CN100592071C - 生物流式分析仪 - Google Patents
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Abstract
生物流式分析仪,涉及一种分析仪,尤其是涉及一种生物流式分析仪及应用。提供一种灵敏度较高的生物流式分析仪。包括光学系统、液流系统和检测系统。光学系统设有光学平台、固态激光器、平移台、连续可调衰减器、反射镜、消色差胶合透镜、石英流通池、第1非球面透镜、第2非球面透镜、第3非球面透镜、第1滤光片、第2滤光片和第3滤光片。液流系统设有氮气瓶、三通阀、第1开关阀、第2开关阀、第3开关阀、第4开关阀、压力调节器、压力传感器、四通阀、注射器、石英毛细管、样品管、进样器、鞘液瓶和废液瓶。检测系统设有第1检测器、第2检测器、平移台、数据采集卡和信号采集软件。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析仪,尤其是涉及一种生物流式分析仪及应用。
背景技术
流式细胞仪是一种在功能水平上对单个细胞或其它生物粒子进行定量分析和分选的仪器,其工作原理是:将待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流通室,不含细胞的磷酸盐缓冲液在高压下从鞘液管喷出,形成一定形状的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过激光检测区。被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和荧光,光信号同时被前向和90°方向的光电倍增管接收。液相芯片分析系统是将流式细胞检测技术和微球阵列技术结合起来的新一代分子诊断技术平台,可以对溶液中的多种待测组分进行同时检测。但是无论是传统的流式细胞仪还是液相芯片分析系统都存在价格昂贵、体积庞大、操作繁琐、样品和试剂用量大等缺点。此外,传统的流式细胞仪和液相芯片分析系统的检测灵敏度并不能满足常规样品如组织或体液中低拷贝生物标志物的检测。由于传统的流式细胞仪和液相芯片分析系统具有以上缺点,因此发展灵敏度高、选择性好、简单、快速的生物样品分析仪器及方法成为近年来的一个热点,受到越来越多的关注。
单分子测定是生物检测技术的最高极限。单分子检测(Single Molecule Detection,SMD)方法能检测非均匀聚集体中的单个分子,并对它们进行识别、分类和定量描述,也可对化学反应的途径进行实时监测,特别是能在生理条件下对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间的信息。而这些用传统的检测方法是非常困难、甚至无法获得的。
公开号为CN1795389的发明专利申请公开一种用于自动生物分析仪的温控系统,该自动分析仪主要包括:用于在包含预定多个位置点的路径上支持、引导和步进式输送反应试管的装置;用于分析物样品的支持转盘;用于反应物的支持转盘,用于样品和反应物的限量取样和用于将这些取样注入反应试管的装置;用于洗涤该试管的装置;用于光学读取测定结果的装置以及可以执行预编程的分析循环的计算机控制系统;所述温控系统连接在测定反应物的支持转盘的下部,所述系统本身包括:至少一个入口空气挡板;至少一个出口空气挡板;位于该入口挡板和出口挡板之间的环形空气传输路径;用于在该环形路径中产生循环空气的装置,从而可以减小该温控系统内的在入口空气和出口空气温度之间的热变化。该发明可优先应用于诊断领域中。
公开号为CN1685226的发明专利申请公开一种高分辨率的颗粒区分处理和分离系统,该系统可包括分辨率增强的流式细胞仪。在一个实施方案中,该发明可包括至少一个流体源导管,其可将流体源流以一定角度导入分辨率增强的喷嘴中,所述角度可通过细胞传感系统使颗粒的分辨率增强。
公开号为CN1330151的发明专利申请公开一种基于微流控技术的流式细胞仪,由底座、机箱、微流控芯片、光学检测单元、流体输入输出接口、微位移调节平台、信号处理箱、连接电缆、控制主机等组成。底座同定在机箱上,微位移平台固定在底座上,微流控芯片固定在微位移平台上,流体输入输出接口通过平台与微流控芯片相连接,光学检测单元位于微流控芯片的上方,通过调节相对位置完成光学检测,同时芯片上的分选单元完成分选工作。
