CN1009899B - 线虫的液体培养 - Google Patents

Abstract

昆虫致病性线虫可用作生物杀虫剂来防治某些害虫。至今在商业上使用线虫生物杀虫剂由于不能大规模培养和生产线虫而受到限制。现已发现，只要小心控制某些参数，昆虫致病性线虫可以用液体培养于发酵罐中进行大规模培养。特别是发现，如果尽量减低剪力并小心控制充气和搅动，便可使线虫及其共生细菌的生长最佳化。

Description

本发明涉及用液体培养法大规模生产昆虫致病性线虫。

已知昆虫致病性线虫可用于不同种类的害虫的生物防治。但要在商业上采用线虫为生物杀虫剂则受到很多限制，包括不能大规模生产线虫，和不能以化学杀虫剂的价格来生产线虫，因此大规模地生产线虫有重要的商业意义。

昆虫致病性线虫在其生活史中要经过不同的发育阶段。在宿主昆虫血腔中的天然环境下，传染期（J3）线虫出鞘、驱逐它们的细菌、代谢活动增加并开始摄食。专性于线虫的菌株Xenorhabdus    nematophilus或X.luminescens由线虫分泌出来，并于血腔内繁殖。线虫生长成成虫后开始繁殖和产卵，这些卵的发育经过J1和J2期，在1至3星期后产生下一代传染期（J3）线虫。传染性线虫离开昆虫尸体，寻找另一个新的宿主。细菌性败血病是幼虫死亡的主要原因。但线虫的生长和繁殖或线虫所产生的杀虫物质，在没有共生细菌时，也能造成幼虫死亡。

在商业上使用昆虫致病性线虫来防治重要经济害虫的主要限制是不能以体外培养生产大量的传染性（持久期）线虫。体内培养，特别是用大蜡螟幼虫进行体内培养，只为研究者提供了足以供实验室和有限的大田试验之用的材料。

美国专利4，334，498公开了一种在体外大量养殖的方法，采用了废料匀浆于海绵基质上。该方法及其整个途径显示了目前培养线虫的最新方法，在各种方法中，它最适合于大规模生产。线虫学家倾向 于在生长培养基内采用固相载体。美国专利4，417，545公开了一种贮存和运输线虫的方法和密封装置，该方法是在不透水的容器中利用了具有毛细作用的开孔轻泡沫，该容器有一个可移动的盖用来保护线虫和/或休眠态虫卵，所用的水小心地保持在微酸性至中性PH。贝丁（Bedding）在Ann·Appl·Biol·（1984），104，117-120中说明需要采用固体基质以促进线虫培养中空气的流通。贝丁指出，即使轻微的搅动也几乎完全抑制线虫的发育，这支持了在本技术中公认的说法，即大规模的液体培养法是不可能的。但最好能用液体培养法大规模培养线虫，因为液体培养法更容易扩大以便生产大量的线虫，液体培养法也易于维持无菌条件，监视及收集线虫。

虽然昆虫致病性线虫可在液体培养中生长，但只能在约少于1升的容积中达到。例如在营养学研究中，斯托尔（Stoll，1953和1961）、杰克逊（Jackson    1962，1965a-1965b和1973）、汉森等人（Hansen    et    al，1967）、洛厄和比克（Lower    and    Buecher    1970）和比克等人（Buecher    et    al，1970）都采用了体积少于100毫升的液体培养。汉森等人（Hansen    et    al    1967）和塔雷卡卢（Tarakanow    1983）则采用液体薄膜来培养线虫。

至今仍没人发表任何采用传统发酵系统来大规模（多于1升）深层液体培养昆虫致病性线虫的方法。

上述的液体培养生产出低浓度的幼态传染性线虫（每毫升液体有数千条线虫），并包括有传染性和非传染性的幼虫及昆虫致病性成虫。只有传染期的线虫能有效地控制昆虫，并于储藏和应用期间继续生 存。混合生长期亦会降低传染期线虫的寿命，因此产生混合生长期的方法在经济上不理想。

