:设计、研制的,各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,提供更进一步相关动物模型实验科学依据。
6.5.HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,作为抗HIV治疗疫苗,治疗HIV感染者临床人体抗HIV实验方法、检测、结果评定:
6.5.1.用被大猩猩实验证实的,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120、或gp160抗原,作为抗HIV治疗疫苗,实施I期临床HIV-I感染者急性期,应用非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗,同时应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原抗HIV治疗疫苗治疗试验。选择40~60位HIV-I感染者急性期,经非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗,可在14d内病毒载量下降为不可检测、28d内CD4+T淋巴细胞检测计数可恢复≥800/μl的患者;分2组,分别实施HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原抗HIV治疗疫苗治疗试验,100μg/人、200μg/人,0d、7d、14d、21d、42d各一次。在免疫接种第14d、21d、28d、35d、42d、49d,微量采血,检测每位患者针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。60d,分别各自抽取静脉血30ml,制取淋巴细胞。
6.5.2.用每位经非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗,与HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原抗HIV治疗疫苗治疗患者的淋巴细胞,各自分别实施3~5只SCID鼠的,人淋巴细胞免疫缺陷鼠Hu-PBL-SCID的再构建。21d,分别抽血处死Hu-PBL-SCID鼠,分别做HIV前病毒检测、HIV病毒载量检测。
6.5.3.对Hu-PBL-SCID鼠的HIV前病毒、HIV病毒载量为不可以检测患者,停止非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗7d后,各自抽取静脉血20ml,分别制取抗gp120抗体的人血清。实施5.1.3.体外HIV-I毒株感染细胞培养系统实验:2种体外HIV-I毒株感染T4细胞培养、每种3个细胞培养瓶,2种体外HIV-I毒株感染人PBMC培养、每种3个细胞培养瓶。各自培养12d后,对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。揭示用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原抗HIV治疗疫苗,治疗HIV感染者,体液免疫应答产生的抗gp120抗体,抑制实验室HIV-I毒株感染细胞的能力、抑制感染人体野生HIV-I毒株感染细胞的能力。
6.5.4.对Hu-PBL-SCID鼠的HIV前病毒、HIV病毒载量为不可以检测、血清抗gp120抗体具有抑制感染人体野生HIV-I毒株的能力的患者,停止非逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs抗HIV-I药联合治疗。定期抽血检测HIV前病毒、HIV病毒载量1年,观察是否会发生HIV前病毒、HIV病毒载量反跳恢复?如果有没有发生反跳恢复的HIV-I感染者,即可被认为是:应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原抗HIV治疗疫苗,临床治愈的首例或几例HIV-I感染者。
6.5.实验应用做检验、筛选:设计、研制的,各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原,具有最佳抗HIV免疫抑制免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,将能够作为抗HIV治疗疫苗、可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,提供足够充分的直接临床人体实验科学依据。
6.6.HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,作为可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,临床人体实验方法、检测、结果评定:
6.6.1.用被临床抗HIV治疗疫苗治疗HIV感染者人体实验证实的,HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,作为可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,实施I、II、III期临床人体试验。实施上述相关HIV疫苗实验科学研究、生物检测。
6.6.实验应用做检验、筛选:设计、研制的,各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、能够改变HIV包膜蛋白gp120或gp160分子的某个或某几个氨基酸结构,使其失去针对人CD4受体的异种特异配体生物性质、不能与人的CD4受体结合的HIV包膜蛋白gp120或gp160抗原,具有最佳抗HIV免疫抑制的高免疫原性的、HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120或gp160抗原,将能够作为可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,提供足够充分的直接临床人体实验科学依据。