文献报道的常规流式细胞仪的最高检测灵敏度为400个藻红蛋白。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的常规流式细胞仪的检测灵敏度较低、仪器体积庞大、操作复杂、价格昂贵、样品与试剂用量较大等不足,提供一种具有超高灵敏度的生物流式分析仪。
本发明包括光学系统、液流系统和检测系统。
光学系统设有光学平台、固态激光器、平移台、连续可调衰减器、反射镜、消色差胶合透镜、石英流通池、第1非球面透镜、第2非球面透镜、第3非球面透镜、第1滤光片、第2滤光片和第3滤光片。固态激光器、消色差胶合透镜、石英流通池分别通过平移台固定于光学平台上,连续可调衰减器、反射镜通过支杆固定于光学平台上,第1非球面透镜、第2非球面透镜、第3非球面透镜和第1滤光片、第2滤光片、第3滤光片也通过平移台固定于光学平台上。固态激光器、连续可调衰减器、反射镜依次一字排列。在与反射镜垂直的方向上依次放置消色差胶合透镜和石英流通池。在与石英流通池垂直且与固态激光器同侧的方向上依次放置第1非球面透镜、第1滤光片、第3滤光片和第3非球面透镜。在与第1滤光片垂直的方向上依次放置第2滤光片和第2非球面透镜。
液流系统设有氮气瓶、三通阀、第1开关阀、第2开关阀、第3开关阀、第4开关阀、压力调节器、压力传感器、四通阀、注射器、石英毛细管、样品管、进样器、鞘液瓶和废液瓶。液流管路均由软管连接。所有液流都是自下而上流动。压力调节器和压力传感器固定于实验台上。样品管固定在进样器内,进样器通过底板固定于光学平台上。石英毛细管一端从石英流通池底部插入石英流通池中心,石英毛细管另一端插入密闭的样品管。氮气瓶通过三通阀分为高压和低压两个气路通道,低压气路通道依次连接有第1开关阀、压力调节器和压力传感器,最后连接到四通阀的第一个管口;高压气路通道通过第2开关阀连接到四通阀的第二个管口。四通阀的第三个管口连接第3开关阀,四通阀的最后一个管口连接到进样器上。鞘液瓶固定在光学平台上,鞘液依靠重力作用从石英流通池底部流入石英流通池内部,包围在样品流外面流动,从而起到流体聚焦作用。注射器通过第4开关阀与石英流通池底部连接,实现整个管路中的除气功能。废液瓶通过管路连接到石英流通池的顶部,收集实验中产生的废液。
检测系统设有第1检测器、第2检测器、平移台、数据采集卡和信号采集软件。第1检测器和第2检测器通过平移台固定于光学平台上。数据采集卡安装在电脑内,并通过信号线与第1检测器和第2检测器连接。第1检测器位于第2非球面透镜后面,第2检测器位于第3非球面透镜后面。
所述光学平台的尺寸可选为长600mm、宽300mm、厚50mm,可采用铁磁不锈钢台面,表面阵列M6螺纹孔,孔距25mm。所述固态激光器的参数可采用:波长157~1100nm(主要包括488nm,532nm,633nm等);输出功率1~100mW;发光模式为连续波;基模高斯光束;光束直径0.5~1mm。所述连续可调衰减器可由半波片和偏振分光镜组成,半波片的作用光波长400~900nm,偏振分光镜的作用光波长400~900nm。所述反射镜的作用光波长可选为400~900nm。所述消色差胶合透镜的焦距可选为7.5~100mm,作用光波长可选为400~700nm。所述石英流通池可采用长方体结构,中心有方形通道,通道边长10~250μm。所述第1非球面透镜、第2非球面透镜和第3非球面透镜的焦距可选为1~20mm,数值孔径0.15~1.25,作用光波长400~700nm。所述第1滤光片、第2滤光片和第3滤光片可采用二向色滤光片、边缘滤光片、带通滤光片或中性密度滤光片。所述二向色滤光片的作用光波长可为400~900nm。所述边缘滤光片的阻截波长可为488nm,532nm或633nm。所述带通滤光片的中心波长可为500~700nm,带宽可为10~50nm。所述中性密度滤光片的OD值可为0.1~5,作用光波长可为400~1200nm。所述平移台的行程可为5~25mm,台面上有M3、M4、M6螺纹孔,孔距5~25mm。
液流系统的样品管通过弹簧固定在进样器内,进样器通过底板固定于光学平台上并位于石英流通池旁边。鞘液瓶固定在光学平台上的靠近石英流通池的地方。
所述第1检测器可采用光电倍增管或单光子计数模块,用来探测第1带宽的光信号(包括散射光或荧光信号)。所述第2检测器可采用单光子计数模块,有效接受面积直径20~180μm,计数速率0~15Mc/s,暗计数0~500c/s,用来探测第2带宽的荧光光子信号,对探测到的弱光信号进行计数处理。所述进样器可设有2个通道,1个供氮气进入,1个供毛细管插入,通道直径0.5~5mm。所述石英毛细管内径10~100μm,外径150~380μm,从石英流通池底部插入石英流通池中心的石英毛细管一端最好削成5°~20°的锥形喷嘴,有利于实现流体聚焦,表面有涂层,使其柔软便于弯曲。所述鞘液瓶体积最好为0.1~2L,瓶盖上有3个开关阀,其中2个开关阀供大气进入,使瓶内外气压平衡;另外一个开关阀供鞘液流出。