文献中所述的小规模线虫液体培养法不会遇到大规模培养特有的困难，例如为线虫和细菌的混合培养提供足够的氧气，及除去CO₂和其他挥发性代谢产物。

我们的研究表明，用传统的装置了叶轮（平直叶片）的发酵罐来培养线虫，比摇瓶培养有更高的产量，但由于传统发酵罐所遇到的高剪应力，此方法也很不经济。

本发明人用低剪力（内导水管）的气升发酵罐进一步研究，表明在导水管底部由整体流速所产生的气升不足以悬浮重的雌性线虫。

本发明人发现，只要在制备培养介质时和在培养过程的本身遵循某些临界参数，大规模液体培养昆虫致病性线虫，生产高浓度的较纯的传染期线虫是可行的。

本发明的目的是提供一种大规模液体培养昆虫致病性线虫，以生产高浓度的较纯的传染期线虫的方法。本发明的另一目的是提供一种杀虫组合物，该组合物含有由上述方法生产的线虫及一种农用载体或稀释剂。

本发明的一个形式包括大规模液体培养昆虫致病性线虫以生产高浓度和较纯的传染期线虫的方法，其中上述线虫的培养介质用线虫的共生细菌进行预接种，这些细菌经培养或处理，减少了对上述线虫有毒或有抑制作用的化合物。

线虫的共生细菌可存在于两种不同的形态，称为初生和次生细菌。 细菌最好是从反复传代培养后仍能稳定地保持初生特性的菌株中得来。初生态的共生细菌可转化为次生态。线虫生长和繁殖时如有次生态细菌存在，会导致固体培养中的线虫产量下降（贝丁（Bedding）1984）。我们观察到当次生的Xenorhabdus存在时，液体培养的线虫产量下降。以往的试验未采用共生细菌于液体培养中。

在本发明的一种形式中，在加入线虫时，该线虫培养每升介质中含5至10克/升干重的细菌细胞。

在本发明的另一种形式中，将线虫培养在无菌培养中，当线虫的新一代处在J2期时，加入初生态细菌。

从上文可以清楚知道，线虫可以在无菌或有共生细菌的存在下培养。加入共生细菌对于增加线虫对昆虫的传染力是很重要的。

对于培养上述线虫的过程的临界参数是线虫在反应器中须承受的剪力。

对剪力最敏感的是线虫的生殖过程。此过程需要雄性线虫把身体缠绕在较大的雌性线虫上。大条的带卵和产卵的雌性线虫和刚刚孵化的J1期线虫亦很容易受剪力损害。从平直叶片的叶轮所产生的剪力可表达为叶轮尖的速度，我们的研究确定1米/秒或大于1米/秒的叶轮尖速度可导致成年雌性线虫断裂。要得到最高产量，剪力最好是少于0.3米/秒。

在传统的搅拌反应罐中，发酵介质的充气程度必须维持充足的气体交换，同时要避免高速搅动，以防止线虫受剪力的伤害。

最好是用桨式搅拌机（如培养哺乳动物细胞所用的）来代替平直叶 片的叶轮。

在本发明的另一个形式中，把充气和搅动系统从反应器中移走，而装上一个为特别目的设计的充气系统。此充气分布器把空气向下吹向该容器的底部，以便吹起及升高重的成年线虫。此分布器的操作方向与传统气泡塔发酵罐采用的充气系统向上吹的方向相反。

在传统发酵容器中进行的液体培养法相对于现有技术的固体培养法的优点是，第一，可以抽取无菌样本，然后分析，例如测试污染，或测定应在什么时候处理该培养，以便增加传染性线虫的形成;第二，可以控制重要的参数，如温度、pH、氧气和二氧化碳的浓度，并可用来预测该培养的状态;第三，可以在培养中加入无菌液，例如在临界期加入Xenorhabdus于无外来菌的培养中;第四，由于可以严密控制液体培养，可以测试在大量发酵所需的接种期的污染，最重要的是可以收集该接种期的线虫，并可在约一星期的培养时间后，在线虫的传染期之前作为接种物，这样可为一个需要3个接种期的发酵过程节省6星期的时间。在以前从未采用非传染性的线虫作为生产线虫的接种物。

更重要但不是必需的参数与培养介质有关。该介质最好含有动物来源（如鸡肠或牛肾或猪肾）的匀浆材料。应调整介质的成分，使其有助于刺激所培养的特定种类的线虫及其共生菌的生长，以及有助于线虫发展为传染型。