发明创新讨论
自上个世纪70年代,Gershon提出传染性免疫耐受及抑制性T细胞,免疫耐受新概念;Hall等在1985年最先描述介导移植免疫耐受中抑制性CD4T细胞的存在;Qin等在1993年实验证实,CD4+T细胞的存在能够明显抑制小鼠移植免疫排斥反应,用非剔除的抗CD4和抗CD4抗体处理受者可以诱导免疫耐受……。迄今世界各国从事器官移植免疫耐受研究的学者们,针对CD4+细胞及CD4特异受体同特异配体抗CD4的mAb结合与器官移植免疫耐受的关系,在分子生物学科学研究层面,在细胞模型的细胞生物学、分子生物学科学研究层面,在动物模型及临床人体的组织学、细胞生物学、分子生物学科学研究层面,已经研究分析揭示的比较全面。大量动物模型实验、及临床人体实验表明:非剔除性抗T细胞辅助分子的mAb,如抗CD4的mAb同CD4特异受体结合,使T细胞产生不应答性,或诱导抑制性T细胞,建立T细胞免疫耐受、B细胞免疫耐受,可以避免同种异体移植物的排斥反应,其免疫抑制功能失去抗原特异性,即可以抑制对第三者抗原特异的T细胞免疫应答……等;诱导感染性免疫耐受,诱导CD4+T前细胞Th1/Th2极性分化偏离,抗CD4单克隆抗体可以阻止T细胞在胸腺的分化成熟,……等。有众多不可被一一综述的,CD4+细胞及CD4特异受体同抗CD4的mAb——特异配体结合,促发免疫耐受关系的科学研究文献、科学研究报告,可以供HIV科学研究者学习借鉴,开拓HIV科学研究者的创新综合科学研究思维,揭示:HIV感染人体复制,通过表达包膜蛋白gp120——CD4受体的特异配体,与CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,导致感染机体免疫系统针对HIV感染体液免疫应答反应延迟,不能首先产生针对gp120的保护性中和抗体、抑制gp120与CD4+细胞特异受体特异结合触发免疫耐受机制;可以在免疫应答产生针对gp120的保护性中和抗体之前,还没有被CTL细胞免疫有效抑制时、过度复制达到病毒血症峰值,进一步触发细胞免疫耐受机制-细胞免疫损伤机制;使HIV感染复制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制,能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效对抗机体免疫抑制压力的,现代细胞免疫学、分子免疫学生物机制。
可以借鉴器官移植免疫学的实验科学方法,利用现有的SIV、HIV-II恒河猴动物模型,SIV-mac239Δnef减毒株疫苗、SIV包膜蛋白抗原疫苗、HIV-II包膜蛋白抗原疫苗,实施揭示SIV包膜蛋白、HIV-II包膜蛋白——CD4受体的特异配体,与CD4+细胞特异受体特异结合,触发免疫耐受机制相关的器官移植实验,为模拟证实HIV感染人体,通过包膜糖蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+T淋巴细胞受体特异结合,首先触发人体免疫耐受机制,能够比HIV-1具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效应对机体免疫抑制压力,提供可令人信服的,足够充分的相关动物模型实验科学依据。通过“HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验”,证实:HIV感染人体,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+T淋巴细胞受体特异结合,首先触发人体免疫耐受机制,能够比HIV-1具有高度变异性免疫逃逸机制,更为有效应对机体免疫抑制压力,提供足够充分的直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。但是它将会不幸的证实,HIV疫苗科学研究设计、研制的,所有各种不同HIV包膜蛋白gp160、gp120抗原疫苗临床人体试验,不能证实HIV疫苗可以预防HIV感染人类,最重要的因素之一是:gp120、gp160是人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+T淋巴细胞受体特异结合,首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制,不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机制、细胞免疫应答机制。世界HIV疫苗科学研究在过去20多年里,关于是先加强基础研究,搞清HIV致病机制和免疫机制,还是尽快开始人体试验,在试验中积累知识,以便改进疫苗设计和工艺技术,各国专家的意见趋于一致,错误的主张采取后者;在没有揭示HIV感染通过gp120与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发人体免疫耐受机制,寻找到能够解决它触发免疫耐受机制问题的方法前,现有的疫苗科学研究思维、科学研究方法,不能研制出可能会有效预防HIV感染人类的HIV疫苗,是客观存在的必然科学现实。它极有可能是当今HIV科学研究,在HIV疫苗预防艾滋病AIDS科学研究方面,难以逾越的科学障碍!是被HIV科学界疏漏的一个极重要的科学研究“盲区”。因此,在没有揭示HIV感染通过gp120与人CD4+细胞特异受体特异结合,首先触发人体免疫耐受机制,寻找到能够解决它触发免疫耐受机制问题的方法前,没有科学研究迹象表明:HIV疫苗可能会有效预防HIV感染人类。