本发明相对现有技术具有如下优点和效果:1)本发明的各个部件安装在一个小型光学平台上,结构紧凑,体积小。2)利用流体聚焦技术减小检测区体积,消除了流通池光窗界面上的杂散光干扰,有效地降低了背景。3)检测流动的液体溶液中的分子、细胞或颗粒,大大提高了检测速度与统计精确性,且试剂与鞘液用量少。4)本发明采用高效能集光系统收集微弱光信号,大大提高了光信号的收集效率。5)单光子计数检测器暗计数极小,接受面积的大小只有微米级,所以检测器本身可以起到空间滤波的作用,有效地提高了检测效率和检测灵敏度。6)本发明可以应用于微球免疫分析以及蛋白质、核酸、病毒、细菌、亚细胞器和细胞等生物样品的分析,扩大了其应用领域。7)本发明结合单分子流式检测技术与微珠免疫分析方法创建的超高灵敏蛋白质免疫化学分析平台,可以将常规流式微珠免疫分析方法的检测灵敏度提高2-3个数量级。
附图说明
图1为本发明实施例的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明。
如图1所示,本发明包括光学系统A、液流系统B和检测系统C。
光学系统A设有光学平台、固态激光器2、平移台、连续可调衰减器4、反射镜5、消色差胶合透镜6、石英流通池7、第1非球面透镜8、第2非球面透镜9、第3非球面透镜10、第1滤光片11、第2滤光片12和第3滤光片13。固态激光器2、消色差胶合透镜6、石英流通池7分别通过平移台固定于光学平台上,连续可调衰减器4、反射镜5通过支杆固定于光学平台上,第1非球面透镜8、第2非球面透镜9、第3非球面透镜10和第1滤光片11、第2滤光片12和第3滤光片13也通过平移台固定于光学平台上。固态激光器2、连续可调衰减器4、反射镜5依次一字排列。在与反射镜5垂直的方向上依次放置消色差胶合透镜6和石英流通池7。在与石英流通池7垂直且与固态激光器2同侧的方向上依次放置第1非球面透镜8、第1滤光片11、第3滤光片13和第3非球面透镜10。在与第1滤光片11垂直的方向上依次放置第2滤光片12和第2非球面透镜9。
液流系统设有氮气瓶14、三通阀15、第1开关阀16、第2开关阀17、第3开关阀18、第4开关阀19、压力调节器20、压力传感器21、四通阀22、注射器23、石英毛细管24、样品管25、进样器26、鞘液瓶27和废液瓶28。液流管路均由软管连接。所有液流都是自下而上流动。压力调节器20和压力传感器21固定于实验台上。样品管25通过弹簧固定在进样器26内,进样器26通过底板固定于光学平台上并位于石英流通池7旁边。石英毛细管24一端从石英流通池7底部插入石英流通池7中心,石英毛细管24另一端插入密闭的样品管25。氮气瓶14通过三通阀15分为高压和低压两个气路通道,低压气路通道依次连接有第1开关阀16、压力调节器20和压力传感器21,最后连接到四通阀22的第一个管口;高压气路通道通过第2开关阀17连接到四通阀22的第二个管口。四通阀22的第三个管口连接第3开关阀18,四通阀22的最后一个管口连接到进样器26上。鞘液瓶27固定在光学平台上的靠近石英流通池7的地方,鞘液依靠重力作用从石英流通池7底部流入石英流通池7内部,包围在样品流外面流动,从而起到流体聚焦作用。注射器23通过第4开关阀19与石英流通池7底部连接,实现整个管路中的除气功能。废液瓶28通过管路连接到石英流通池7的顶部,收集实验中产生的废液。
检测系统设有第1检测器29、第2检测器30、平移台、数据采集卡31和信号采集软件32。第1检测器29和第2检测器30通过平移台固定于光学平台上。数据采集卡31安装在电脑内,并通过信号线与第1检测器29和第2检测器30连接。第1检测器29位于第2非球面透镜9后面,第2检测器30位于第3非球面透镜10后面。
