CN100999748A - 一种用戊糖进行细胞内辅酶nadph再生的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用戊糖进行细胞内辅酶NADPH再生的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明通过在转化反应体系中添加戊糖作为辅酶再生的辅助底物，提高菌体的立体选择性转化能力。通过在菌体重复利用的转化体系中添加8mg/mL的戊糖，可以使产物(S)－苯基乙二醇的对映体过量值由86％提高到98％，产率由77％提高到85％；在产物的对映体过量值保持在98％的情况下，菌体可重复使用3－4次。提出戊糖是通过戊糖磷酸途径(PPP)代谢再生了大量的NADPH，为转化反应补充了辅酶。本发明有助于了解与辅酶再生相关的细胞代谢机制，对于今后开发广泛适用的经济、方便、有效的细胞内辅酶再生体系具有较为重要的意义。

Description

一种用戊糖进行细胞内辅酶NADPH再生的方法及其应用
技术领域
一种用戊糖进行细胞内辅酶NADPH再生的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料以及环保等领域都具有重要的意义。
目前，国际上拆分外消旋化合物常见方法主要包括：化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法，和生物法。利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从内消旋或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。
90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转化，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机-水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。
微生物细胞所产生的氧化还原酶具有立体选择性高和反应条件温和等特点，在制备手性醇、氨基酸和类固醇等方面显示出极大的优势，广泛应用于医药、农药、食品、精细化工等领域。但是氧化还原酶在进行生物催化时，都需要辅酶NAD(P)H作为电子传递体参与反应，在合成产物的同时会消耗掉一定量的辅酶。因此随着反应的进行细胞内的辅酶量逐渐减少，不能为催化反应提供足够的还原力或氧化力，造成转化效果降低，菌体无法重复使用。而由于辅酶价格昂贵，从经济角度考虑在催化反应过程中添加大量辅酶是不现实的，因此应设法建立辅酶再生体系，对辅酶进行再生并循环使用。
在辅酶依赖的氧化还原酶中，NADP(H)依赖型的酶通常比NAD(H)依赖型的更为希缺，而且辅酶NADPH也是四种辅酶中价格最高以及最不稳定的一种。因此，NADPH的辅酶循环和再生就显得尤为重要。目前，NADPH的再生方式仍比较有限，并且由于其较弱的稳定性，NADPH在全细胞环境中再生更为有效。全细胞的辅酶再生通常采用两种方式：一种是以醇类或糖类化合物为辅助底物的底物耦联再生，但维持辅酶循环所需的醇类化合物可能会对催化用酶本身产生变性失活作用；另一种是构建胞内的酶耦联再生体系，但其需要实施一系列基因工程操作以共表达再生酶，并且通常需要诱导而使构建的催化酶与再生酶成功表达。近年来，尽管可用于NADPH循环的几种再生酶已被开发，如葡萄糖脱氢酶、改造的甲酸脱氢酶、氢化酶以及转氢酶等，但这些酶仅适用于游离酶系统而无法直接用于全细胞系统的NADPH再生。因此，很有必要建立一种方便、有效、经济的全细胞辅酶NADPH再生系统以促进和改善其催化转化效果。
在利用糖类化合物作为辅助底物进行全细胞辅酶NADPH再生的方法中，通常采用葡萄糖等己糖为辅助底物，而尚没有利用戊糖进行细胞内辅酶NADPH再生方法的报道。
发明内容
(1)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种利用戊糖再生细胞内辅酶NADPH的方法，并将这种方法应用于微生物细胞催化不对称还原潜手性羰基化合物的反应中，以提高微生物催化不对称转化制备光学活性手性醇产物的光学纯度和产率，以及微生物细胞催化转化的重复使用次数，进而建立一种具有广泛适用性的经济、方便、有效的细胞内辅酶再生体系。
(2)技术方案
利用戊糖再生细胞内辅酶NADPH的方法，是在微生物细胞体系中添加戊糖作为辅酶再生的辅助底物，促进细胞内辅酶NADPH的再生，添加戊糖浓度为2～20mg/mL。
所用的戊糖为木糖、阿拉伯糖、木酮糖、5-磷酸木酮糖、5-磷酸核糖或5-磷酸核酮糖。
所述方法用于微生物细胞催化不对称还原反应中，转化反应后，离心将菌体取出，重新悬浮于新鲜的底物溶液中，并加入2～20mg/mL的戊糖后，在菌体重复使用的转化体系中，能提高底物的催化不对称还原反应光学活性手性醇产品的对映过量值和产率，菌体能重复使用4次。
应用的典型例子为用于催化不对称还原反应的菌株为近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；
培养基：葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，(NH4)2HPO4 13g/L，KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，NaCl 0.1g/L；
菌种在装液量为20％的250mL摇瓶中，于30℃下，150r/min振荡培养48h，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞用于转化反应；
近平滑假丝酵母转化反应：2g湿菌体悬浮于20ml 100mmol/L、pH6.5的磷酸钾缓冲溶液中，加入10～20mg/mL的底物外消旋苯基乙二醇，于30℃，150r/min下反应48h，获得(S)-苯基乙二醇；