在制备种菌和线虫生长的整个过程中维持无菌条件也很重要，这可防止不需要的微生物生长。

本发明的另一个方式提供了一种大规模液体培养线虫，特别是昆虫致病性线虫的方法，此方法产生高比例的成熟的持久期传染性线虫，此方法的特征是在第3期幼虫存在时，把培养介质高度稀释，或用一种不含营养的含水介质或水来代替，但仍维持充气和搅动。

最好把温度降至15℃或更低。

下面的例子说明了在大规模液体培养中不同品系的线虫的生长，但这并不排除在本发明的广大范围内的其他形式。虽然以下的例子只说明了某些品系，但本发明适用于所有品系的昆虫致病性线虫。

例1：

在10升的布朗E系列（Braun    E    series）（E10）搅拌发酵罐中培养费氏线虫（Steinernema    feltiae）（Mexican）（S.f.M）。

制备S.f.M的共生菌Xenorhabdus    nematophilus的种菌（N.f.M/1），方法是，把初生细菌的一个菌落由指示板（营养琼脂加上溴麝香草酚蓝（25毫克/升）和2，3，5-三苯基四唑氯化物（40毫克/升，阿库斯特（Akhurst）1980）转移到200毫升甘油-酵母抽提物-盐（GYS）介质中。24小时后，于28℃和搅拌器速度为120转/分的条件下，把该培养无菌转移至10升的发酵罐中。

该发酵罐已装有8升无菌介质，该介质由100克/升牛肾匀浆和在去离子水中的10克/升酵母抽提物组成。

确定的介质、半确定的介质和基于不同种类的废料的介质也可维持线虫以不同的产量生长和繁殖。

发酵罐参数指定如下：

温度28℃，pH6.8（用20%W/VH₃PO₄和20%W/V NaOH来维持），用充气和搅动利用自动调整点控制来维持50%的氧气饱和。

在24小时的发酵时间后，从固体培养瓶中用无菌技术收集传染期的S.f.M单种培养，并无菌加入发酵罐中，使其浓度为每毫升2000条J3期幼虫。

把发酵参数改变为23℃，没有pH的控制（pH由6.8增至8.7），搅拌速度为180rpm（非常接近发酵罐最低速度150rpm），而充气的速度是可变的，以维持至少20%的氧气饱和。不控制泡沫，而是设置一个膨胀器于排气管中。从摇瓶和发酵罐中无菌取样，用活菌计数法和在显微镜下直接计数计算初生和次生Xenorhabdus的数目，然后再计算线虫的数目。

在发酵罐中，在大约80小时后，线虫由幼态传染（持久）期发育至成年（J4）期。大约在这时见到交配，接着进一步发育并在约100小时时见到带卵的雌性线虫。

在100至180小时的时候见到游离的卵和J1期幼虫。240小时后，该培养达40，000个/毫升J3期幼虫，成活率为90%。

在发酵罐中再过10天（以增加传染线虫的数目），用沉降和清洗法收集线虫。

加入5000条传染性线虫至20条铜绿蝇（Lucilia    Cuprina）3龄幼虫中，以生物检定线虫生物杀虫剂，对照为固体培养的线虫。液体培养线虫的效果与对照一样好，平均在20条幼虫中可杀除15条。

例2

用与例1不同的方法，用不同的方式制备线虫接种物。

该线虫接种物可从幼虫、固体培养或液体培养中得来。在每种情况下，线虫将Xenorhabdus装于一个囊中，在转化至传染期过程中，此囊由正在退化的消化系统形成。Xenorhabdus菌亦存在于线虫表面和含线虫的介质或基质中。

这些Xenorhabdus菌可以是次生的，但最好是初生的。次生的Xenorhabdus可能很难从其他污染细菌中分辨出来。

因此，无菌的线虫最好是以存贮培养保存，用时加入只含初生Xenorhabdus的培养中。

最好让线虫无菌生长于大体积培养中，当线虫转化为传染期时加入Xenorhabdus。

要制备无菌的培养，用0.1%W/V乙基汞硫代水杨酸钠清洗S.F（A11）品系线虫2小时，进行表面消毒，然后接种于含以下物质的介质中：40克/升黄豆胨、30克/升酵母抽提物、1克/升马血红蛋白、0.2克/升胆甾醇、1克/升链霉素和10，000单位/升氨苄青霉素。线虫生长并繁殖，每毫升产生95，000条幼虫，将其用作预先用Xenorhabdus接种的介质的接种物，观察到正常的生殖和生物活性。