光学平台的尺寸选为长600mm、宽300mm、厚50mm,采用铁磁不锈钢台面,表面阵列M6螺纹孔,孔距25mm。固态激光器的参数为波长157~1100nm(主要包括488nm,532nm,633nm等);输出功率1~100mW;发光模式为连续波;基模高斯光束;光束直径0.5~1mm。连续可调衰减器由半波片和偏振分光镜组成,半波片的作用光波长400~900nm,偏振分光镜的作用光波长400~900nm。反射镜的作用光波长为400~900nm。消色差胶合透镜的焦距为7.5~100mm,作用光波长为400~700nm。石英流通池采用长方体结构,中心有方形通道,通道边长10~250μm。第1非球面透镜、第2非球面透镜和第3非球面透镜的焦距选为1~20mm,数值孔径0.15~1.25,作用光波长400~700nm。第1滤光片、第2滤光片和第3滤光片采用二向色滤光片、边缘滤光片、带通滤光片或中性密度滤光片。二向色滤光片的作用光波长为400~900nm。边缘滤光片的阻截波长为488nm,532nm或633nm。带通滤光片的中心波长为500~700nm,带宽为10~50nm。中性密度滤光片的OD值为0.1~5,作用光波长为400~1200nm。平移台的行程为5~25mm,台面上有M3、M4、M6螺纹孔,孔距5~25mm。
第1检测器采用光电倍增管或单光子计数模块,用来探测第1带宽的光信号(包括散射光或荧光信号)。第2检测器采用单光子计数模块,有效接受面积直径20~180μm,计数速率0~15Mc/s,暗计数0~500c/s,用来探测第2带宽的荧光光子信号,对探测到的弱光信号进行计数处理。进样器设有2个通道,1个供氮气进入,1个供毛细管插入,通道直径0.5~5mm。石英毛细管内径10~100μm,外径150~380μm,从石英流通池底部插入石英流通池中心的石英毛细管一端削成5°~20°的锥形喷嘴,有利于实现流体聚焦,表面有涂层,使其柔软便于弯曲。鞘液瓶体积为0.1~2L,瓶盖上有3个开关阀,其中2个开关阀供大气进入,使瓶内外气压平衡;另外一个开关阀供鞘液流出。
15mW、532nm的固态激光器发出的激光经过连续可调衰减器后能量衰减为1.0mW,被反射镜90度反射后经过消色差胶合透镜聚焦为直径~10μm的光斑,这个激光光斑在石英流通池中心与样品流正交。利用1~5psi的氮气压力将样品管中的样品压入石英毛细管,样品经毛细管流入石英流通池中心。鞘液依靠重力作用从鞘液瓶流入石英流通池,包围在石英毛细管外面流动。样品从毛细管锥形喷嘴处流出后被鞘液聚焦,形成直径4~9μm的样品流,保证了所有的样品分子(包括蛋白质、核酸等生物分子)或者样品颗粒(包括微球、病毒、细菌、亚细胞器、细胞等)一个一个地穿过高度聚焦的激光束中心而被激发产生光信号。在与激光光束和样品流正交的方向,单个样品分子或样品颗粒所产生的光信号用数值孔径为0.68的非球面透镜收集。第1带宽的光信号(包括散射光或荧光信号)被二向色滤光片90度反射后再经过中性密度滤光片衰减,最后进入第1检测器被检测。第2带宽的荧光光子信号透过二向色滤光片后再经过边缘滤光片和带通滤光片(必要时添加中性密度滤光片)除去杂散光,最后由第2非球面透镜聚焦到第2检测器的有效接受面积上。当第1检测器和第2检测器探测到光信号,立即向数据采集卡输出信号。这些信号经过数据采集卡进入信号采集软件进行综合与处理。通过这些信号可以对生物样品进行定性和定量分析。
利用本发明实现蛋白质微球免疫分析的方法为:通过偶联于微球上的特异性单克隆抗体将靶蛋白富集在微球体上,并对其进行报告抗体荧光标记。当这些微球一个一个地穿过高度聚焦的激光束中心时产生光信号。第1检测器用于检测微珠自身固有的光学信号,如与微珠大小相关的散射光信号或微珠内部包被的用于光学编码的荧光染料的信号,即第1检测器用于定性分析。第2检测器用于检测靶蛋白上报告抗体的荧光信号,即第2检测器用于待测靶蛋白的定量分析。在信号采集的处理模式上,利用第1检测器的光学信号来识别穿过激光探测区的微珠并同时触发第2检测器对荧光信号的采集。因此,生物流式检测仪在没有接收到微珠自身发出的光学信号时将不对通过激光探测区的溶液中游离的标记抗体进行检测,增强了微珠表面待测靶蛋白荧光和游离标记抗体背景信号的区分,从而实现蛋白质的定性和定量分析。
Claims (9)
1.生物流式分析仪,其特征在于包括光学系统、液流系统和检测系统;
光学系统设有光学平台、固态激光器、平移台、连续可调衰减器、反射镜、消色差胶合透镜、石英流通池、第1非球面透镜、第2非球面透镜、第3非球面透镜、第1滤光片、第2滤光片和第3滤光片;固态激光器、消色差胶合透镜、石英流通池分别通过平移台固定于光学平台上,连续可调衰减器、反射镜通过支杆固定于光学平台上,第1非球面透镜、第2非球面透镜、第3非球面透镜和第1滤光片、第2滤光片、第3滤光片也通过平移台固定于光学平台上;固态激光器、连续可调衰减器、反射镜依次一字排列;在与反射镜垂直的方向上依次放置消色差胶合透镜和石英流通池,在与石英流通池垂直且与固态激光器同侧的方向上依次放置第1非球面透镜、第1滤光片、第3滤光片和第3非球面透镜,在与第1滤光片垂直的方向上依次放置第2滤光片和第2非球面透镜;