转化反应后，离心将菌体取出，重新悬浮于新鲜的底物溶液中，并加入2～20mg/mL的戊糖后，在菌体重复使用的转化体系中，能提高产品(S)-苯基乙二醇的对映过量值和产率，菌体能重复使用4次。
一、微生物全细胞催化不对称转化反应
用于催化不对称还原反应的微生物菌株为：近平滑假丝酵母。
近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011培养基：葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，(NH4)2HPO4 13g/L，KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，NaCl 0.1g/L。
菌种在装液量为20％的250mL摇瓶中，于30℃下，150r/min振荡培养48h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞用于转化反应。
近平滑假丝酵母转化反应：2g湿菌体悬浮于20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH6.5)，加入10～20mg/mL的外消旋苯基乙二醇(苯基乙二醇简称为PED)，于30℃，150r/min下反应48h。反应后，将产物于8000r/min离心10min，取上清液用6倍体积乙酸乙酯萃取，萃取液用于高效液相检测。
产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(S)-PED对映过量值的计算：对映过量值(e.e.％)＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
产物(S)-PED产率的计算：苯基乙二醇残余物(％)＝[(SS+SR)/S0]×100％
产率(％)＝SS/S0×100％
式中SS为反应后(S)-对映体的峰面积，SR为反应后(R)-对映体的峰面积，S0为反应前(S)-和(R)-对映体的峰面积之和。
二、戊糖对全细胞催化不对称转化的影响
去消旋转化外消旋苯基乙二醇的氧化还原酶，需要辅酶NAD+和NADPH的参与。随着反应的多批次进行细胞内的辅酶量逐渐减少，其生理浓度不能满足转化反应的需要，造成转化效果下降。
在首次转化反应结束后，离心将菌体取出重新悬浮于新的底物溶液中，加入与底物等摩尔的辅助底物戊糖，考察了其对转化效果的影响。转化体系中添加戊糖后(S)-PED产物的e.e.值和产率都有很大的提高，转化效果与菌体首次转化效果相当。
当菌体完成一个批次的转化进行第二次重复使用时，与首次转化相比，产物(S)-PED的e.e.值和产率都很大程度的下降。在首次转化反应结束后，离心将菌体取出重新悬浮于新的底物溶液中，并加入2～20mg/mL的戊糖。添加戊糖后，产物的e.e.值为90％～100％，产率为80％～100％。
考察戊糖辅酶再生体系对多批次转化稳定性的影响，对菌体进行多批次重复利用。每次转化反应结束后，将菌体离心后重新投入等量的新底物，加入2～20mg/mL戊糖，并跟踪产物e.e.值和产率的变化，
在菌体重复使用的转化体系中加入适量的戊糖可以提高(S)-PED产物的e.e.值和产率。特别是随着菌体使用批次的增加，这种效果也越来越显著。当菌体重复使用至第4批次时，添加戊糖的转化体系中(S)-PED产物的e.e.值为90％～100％，产率为80％～100％。菌体可在保持较好的转化效果下重复使用4次。
三、戊糖促进细胞内辅酶NADPH再生的机理
在菌体重复使用的转化体系中，未添加木糖或阿拉伯糖等戊糖的体系随着菌体使用批次的增加，产物中2-羟基苯乙酮中间体的积累量不断增加，转化效果变差。而在添加了戊糖的转化体系中，随着菌体使用批次的增加其产物中并没有出现2-羟基苯乙酮的积累，产物中的2-羟基苯乙酮量一直处于较低的水平，转化效果稳定。这说明转化体系中添加戊糖可以减少因菌体重复使用而造成的转化产物中酮类中间体的积累，使反应朝有利于生成(S)-PED的方向进行。
戊糖通过对(S)-羰基还原酶系的强化作用，减少了2-羟基苯乙酮中间体的积累，提高了菌体的立体选择性转化能力，增强了转化效果的批次稳定性。
结合戊糖在微生物内的代谢路径分析，发现木糖前期代谢中所需酶的辅酶依赖性，如木糖还原酶和木糖醇脱氢酶分别需要NADPH和NAD+作为辅酶，与去消旋转化过程之间形成了辅酶竞争关系，因此排除了戊糖直接代谢耦联的辅酶再生作用。而戊糖是能够通过强化(S)-羰基还原酶系来提高转化效果的，因此可以断定必然是戊糖的后期代谢路径-戊糖磷酸途径代谢阶段起到了辅酶再生的作用。
据此推断出戊糖的作用机理是：木糖或阿拉伯糖等戊糖进入细胞后，经过氧化还原作用和磷酸化作用和异构化作用反应生成5-磷酸木酮糖并由此进入磷酸戊糖途径，通过磷酸戊糖途径的中间代谢产物6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸的两步脱氢反应产生了大量的NADPH，为主反应补充了辅酶，提高了菌体的立体选择性转化能力。
除了可以促进近平滑假丝酵母细胞内辅酶NADPH的再生，该利用戊糖作为辅助底物的辅酶再生体系还可以用于其他微生物菌种的细胞内辅酶NADPH再生，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，大肠杆菌(Escherichia coli)等。
(3)有益效果
本发明与通常采用的底物耦联再生方式和酶耦联再生方式不同，是一种戊糖代谢耦联的辅酶再生方法。通过在转化反应过程中添加戊糖作为用于辅酶再生的辅助底物，有效的提高菌体的立体选择性转化能力。
通过在菌体重复利用的转化体系中添加8mg/mL的戊糖，可以使产物(S)-苯基乙二醇的对映体过量值由86％提高到98％，产率由77％提高到85％；在产物的对映体过量值保持在98％的情况下，菌体可重复使用4次。