例3：

在10升布朗E系列（E10）发酵罐中培养费氏线虫（Mexican），在一个剪力器中测试摇瓶培养的S.f.M雌性成虫。

如例1所述的方法培养线虫和细菌，不同的是发酵罐的搅拌速度随需氧量而增加至400转/分。

此实验中线虫产量是23，000个/毫升，比预期的为低。为测试剪力对线虫存活的影响，设置一部实验室剪力测试器，该测试器包括有：

Ⅰ）一个5升玻璃容器，其操作体积为2升;

Ⅱ）可变速的搅拌电动机，由25至1，500转/分;

Ⅲ）旋转轴和1个标准的（布朗6叶片）平直叶片轮;

Ⅳ）4块隔流板，插于该容器中。

各个组件的尺寸可与标准的搅拌发酵罐比较，可用布朗发酵罐来代表。

尺寸：

容器的直径    165毫米

叶轮1    0.4容器直径

叶轮2    0.5容器直径

叶轮3    0.6容器直径

叶轮高度    0.3容器底部的直径

隔流板宽度    0.8容器直径

隔流板与壁的距离    0.8容器直径

将线虫和细菌培养于如例1所述的介质中。线虫培养条件是：500毫升摇瓶，150毫升体积，22℃和110转/分，直至出现雌性成虫。

用沉积法来收集雌性线虫，并置于容器内的2升自来水中。在每个实验期间内，把自来水中的线虫样本放于培养皿中。留在水中的线虫在15小时后出现由于渗透压而产生的任何损害或活力下降。

进行实验时，操作搅动器于接近提升（即悬浮线虫）转速2小时， 然后把转速每次增加150转/分，维持每个速度2小时，直至对线虫产生物理损害。

用叶轮尖的速度（ND）来估算剪力，其中

N＝搅拌器转速

D＝搅拌器直径

结果：

叶轮    线虫

直径    提升    破裂

转/分    转/分    剪力（米/秒）

A    70毫米    30    350    1.2

B    90毫米    ＜25    200    0.9

C105毫米    ＜25    200    1.1

本实验中，用成年雌性线虫的物理破裂来估计培养物在发酵罐内所受到的最大剪力。但是，可假设线虫的生殖过程对剪力更为敏感，因此，大体积线虫培养的容器一定要设计成可尽量减低剪力和相对质点速度，但仍能维持足够的混合、气体交换和线虫悬浮。

例4：

在10升配有桨式搅拌机的布朗E系列发酵罐中培养费氏线虫（Mexican）。

在此例中，发酵容器、发酵罐操作条件、介质、线虫和细菌都如例1所述，只有以下不同。

在标准装置发酵罐中的3个6叶（平直叶片）叶轮用一个4叶叶轮来 代替。叶片的高度由10毫米增加至100毫米。把叶轮的最低点置于移走的最低叶轮的同一深度，改变发酵罐的速度控制，使速度的范围向下扩至0转/分，搅拌器速度对线虫调整至固定于50转/分。充气速度调整至维持20%氧气饱和。这些改变使产量提高到每毫升70，000条幼虫。生物活性仍等于固体培养对照。

例5：

在20升布朗E系列发酵罐中培养费氏线虫（A11）（S.f.A），该发酵罐作为气泡塔发酵罐形式的提气发酵罐进行操作。

此例中，介质和条件同例1，只有以下不同。

肾介质不在发酵罐中消毒，而是于155℃经过一个连续的闪光消毒器1分钟。闪光消毒法能降低成本，用于大规模液体培养系统较为有利。

采用一个标准的20升布朗发酵容器，但去掉叶轮的旋转轴、叶轮和气体分布器，取而代之的是一个特别设计的分布器，以提供充气和搅动作用，即提升并悬浮重的成年线虫。

该分布器包括3个用6毫米管子造的相连的环，安装在容器底部之上20毫米处。最外的环直径为150毫米，有相隔10毫米的2毫米小孔。这些孔与垂直向下的容器侧边成45°角。两个内环的直径分别为100毫米和50毫米，亦有相隔10毫米的2毫米小孔，但这些小孔垂直向下。此设计适用于平底容器，可有效保护线虫处于最低剪力的环境。空气的流速调整至10NL/分的最低流速，但当溶解氧低于20%饱和时，该流速可以增加。