液流系统设有氮气瓶、三通阀、第1开关阀、第2开关阀、第3开关阀、第4开关阀、压力调节器、压力传感器、四通阀、注射器、石英毛细管、样品管、进样器、鞘液瓶和废液瓶;液流管路均由软管连接,样品管固定在进样器内,进样器通过底板固定于光学平台上,石英毛细管一端从石英流通池底部插入石英流通池中心,石英毛细管另一端插入密闭的样品管;氮气瓶通过三通阀分为高压和低压两个气路通道,低压气路通道依次连接有第1开关阀、压力调节器和压力传感器,最后连接到四通阀的第一个管口;高压气路通道通过第2开关阀连接到四通阀的第二个管口,四通阀的第三个管口连接第3开关阀,四通阀的最后一个管口连接到进样器上;鞘液瓶固定在光学平台上,注射器通过第4开关阀与石英流通池底部连接,废液瓶通过管路连接到石英流通池的顶部;
检测系统设有第1检测器、第2检测器、平移台、数据采集卡和信号采集软件,第1检测器和第2检测器通过平移台固定于光学平台上,数据采集卡安装在电脑内,并通过信号线与第1检测器和第2检测器连接,第1检测器位于第2非球面透镜后面,第2检测器位于第3非球面透镜后面。
2.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述光学平台的尺寸为长600mm、宽300mm、厚50mm,采用铁磁不锈钢台面;所述固态激光器的参数为:波长157~1100nm,输出功率1~100mW,发光模式为连续波,基模高斯光束,光束直径0.5~1mm。
3.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述连续可调衰减器由半波片和偏振分光镜组成,半波片的作用光波长400~900nm,偏振分光镜的作用光波长400~900nm;所述反射镜的作用光波长为400~900nm;所述消色差胶合透镜的焦距为7.5~100mm,作用光波长为400~700nm。
4.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述第1非球面透镜、第2非球面透镜和第3非球面透镜的焦距为1~20mm,数值孔径0.15~1.25,作用光波长400~700nm;所述第1滤光片、第2滤光片和第3滤光片采用二向色滤光片、边缘滤光片、带通滤光片或中性密度滤光片,所述二向色滤光片的作用光波长为400~900nm,所述边缘滤光片的阻截波长为488nm,532nm或633nm,所述带通滤光片的中心波长为500~700nm,带宽为10~50nm,所述中性密度滤光片的OD值为0.1~5,作用光波长为400~1200nm。
5.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述平移台的行程为5~25mm。
6.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于液流系统的样品管通过弹簧固定在进样器内,进样器通过底板固定于光学平台上并位于石英流通池旁边;鞘液瓶固定在光学平台上的靠近石英流通池的地方。
7.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述第1检测器为光电倍增管或单光子计数模块;所述第2检测器为单光子计数模块,有效接受面积直径20~180μm,计数速率0~15Mc/s,暗计数0~500c/s。
8.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述进样器设有2个通道,1个供氮气进入,1个供毛细管插入,通道直径0.5~5mm;所述石英毛细管内径10~100μm,外径150~380μm,从石英流通池底部插入石英流通池中心的石英毛细管一端削成5°~20°的锥形喷嘴。
9.如权利要求1所述的生物流式分析仪,其特征在于所述鞘液瓶体积为0.1~2L,瓶盖上有3个开关阀,其中2个开关阀供大气进入;另外一个开关阀供鞘液流出。
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