证明了戊糖是通过强化不对称反应过程中的辅酶再生来提高菌体的立体选择性转化能力后，提出戊糖是通过戊糖磷酸途径(PPP)代谢再生了大量的NADPH，为转化反应补充了辅酶。这些工作有助于了解与辅酶再生相关的细胞代谢机制，对于今后开发广泛适用的经济、方便、有效的细胞内辅酶再生体系具有较为重要的意义。
生物材料：近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)，保藏日期2003年3月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌株编号：M203011。该菌株已在中国专利CN 1212403 C公告。
具体实施方式
实施例1
将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入300mg的外消旋苯基乙二醇，40mg木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度91.53％e.e.，产率80.41％。
实施例2
将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入300mg的外消旋苯基乙二醇，400mg木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度93.12％e.e.，产率82.19％。
实施例3
将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入300mg的外消旋苯基乙二醇，160mg木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度98.72％e.e.，产率86.43％。
实施例4
将在含有木糖的反应体系中已催化三次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入300mg的外消旋苯基乙二醇，160mg木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度97.56％e.e.，产率80.09％。
实施例5
将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入200mg的外消旋苯基乙二醇，160mg木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度98.86％e.e.，产率92.32％。
实施例6
将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入400mg的外消旋苯基乙二醇，160mg木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度94.28％e.e.，产率85.42％。
实施例7
将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入300mg的外消旋苯基乙二醇，160mg阿拉伯糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度97.31％e.e.，产率87.02％。
实施例8
与实施例3进行对照，将已催化一次转化反应的近平滑假丝酵母湿菌体2g在20ml 100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)中重悬，加入300mg的外消旋苯基乙二醇，不加木糖，于30℃，150r/min下反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-PED的光学纯度86％e.e.，产率77％。

Claims (4)

1、一种利用戊糖再生细胞内辅酶NADPH的方法，其特征是在微生物细胞体系中添加戊糖作为辅酶再生的辅助底物，促进细胞内辅酶NADPH的再生，添加戊糖浓度为2～20mg/mL。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的戊糖为木糖、阿拉伯糖、木酮糖、5-磷酸木酮糖、5-磷酸核糖或5-磷酸核酮糖。
3、权利要求1所述方法的应用，其特征是用于微生物细胞催化不对称还原反应中，转化反应后，离心将菌体取出，重新悬浮于新鲜的底物溶液中，并加入2～20mg/mL戊糖后，在菌体重复使用的转化体系中，能提高底物的催化不对称还原反应光学活性手性醇产品的对映过量值和产率，菌体能重复使用4次。
4、根据权利要求3所述的应用，其特征是：用于催化不对称还原反应的菌株为近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；
培养基：葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，(NH4)2HPO4 13g/L，KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，NaCl 0.1g/L；
菌种在装液量为20％的250mL摇瓶中，于30℃下，150r/min振荡培养48h，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞用于转化反应；
近平滑假丝酵母转化反应：2g湿菌体悬浮于20ml 100mmol/L、pH 6.5的磷酸钾缓冲溶液中，加入10～20mg/mL的底物外消旋苯基乙二醇，于30℃，150r/min下反应48h，获得(S)-苯基乙二醇；
转化反应后，离心将菌体取出，重新悬浮于新鲜的底物溶液中，并加入2～20mg/mL的戊糖后，在菌体重复使用的转化体系中，能提高产品(S)-苯基乙二醇的对映过量值和产率，菌体能重复使用4次。
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