发明者认为:HIV-1感染人体,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体,与人CD4+T淋巴细胞受体特异结合,首先触发HIV-1感染者人体免疫耐受机制,导致感染机体免疫系统针对HIV-1感染体液免疫应答反应延迟,不能首先产生针对gp120的保护性中和抗体、抑制gp120与CD4+细胞特异受体特异结合触发免疫耐受机制;可以在免疫应答产生针对gp120的保护性中和抗体之前,还没有被CTL细胞免疫有效抑制时、过度复制达到病毒血症峰值,进一步触发细胞免疫耐受机制-细胞免疫损伤机制;诱导抑制性T淋巴细胞,诱导感染性免疫耐受,HIV-1过度复制表达所编码的超抗原,能够与某些特定的T淋巴细胞受体Vβ克隆反应,导致某些特定的T淋巴细胞受体Vβ克隆损伤、渐至枯竭,从而使T细胞Vβ库不可被再生恢复;因而确实存在HIV感染者免疫系统损伤的阈值,若超过该阈值,HIV感染者的免疫功能便不可被恢复重建。因而作者认为:HIV感染者急性期达到病毒血症峰值期,可能是使T淋巴细胞受体Vβ克隆损伤、转向渐至枯竭不可被重建损伤,至无症状期达到免疫系统损伤不可被重建的阈值。因而作者认为:在HIV感染者急性期、至达到免疫系统损伤不可被重建的阈值之前,可能会存在一个可以被抗HIV药有效根治、能够重建HIV感染者受损免疫系统的,很暂短的抗HIV药有效根治早期HIV感染者的“窗口期”。是被HIV科学研究疏漏的,极重要的科学研究“盲区”。
“HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验”方法,能够揭示上述被HIV科学研究疏漏的,极重要的科学研究“盲区”;可以被应用做寻找HIV感染人体,通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体抗原,与人CD4+细胞特异受体特异结合,触发人体免疫耐受机制的解决方法,提供足够充分的直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据;研制筛选抗HIV治疗疫苗、可以预防HIV感染人类的HIV疫苗,提供直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。可行性科学分析理论、方法依据:是HIV相关生物学科不需要科学论证的基本科学常识,与相关实用科学技术;不存在不可实施的现代生物科学的,应用科学理论疑点、应用科学技术难点。
将可以在HIV科学研究理论、科学认识思维、方法论、方法方面取得科学突破。
Claims (11)
1.一种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)免疫接种实验动物(2),检测免疫接种实验动物针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)的体液免疫应答、抗体的滴度(3)。
2.一种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)免疫接种实验动物(2),检测免疫接种实验动物针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)的体液免疫应答、抗体的滴度(3),检测免疫接种实验动物针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)的抗体抑制HIV毒株(4)感染细胞的能力(5)。
3.根据权利要求1、2中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:HIV毒株(4)是感染人体的HIV毒株(6)。
4.根据权利要求1至3中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:实验动物(2)是非人类的灵长类动物(7)。
5.根据权利要求1至4中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:实验动物(2)是非人类的灵长类动物猴(8)。
6.根据权利要求1至4中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:实验动物(2)是非人类的灵长类动物大猩猩(9)。
7.根据权利要求1至3中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:实验动物(2)是小鼠(10)。
8.根据权利要求1至3中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:实验动物(2)是临床实验人体(11)。
9.根据权利要求1中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白(1)是异种动物抗实验动物(2)的CD4受体的单克隆抗体(12)。
10.根据权利要求1至8中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白(1)抗原是HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp120(13)抗原。
11.根据权利要求1至8中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法,其特征在于:HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)是HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gp160(14)抗原。
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2006
- 2006-12-25 CN CN 200610170212 patent/CN101002949A/zh active Pending
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070725 |