线虫产量为90，000个/毫升，仍有高度传染性。

例6：

在接种期中采用不在传染期的线虫。

大规模线虫液体培养中，所需的接种物要从若干阶段的液体培养来构建。在现有技术中，只采用传染期（J3）的幼虫作为接种物。

如果液体线虫培养需要3星期，就需要9星期的时间来提供大体积液体培养所需的3个接种物构建期。

在摇瓶培养中模拟接种物的构建，在500毫升锥形瓶中加150毫升培养物，于22℃以110转/分的速度摇动。采用了如例1所述的S.f.M品系、介质和条件。

培养大约1星期后，当J1和J2期幼虫都出现时，把这些线虫连续地传代培养5次。

这些培养在1毫升中的产量为60，000至90，000条幼虫，如果让它们达到传染期，它们的传染性与对照相同。

因此接种物构建时间可由9星期减至3星期。

例7：

在液体培养中培养不同的昆虫致病性线虫。

10升发酵罐和500毫升摇瓶培养于上述条件下进行。

肾-酵母抽提物介质用标准的分批方法121℃以15磅/英寸²用闪光消毒法消毒20分钟，或用微波炉以650瓦和2450兆赫的频率微波消毒10分钟（每100毫升介质）。闪光消毒和微波消毒可以连续方式操作，使大规模操作的成本减低。

不同种或品系的昆虫致病性线虫的液体培养仍未最佳化，因此预料还可以有更高的产量。

结果

最高产量/毫升

线虫    摇瓶    发酵罐

S.f.（Mexican）    120，000    70，000

S.f.（A11）    190，000    90，000

S.f.（Agriotis）    125，000    65，000

S.bibionis    70，000    63，000

S.glaseri    66，000    40，000

Heterorhabditis    20，000    15，000

heliothidis

从这些品系收集60至90%的传染性（持久期）幼虫，方法是，于不进食、双重包盖、抗性的传染性（持久期）线虫第一次出现的临界期，把培养中营养丰富的介质用蒸馏水来代替，把温度降至15℃，并用空气喷射。

以上例子说明大规模深层液体培养对线虫是可行的。虽然仅用20升容器作了说明，但以此规模所得的结果在技术上公认为可以扩大至商业用的体积，例如大于3立方米。线虫的物理环境的最佳化可以尽量增强线虫的发育、交配、生殖力和传染期的形成。

用本发明方法生产的昆虫致病性线虫可用作广谱生物杀虫剂。

施用这些线虫可用熟知的方法，例如以稀释或未稀释的形式喷射 在作物上，注射入树干中，喷射在土壤上和以固态如颗粒施用于土壤。

Claims (9)

1、一种大规模液体培养昆虫致病性线虫，以生产高浓度的较纯的传染期线虫的方法，其特征在于，培养条件为：剪力小于1.0米/秒，但仍允许适度的搅动、气体交换和线虫悬浮，并在整个细菌接种物制备和线虫培养过程中保持无菌条件，以防止不期望的微生物生长。

2、按权利要求1所述的方法，其特征在于，剪力小于0.3米/秒。

3、按权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，在低剪力反应器中培养线虫而获得低剪力。

4、按权利要求3所述的方法，其特征在于，低剪力反应器为气泡塔发酵罐。

5、按权利要求1所述的方法，其特征在于，在低剪力下提供搅动作用的方法是：使空气向下吹过该培养，使空气掠过培养容器底部而提升该培养中所含的重的成年线虫。

6、按权利要求1所述的方法，其特征在于，培养介质用线虫的共生细菌预接种，所述细菌已经以某种方式进行了培养或处理而减少了由该细菌产生的对所述线虫有毒或有抑制作用的化合物。

7、按权利要求6所述的方法，其特征在于，细菌取自经反复传代培养后稳定地维持初生态特征的菌株。

8、按权利要求1所述的方法，其特征在于，将线虫培养在无菌培养中，当线虫至少已发育至J2期时，加入初生态的线虫共生细菌。

9、按权利要求1所述的方法，其特征在于，在培养约一周后，J1和J2期幼虫占优势时进行传代培养。